CN115340983A - 一种将干细胞诱导为中脑多巴胺能神经元前体细胞的诱导培养液及其应用、诱导方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物医药技术领域，特别是涉及一种将干细胞诱导为中脑多巴胺能神经元前体细胞的诱导培养液及其应用、诱导方法，所述诱导培养液包括：嘌吗啡胺、非必需氨基酸、B27、腺苷‑3',5'‑环化一磷酸、抗坏血酸、生长因子、神经营养因子。本发明解决现有技术中干细胞分化成多巴胺能神经元或其前体细胞诱导所需时间较长的问题。上述诱导培养液使脂肪干细胞分化为多巴胺能神经元前体细胞所需时长比用胚胎干细胞/诱导多能干细胞的时长短，即大大缩短了诱导周期。采用上述诱导培养液所诱导分化的多巴胺能神经元前体细胞存活率高，诱导7天即可检测到酪氨酸羟化酶表达阳性细胞。

Description

一种将干细胞诱导为中脑多巴胺能神经元前体细胞的诱导培 养液及其应用、诱导方法
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，特别是涉及一种将干细胞诱导为中脑多巴胺能神经元前体细胞的诱导培养液及其应用、诱导方法。
背景技术
帕金森病(Parkinson's Disease，PD)是一种神经退行性病变，由中脑多巴胺能神经元的逐渐丧失引起。导致中脑多巴胺能神经元异常死亡的原因尚无明确定论，但是帕金森病是遗传和环境因素相互作用的结果。此外，目前还没有减缓多巴胺能神经元退化过程的有效治疗方法。但是帕金森综合症涉及的病变部位明确，因此干细胞治疗具有良好的靶向策略优势。干细胞治疗临床各种疾病特别是对再生能力有限的神经系统的退行性神经疾病拥有广阔的应用前景。
自20世纪80年代末首次开展利用胎儿中脑组织替代疾病中丢失的多巴胺能神经元的临床试验以来，全世界已有数百名患者接受了胎儿组织移植，其中一些患者已显示出长期的移植存活，临床效果良好，几十年来与多巴胺的生理释放相结合。自人类胚胎干细胞(hESCs)分化移植应用于治疗帕金森综合征之后，细胞移植开始成为一种新的治疗思路。随后其他不同来源的干细胞，例如诱导多能干细胞、间充质干细胞等也成为帕金森综合征治疗的备选种子细胞，而其中脂肪间充质干细胞对于帕金森氏症的治疗作用值得深一步研究。
在各类干细胞中，脂肪间充质干细胞(Adipose-derived Stem cells，ADSCs)具有低免疫源性和抑制免疫作用，具有作为种子细胞的优势，但其在帕金森综合征治疗中的应用尚待探索。相较于其他种类的干细胞，其中胚胎干细胞(Embryonic Stem Cells，ESCs)增殖、分化能力出众，但ESCs涉及到伦理、免疫排斥、致瘤性等问题；诱导性多能干细胞(Induced Pluripotent Stem Cells，iPSCs)克服了伦理问题，避开了免疫排斥，在疾病模型和新药筛选方面表现出了强大的功能，但其致瘤性和生物安全性依然阻碍临床应用。ADSCs因为取材方便、对病人危害小、体外分离扩增容易且培养过程中老化率低、免疫原性低且具免疫正调节功能、无致瘤性等优点成为非常有希望的临床移植用种子细胞。当前已有的研究证明，ADSCs具有多向分化潜能，能够向包括神经细胞、软骨细胞、成骨细胞、胰岛素分泌细胞、心肌细胞等功能细胞分化，这些研究均证明了ADSCs在治疗退行性或损伤性疾病方面的应用价值和优势。
在现有技术中，中国专利CN104379732B提供了由人多能干细胞衍生神经干细胞和多巴胺能神经元，基于化学上定义的由人多能干细胞(hPSC)生成神经干细胞(NSC)和多巴胺能(DA)神经元的方法。该发明用检测点激酶1(CK1)抑制剂和骨形态发生蛋白(BMP)抑制剂处理人多能干细胞(hPSC)产生神经干细胞，然后多巴胺能神经元相关诱导化合物诱导，可选诱导化合物为高奎宁酸、L-半胱亚磺酸、犬尿喹啉酸、(R)-(+)-HA-966、间氯苯基双胍盐酸盐、钙蛋白酶抑制剂、Dimaprit二盐酸盐、8-羟基-DPAT-氢溴酸盐等。
中国专利CN103865956B提供一种利用重组慢病毒诱导神经干细胞向多巴胺能神经元分化的方法，包括重组慢病毒载体构建(目的基因TH和Brn4的慢病毒载体)；神经干细胞的分离、培养及鉴定；重组病毒转染NSCs；重组慢病毒转染NSCs的鉴定。分化后产生高比例的TH阳性多巴胺能神经元；Brn4能促进神经营养因子的高表达，且具有抑制细胞凋亡的功能。
中国专利CN104789531B提供一种将脐带间充质干细胞诱导分化成多巴胺能神经元的方法，该方法采用预诱导和诱导二步结合法。第一种诱导培养基：添加5-氮胞苷和三酰叠氮脂蛋白，第二种诱导培养基：添加碱性成纤维细胞生长因子和Noggin蛋白，第三种诱导培养基：添加碱性成纤维细胞生长因子、维甲酸、成纤维细胞生长因子8和Wnt3a蛋白，第四种诱导培养基：添加骨成形蛋白4、Shh蛋白、维甲酸、神经生长因子和脑源性神经营养因子。
中国专利CN104031882B提供一种人神经干细胞体外定向诱导分化为多巴胺能神经元的方法，包括：步骤1、人神经干细胞的贴壁培养：用无血清培养基将人神经干细胞按照5×104/mL的浓度制成细胞悬液，接种至层粘连蛋白(Laminin，LN，)包被的培养器皿中，35℃培养箱中静置培养24-48小时；步骤2：多巴胺能神经元前体细胞的诱导：换用多巴胺能神经元前体细胞诱导液，此诱导液由无血清培养基添加细胞因子SHH、FGF8b、CHIR99021组成，35℃培养箱中静置培养7-10天，每3天换液；步骤3：多巴胺能神经元细胞的定向诱导：换用多巴胺能神经元细胞定向诱导液，此诱导液由神经细胞培养基Neurobasal Medium添加B27、BDNF、GDNF、TGFβ3、ascorbic acid、cAMP、forskolin组成；35℃培养箱中静置培养14-20天，每3天换液；收获细胞后即得到多巴胺能神经元。上述步骤1、2中细胞的无血清培养基的配方可以为DMEM/F12、B27(1∶50)、N2(1∶50)、bFGF(20ng/mL，)与EGF(20ng/mL)。
中国专利CN101029302B提供一种用于治疗帕金森病的多巴胺能神经元和具有增殖能力的前体细胞，胚状体(EB)在纤连细胞包被的平板上铺板。胚状体粘着到平板上，并且细胞开始迁移到塑料上，形成单细胞层。EB通过在1mg/mL的胶原酶中培养(37℃，5-20分钟)传代32次时从H7细胞系的融合hES细胞产生，刮削培养皿，并将细胞放入非-粘着培养平板中获得的EB培养于含有FBS和10μM的视黄酸的培养基中的悬浮液中。4天后，收集聚集体并使之沉淀于离心管中。然后吸出上清液，并且聚集体在增殖培养基中(添加1：100N2的DMEM/F12，1：50的B27，10ng/mL的EGF，10ng/mL的bFGF，1ng/mL的PDGF-AA，和1ng/mL的IGF的聚L-赖氨酸和纤连蛋白包被的平板上铺板。使EB附着并增殖3天；然后通过胰蛋白酶消化约1min收集并以1.5×105个细胞/孔的密度铺板于增殖培养基中的聚L-赖氨酸和层粘连蛋白包被的4-孔分室玻片上1天。然后将培养基改为Neural Basal培养基，该培养基添加了B27，以及下面的生长混合物之一：10ng/mL bFGF，10ng/mL BDNF，和10ng/mL NT-3，5000ng/mL的SHH，和100ng/mL的FGF8b。细胞保存于这些条件下6天，隔天换液。在第7天，培养基改为具有B27的NeuralBasal培养基，添加：10ng/mL的BDNF，10ng/ml NT-3，1μM cAMP，200μM的AA，1μMcAMP，隔天换液直到第12天。
有关将干细胞作为治疗手段的临床前研究，最早集中在胚胎干细胞上，之后随着骨髓移植、诱导多能干细胞技术的出现，可被考虑作为种子细胞的干细胞种类逐渐增多。当前诱导分化相关技术中，胚胎干细胞/诱导多能干细胞是分化潜能最高的细胞，但是存在诸多问题，例如难以获取、存在成瘤风险等；且即使不考虑这些因素，胚胎干细胞/诱导多能干细胞的培养条件苛刻、诱导所需时间较长，多需要经过拟胚体阶段。这些都限制了它们作为种子细胞的应用范围和发展前景，因此有关成体干细胞定向分化的研究势在必行。在种类众多的自体成体干细胞中，有些细胞的获取过程较为麻烦且痛苦，例如骨髓间充质干细胞。
在现有技术中，几乎没有采用脂肪干细胞分化为多巴胺能神经元前体细胞的技术方案，采用其他干细胞分化成多巴胺能神经元前体细胞又存在培养条件苛刻、诱导所需时间较长等问题。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供将干细胞诱导为中脑多巴胺能神经元前体细胞的，用于解决现有技术中干细胞分化成多巴胺能神经元或其前体细胞诱导所需时间较长的问题，同时，本发明还将提供一种脂肪干细胞定向诱导分化为多巴胺能神经元前体细胞的方法；此外，本发明还将提供诱导培养液在脂肪干细胞定向诱导分化为多巴胺能神经元前体细胞上的应用。上述诱导培养液使得脂肪干细胞分化为多巴胺能神经元前体细胞所需时长比起胚胎干细胞/诱导多能干细胞的时长短，即大大缩短了诱导周期。采用上述诱导培养液所诱导分化的多巴胺能神经元前体细胞存活率高，诱导7天即可检测到酪氨酸羟化酶(TH)表达阳性细胞。
为实现上述目的及其他相关目的，
本发明的第一方面，提供一种将干细胞诱导为中脑多巴胺能神经元前体细胞的诱导培养液，所述诱导培养液包括：
Figure BDA0003063846380000041
上述诱导培养液使得脂肪干细胞分化为多巴胺能神经元前体细胞所需时长比起胚胎干细胞/诱导多能干细胞的时长短，即大大缩短了诱导周期。采用上述诱导培养液所诱导分化的多巴胺能神经元前体细胞存活率高，诱导7天即可检测到酪氨酸羟化酶(TH)表达阳性细胞。
非必需氨基酸是细胞体外培养时的一种常见补充剂，以增加细胞生长和生存能力。是一种混合物而非单一氨基酸，其成分包括：甘氨酸，L-丙氨酸，L-天冬酰胺，L-天冬氨酸，L-谷氨酸，L-脯氨酸，L-丝氨酸。M是mol/L的简写，μM也就是10-6mol/L。
上述将干细胞诱导为中脑多巴胺能神经元前体细胞的诱导培养液可简称为mDA诱导培养液。
于本发明的一实施例中，所述生长因子包括碱性成纤维细胞生长因子和成纤维细胞生长因子8b；
所述神经营养因子包括神经生长因子和神经营养因子3；
所述诱导培养液的基础培养基为神经元基础培养基；
所述诱导培养液包括：
Figure BDA0003063846380000042
Figure BDA0003063846380000051
神经细胞基础培养基(Neurobasal medium)：是一种基础培养基，设计用于纯产前和胚胎神经元细胞群的长期维持和成熟，在与B-27补充剂配合使用时无需星形胶质细胞滋养层。Neurobasal培养基适用于大多数神经元细胞应用。
嘌吗啡胺(Purmorphamine)：上调SHH信号通路促进神经干细胞分化，即引起SHH信号通路、背-腹轴通路、运动神经元和少突胶质细胞发育中相关基因的变化。
非必需氨基酸(NEAA，non-essential amino acid)：用作细胞培养基的补充剂，以增加细胞生长和生存能力。
B27：维持神经元生存和成熟。提高神经元存活率；改善神经突生长；改善电生理活性和成熟度。
胰岛素(Insulin)：胰岛素-胰岛素受体对于大脑发育、神经元间信号传导具有重要作用。有研究表明，胰岛素作用下的神经干细胞增殖能力强,且神经元分化率较高。
腺苷-3',5'-环化一磷酸(cAMP，cyclic adenosine monophosphate,环磷酸腺苷)：对离体细胞具有抑制细胞分裂、促进分化的作用，因此凡能使细胞内环磷酸腺苷含量升高的因素均能降低细胞的生长速度，抑制细胞的增殖，而促进细胞的分化。
抗坏血酸(Ascorbic acid)：由于培养的细胞持续处于氧化应激下，抗坏血酸已经成为干细胞身份/行为的关键调节剂，影响多能性、自我更新和分化。抗坏血酸维持细胞内的氧化还原平衡，降低活性氧。
重组人碱性成纤维细胞生长因子(bFGF，称为碱性FGF、bFGF、FGF 2、FGF-β)，是一种适用于细胞培养应用的生物活性蛋白质。bFGF可用于血管发生、成纤维细胞有丝分裂、PC-12细胞的轴突生长、受体结合以及酪氨酸磷酸化等，也应用于维持干细胞活性，与诱导添加剂使用可促进分化。
成纤维细胞生长因子8b(FGF8b)：在中脑发育中至关重要，因此可以使诱导干细胞向中脑多巴胺能神经元分化。
神经生长因子(NGF)：具有神经元营养和促突触生长的双重生物学功能。它对中枢及周围神经元的发育、分化、生长、再生和功能特性的表达均具有重要的调控作用。
神经营养因子3(NT3)：可以干预抑制因子作用的信号传导过程，可以促进中枢神经的再生。
于本发明的一实施例中，所述诱导培养液包括：
Figure BDA0003063846380000061
本发明的第二方面，提供一种将干细胞诱导为中脑多巴胺能神经元前体细胞的诱导培养液，所述诱导培养液包括：
Figure BDA0003063846380000062
音猬因子(SHH，sonic hedgehog)在发育中起着重要作用。其相关通路在中枢神经系统发育中提供形态发生诱导信号，诱导小脑及其他组织中神经元前体细胞的增殖，即促进干细胞向神经方向分化。
于本发明的一实施例中，所述生长因子包括碱性成纤维细胞生长因子和成纤维细胞生长因子8b；
所述神经营养因子包括神经生长因子和神经营养因子3；
所述诱导培养液的基础培养基为神经元基础培养基；
所述诱导培养液包括：
Figure BDA0003063846380000063
Figure BDA0003063846380000071
于本发明的一实施例中，所述诱导培养液包括：
Figure BDA0003063846380000072
本发明的第三方面，提供一种脂肪干细胞定向诱导分化为多巴胺能神经元前体细胞的方法，包括如下步骤：
步骤一、对人源脂肪干细胞的分离和后续扩增培养；
步骤二、选取正常培养的第3～5代的人源脂肪干细胞，进行铺板培养过夜后，将扩增培养基更换为上述诱导培养液，每40～60h换一次液，进行诱导5～10天，即可。
上述诱导培养液使得脂肪干细胞分化为多巴胺能神经元前体细胞所需时长比起胚胎干细胞/诱导多能干细胞的时长短，且所需操作条件简易。换言之，在大大缩短了诱导周期的同时，也使得整个诱导培养技术更容易推广。上述方法所诱导分化的多巴胺能神经元前体细胞存活率高，诱导7天即可检测到酪氨酸羟化酶(TH)表达阳性细胞。
于本发明的一实施例中，所述步骤一中采用I型胶原酶和胰蛋白酶消化方法进行人源脂肪干细胞的分离和后续扩增培养。
于本发明的一实施例中，所述步骤二中换液间隔时间为48h，诱导时间为7天。
如上所述，本发明的一种将干细胞诱导为中脑多巴胺能神经元前体细胞的诱导培养液及其应用、诱导方法，具有以下有益效果：上述诱导培养液使得脂肪干细胞分化为多巴胺能神经元前体细胞的诱导时间短且效率高，仅需7天即可使细胞表达多巴胺能神经元相关标记物；诱导方法简便，不需要经过拟胚体等阶段，诱导过程仅需一种诱导液，不需要转入基因等复杂手段；此外，人源脂肪干细胞获取容易，且所有人都可以实现自体细胞提取。综合以上优点，脂肪干细胞定向诱导分化为多巴胺能神经细胞有利于后续临床推广。
附图说明
图1为步骤一中人源脂肪干细胞的表征。
图2为CD表面标记阳性表达率统计结果。
图3为人源脂肪干细胞向脂肪细胞的分化的鉴定。
图4为人源脂肪干细胞向成骨细胞的分化的鉴定。
图5为人源脂肪干细胞向软骨细胞的分化的鉴定。
图6人源脂肪干细胞系分化的阳性率统计结果。
图7为人源脂肪干细胞向多巴胺能神经元诱导过程中的细胞形态变化。
图8利用多巴胺能神经元相关标记物酪氨酸羟化酶染色鉴定人源脂肪干细胞分化的多巴胺能神经元的成熟过程。
图9利用多巴胺能神经元相关标记物多巴胺转运体-1染色鉴定人源脂肪干细胞分化的多巴胺能神经元的成熟过程。
图10利用多巴胺能神经元相关标记物微管相关蛋白-2染色鉴定人源脂肪干细胞分化的多巴胺能神经元的成熟过程。
图11为实施例1诱导7天后各标记物的阳性率。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效。
实施例1
一种脂肪干细胞定向诱导分化为多巴胺能神经元前体细胞的方法，包括如下步骤：
步骤一、分离、培养人源脂肪干细胞：采用I型胶原酶和胰蛋白酶消化方法进行人源脂肪干细胞的分离和后续扩增培养，并应用流式细胞仪及细胞免疫组化方法检测人源脂肪干细胞的特性，检测结果如图1～6。图1表明，所提取的人源脂肪干细胞呈梭状，网格式生长，表达间充质干细胞的表面标记蛋白CD73、CD44、CD105，不表达血液干细胞标记蛋白CD45，也不表达血管内皮细胞的前体细胞标记蛋白CD34、CD133。图2为CD表面标记阳性表达率统计结果。图3～5表明人源脂肪干细胞三系分化，图3为向脂肪的分化的鉴定(油红O，英文名称为Oil Red O，CAS号为1320-06-5，分子式为C26H24N4O，显微技术中用作脂肪染色剂)，图4为向成骨的分化的鉴定(茜素胭脂红，英文名称为Alizarin red，CAS号为
130-22-3，分子式为C14H7NaO7S·H2O)，图5为向软骨细胞的分化的鉴定(阿辛兰，英文名alcian blue)，图6为hADSCs(人源脂肪干细胞)三系分化的阳性率统计结果。
步骤二、mDA诱导培养液配方成分、比例及使用注意事项：mDA诱导培养液是以Neurobasal medium(神经元基础培养基，来源为Gibco，货号21103049)作为基础培养基，在基础培养基内加入Purmorphamine(嘌吗啡胺，来源为Sigma，货号SML0868)、NEAA(非必需氨基酸，来源为Gibco，货号11140)、B27(来源为Gibco，货号12587-010)、insulin(胰岛素，来源为Sigma，货号I2643)、cAMP(腺苷-3',5'-环化一磷酸，又称环磷酸腺苷、环化腺核苷一磷酸、环腺一磷，来源为Sigma，货号D-0260)、Ascorbic acid(抗坏血酸，来源为Sigma，货号A-4403)、生长因子和神经营养因子；生长因子由bFGF(碱性成纤维细胞生长因子，来源为STEMCELL TECHNOLOGY，货号78134)和FGF8b(成纤维细胞生长因子8b，来源为STEMCELLTECHNOLOGY，货号78008)组成；神经营养因子由NGF(神经生长因子，来源为Novoprotein，货号C060)和NT3(神经营养因子3，来源为Novoprotein，货号C079)。具体如表格1所示：
表格1
Figure BDA0003063846380000091
Figure BDA0003063846380000101
注：每次使用的诱导液需要现用现配。
步骤三、诱导处理：选取正常培养的第3～5代的人源脂肪干细胞，进行铺板培养过夜后，将正常扩增培养基(90％DMEM/F12，10％FBS，10ng/ml bFGF)移除并用生理盐水或磷酸缓冲液清洗3次，再换为上述诱导培养液，48h换一次液，进行诱导7天，7天后即可进行指标检测。
将诱导后的细胞进行检测：
1、细胞形态：诱导期间细胞形态变化检测结果如图7，细胞形态发生较为明显的变化，包括但不限于：细胞形态逐渐呈神经元样、弯曲弧度增大、原本呈长梭状细胞两端变细、胞体变大变圆，之后细胞形态变化逐渐趋于稳定，呈细长梭状。
2、细胞标记物表达：利用细胞免疫染色鉴定hADSCs分化的多巴胺能神经元的成熟过程，检测结果如图8～10，荧光染料DAPI即4',6-二脒基-2-苯基吲哚，多巴胺能神经元相关标记物酪氨酸羟化酶(Tyrosine hydroxylase，TH)的染色结果如图8，多巴胺转运体(Dopamine Transporter，DAT1)的染色结果如图9，微管相关蛋白(Microtubule-associated protein 2，MAP2)的染色结果如图10。根据免疫荧光检测结果，这几种标记物在诱导后的细胞中呈高表达阳性。上述方法诱导7天后各种多巴胺能神经元相关标记物的阳性率如图11所示。从图8～11可知，经过诱导后的人源脂肪干细胞已经可以表达多巴胺能神经元相关标记物。
实施例2
比较目前现有专利和文献中不同来源细胞向多巴胺能神经元或其前体细胞诱导的分化时间和分化率，如表2所示：
表格2类似方法诱导时长比较
Figure BDA0003063846380000102
Figure BDA0003063846380000111
从表格2中可以看出，本申请的诱导时长短，但是其分化率高。其他的技术方案如果分化率高，则所需时间长、操作较为复杂；如果所需诱导时间短，则存在分化率低的问题。
综上所述，本发明的诱导培养液使得脂肪干细胞分化为多巴胺能神经元前体细胞所需时长比起胚胎干细胞/诱导多能干细胞的时长短，且所需操作条件简易。换言之，在大大缩短了诱导周期的同时，也使得整个诱导培养技术更容易推广。上述方法所诱导分化的多巴胺能神经元前体细胞存活率高，诱导7天即可检测到酪氨酸羟化酶(TH)表达阳性细胞。所以，本发明有效克服了现有技术中的种种缺点而具高度产业利用价值。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

Claims (10)

1.一种将干细胞诱导为中脑多巴胺能神经元前体细胞的诱导培养液，其特征在于，所述诱导培养液包括：
Figure FDA0003063846370000011
2.根据权利要求1所述的一种将干细胞诱导为中脑多巴胺能神经元前体细胞的诱导培养液，其特征在于：
所述生长因子包括碱性成纤维细胞生长因子和成纤维细胞生长因子8b；
所述神经营养因子包括神经生长因子和神经营养因子3；
所述诱导培养液的基础培养基为神经元基础培养基；
所述诱导培养液包括：
Figure FDA0003063846370000012
3.根据权利要求2所述的一种将干细胞诱导为中脑多巴胺能神经元前体细胞的诱导培养液，其特征在于：所述诱导培养液包括：
Figure FDA0003063846370000013
Figure FDA0003063846370000021
4.一种将干细胞诱导为中脑多巴胺能神经元前体细胞的诱导培养液，其特征在于，所述诱导培养液包括：
Figure FDA0003063846370000022
5.根据权利要求4所述的一种将干细胞诱导为中脑多巴胺能神经元前体细胞的诱导培养液，其特征在于：
所述生长因子包括碱性成纤维细胞生长因子和成纤维细胞生长因子8b；
所述神经营养因子包括神经生长因子和神经营养因子3；
所述诱导培养液的基础培养基为神经元基础培养基；
所述诱导培养液包括：
Figure FDA0003063846370000023
Figure FDA0003063846370000031
6.根据权利要求5所述的一种将干细胞诱导为中脑多巴胺能神经元前体细胞的诱导培养液，其特征在于，所述诱导培养液包括：
Figure FDA0003063846370000032
7.权利要求1-6任一项所述的诱导培养液在脂肪干细胞定向诱导分化为多巴胺能神经元或其前体细胞方面的应用。
8.一种脂肪干细胞定向诱导分化为多巴胺能神经元前体细胞的方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一、对人源脂肪干细胞的分离和后续扩增培养；
步骤二、选取正常培养的第3～5代的人源脂肪干细胞，进行铺板培养过夜后，将扩增培养基更换为权利要求1～6任一项所述的诱导培养液，每40～60h换一次液，进行诱导6～8天，即可。
9.根据权利要求8所述的一种脂肪干细胞定向诱导分化为多巴胺能神经元前体细胞的方法，其特征在于：所述步骤一中采用I型胶原酶和胰蛋白酶消化方法进行人源脂肪干细胞的分离和后续扩增培养。
10.根据权利要求8所述的一种脂肪干细胞定向诱导分化为多巴胺能神经元前体细胞的方法，其特征在于：所述步骤二中换液间隔时间为48h，诱导时间为7天。
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