CN115362250A - 用于基于细胞的测定的方法和装置 - Google Patents

Abstract

本发明提供了细胞测定系统及其在基于细胞的测定中的用途。

Description

用于基于细胞的测定的方法和装置

基于细胞的测定已经广泛用于细胞生物学、医学、药理学、毒理学等领域。基于细胞的测定通常在多孔细胞培养板中进行。根据测定，细胞可以呈悬浮液、二维单层或三维类器官/球状体的形式。为了满足一些特殊需求，引入了许多新的系统。这些系统包括微流控细胞培养装置、三维膜基灌注生物反应器、三维细胞培养柱系统等。虽然这些系统具有一些优势，但它们在复杂性、稳健性、灵活性、易操作性和成本效益方面具有或多或少的缺点。例如，所述微流控系统的流道容易被气泡、水凝胶和细胞团堵塞。所述三维细胞培养柱系统只适用于从增殖细胞中制备多球状体，因为它必须使用水凝胶将细胞固定在柱上。像人肝细胞这样的非增殖细胞不能在水凝胶中形成球状体。水凝胶的使用也限制了该柱系统的应用，因为水凝胶可能对，尤其对，大分子扩散和测定结果产生影响。此外，由于水凝胶需要在很短的时间内凝固以避免小体积的蒸发，将细胞固定在微小的柱子上可能是一个挑战。

鉴于这些系统的缺点，本发明公开了一种用于基于细胞的测定的可移动针细胞培养系统。所述系统不仅适用于二维单层和三维细胞培养，而且能够同时测试在二维单层、三维支架和三维非支架上培养的不同类型的细胞。所述系统更灵活，更容易处理，更坚固，用于进行基于细胞的测定。

发明内容

在第一方面，本发明涉及一种适用于基于细胞的测定装置的针，包括：针体和针尖部，其中所述针体包括针头，所述针尖部包括用于细胞接种的表面。

在本发明的所述针的一实施例中，所述针体至少包括一个锥形段，并且所述针体和所述针头一起形成T形。

在本发明的所述针的一实施例中，所述针体和所述针尖部呈圆柱形。

在本发明的所述针的一实施例中，所述针体和所述针尖部呈非圆形横切形状。

在本发明的所述针的一实施例中，所述针头是包括凹槽的阶梯式针头。

在本发明的所述针的一实施例中，所述表面选自由以下项组成的组：平坦表面、边缘处具有凸起边缘的平坦表面、向内结构化表面、多凹槽表面、多微孔表面、多微柱表面、粗糙表面、渗透膜、多孔段或磁性段；优选地，层包括促进细胞粘附的层，更优选地，选自水凝胶的细胞粘附促进层。

在第二方面，本发明涉及一种针支架，其包括用于接收本发明的针的多个开口，其中所述针支架包括环形部分连接到圆柱形部分形成的T形的针支架，其中所述环形部分的直径大于所述圆柱形部分的直径，其中所述环形部分包括用于接接收所述针的所述多个开口。

在一个实施例中，所述针支架由塑料制成，该塑料优选地为聚四氟乙烯、聚苯乙烯、聚酯和聚碳酸酯。

在一个实施例中，所述针支架的尺寸设置成适应多孔板的孔。

在第三方面，本发明涉及一种用于执行基于细胞的测定的装置，包括:

针支架，其中所述针支架包括用于接收本发明的针的多个开口和具有凹槽通道的基座。

在所述用于执行基于细胞的测定的装置的一个实施例中，所述针支架和所述基座具有匹配的形状，用于接收针的所述开口被布置成使得所述开口与所述基座的凹槽通道对准。

在所述用于执行基于细胞的测定的装置的一个实施例中，所述针支架还包括用于接收细胞培养插件的开口，并且所述基座还包括用于接收液体的贮液槽，其中所述贮液槽设置在所述基座内，使得所述贮液槽与所述针支架的用于接收细胞培养插件的所述开口对准。

在所述用于执行基于细胞的测定的装置的一个实施例中，所述装置还包括泵，所述泵与所述贮液槽、所述凹槽通道和所述细胞培养插件流体连接。

在所述用于执行基于细胞的测定的装置的一个实施例中，所述针支架包括：

用于接收针的多个开口，

用于接收至少两个细胞培养插件的至少两个开口，

用于接收所述泵的轴的至少一个开口；和

所述基座包括：

至少两个贮液槽，

用于接收所述泵，特别是泵叶轮的至少一个开口，

入口通道，

出口通道，

其中所述泵的所述入口通道和所述出口通道连接到所述贮液槽和所述凹槽通道。

在所述用于执行基于细胞的测定的装置的一个实施例中，所述装置包括用于接收本发明的针的多个开口的针支架，包括凹槽通道和贮液槽的基座，其中所述凹槽通道的尺寸设置成接收固定在所述针支架的开口中的所述针的所述针尖部，其中所述凹槽通道连接至所述贮液槽。

在所述用于执行基于细胞的测定的装置的一个实施例中，所述针支架和所述基座是所述装置的可分离部件。

在所述用于执行基于细胞的测定的装置的一个实施例中，所述针支架和所述基座集成为单个部件。

在所述用于执行基于细胞的测定的装置的一个实施例中，所述基座包括多于一个的凹槽通道。

在所述用于执行基于细胞的测定的装置的一个实施例中，所述凹槽通道具有包括上部部分、阶梯和下部部分的阶梯形状，其中所述上部部分的尺寸大于所述下部部分的尺寸。

在所述用于执行基于细胞的测定的装置的一个实施例中，所述凹槽通道在所述基座中呈直线或圆形布置。

在所述用于执行基于细胞的测定的装置的一个实施例中，所述贮液槽包含液体。

在所述用于执行基于细胞的测定的装置的一个实施例中，所述针支架，所述针和所述基座由塑料制成，该塑料优选地为聚苯乙烯、聚酯和聚碳酸酯。

在第四方面，本发明涉及用于在本文所定义的针的针表面上接种细胞的细胞接种装置，该细胞接种装置包括：

组装时形成多个漏斗形空腔的第一部分和第二部分，其中所述漏斗形空腔包括具有开口的上空腔部分和具有开口的下空腔部分，其中所述漏斗形空腔的所述下空腔部分的尺寸设置成接收所述针的针尖部。

在所述细胞接种装置的一个实施例中，所述漏斗形空腔排列成矩阵。

在所述细胞接种装置的一个实施例中，所述矩阵是8漏斗、12漏斗、16漏斗、24漏斗、96漏斗格式。

在所述细胞接种装置的一个实施例中，所述漏斗形空腔的下空腔部分和插入的所述针的针尖部形成液体密封。

在所述细胞接种装置的一个实施例中，所述细胞接种装置由塑料制成，该塑料优选地为聚丙烯、橡胶、聚苯乙烯、聚酯和聚碳酸酯。

在所述细胞接种装置的一个实施例中，所述漏斗形空腔形成为单件。

在所述细胞接种装置的一个实施例中，所述细胞接种装置包括处于所述上空腔部分中的可拆卸变径套筒，其中所述套筒包括两个端部均具有开口的腔室，并且所述套筒的靠近所述下空腔部分的端部具有尺寸小于针尖部的直径的开口。

在所述细胞接种装置的一个实施例中，所述套筒的靠近所述下空腔部分的端部包含多个微开口。

在所述细胞接种装置的一个实施例中，所述套筒包含分隔器以在所述套筒内部形成多个腔室，其中每个腔室在所述套筒的靠近所述下空腔部分的端部包含至少一个微开口。

在所述细胞接种装置的一个实施例中，所述上空腔部分具有与所述下空腔部分相同的直径。

在所述细胞接种装置的一个实施例中，所述变径套筒放置到所述细胞接种装置的上空腔部分中，用于允许细胞以设计的形状或图案附着到针尖部。

在第五方面，本发明涉及一种用于执行基于细胞的测定的套件，包括：

多个如本文所定义的针，

至少一个本发明的用于执行基于细胞的测定的装置，

至少一个本发明的细胞接种装置，和

用于执行基于细胞的测定和细胞接种的手册。

在套件的一个实施例中，所述套件进一步包括用于执行基于细胞的测定的试剂。

在第六方面，本发明涉及一种用于执行基于细胞的测定的方法，包括：

通过将细胞附着到所述针表面并培养细胞以在所述针表面上形成二维单层细胞或三维结构化细胞来制备针，

通过用测试培养基填充所述基座的所述贮液槽,并组装所述针支架和所述基座以形成用于执行基于细胞的测定的装置，

并将所述细胞针插入所述针支架的所述开口中以固定所述针，使得所述针表面浸入所述测试培养基中，和

将所述细胞在所述测试培养基中培养规定的时间，其中所述测试培养基在所述凹槽通道中流动，以及在完成培养后，分析所述测试培养基中的物质和/或所述细胞针中的每个细胞针上的所述细胞。

在本发明的用于执行基于细胞的测定的方法的一个实施例中，所述细胞在所述针表面的最外表面被水凝胶薄层覆盖以防止细胞分离。

在本发明的用于进行基于细胞的测定的方法的一个实施例中，所述细胞针由一组靶细胞制备，其中所述细胞针中的每个细胞针包含一种类型的以二维或三维形式培养的靶细胞。

在第七方面，本发明涉及一种用于在针的针表面上接种细胞的方法，包括：

将本文所定义的针插入本发明的所述细胞接种装置的所述下空腔部分的所述开口中以形成液体密封；

将细胞悬液添加到所述细胞接种装置的所述上空腔部分的每个开口中，并将所述细胞培养规定的时间以允许所述细胞粘附到所述针表面；

拆卸所述装置并将所述针转移到用于执行基于细胞的测定的装置。

在所述用于在针的针表面上接种细胞的方法的一个实施例中，所述针沿着下空腔部分移动，以将液体吸入到下空腔部分中。

在所述用于在针的针表面上接种细胞的方法的一个实施例中，所述套筒用于在所述针表面接种第一类细胞，所述第一类细胞附着到所述针表面后，拆除所述套筒，并且将第二类型的细胞添加到上空腔部分中，培养所述第二类型的细胞以在所述第一类细胞的细胞层上形成第二细胞层。

在所述用于在针的针表面上接种细胞的方法的一个实施例中，在步骤a)之前，所述针尖部包含一层细胞。

附图说明

图1示出了可移动针细胞培养系统。图1A示出了可移动针细胞培养系统的正视图，图1B示出了可移动针细胞培养系统的侧视图，图1C示出了可移动针细胞培养系统的俯视图。图1D是基座的沿AA线的横切图，其示出贮液槽和阶梯式凹槽通道。

图2是针尖部朝上放置的针。

图3显示了朝向具有向内表面的针尖部的一段针。

图4是多单元细胞接种装置的正视图(A),侧视图(B),该装置的俯视图(C)，显示了由漏斗的上部形成的贮液槽的装置的BB线横切图(D)，显示了漏斗窄管中的针1的装置的CC线横切图(E)，和显示了漏斗上部的连接部分的FF线横切图(F)。

图5显示了具有圆形凹槽通道的可移动针细胞培养系统的正视图(A)、系统的俯视图(B)和显示了针6和凹槽通道的基座的DD线横切图(C)。

图6A-C示出了可以在本发明的测定系统中使用的凹槽通道的变型的一些俯视图。

图7是中空针和可移除磁性插件的正视图和俯视图。

图8是针和漏斗状细胞接种条的示例。

图9是T形插件的示例。

图10是12孔板中T形插件的示例。

图11是孔中带有针的T形插件的示例。

图12显示了用于漏斗形空腔的上空腔部分的变径套筒。图12A显示了正视图，图12B显示了具有单个开口的俯视图，图12C显示了具有多个开口的俯视图，图12D显示了具有套筒分隔器的俯视图，图12E显示了细胞接种装置中套筒的俯视图。

图13是具有细胞培养插件和集成离心泵的可移动针细胞培养系统1a的示例；图13A显示了细胞培养系统的透视图；图13B显示了具有针和细胞培养插件的组装系统的俯视图；图13C显示了具有针和细胞培养插件的组装系统的仰视图。

具体实施方式

图1描绘了示例性的可移动针细胞培养系统1a。该细胞培养系统1a包括单独的可移动针1、针支架2和基座3。该针1具有带凹槽5的阶梯式针头4a和针尖部6，针尖部6的表面6a用于二维或三维细胞培养。针支架2放置在基座3上，并且针支架2包括用于接收所述针1的开口7a，以便将该针1固定在可移动针细胞培养系统1a中。针支架2也用作基座3的盖子。基座3包含阶梯式凹槽通道7和两个梯形贮液槽8。通道7的每一侧都有一个贮液槽，这些所述贮液槽由底部窄槽9以S形布置方式连接。使用时，测试培养基(图中的红点)添加到一个贮液槽8中，该测试培养基将通过窄槽9流到另一个贮液槽中。将针支架2放置在基座3上，然后用具有例如蟹尖的镊子将细胞针1插入到针支架3上的容器开口7a中，镊子可以将该针1固定在所述凹槽5处。阶梯式针头4a将由凹槽通道7固定，使得针尖部浸入窄凹槽9中的培养基中。在培养期间，翘板式摇床用于使培养基通过窄槽9从一个贮液槽7到另一个贮液槽来回循环。上下运动的轴线平行于通道。根据测定，结果可以通过分析测试培养基和/或该细胞针1上的细胞相应地读出。例如，该系统能够在药物代谢测定中用二维单层或三维非支架形式的肝细胞测试细胞针1。培养后，分析培养基中的测试化合物及其代谢物。对于细胞毒性的测定，可以使用一组靶细胞制备细胞针，以便可以在相同的环境中对它们进行测试。因此，结果可能与活体内情况有更多相关性。可以使用显微镜或分光光度计检测对细胞的毒性作用，例如细胞形态的变化、细胞内有色或荧光物质形成或积累的能力等。在某些情况下，可以将单个细胞针转移到多孔板中进行进一步的测定。

图2描绘了一个示例性的针1，其包括平的针尖部6和阶梯式圆柱形针头5。该平的针尖部6的表面6a用于细胞附着和细胞生长。在一些情况下，该针1的表面6a可以在边缘处包含稍微凸起的边缘，使得它可以在针尖部保留更多的培养基，以避免在装配测定系统期间变干。尽管根据本发明，各种形状的针1都可以用于二维和三维细胞培养，优选大的圆形表面用于制备单层细胞，优选窄的矩形表面用于制备多细胞的三维细胞以将营养物质更好扩散到细胞团的中心，并且优选可渗透的膜表面用于制备多层的大细胞层以确保营养物质到达细胞的深层。除了平的表面之外，表面6a可以是向内结构化表面，例如,凹面(图3A，圆锥面、棱锥面或半圆柱面(图3B))，针尖部的多凹槽、多微孔、多微柱表面和针尖部的粗糙表面也可以用于，尤其是用于具有水凝胶的三维细胞培养。在另一个实施例中，用于三维支架细胞培养的针1包含朝向针尖部的多孔段。尽管对该针1的尺寸没有特别的限制，但是该针表面6a的尺寸优选地在显微镜视野内以便于观察。优选的针表面尺寸是直径为0.1至2.5mm的圆形区域。

使用细胞接种装置40将细胞直接附着到针表面6a的表面，在细胞接种装置40中，所述针1向上放置。因此细胞悬液中的细胞将通过重力沉淀并附着在该针1的表面6a上，并且形成单层或多细胞三维细胞团。根据本发明的一个实施例，细胞接种装置40包括第一部分41和第二部分43两个隔室，其都包含半漏斗形空腔。两个隔室41和43组装在一起时，形成用于接收该针1的漏斗形空腔。每个漏斗形空腔44包括具有开口的上空腔部分44a和具有开口的下空腔部分44b，其中漏斗形空腔44的下空腔部分44b的尺寸被设置成接收该针1的针尖部6。在本发明的一个实施例中,下空腔部分44b的直径优选地对应针尖部6的直径。该针1放置在下空腔部分44b中时，两个隔室41和43被紧固在一起以密封缝隙防止培养基泄漏。在本发明的一个实施例中，可以在接触表面周围放置垫圈，例如橡胶环或橡胶片，以防止培养基泄漏。当细胞接种装置40由弹性材料，例如硅酮制成时，可以省略垫圈。优选地，特别是对于三维细胞培养，针尖部6不伸入空腔44中。因此，所有细胞都可以附着在针尖部6的表面6a上，以减少该针之间的细胞数量的可变性。为了避免在下空腔部分44b中形成气泡，对于一端封闭的小型管来说，这种情况经常发生,可以上下移动该针1几次，以去除滞留的空气。在另一个实施方案中，所述细胞接种装置也可以制成单个隔室代替两个隔室。一段管也可以用于接种细胞，因为大小适宜的管和针可以形成类似注射器的装置，其中该管用作筒，而该针用作活塞。因此，可以将细胞悬液吸入该筒中。当该针的尺寸足够大时，甚至可以使用移液管将细胞悬液添加到该管中，其中针尖设置在该管的内开口下方。对于三维细胞培养，漏斗形空腔的表面最好具有细胞排斥层，其可以通过涂覆或接枝适当的化学物质或聚合物来形成。

图4描绘了包括两个不同结构的空腔隔室的多漏斗细胞接种装置40。一个隔室41具有多个半圆形通道42，第二隔室43具有匹配数量的半漏斗结构的空腔44，漏斗的宽上部在该空腔44中连接(图4F)。组装时，半圆形通道42和漏斗44的相应窄半管45形成用于容纳该针1的窄管(图4E)。该漏斗的相连的宽上部成为贮液槽46(图4D)。因此，可以将细胞悬液倒入贮液槽46中。一旦细胞悬液液位上升到贮液槽中，细胞悬液就可以在漏斗的上部自由流动。将多漏斗快速细胞接种装置40水平放置后，细胞会在重力作用下均匀分布到漏斗中并在针尖部6的表面6a上沉淀。每个该针1将接收相同数量的细胞用于生长。从所述半圆形通道的薄隔室可以观察细胞的生长状态。多漏斗快速细胞接种装置40的使用不仅简化了操作，而且由于细胞快速沉淀导致所述细胞悬液很快变得不均匀，因此减少了多次移液将所述细胞悬液转移到每个漏斗所带来的变化。

多漏斗细胞接种装置的原理也可用于制造具有细胞排斥表面的多孔板，例如用于制备球状体的96-或384-或1536孔板，其中该多孔板的孔是具有圆锥形或圆形底部的正方形孔。方形孔都通向贮液槽，该贮液槽由该板周围的凸起边形成。该边和最外面的孔之间有凹槽，以最小化由堤岸周围的液体上升引起的细胞的不均匀分布。孔和凹槽之间的壁的上部相互连接，形成有角的屋顶结构，以防止细胞落下并且将细胞均匀地引导至相邻的孔。因此，当所述细胞悬液以足以覆盖孔的开口的体积添加到贮液槽中时，细胞可以无缝地分布到孔中。一旦细胞沉淀到每个孔的底部，就可以移除贮液槽中的培养基，随后可以像处理普通的多孔板一样对该培养基进行处理。在培养箱中培养后，细胞将在每个孔中形成单个球装体。

对细胞无毒的材料可用于制造可动针细胞培养系统1a和细胞接种装置40。塑料如聚苯乙烯、聚酯、聚碳酸酯、聚丙烯和聚甲醛是优选的。由于细胞附着的各种条件，针尖部6的表面6a可能需要通过不同的方式进行处理，例如，气体等离子处理、聚合物接枝和细胞外基质涂层。聚四氟乙烯可用于制造细胞接种装置40以及针1，以避免培养基泄漏和气泡的产生。该针1和小直径管之间的窄疏水间隙可以起到选择性屏障的作用，因为它允许空气自由通过但防止培养基泄漏。疏水间隙也可以通过在针和细胞接种装置的接触表面上涂覆疏水材料制成。

使用细胞接种装置40，单细胞悬液、活检微组织和三维细胞培养产生的类器官/球状体可以直接接种到针表面6a上。一旦细胞紧紧地附着在针尖部6的表面6a上，就可以将针1转移到多孔细胞培养板中进行生长。对于来自例如肺癌细胞系的细胞，由于细胞针1向下放置在多孔板中，一些表面细胞会在细胞培养期间脱离细胞团。为了防止表面细胞脱落，可以用一薄层水凝胶覆盖附着的细胞。合适的水凝胶是琼脂糖、藻酸盐和胶原。薄水凝胶涂层可以通过首先将针尖部6浸入水凝胶溶液中，然后将针尖部6浸入合适的溶液中以固化该水凝胶来形成。例如，琼脂糖可以通过冷介质固化。藻酸盐溶液可以用BaCl₂或CaCl₂溶液固化，胶原可以用温热的碱性溶液固化。

除了薄水凝胶涂层之外，细胞在针上的细胞培养期间用顺磁性纳米颗粒处理成为磁化细胞或细胞团时，在针尖部6包含磁性段的针1也可用于将细胞限制在针尖部表面6a。图7是具有可移除磁性插件72的中空针71的示例，该可移除磁性插件72在针尖部包含一个磁性块73。该针的头部具有凹槽74，该凹槽适于容纳插件的头部75。当该插件放置在空心针中时，形成磁针，该磁性针可以在针尖端76处吸引铁磁材料和顺磁材料。磁针也可以通过在所述针尖端嵌入磁块制成，其中磁块可以是硬磁材料，也可以是软磁材料。软磁材料是优选的，因为它可以同时具有磁化和去磁化状态。当细胞在针尖部被直接磁化时，为了去除未结合的顺磁性纳米颗粒，最好引入去磁洗涤步骤。此外，通过使用磁化细胞，磁针可以直接将细胞从细胞悬液中固定到针尖部上。因此，可移动针细胞培养系统的应用可以扩展到非粘附细胞测定、通过使用特异性结合顶端膜或基侧膜的顺磁性纳米颗粒而具有确定的顶-基底极性取向的极性细胞测定，以及通过使用针对靶细胞的特异性顺磁性纳米颗粒从具有几种细胞类型的细胞混合物中直接捞出靶细胞的测定。此外，应用可以进一步扩展到磁珠免疫测定，特别是多重测定，其中由于磁针可以轻松且完全地转移珠子，不同的靶向珠子可以与样品溶液逐一反应。

细胞接种装置40也可用于制备具有水凝胶的多球状体，水凝胶需要长时间温育来固化。例如，为了在低浓度的胶原溶液中制备细胞，将悬浮在胶原溶液中的少量细胞添加到细胞接种装置40中的针尖部6的表面6a，并用具有适当pH的较低密度的碱性溶液覆盖细胞溶液。在37℃下温育一定时间后，该胶原溶液会缓慢形成水凝胶，其与包埋的细胞一起粘附在针尖部6的表面6a上。水凝胶中的每个细胞都会生长形成一个球状体。

根据本发明的一个实施例，可移动针细胞培养系统1a使用阶梯式凹槽通道7，以最小化翘板式摇床的上下运动期间通道中培养基的体积变化(图1D)。在阶梯形凹槽通道中，台阶10是为了防止培养基爬进上部宽凹槽中11。然而，所述窄凹槽9的毛细作用力将培养基保持在窄槽中，以确保针尖部6的表面6a上的细胞可以总是在培养基中。优选地，该窄槽具有间隙尺寸，使得这种窄槽的毛细作用力能够将培养基升高到比所述台阶更高的高度。因此，通过引入低于最大提升高度的所述台阶来阻止培养基进一步向上攀升，阶梯式凹槽通道可以保持相同的体积。

在另一个实施例中，可移动针细胞培养系统(图5)的基座包含具有圆形凹槽通道7的基座，该圆形凹槽通道7具有用于细胞针6的容器开口7a。该容器开口7a位于通道7的上部。在使用时，将针1沿着环形凹槽通道7一个接一个地插入，并且T形针头4a会固定在容器开口7a中，使得附着于针尖部6的表面6a的细胞浸入培养基中。垂直和水平轨道运动振荡器可用于驱动培养基在凹槽通道7中顺时针或逆时针流动。对于需要高细胞数量与培养体积比的测定，所述具有圆形通道的可移动针细胞培养系统是优选的。该圆形通道7a也可以通过另一种方法制成，根据该方法，通道7通过将T形插件101放置在多孔板的匹配孔中而形成(参见图9和图10)。T形插件102的顶部突出结构包含用于细胞针1的孔洞103，其尺寸优选地与孔的尺寸相同，因此所述T形插件101可以固定在该孔的中间，并形成圆形凹槽通道7a。在某些情况下，当细胞对培养基的流动敏感时，阶梯式凹槽通道可能是优选的。在这种情况下，台阶被培养基覆盖，因此上部宽凹槽也作为流动通道，以降低窄凹槽中培养基的流速，从而使所述针尖部6的表面6a上的细胞受到的影响较小。凹槽通道的几种变型如图6所示。例如，当测定需要来自几种细胞类型的不同量的细胞时，凹槽通道的间隙尺寸可以沿凹槽通道(图6A)不同，以适合小尺寸的针1和大尺寸的针1。当使用大尺寸的针1时，沿窄通道的孔的设计(图6B)可以最小化总体积。当孔的底部低于窄通道的底部时，该孔也可以用于细胞培养。因此，结合针1，细胞与培养基的比例可以进一步增加。蛇形排列的凹槽(图6C)可以容纳更多的细胞针，但不会增加基座的长度。

可移动针测定系统1a不仅可以应用于凹槽通道7，还可以应用于其中的容器开口沿管布置的管通道。螺钉和螺母结构用于将针固定到容器开口上，以实现液体密封。管中培养基的循环可以由管式泵驱动。由于管的封闭空间，该针1不必安装成针尖部朝下。由于管周围的所有方向都可以用于安装细胞针1，因此可移动针测定系统1a中的细胞量可以显着增加，并且它可以适应需要高细胞数与体积比的测定。

图8A和图8B描绘了针1和相应的细胞接种装置40。

图9描绘了根据本发明的具有用于接收针1的多个开口103的示例针支架101。该针支架101包括环形部分102连接到圆柱形部分104形成的T形插件101。环形部分102的直径大于圆柱形部分104的直径，环形部分102包括用于接收针1的多个开口103。针支架101的尺寸设置成适应多孔板的孔。

图10描绘了具有插入的针支架101的多孔板110。这种组件是本发明的用于执行基于细胞的测定的功能系统。本发明的使用这种组件的示例性基于细胞的测定包括以下步骤：用细胞培养基填充多孔板的孔，并且在每个孔中添加不同的测试化合物。然后将针支架101放入多孔板110的孔中，并且将针尖部表面6a上带有接种细胞的针1插入开口103中。接种在针尖部表面6a上的细胞与含有测试化合物的细胞培养基接触。针尖部表面6a可以接种相同或不同类型的细胞。将多孔板110放置在培养箱中规定的时间，并且在完成培养之后，分析细胞培养基和/或接种在针尖部表面6a上的细胞。图11显示了图10中所示的多孔组件的仰视图。

图13显示了用于执行基于细胞的测定的装置(1a)的另一个实施例，其集成了可以由磁力混合器驱动的离心泵1311。用于执行基于细胞的测定的装置1a包括基座1301、磁驱动泵1311和针支架1307。该基座1301具有凹槽通道1302、用于接收两个细胞培养插件1312的两个贮液槽1303和用于接收泵1311特别是离心泵叶轮1311的开口1304，它们通过泵入口通道1305和泵出口通道1306连接，从而允许液体(例如细胞培养基)在组装时循环通过这些空腔。针支架1307包括用于细胞培养插件1312开口，用于接收针1的开口1314，以及取样开口1308和泵轴轴承开口1309。螺钉1310用于将基座1301固定到针支架1307上。

使用之前，组装包括针支架1307和基座1301的基于细胞的测定系统1a。基于细胞的测定系统1a的组装包括以下步骤:

1)将基座1301放入培养皿中，

2)将泵叶轮1311放置在泵室1304中，

3)将针支架1307放在基座上，和

4)拧紧螺钉1310，将基座1301固定在针支架1307上。

然后，将细胞培养基填充到组装的基于细胞的测定系统中，将细胞培养插件1312和细胞针1放置到它们的对应位置上，并且用培养皿盖盖住组装的系统。然后将系统放在细胞培养箱中的磁性混合器上。设置合适的混合器转速，叶轮1311会以相应的速度转动，以便驱动培养基以规定的流速流过空腔。取样开口1308可用于添加化合物以及对用于分析的测试培养基取样。由于不同供应商的混合器的旋转方向可能不同，因此在系统中使用双向叶轮，例如无叶片叶轮。

细胞培养插件是可渗透的支架，可作为研究贴壁依赖性和独立细胞系的工具。细胞培养插件包括细胞可以在其上生长的膜。优选的细胞培养插件是

细胞培养插件。

细胞培养插件是方便、无菌，易于使用的可渗透支撑装置，用于研究依赖贴壁和不依赖贴壁的细胞系。

可从细胞培养装置制造商处购得，例如Fisher Scientific或Sigma Aldrich。

在另一个实施例中，该可移动针细胞培养系统1a还可以包括用于细胞培养插件1312a的容器开口。用于该细胞培养插件1312的容器开口优选地位于该贮液槽1303上方。该细胞培养插件1312可用于制备细胞层，并用作化学化合物的屏障。因此，可以执行更复杂的测定来同时研究化学化合物的吸附、代谢和分泌。例如，该组装的系统1a包含贮液槽1303中的肠细胞层插件1312、在另一个细胞层插件1312中的肾细胞层和接种在通道1302中的针1的表面6a上的肝细胞。当测试化合物添加到该肠细胞层插件1312的内室时，肠细胞将吸收该化合物并输送到通道1302。接种在该针1的表面6a上的肝细胞代谢该化合物，然后该肾细胞将化合物排泄到该肠细胞层插件1312的内室中。通过分析该化合物和来自不同隔室的培养基中的代谢产物，可以获得有用的数据。

实例：基于细胞的系统在药物代谢研究中的应用

步骤1：用0.02mg/mL的胶原涂覆针1三个小时，然后在室温下将该针烘干过夜。

步骤2：使用本发明的接种装置以0.8-1million/mL的浓度接种肝细胞，在过夜培养后移除该针1并将该针放置在针支架101中，如图9所示。

步骤3：将具有细胞包被的针1的针支架101倒置放置在含有0.8-0.9mL细胞培养基和测试化合物的12孔细胞培养板中(见图10)。

步骤3：将该12孔细胞培养板放在翘板式摇床上，在细胞培养箱中以10rpm的速度摇动。

步骤4：通过将20μL培养基转移到含有乙腈的板孔中，在指定时间点取样。

步骤5：使用LC-MS/MS分析样品中的药物代谢物。

Claims (42)

1.一种用于基于细胞的测定的装置(1a)的针(1)，所述针包括：

针体(4)和针尖部(6)，所述针体包括针头(4a)，其中所述针尖部(6)包括用于细胞接种的表面(6a)。

2.根据权利要求1所述的针，其中所述针体(4)包括至少一个锥形段，并且所述针体(4)和所述针头(4a)一起形成T形。

3.根据权利要求1所述的针，其中所述针体(4)和所述针尖部(6)具有圆柱形。

4.根据权利要求1所述的针，其中所述针体(4)和所述针尖部(6)具有非圆形横切形状。

5.根据权利要求1-4所述的针，其中所述针头(4a)是包括凹槽(5)的阶梯式针头。

6.根据权利要求1-5所述的针，其中所述表面(6a)选自由以下项组成的组：平坦表面、边缘处具有凸起边缘的平坦表面、向内结构化表面、多凹槽表面、多微孔表面、多微柱表面、(加到说明中)粗糙表面、渗透膜、多孔段或磁性段；优选地，层包括促进细胞粘附的层，更优选地，选自水凝胶的细胞粘附促进层。

7.一种针支架(101)，其包括用于接收根据权利要求1-6所述的针(1)的多个开口(103)，其中所述针支架(101)包括环形部分(102)，所述环形部分连接到圆柱形部分(104)以形成T形的针支架(101)，其中所述环形部分(102)的直径大于所述圆柱形部分(104)的直径，其中所述环形部分(102)包括用于接收所述针(1)的所述多个开口(103)。

8.根据权利要求7所述的针支架(101)，其中所述针支架(101)由塑料制成，所述塑料优选地为聚四氟乙烯、聚苯乙烯、聚酯和聚碳酸酯。

9.根据权利要求7或8所述的针支架(101)，其中所述针支架(101)的尺寸设置成适应多孔板的孔。

10.一种用于执行基于细胞的测定的装置(la)，所述装置包括：

针支架(2,1307)和基座(3,1301)，所述针支架包括用于接收根据权利要求1-6所述的针(1)的多个开口(7a,1314)，所述基座包括凹槽通道(7,1302)。

11.根据权利要求10所述的用于执行基于细胞的测定的装置(la)，其中所述针支架(2,1307)和所述基座(3,1301)具有匹配的形状，并且用于接收针(1)的所述开口(7a,1314)被布置成使得所述开口与所述基座(3,1301)的所述凹槽通道(7,1302)对准。

12.根据权利要求11所述的用于执行基于细胞的测定的装置(la)，其中所述针支架(1307)还包括用于接收细胞培养插件(1312)的开口(1312a)，并且所述基座(1301)还包括用于接收液体的贮液槽(1303)，其中所述贮液槽(1303)设置在所述基座(1301)内，使得所述贮液槽与所述针支架(1307)的用于接收所述细胞培养插件(1312)的所述开口(1312a)对准。

13.根据权利要求10-12所述的用于执行基于细胞的测定的装置(la)，其中所述装置(1a)还包括泵(1311)，所述泵与所述贮液槽(1303)、所述凹槽通道(1302)和所述细胞培养插件(1312)流体连接。

14.根据权利要求10-13所述的用于执行基于细胞的测定的装置(la)，其中所述针支架(1307)包括：

用于接收针(1)的多个开口(1314)，

用于接收至少两个细胞培养插件(1312)的至少两个开口(1312a)，和

用于接收所述泵(1313)的叶轮轴的至少一个开口(1309)；

并且所述基座(3,1301)包括：

用于接收液体，特别是细胞培养基的至少两个贮液槽(1303)，

用于接收所述泵(1311)，特别是泵叶轮(1311)的至少一个开口(1304)，

入口通道(1305)，

出口通道(1306)，

其中所述泵(1313)的所述入口通道(1305)和所述出口通道(1306)连接到所述贮液槽(1303)和所述凹槽通道(1302)。

15.根据权利要求10所述的用于执行基于细胞的测定的装置(la)，所述装置包括：

包括用于接收根据权利要求1-6所述的针(1)的多个开口(7a)的针支架(2)、包括凹槽通道(7)和贮液槽(8)的基座(3)，其中所述凹槽通道(7)的尺寸设置成接收固定在所述针支架(2)的所述开口(7a)中的所述针(1)的所述针尖部(6)，其中所述凹槽通道(7)连接至所述贮液槽(8)。

16.根据权利要求15所述的用于执行基于细胞的测定的装置(la)，其中所述针支架(2)和所述基座(3)是所述装置的可分离部件。

17.根据权利要求15所述的用于执行基于细胞的测定的装置(la)，其中所述针支架(2)和所述基座(3)集成为单个部件。

18.根据权利要求15-17所述的用于执行基于细胞的测定的装置(la)，其中所述基座(2)包括多于一个的凹槽通道(7)。

19.根据权利要求15-18所述的用于执行基于细胞的测定的装置(la)，其中所述凹槽通道(7)具有包括上部部分(11)、阶梯(10)和下部部分(9)的阶梯形状，其中所述上部部分(11)的尺寸大于所述下部部分(9)的尺寸。

20.根据权利要求15-19所述的用于执行基于细胞的测定的装置(la)，其中所述凹槽通道(7)在所述基座(3)中呈直线或圆形布置。

21.根据权利要求15-20所述的用于执行基于细胞的测定的装置(la)，其中所述贮液槽(8)包含液体。

22.根据权利要求15-21所述的用于执行基于细胞的测定的装置(la)，其中所述针支架(2)、所述针(1)和所述基座(3)由塑料制成，所述塑料优选地为聚苯乙烯、聚酯和聚碳酸酯。

23.一种用于在如权利要求1-6所定义的针(1)的针表面(6a)上接种细胞的细胞接种装置(40)，所述细胞接种装置包括：

组装时形成多个漏斗形空腔(44)的第一部分(41)和第二部分(43)，其中所述漏斗形空腔(44)包括具有开口的上空腔部分(44a)和具有开口的下空腔部分(44b)，其中所述漏斗形空腔(44)的所述下空腔部分(44b)的尺寸设置成接收所述针(1)的所述针尖部(6)。

24.根据权利要求23所述的细胞接种装置(40)，其中所述漏斗形空腔(44)排列成矩阵。

25.根据权利要求23或24所述的细胞接种装置(40)，其中所述矩阵是8漏斗、12漏斗、16漏斗、24漏斗、96漏斗格式。

26.根据权利要求23-25所述的细胞接种装置(40)，其中所述漏斗形空腔的所述下空腔部分(44b)和插入的所述针(1)的针尖部(6)形成液体密封。

27.根据权利要求23-26所述的细胞接种装置(40)，其中所述细胞接种装置(40)由塑料制成，所述塑料优选地为聚丙烯、橡胶、聚苯乙烯、聚酯和聚碳酸酯。

28.根据权利要求23所述的细胞接种装置(40)，其中所述漏斗形空腔(44)形成为单件。

29.根据权利要求23-28所述的细胞接种装置(40)，其中所述细胞接种装置(40)包括处于所述上空腔部分(44a)中的可拆卸变径套筒(470)，其中所述套筒(470)包括两个端部均具有开口的腔室，并且所述套筒的靠近所述下空腔部分(44b)的端部具有尺寸小于所述针尖部1的直径的开口(47)。

30.根据权利要求23-29所述的细胞接种装置(40)，其中所述套筒的靠近所述下空腔部分(44b)的所述端部包含多个微开口(48)。

31.根据权利要求30所述的细胞接种装置(40)，其中所述套筒(470)包含分隔器(49)以在所述套筒内部形成多个腔室，其中每个腔室在所述套筒的靠近所述下空腔部分(44b)的所述端部包含至少一个微开口(48)。

32.根据权利要求30所述的细胞接种装置(40)，其中所述上空腔部分(44a)具有与所述下空腔部分(44b)相同的直径。

33.根据权利要求30所述的细胞接种装置(40)，其中所述变径套筒(470)放置到所述细胞接种装置(40)的上空腔部分(44a)中，用于允许细胞以设计的形状或图案附着到所述针尖部6。

34.一种用于执行基于细胞的测定的套件，所述套件包括：

多个如权利要求1-6所定义的针(1)，

至少一个如权利要求6-22所定义的用于执行基于细胞的测定的装置(1a),

至少一个如权利要求23-33所定义的细胞接种装置(40)，和

用于执行所述基于细胞的测定和细胞接种的手册。

35.根据权利要求34所述的用于执行基于细胞的测定的套件，所述套件进一步包括用于执行所述基于细胞的测定的试剂。

36.一种用于执行基于细胞的测定的方法，所述方法包括：

a)通过将细胞附着到针表面(6a)并培养所述细胞以在所述针表面(6a)上形成二维单层细胞或三维结构化细胞来制备针(1)，

b)通过以下来制备测定装置(1a)：用测试培养基填充基座(3,1301)的贮液槽(8,1303)，组装针支架(2,1307)和基座(3,1301)，并将细胞针(1)插入所述针支架(2,1314)的开口中以固定所述针(1)，从而将所述针表面(6a)浸入所述测试培养基中，以及

c)将所述细胞在所述测试培养基中培养规定的时间，其中所述测试培养基在凹槽通道(7,1302)中流动，以及分析所述测试培养基中的物质和/或所述细胞针(1)中的每个细胞针上的所述细胞。

37.根据权利要求36所述的方法，其中所述细胞在所述针表面(6a)的最外表面被水凝胶薄层覆盖以防止细胞分离。

38.根据权利要求36或37所述的方法，其中所述细胞针(1)由一组靶细胞制备，其中所述细胞针(1)中的每个细胞针包含一种类型的以二维或三维形式培养的靶细胞。

39.一种用于在针(1)的针表面(6a)上接种细胞的方法，所述方法包括：

a)将如权利要求1-6所定义的针(1)插入如权利要求23-33所定义的细胞接种装置(40)的所述下空腔部分(44b)的所述开口中，以形成液体密封，

b)将细胞悬液吸取到所述细胞接种装置(40)的所述上空腔部分(44a)的每个开口中，并将所述细胞培养规定的时间以允许所述细胞粘附到所述针表面(6a)，以及

c)拆卸所述装置并将所述针(1)转移到如在权利要求36-38中所定义的用于执行基于细胞的测定的装置(1a)。

40.根据权利要求39所述的用于在针(1)的针表面(6a)上接种细胞的方法，其中所述针(1)沿着所述下空腔部分(44b)移动以将液体吸入到至少所述下空腔部分(44b)中。

41.根据权利要求39或40所述的用于在针(1)的针表面(6a)上接种细胞的方法，其中在所述细胞附着到所述针尖之后，拆除所述套筒(470)，并且将第二类型的细胞添加到所述上空腔部分(44a)中，并培养所述细胞以形成由所述第二类型的细胞构成的顶部细胞层。

42.根据权利要求39-41所述的用于在针(1)的针表面(6a)上接种细胞的方法，其中在步骤a)之前，所述针尖部6包含一层细胞。

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