CN115327102B - 一种生物素化的抗谷氨酸脱羧酶抗原保存液及其制备方法 - Google Patents
一种生物素化的抗谷氨酸脱羧酶抗原保存液及其制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供一种生物素化的抗谷氨酸脱羧酶抗原保存液及其制备方法。本发明的生物素化的抗谷氨酸脱羧酶抗原保存液的pH值为7~7.5，其原料组分包括4‑羟乙基哌嗪乙磺酸、氯化钠、有机分散剂、非离子表面活性剂、海藻糖、磷酸吡哆醛、牛血清蛋白、叠氮钠和蛋白酶抑制剂。本发明通过优化抗原保存液组分，使得制备的抗原保存液在用于生物素标记的抗谷氨酸脱羧酶抗原的保存时，在2℃‑8℃条件下，生物素标记的抗谷氨酸脱羧酶抗原的保存期限大大延长。
Description
技术领域
本发明具体涉及一种生物素化的抗谷氨酸脱羧酶抗原保存液及其制备方法。
背景技术
谷氨酸脱羧酶(GAD)是将谷氨酸转化成抑制性神经递质γ-氨基丁酸(GABA)的限速酶，在胰岛β细胞中存在。抗谷氨酸脱羧酶抗体(GADA)是1型糖尿病的标志性抗体，可用于缓进型或隐匿型1型糖尿病的诊断和鉴别诊断，还适用于成年人迟发性自身免疫性糖尿病诊断。
目前，在抗谷氨酸脱羧酶抗体检测中，作为重要试剂成分的生物素化的抗谷氨酸脱羧酶抗原（即生物素标记的抗谷氨酸脱羧酶抗原）难以得到稳定保存，随着保存时间延长，生物素化的抗谷氨酸脱羧酶抗原的检测结果偏差越来越大。目前市面上还未见用于生物素化的抗谷氨酸脱羧酶抗原保存液，常见的产品为未生物素化的抗谷氨酸脱羧酶抗原保存液，但保存期限也比较短，通常在2℃-8℃条件下的保存期限最多2~3个月，如何采用有效的手段延长在2℃-8℃条件下的生物素化的抗谷氨酸脱羧酶抗原的保存期限是目前急需解决的问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种能够长期稳定保存生物素化的抗谷氨酸脱羧酶抗原保存液。
为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
一种生物素化的抗谷氨酸脱羧酶抗原保存液，所述的生物素化的抗谷氨酸脱羧酶抗原保存液的pH值为7~7.5，其原料组分包括4-羟乙基哌嗪乙磺酸、氯化钠、有机分散剂、非离子表面活性剂、海藻糖、磷酸吡哆醛、牛血清蛋白、叠氮钠和蛋白酶抑制剂。
优选地，所述的磷酸吡哆醛在所述的生物素化的抗谷氨酸脱羧酶抗原保存液中的浓度为0.01mmol/L~0.02mmol/L。
优选地，所述的非离子表面活性剂为聚乙二醇辛基苯基醚，又名曲拉通 X-100（Triton X-100）。
优选地，所述的非离子表面活性剂占所述的生物素化的抗谷氨酸脱羧酶抗原保存液的总质量的0.1%~0.2%。
优选地，所述的有机分散剂包括甘油和山梨醇。
优选地，所述的有机分散剂占所述的生物素化的抗谷氨酸脱羧酶抗原保存液的总质量的20%~35%。
进一步优选地，所述的甘油和所述的山梨醇的质量之比为（2~3.5）：1。
再进一步优选地，所述的甘油和所述的山梨醇的质量之比为（2~3）：1。
优选地，所述的4-羟乙基哌嗪乙磺酸以酸或HEPES缓冲液的形式进行投料，所述的4-羟乙基哌嗪乙磺酸在所述的生物素化的抗谷氨酸脱羧酶抗原保存液中的浓度为15mmol/L~20mmol/L，例如15mmol/L、16mmol/L、17mmol/L、18mmol/L、19mmol/L、20mmol/L。
优选地，所述的海藻糖占所述的生物素化的抗谷氨酸脱羧酶抗原保存液的总质量的10%~20%，例如10%、12%、14%、16%、18%或20%。
优选地，所述的氯化钠在所述的生物素化的抗谷氨酸脱羧酶抗原保存液中的浓度为200mmol/L~300mmol/L，例如200mmol/L、220mmol/L、240mmol/L、260mmol/L、280mmol/L、300mmol/L。
优选地，所述的牛血清蛋白占所述的生物素化的抗谷氨酸脱羧酶抗原保存液的总质量的0.1%~0.3%，例如0.1%、0.15%、0.2%、0.25%、0.3%。
优选地，所述的叠氮钠占所述的生物素化的抗谷氨酸脱羧酶抗原保存液的总质量的0.01%~0.03%，例如0.01%、0.02%、0.03%。
优选地，所述的蛋白酶抑制剂为抑肽酶，所述的抑肽酶在所述的生物素化的抗谷氨酸脱羧酶抗原保存液中的浓度为1µg/mL~3µg/mL，例如1µg/mL、2µg/mL、3µg/mL。
优选地，所述的生物素化的抗谷氨酸脱羧酶抗原保存液包括如下组分：
4-羟乙基哌嗪乙磺酸 15mmol/L~20mmol/L；
氯化钠 200mmol/L~300mmol/L；
有机分散剂 20wt %~35wt %；
非离子表面活性剂 0.1wt%~0.2wt%；
海藻糖 10wt%~20wt%；
磷酸吡哆醛 0.01mmol/L~0.02mmol/L；
牛血清蛋白 0.1wt%~0.3wt%；
叠氮钠 0.01wt%~0.03wt%；
蛋白酶抑制剂 1µg/mL~3µg/mL；
余量水。
根据一些优选且具体的实施例，所述的生物素化的抗谷氨酸脱羧酶抗原保存液包括如下组分：
4-羟乙基哌嗪乙磺酸 15mmol/L~20mmol/L；
氯化钠 200mmol/L~300mmol/L；
甘油 15wt%~25wt%；
山梨醇 5wt%~10 wt%；
聚乙二醇辛基苯基醚 0.1wt%~0.2wt%；
海藻糖 10wt%~20wt%；
磷酸吡哆醛 0.01mmol/L~0.02mmol/L；
牛血清蛋白 0.1wt%~0.3wt%；
蛋白酶抑制肽 1µg/mL~3µg/mL；
余量水。
本发明还提供所述的生物素化的抗谷氨酸脱羧酶抗原保存液的制备方法，将4-羟乙基哌嗪乙磺酸或HEPES缓冲液、氯化钠、有机分散剂、非离子表面活性剂、海藻糖、磷酸吡哆醛、牛血清蛋白、叠氮钠和蛋白酶抑制剂与水混合均匀得到混合液，然后采用盐酸调节所述的混合液的pH值至7~7.5，经过滤后所得滤液即为所述的生物素化的抗谷氨酸脱羧酶抗原保存液。
本发明与现有技术相比具有如下优势：
本发明通过优化抗原保存液组分，使得制备的抗原保存液在用于生物素标记的抗谷氨酸脱羧酶抗原的保存时，在2℃~8℃条件下，生物素标记的抗谷氨酸脱羧酶抗原的保存期限大大延长。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步描述。但本发明并不限于以下实施例。实施例中采用的实施条件可以根据具体使用的不同要求做进一步调整，未注明的实施条件为本行业中的常规条件。本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
为了解决市面上关于生物素标记的抗谷氨酸脱羧酶抗原保存液的空白，延长生物素标记的抗谷氨酸脱羧酶抗原的稳定保存期限，发明人经过大量的研究和实验验证，对抗原保存液的组分配方进行了优化，最终得以提供一种适用于生物素标记的抗谷氨酸脱羧酶抗原的保存液。
具体地，本发明的生物素化的抗谷氨酸脱羧酶抗原保存液的pH值为7~7.5，其原料组分包括4-羟乙基哌嗪乙磺酸、氯化钠、有机分散剂、非离子表面活性剂、海藻糖、磷酸吡哆醛、牛血清蛋白、叠氮钠和蛋白酶抑制剂。
根据一些优选地实施方式，所述的生物素化的抗谷氨酸脱羧酶抗原保存液包括如下组分：
4-羟乙基哌嗪乙磺酸 18mmol/L~20mmol/L；
氯化钠 240mmol/L~260mmol/L；
甘油 18%~22%；
山梨醇 6%~10%
聚乙二醇辛基苯基醚 0.12%~0.18%；
海藻糖 12%~17%；
磷酸吡哆醛 0.015mmol/L~0.02mmol/L；
牛血清蛋白 0.15%~0.25%；
蛋白酶抑制肽 1.5µg/mL~2.5µg/mL；
余量水。
本发明的生物素化的抗谷氨酸脱羧酶抗原保存液能够使生物素化的抗谷氨酸脱羧酶抗原的稳定保存期限延长，保存9个月后生物素化的抗谷氨酸脱羧酶抗原的活性损失较小，保存16个月后生物素化的抗谷氨酸脱羧酶抗原仍然具有较高的生物活性。
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细的描述。
以下实施例和对比例中，生物素化的抗谷氨酸脱羧酶抗原的制备方法为：440µL助溶剂（DMSO）加入到2mg活性生物素瓶内，混匀，再取1mg待标记的抗谷氨酸脱羧酶抗原于超滤管中，并加入适量体积的标记缓冲液定容至0.5mL，使终浓度为2mg/mL，混匀后，高速冷冻离心机离心，转速14000r/min，温度为2℃～8℃，时间10分钟，离心后在超滤管中加入15.38µL生物素溶液和424.62µL标记缓冲液，并轻轻吹打混匀。离心，转速14000r/min，温度为2℃～8℃，时间10分钟。离心后在超滤管中加入500µL标记缓冲液至上述超滤管中，并轻轻吹打混匀，转速14000r/min离心10分钟。此步骤重复操作3次，最后一次离心后在超滤管中加入250µL标记缓冲液并轻轻吹打混匀，转移到离心管内，再加入250µL保存液，即得到0.5ml浓度为2mg/mL生物素标记抗谷氨酸脱羧酶抗原，2℃～8℃保存。其中，使用的活性生物素为购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司的烷氧基胺-PEG4-生物素（Thermo Scientific EZ-Link）。
以下实施例和对比例中，若如特殊说明，所使用的原料、试剂等均为常规市售产品。
以下实施例和对比例中，若如特殊说明，所述的“%”为质量百分比。
下文中，用于保存液的性能检测的质控品1为国际标准品97/550配制的浓度为15IU/mL的谷氨酸脱羧酶抗体溶液；用于保存液的性能检测的质控品2为国际标准品97/550配制的浓度为150IU/mL的谷氨酸脱羧酶抗体溶液。
下文中，用于保存液的性能检测的链霉亲和素磁珠购自安捷伦科技有限公司(货号PL6727-1001)。
下文中，用于保存液的性能检测的化学发光底物液为APS-5缓冲液。
实施例1
本实施例提供一种生物素化的抗谷氨酸脱羧酶抗原保存液，其配方如下：4-羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES） 20mmol/L，甘油 20wt%，氯化钠 250mmol/L，山梨醇 8wt%，聚乙二醇辛基苯基醚 0.15wt%，海藻糖 15wt%，磷酸吡哆醛 0.018mmol/L，牛血清蛋白 0.2wt%，叠氮钠 0.03wt%，抑肽酶 2µg/mL，余量水。本实施例的生物素化的抗谷氨酸脱羧酶抗原保存液pH值为7.5。
配制方法：按比例称量HEPES，甘油，氯化钠，山梨醇，Triton X-100，海藻糖，磷酸吡哆醛，牛血清蛋白，叠氮钠，抑肽酶，与水混合均匀后，采用浓度为12mol/L的盐酸调整生物素化的抗谷氨酸脱羧酶抗原保存液的pH值至7.5，采用0.22µm滤纸过滤后于4℃保存备用。
实施例2
本实施例提供一种生物素化的抗谷氨酸脱羧酶抗原保存液，其配方如下：4-羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES） 15mmol/L，甘油 20wt%，氯化钠 200mmol/L，山梨醇 5wt%，聚乙二醇辛基苯基醚 0.15%，海藻糖 15wt%，磷酸吡哆醛 0.01mmol/L，牛血清蛋白 0.2wt%，叠氮钠0.03wt%，抑肽酶 2µg/mL，余量水。本实施例的生物素化的抗谷氨酸脱羧酶抗原保存液pH值为7.5。
配制方法：按比例称量HEPES，甘油，氯化钠，山梨醇，聚乙二醇辛基苯基醚，海藻糖，磷酸吡哆醛，牛血清蛋白，叠氮钠，抑肽酶，与水混合均匀后，采用浓度为12mol/L的盐酸调整生物素化的抗谷氨酸脱羧酶抗原保存液的pH值至7.5，采用0.22µm滤纸过滤后于4℃保存备用。
实施例3
本实施例提供一种生物素化的抗谷氨酸脱羧酶抗原保存液，其配方及制备方法基本同实施例1，区别在于生物素化的抗谷氨酸脱羧酶抗原保存液的pH值为7.0。
对比例1
本对比例提供一种生物素化的抗谷氨酸脱羧酶抗原保存液，其配方及制备方法基本同实施例1，区别在于将4-羟乙基哌嗪乙磺酸换成磷酸。
对比例2
本对比例提供一种生物素化的抗谷氨酸脱羧酶抗原保存液，其配方及制备方法基本同实施例1，区别在于未使用磷酸吡哆醛。
对比例3
本对比例提供一种生物素化的抗谷氨酸脱羧酶抗原保存液，其配方及制备方法基本同实施例1，区别在于未使用海藻糖。
对比例4
本对比例提供一种生物素化的抗谷氨酸脱羧酶抗原保存液，其配方及制备方法基本同实施例1，区别在于将4-羟乙基哌嗪乙磺酸换成磷酸，且未使用聚乙二醇辛基苯基醚。
对比例5
本对比例提供一种生物素化的抗谷氨酸脱羧酶抗原保存液，其配方及制备方法基本同实施例1，区别在于生物素化的抗谷氨酸脱羧酶抗原保存液的pH值为6.5。
将生物素化的抗谷氨酸脱羧酶抗原分别与上述实施例和对比例制备的生物素化的抗谷氨酸脱羧酶抗原保存液混合得到抗谷氨酸脱羧酶抗原溶液，于2℃～8℃条件下贮存16个月，分别在配制当天、保存1个月后、保存3个月后、保存6个月后、保存9个月后、保存13个月后和保存16个月后，采用质控品1和质控品2测试生物素化的抗谷氨酸脱羧酶抗原的生物活性。以全自动化学发光免疫分析仪(i2900)为检测仪器，测定原理是间接法，即在仪器中依次加入15µL的质控品1或质控品2，30µL的生物素化的抗谷氨酸脱羧酶抗原溶液和30µL链霉亲和素磁颗粒溶液，反应10min后，进行磁分离，清洗未被结合的物质，再加入50µL化学发光标记物标记的抗谷氨酸脱羧酶抗体溶液，反应5min后，进行磁分离，清洗未被结合的物质，加入发光底物液进行反应，最后记录相对光单位(RLU)并计算其相对抗谷氨酸脱羧酶抗原溶液配制当天的RLU值的偏差，测试结果见表1，偏差越大，生物素化的抗谷氨酸脱羧酶抗原的生物活性损失越大。
表1显示，实施例1~3的生物素化的抗谷氨酸脱羧酶抗原保存液可有效延长抗谷氨酸脱羧酶抗原的稳定保存期限，保存9个月后生物素化的抗谷氨酸脱羧酶抗原的活性损失较小，保存16个月后生物素化的抗谷氨酸脱羧酶抗原仍然具有较高的生物活性。经分析，HEPES不参加且不干扰生物化学反应过程，对酶化学反应等无抑制作用，不易与离子发生反应，保存液体系更加稳定；磷酸吡哆醛是谷氨酸脱羧酶的辅酶，与谷氨酸脱羧酶结合后可以使其结构更加稳定；海藻糖是一种应激代谢物，能够在低温下有效地保护生物分子结构不被破坏；Triton X-100可防止蛋白团聚，使生物素化的谷氨酸脱羧酶抗原更稳定；经生物素标记后的谷氨酸脱羧酶抗原性质已经发生改变，弱碱性pH更有利于延长其稳定保存的期限。
以上对本发明做了详尽的描述，其目的在于让熟悉此领域技术的人士能够了解本发明的内容并加以实施，并不能以此限制本发明的保护范围，凡根据本发明的精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围内。
Claims (3)
1.一种生物素化的抗谷氨酸脱羧酶抗原保存液，其特征在于：所述的生物素化的抗谷氨酸脱羧酶抗原保存液的pH值为7~7.5，其原料组分包括4-羟乙基哌嗪乙磺酸、氯化钠、有机分散剂、非离子表面活性剂、海藻糖、磷酸吡哆醛、牛血清蛋白、叠氮钠和蛋白酶抑制剂，
所述的磷酸吡哆醛在所述的生物素化的抗谷氨酸脱羧酶抗原保存液中的浓度为0.01mmol/L~0.02mmol/L，
所述的非离子表面活性剂为聚乙二醇辛基苯基醚；所述的非离子表面活性剂占所述的生物素化的抗谷氨酸脱羧酶抗原保存液的总质量的0.1%~0.2%，
所述的有机分散剂包括甘油和山梨醇；所述的有机分散剂占所述的生物素化的抗谷氨酸脱羧酶抗原保存液的总质量的20%~35%；所述的甘油和所述的山梨醇的质量之比为（2~3.5）：1，
所述的4-羟乙基哌嗪乙磺酸以酸或HEPES缓冲液的形式进行投料，所述的4-羟乙基哌嗪乙磺酸在所述的生物素化的抗谷氨酸脱羧酶抗原保存液中的浓度为15mmol/L~20mmol/L，
所述的海藻糖占所述的生物素化的抗谷氨酸脱羧酶抗原保存液的总质量的10%~20%；所述的氯化钠在所述的生物素化的抗谷氨酸脱羧酶抗原保存液中的浓度为200mmol/L~300mmol/L；所述的牛血清蛋白占所述的生物素化的抗谷氨酸脱羧酶抗原保存液的总质量的0.1%~0.3%，
所述的叠氮钠占所述的生物素化的抗谷氨酸脱羧酶抗原保存液的总质量的0.01%~0.03%；
所述的蛋白酶抑制剂为抑肽酶，所述的抑肽酶在所述的生物素化的抗谷氨酸脱羧酶抗原保存液中的浓度为1µg/mL~3µg/mL。
2.根据权利要求1所述的生物素化的抗谷氨酸脱羧酶抗原保存液，其特征在于：所述的生物素化的抗谷氨酸脱羧酶抗原保存液包括如下组分：
4-羟乙基哌嗪乙磺酸 15mmol/L~20mmol/L；
氯化钠 200mmol/L~300mmol/L；
有机分散剂 20wt%~35wt %；
非离子表面活性剂 0.1wt%~0.2wt%；
海藻糖 10wt%~20wt%；
磷酸吡哆醛 0.01mmol/L~0.02mmol/L；
牛血清蛋白 0.1wt%~0.3wt%；
叠氮钠 0.01wt%~0.03wt%；
蛋白酶抑制剂 1µg/mL~3µg/mL；
余量水。
3.如权利要求1或2所述的生物素化的抗谷氨酸脱羧酶抗原保存液的制备方法，其特征在于：将4-羟乙基哌嗪乙磺酸或HEPES缓冲液、氯化钠、有机分散剂、非离子表面活性剂、海藻糖、磷酸吡哆醛、牛血清蛋白、叠氮钠和蛋白酶抑制剂与水混合均匀得到混合液，然后采用盐酸调节所述的混合液的pH值至7~7.5，经过滤后所得滤液即为所述的生物素化的抗谷氨酸脱羧酶抗原保存液。
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