CN115300496B - 一种儿茶酚纳米颗粒、儿茶酚蛋白质纳米颗粒及其制备方法和应用 - Google Patents
一种儿茶酚纳米颗粒、儿茶酚蛋白质纳米颗粒及其制备方法和应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN115300496B CN115300496B CN202210932024.5A CN202210932024A CN115300496B CN 115300496 B CN115300496 B CN 115300496B CN 202210932024 A CN202210932024 A CN 202210932024A CN 115300496 B CN115300496 B CN 115300496B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- catechol
- nanoparticles
- nps
- protein
- nano
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 title claims abstract description 156
- YCIMNLLNPGFGHC-UHFFFAOYSA-N catechol Chemical compound OC1=CC=CC=C1O YCIMNLLNPGFGHC-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 136
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 73
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 73
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 30
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 58
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 45
- 238000010992 reflux Methods 0.000 claims abstract description 33
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 claims abstract description 26
- 229920001864 tannin Polymers 0.000 claims abstract description 18
- 235000018553 tannin Nutrition 0.000 claims abstract description 18
- 239000001648 tannin Substances 0.000 claims abstract description 18
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims abstract description 14
- 150000005206 1,2-dihydroxybenzenes Chemical class 0.000 claims abstract description 13
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 claims abstract description 7
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims abstract description 5
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims description 45
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 35
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 31
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 claims description 28
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 claims description 28
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 claims description 25
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 24
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims description 22
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 20
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 20
- 238000001338 self-assembly Methods 0.000 claims description 19
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 claims description 12
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 12
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 claims description 11
- 108010015776 Glucose oxidase Proteins 0.000 claims description 10
- 239000004366 Glucose oxidase Substances 0.000 claims description 10
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 claims description 10
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 claims description 10
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 claims description 10
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 claims description 10
- 229940116332 glucose oxidase Drugs 0.000 claims description 10
- 235000019420 glucose oxidase Nutrition 0.000 claims description 10
- 229940027941 immunoglobulin g Drugs 0.000 claims description 10
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 claims description 10
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 claims description 10
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 claims description 10
- 102000008192 Lactoglobulins Human genes 0.000 claims description 8
- 108010060630 Lactoglobulins Proteins 0.000 claims description 8
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 claims description 8
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 claims description 8
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 claims description 8
- 102000018832 Cytochromes Human genes 0.000 claims description 6
- 108010052832 Cytochromes Proteins 0.000 claims description 6
- 102000001554 Hemoglobins Human genes 0.000 claims description 6
- 108010054147 Hemoglobins Proteins 0.000 claims description 6
- 102000009123 Fibrin Human genes 0.000 claims description 5
- 108010073385 Fibrin Proteins 0.000 claims description 5
- BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N Fibrin monomer Chemical compound CNC(=O)CNC(=O)CN BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 229950003499 fibrin Drugs 0.000 claims description 5
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 abstract description 11
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 abstract description 6
- 230000004043 responsiveness Effects 0.000 abstract description 6
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 abstract description 5
- 230000002000 scavenging effect Effects 0.000 abstract description 3
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 abstract description 2
- 238000012377 drug delivery Methods 0.000 abstract description 2
- 239000002994 raw material Substances 0.000 abstract description 2
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 56
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 50
- XMOCLSLCDHWDHP-IUODEOHRSA-N epi-Gallocatechin Chemical compound C1([C@H]2OC3=CC(O)=CC(O)=C3C[C@H]2O)=CC(O)=C(O)C(O)=C1 XMOCLSLCDHWDHP-IUODEOHRSA-N 0.000 description 41
- 229910021642 ultra pure water Inorganic materials 0.000 description 17
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 description 17
- 230000008859 change Effects 0.000 description 15
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 14
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 238000001878 scanning electron micrograph Methods 0.000 description 12
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 12
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 11
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 11
- LNTHITQWFMADLM-UHFFFAOYSA-N gallic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC(O)=C(O)C(O)=C1 LNTHITQWFMADLM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 11
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 9
- WQZGKKKJIJFFOK-FPRJBGLDSA-N beta-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-FPRJBGLDSA-N 0.000 description 9
- 239000000463 material Substances 0.000 description 9
- FEMOMIGRRWSMCU-UHFFFAOYSA-N ninhydrin Chemical compound C1=CC=C2C(=O)C(O)(O)C(=O)C2=C1 FEMOMIGRRWSMCU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 8
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 8
- OHDRQQURAXLVGJ-HLVWOLMTSA-N azane;(2e)-3-ethyl-2-[(e)-(3-ethyl-6-sulfo-1,3-benzothiazol-2-ylidene)hydrazinylidene]-1,3-benzothiazole-6-sulfonic acid Chemical compound [NH4+].[NH4+].S/1C2=CC(S([O-])(=O)=O)=CC=C2N(CC)C\1=N/N=C1/SC2=CC(S([O-])(=O)=O)=CC=C2N1CC OHDRQQURAXLVGJ-HLVWOLMTSA-N 0.000 description 8
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 8
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 8
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 8
- 239000012224 working solution Substances 0.000 description 8
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 7
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 7
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 7
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 7
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000003917 TEM image Methods 0.000 description 6
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 6
- 235000004515 gallic acid Nutrition 0.000 description 6
- 102000008946 Fibrinogen Human genes 0.000 description 5
- 108010049003 Fibrinogen Proteins 0.000 description 5
- 240000003152 Rhus chinensis Species 0.000 description 5
- 235000014220 Rhus chinensis Nutrition 0.000 description 5
- 230000003078 antioxidant effect Effects 0.000 description 5
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 5
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 5
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 5
- 229940012952 fibrinogen Drugs 0.000 description 5
- 229940074391 gallic acid Drugs 0.000 description 5
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 5
- 150000008442 polyphenolic compounds Chemical class 0.000 description 5
- 235000013824 polyphenols Nutrition 0.000 description 5
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 5
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 5
- OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl beta-D-galactoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CNC2=CC=C(Br)C(Cl)=C12 OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 0.000 description 4
- ZZZCUOFIHGPKAK-UHFFFAOYSA-N D-erythro-ascorbic acid Natural products OCC1OC(=O)C(O)=C1O ZZZCUOFIHGPKAK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N Silicon Chemical compound [Si] XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229930003268 Vitamin C Natural products 0.000 description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 4
- 238000000921 elemental analysis Methods 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- IOLCXVTUBQKXJR-UHFFFAOYSA-M potassium bromide Chemical compound [K+].[Br-] IOLCXVTUBQKXJR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 229910052710 silicon Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000010703 silicon Substances 0.000 description 4
- 235000019154 vitamin C Nutrition 0.000 description 4
- 239000011718 vitamin C Substances 0.000 description 4
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 3
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 3
- 241000411851 herbal medicine Species 0.000 description 3
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 3
- 238000004895 liquid chromatography mass spectrometry Methods 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 3
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 3
- 239000006174 pH buffer Substances 0.000 description 3
- 150000003254 radicals Chemical class 0.000 description 3
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 3
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 3
- XMOCLSLCDHWDHP-SWLSCSKDSA-N (+)-Epigallocatechin Natural products C1([C@H]2OC3=CC(O)=CC(O)=C3C[C@@H]2O)=CC(O)=C(O)C(O)=C1 XMOCLSLCDHWDHP-SWLSCSKDSA-N 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 238000005033 Fourier transform infrared spectroscopy Methods 0.000 description 2
- XMOCLSLCDHWDHP-UHFFFAOYSA-N L-Epigallocatechin Natural products OC1CC2=C(O)C=C(O)C=C2OC1C1=CC(O)=C(O)C(O)=C1 XMOCLSLCDHWDHP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N N-Butanol Chemical compound CCCCO LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000920652 Quercus lusitanica Species 0.000 description 2
- 244000173853 Sanguisorba officinalis Species 0.000 description 2
- 235000008282 Sanguisorba officinalis Nutrition 0.000 description 2
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 238000000862 absorption spectrum Methods 0.000 description 2
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 description 2
- 125000003368 amide group Chemical group 0.000 description 2
- 238000000498 ball milling Methods 0.000 description 2
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 2
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 2
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 2
- 238000001085 differential centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 2
- MQRJBSHKWOFOGF-UHFFFAOYSA-L disodium;carbonate;hydrate Chemical compound O.[Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O MQRJBSHKWOFOGF-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 2
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 2
- DZYNKLUGCOSVKS-UHFFFAOYSA-N epigallocatechin Natural products OC1Cc2cc(O)cc(O)c2OC1c3cc(O)c(O)c(O)c3 DZYNKLUGCOSVKS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 2
- 230000007760 free radical scavenging Effects 0.000 description 2
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 2
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 2
- 125000001165 hydrophobic group Chemical group 0.000 description 2
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 2
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 description 2
- 239000002077 nanosphere Substances 0.000 description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 238000005507 spraying Methods 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- XPFJYKARVSSRHE-UHFFFAOYSA-K trisodium;2-hydroxypropane-1,2,3-tricarboxylate;2-hydroxypropane-1,2,3-tricarboxylic acid Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O.[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O XPFJYKARVSSRHE-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- -1 ABTS free radical Chemical class 0.000 description 1
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000416536 Euproctis pseudoconspersa Species 0.000 description 1
- 238000001157 Fourier transform infrared spectrum Methods 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 238000013494 PH determination Methods 0.000 description 1
- QJYNZEYHSMRWBK-NIKIMHBISA-N Penta-O-galloyl-beta-D-glucose Natural products OC1=C(O)C(O)=CC(C(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@H](OC(=O)C=3C=C(O)C(O)=C(O)C=3)[C@@H](OC(=O)C=3C=C(O)C(O)=C(O)C=3)[C@H](OC(=O)C=3C=C(O)C(O)=C(O)C=3)O2)OC(=O)C=2C=C(O)C(O)=C(O)C=2)=C1 QJYNZEYHSMRWBK-NIKIMHBISA-N 0.000 description 1
- 235000008291 Poterium sanguisorba Nutrition 0.000 description 1
- 230000002292 Radical scavenging effect Effects 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000005811 Viola adunca Nutrition 0.000 description 1
- 240000009038 Viola odorata Species 0.000 description 1
- 235000013487 Viola odorata Nutrition 0.000 description 1
- 235000002254 Viola papilionacea Nutrition 0.000 description 1
- 244000172533 Viola sororia Species 0.000 description 1
- VWEHKCLUPVSLTL-LNMRATFYSA-N [(2r,3r,4s,5r)-6-oxo-2,3,4,5-tetrakis[(3,4,5-trihydroxybenzoyl)oxy]hexyl] 3,4,5-trihydroxybenzoate Chemical compound OC1=C(O)C(O)=CC(C(=O)OC[C@@H](OC(=O)C=2C=C(O)C(O)=C(O)C=2)[C@@H](OC(=O)C=2C=C(O)C(O)=C(O)C=2)[C@H](OC(=O)C=2C=C(O)C(O)=C(O)C=2)[C@@H](OC(=O)C=2C=C(O)C(O)=C(O)C=2)C=O)=C1 VWEHKCLUPVSLTL-LNMRATFYSA-N 0.000 description 1
- 238000004847 absorption spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 229960000583 acetic acid Drugs 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 1
- 150000001370 alpha-amino acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 235000008206 alpha-amino acids Nutrition 0.000 description 1
- 230000003064 anti-oxidating effect Effects 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- COVFEVWNJUOYRL-UHFFFAOYSA-N dehydrodigallic acid Natural products OC(=O)C1=CC(O)=C(O)C(OC(=O)C=2C=C(O)C(O)=C(O)C=2)=C1 COVFEVWNJUOYRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000004807 desolvation Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- HBGGXOJOCNVPFY-UHFFFAOYSA-N diisononyl phthalate Chemical compound CC(C)CCCCCCOC(=O)C1=CC=CC=C1C(=O)OCCCCCCC(C)C HBGGXOJOCNVPFY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 238000002330 electrospray ionisation mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 238000001952 enzyme assay Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 239000012847 fine chemical Substances 0.000 description 1
- 239000000834 fixative Substances 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- 239000012362 glacial acetic acid Substances 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000000589 high-performance liquid chromatography-mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 230000036571 hydration Effects 0.000 description 1
- 238000006703 hydration reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000001788 irregular Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 239000000693 micelle Substances 0.000 description 1
- 238000000593 microemulsion method Methods 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 239000004570 mortar (masonry) Substances 0.000 description 1
- 239000002539 nanocarrier Substances 0.000 description 1
- 239000002114 nanocomposite Substances 0.000 description 1
- 238000007709 nanocrystallization Methods 0.000 description 1
- 239000007908 nanoemulsion Substances 0.000 description 1
- 238000011056 performance test Methods 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- KVMLCRQYXDYXDX-UHFFFAOYSA-M potassium;chloride;hydrochloride Chemical compound Cl.[Cl-].[K+] KVMLCRQYXDYXDX-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000003825 pressing Methods 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000004952 protein activity Effects 0.000 description 1
- 238000010298 pulverizing process Methods 0.000 description 1
- 239000013074 reference sample Substances 0.000 description 1
- 239000012088 reference solution Substances 0.000 description 1
- 239000013558 reference substance Substances 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 238000000870 ultraviolet spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 238000002371 ultraviolet--visible spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/045—Hydroxy compounds, e.g. alcohols; Salts thereof, e.g. alcoholates
- A61K31/05—Phenols
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/33—Heterocyclic compounds
- A61K31/335—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin
- A61K31/35—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having six-membered rings with one oxygen as the only ring hetero atom
- A61K31/352—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having six-membered rings with one oxygen as the only ring hetero atom condensed with carbocyclic rings, e.g. methantheline
- A61K31/353—3,4-Dihydrobenzopyrans, e.g. chroman, catechin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/56—Materials from animals other than mammals
- A61K35/63—Arthropods
- A61K35/64—Insects, e.g. bees, wasps or fleas
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
- A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
- A61K36/185—Magnoliopsida (dicotyledons)
- A61K36/22—Anacardiaceae (Sumac family), e.g. smoketree, sumac or poison oak
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
- A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
- A61K36/185—Magnoliopsida (dicotyledons)
- A61K36/49—Fagaceae (Beech family), e.g. oak or chestnut
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
- A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
- A61K36/185—Magnoliopsida (dicotyledons)
- A61K36/73—Rosaceae (Rose family), e.g. strawberry, chokeberry, blackberry, pear or firethorn
- A61K36/739—Sanguisorba (burnet)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/1703—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- A61K38/1709—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
- A61K38/1722—Plasma globulins, lactoglobulins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/36—Blood coagulation or fibrinolysis factors
- A61K38/363—Fibrinogen
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/38—Albumins
- A61K38/385—Serum albumin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/41—Porphyrin- or corrin-ring-containing peptides
- A61K38/415—Cytochromes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
- A61K38/44—Oxidoreductases (1)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
- A61K38/44—Oxidoreductases (1)
- A61K38/443—Oxidoreductases (1) acting on CH-OH groups as donors, e.g. glucose oxidase, lactate dehydrogenase (1.1)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
- A61K38/46—Hydrolases (3)
- A61K38/47—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2), e.g. cellulases, lactases
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
- A61K38/46—Hydrolases (3)
- A61K38/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- A61K38/488—Aspartic endopeptidases (3.4.23), e.g. pepsin, chymosin, renin, cathepsin E
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
- A61K39/39516—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum from serum, plasma
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/14—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
- A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
- A61K9/51—Nanocapsules; Nanoparticles
- A61K9/5107—Excipients; Inactive ingredients
- A61K9/513—Organic macromolecular compounds; Dendrimers
- A61K9/5169—Proteins, e.g. albumin, gelatin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
- A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
- A61K9/51—Nanocapsules; Nanoparticles
- A61K9/5107—Excipients; Inactive ingredients
- A61K9/5176—Compounds of unknown constitution, e.g. material from plants or animals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
- A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
- A61K9/51—Nanocapsules; Nanoparticles
- A61K9/5192—Processes
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Natural Medicines & Medicinal Plants (AREA)
- Zoology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Nanotechnology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Optics & Photonics (AREA)
- Botany (AREA)
- Medical Informatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Alternative & Traditional Medicine (AREA)
- Marine Sciences & Fisheries (AREA)
- Hematology (AREA)
- Insects & Arthropods (AREA)
- Animal Husbandry (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本发明提供了一种儿茶酚纳米颗粒、儿茶酚蛋白质纳米颗粒及其制备方法和应用,属于医药技术领域。本发明以含鞣质类化合物的天然植物药为原料,通过加热回流法使植物药中儿茶酚类化合物和蛋白质发生自组装,再通过简单分级分离即可制备形态规则的天然纳米颗粒‑儿茶酚纳米颗粒。本发明所制备的儿茶酚纳米颗粒的形成机制为植物药中的小分子量儿茶酚类化合物(质荷比<635)和微量蛋白质自组装形成纳米颗粒。通过该方法制备的纳米颗粒具有pH响应性和清除自由基的能力,并且部分蛋白质可以保留其自身的生物活性,可作为药物载体进行药物递送和治疗。
Description
技术领域
本发明涉及医药技术领域,尤其是涉及一种儿茶酚纳米颗粒、儿茶酚蛋白质纳米颗粒及其制备方法和应用。
背景技术
中草药纳米颗粒是采用纳米技术将中草药制成的纳米级生物功能材料,以增强和改善传统中药在各项疾病中的治疗效果。目前,制备中草药纳米颗粒的方法有:
(1)植物药自身纳米化:将药物、研磨介质、水及相应的稳定剂放入专门的介质研磨机中,通过研磨杆高速剪切运动,从而粉碎得到纳米级药物。粉碎方法包括:机械粉碎法、球磨法等。该方法的缺陷与不足:应用有限,得到的纳米药物的形态通常是不规则的,且对于一些具有高粘性的植物药,机械粉碎法和球磨法均不适用。
(2)将植物药通过自组装法、微乳法或薄膜水化法等,载入到特定的纳米载体中,如固体脂质体、纳米乳或纳米胶束等。该方法的缺陷与不足:制备过程复杂,依赖于现代科学的精密仪器,很难实现大量的工业化生产。
发明内容
本发明的目的在于提供一种儿茶酚纳米颗粒、儿茶酚蛋白质纳米颗粒及其制备方法和应用,能够简便快速从植物药植物药提取液中制得形态规则的球状纳米颗粒,且能实现工业化生产。
为了实现上述发明目的,本发明提供以下技术方案:
本发明提供了一种儿茶酚纳米颗粒的制备方法,包括以下步骤:
将含鞣质类化合物的天然植物药和水混合,进行加热回流提取,得到植物药提取液;
将所述植物药提取液分级分离后,得到儿茶酚纳米颗粒。
优选的,所述含鞣质类化合物的天然植物药包括没食子、五倍子或地榆,所述含鞣质类化合物的天然植物药的质量和水的体积之比为1g:8mL;所述加热回流提取的方式为常压回流提取或减压回流提取;所述常压回流提取的温度为100℃,时间为2h;所述减压回流提取的温度为50℃,时间为2h。
优选的,所述分级分离包括:将所述植物药提取液进行第一离心分离后,得到上清液和儿茶酚纳米颗粒;所述第一离心分离的离心力为6577g,离心时间为10min。
优选的,所述分级分离还包括:将所述上清液进行第二离心分离后,得到儿茶酚纳米颗粒;所述第二离心分离的离心力为9500g,时间为10min。
本发明提供了上述技术方案所述制备方法制备得到的儿茶酚纳米颗粒,由儿茶酚和蛋白质自组装形成,所述儿茶酚纳米颗粒的平均粒径为413.89±202.95nm或230.34±59.48nm。
本发明提供了一种儿茶酚蛋白质纳米颗粒的制备方法,包括以下步骤:
按照权利要求1所述制备方法制备植物药提取液;
将所述植物药提取液进行第一离心分离,将所得第一上清液第二离心分离后,将所得第二上清液、水和蛋白质混合,在加热条件下进行自组装,分离后,得到儿茶酚蛋白质纳米颗粒。
优选的,所述蛋白质包括牛血清白蛋白、溶菌酶、细胞色素C、β-乳球蛋白、胃蛋白酶、β-半乳糖苷酶、牛血红蛋白、牛血纤维蛋白源、免疫球蛋白G、辣根过氧化物酶或葡萄糖氧化酶;所述蛋白质与第二上清液的质量比为(10~300):600。
优选的,所述加热的温度为100℃;所述自组装的时间为2h;所述分离的方式为离心分离,所述离心分离的离心力为5000g,时间为10min。
本发明提供了上述技术方案所述制备方法制备得到的儿茶酚蛋白质纳米颗粒。
本发明提供了上述技术方案所述儿茶酚纳米颗粒或本发明提供了上述技术方案所述儿茶酚蛋白质纳米颗粒在药物载体中的应用。
本发明提供了一种儿茶酚纳米颗粒的制备方法,本发明以含鞣质类化合物的天然植物药为原料,通过加热回流法使儿茶酚类化合物和蛋白质发生自组装,再通过简单分级分离即可制备形态规则的天然纳米颗粒-儿茶酚纳米颗粒。本发明所制备的儿茶酚纳米颗粒的形成机制为没食子中的小分子量儿茶酚类化合物(质荷比<635)和微量蛋白质自组装形成纳米颗粒。通过该方法制备的纳米颗粒具有pH响应性和清除自由基的能力,并且部分蛋白质可以保留它的生物活性,可作为药物载体进行药物递送和治疗。
本发明通过加热回流法提取植物药提取液,一方面,加热有利于分子间的高速运动,溶液在热搅拌中使分子以适当的方向进入自组装聚集体中,以获得更有序、更有组织的最终态。另一方面,加热是蛋白质结构变化的驱动力,蛋白分子内部含疏水基团,当蛋白结构发生变化的时候,疏水基团暴露出来,在水溶液中非极性分子或非极性基团相互靠近而积聚;加热煮沸的过程引起蛋白质的结构变化,即三级结构的部分展开和二级结构的构象变化,然后特定的区域(如疏水位点或游离的-SH基团)容易暴露出来,蛋白质通过疏水作用形成聚集体,从而可以制备得到形态规则的天然球状纳米颗粒。
进一步的,本发明将植物药提取液通过差速离心法能够简便快速得到不同粒径分布且粒径均一、形态规则的天然球状纳米颗粒。
本发明提供了一种儿茶酚蛋白质纳米颗粒的制备方法,在植物药提取液中分别额外加入不同蛋白质后,均可通过自组装得到大量的天然纳米颗粒,从而能够实现大量工业化生产天然纳米颗粒。本发明的制备过程绿色环保、制备工艺简单,周期短,产率高,可实现大量工业化生产。
附图说明
图1为本发明制备没食子儿茶酚纳米颗粒的流程、机理和性能示意图;
图2为实施例1制备的没食子儿茶酚纳米颗粒的表征结果;a为TG-LP纳米颗粒的SEM和TEM图;b为TG-HP NPs的SEM和TEM图,插图:纳米颗粒的代表性形态;c为TG-LP NPs的粒径分布大小;d为TG-HP NPs的粒径分布大小;e为相同浓度的TGE、TG-LP NPs和TG-HP NPs的紫外可见吸收光谱图;f为TGE、TG-LP和TG-HP NPs的傅里叶红外光谱图;g为没食子儿茶酚纳米颗粒TG-LP NPs和TG-HP NPs的Zeta电位图;
图3为实施例1制备的没食子儿茶酚纳米颗粒的性能测试结果;a和b为抗氧化活性结果纳米颗粒清除自由基的实验结果图;c为纳米颗粒与不同pH值的缓冲溶液共孵育振荡30分钟后,丁达尔效应的强度变化图;d为纳米颗粒与不同pH值的缓冲溶液共孵育振荡30分钟后,纳米颗粒的质量和多酚含量随pH值的变化图;e为纳米颗粒与不同pH值的缓冲溶液共孵育振荡30分钟后,纳米颗粒的SEM图;
图4为没食子酸的标准曲线图;
图5为采用LC-MS测定TGE、TG-LP NPs和TG-HP NPs的化学组成的结果图;
图6为不同纳米颗粒中主要成分的含量变化的热图;
图7为没食子中9种儿茶酚系列的化学结构式;
图8为TG-LP NPs的EDX元素映射分析图,比例尺:200nm;
图9为茚三酮反应的示意图;
图10为阳性对照组(牛血清白蛋白(BSA))和样品组(没食子提取液TGE、没食子儿茶酚纳米颗粒TG-LP NPs和TG-HP NPs)中加入茚三酮显色液后的溶液图片;
图11中a为TG-HS与蛋白质自组装的示意图;b为TG-HS(600.00mg)和添加不同BSA含量(b1-b6:10.00、30.00、50.00、100.00、200.00、300.00mg)形成的TG-BSA NPs的SEM图;b7、b8:BSA投量为30.00mg的TG-BSA NPs的TEM图;c为TG-BSA NPs的EDX元素映射分析图;d为TG-BSA NPs和不同pH缓冲溶液孵育30分钟后的SEM图;插图:TG-BSA NPs加入不同pH缓冲溶液中(3.0,7.0,9.0和11.0)的照片;
图12中a为不同分子量、脂肪指数和等电点的模型蛋白图;(x轴:等电点;y轴:分子量;z轴:脂肪族指数);b为没食子提取物TG-HS与10种蛋白质自组装形成纳米颗粒过程中不同提取状态的SEM图;
图13为TG-β-Gal NPs和TG-β-gal NPs(△)处理A549细胞24小时后的X-Gal染色结果图,对照组给予游离β-Gal处理。
具体实施方式
本发明提供了一种儿茶酚纳米颗粒的制备方法,包括以下步骤:
将含鞣质类化合物的天然植物药和水混合,进行加热回流提取,得到植物药提取液;
将所述植物药提取液分级分离后,得到儿茶酚纳米颗粒。
在本发明中,若无特殊说明,所需制备原料均为本领域技术人员熟知的市售商品。
本发明将含鞣质类化合物的天然植物药和水混合,进行加热回流提取,得到植物药提取液。在本发明中,所述含鞣质类化合物的天然植物药优选包括没食子、五倍子或地榆;本发明对所述含鞣质类化合物的天然植物药的来源没有特殊的限定,按照本领域熟知的方式获取即可;在本发明的实施例中,所用没食子(Quercus infectoria Oliv.)药材购于新疆安萨尔药业有限公司,存放于新疆特种植物药重点实验室。
本发明对所述含鞣质类化合物的天然植物药的制备过程没有特殊的限定,按照本领域熟知的过程制备粉料即可。
在本发明中,所述水优选为超纯水;本发明对所述含鞣质类化合物的天然植物药和水混合的过程没有特殊的限定,按照本领域熟知的过程将物料混合均匀即可。
在本发明中,所述含鞣质类化合物的天然植物药的质量和水的体积之比优选为1g:8mL;所述加热回流提取的方式优选为常压回流提取或减压回流提取;所述常压回流提取的温度优选为100℃,时间优选为2h;所述减压回流提取的温度优选为50℃,时间优选为2h。本发明通过加热回流提取含鞣质类化合物的天然植物药中的儿茶酚类化合物。
完成所述加热回流提取后,本发明优选将所得物料趁热用无菌纱布过滤,弃掉滤渣,收集滤液,得到植物药提取液。本发明对所述过滤和收集的过程没有特殊的限定,按照本领域熟知的过程进行即可。
得到植物药提取液后,本发明将所述植物药提取液分级分离后,得到儿茶酚纳米颗粒。
在本发明中,所述分级分离优选包括:将所述植物药提取液进行第一离心分离后,得到上清液和儿茶酚纳米颗粒。
在本发明中,所述第一离心分离的离心力优选为6577g,离心时间优选为10min。
完成所述第一离心分离后,本发明优选将所得沉淀物用超纯水洗涤3次,干燥后,得到儿茶酚纳米颗粒。在本发明中,所述洗涤的方式优选为离心洗涤,所述洗涤离心力优选为6577g,时间优选为3min。在本发明中,所述干燥的方式优选为冷冻干燥;本发明对所述冷冻干燥的具体过程没有特殊的限定,按照本领域熟知的过程进行即可。本发明优选将所得儿茶酚纳米颗粒置于-20℃冰箱保存。
在本发明中,所述分级分离优选还包括:将所述上清液进行第二离心分离后,得到儿茶酚纳米颗粒。在本发明中,所述第二离心分离的离心力优选为9500g,时间优选为10min。本发明控制第一离心分离和第二离心分离的离心力不同(差速分离),能够得到不同粒径分布的纳米颗粒。
完成所述第二离心分离后,本发明优选将所得沉淀物用超纯水洗涤3次,干燥后,得到儿茶酚纳米颗粒;所述洗涤的方式优选为离心洗涤;所述离心洗涤的离心力优选为9500g,时间优选为5min。在本发明中,所述干燥的方式优选为冷冻干燥;本发明对所述冷冻干燥的具体过程没有特殊的限定,按照本领域熟知的过程进行即可。本发明优选将所得儿茶酚纳米颗粒置于-20℃冰箱保存。
在本发明中,所述第二离心分离所得上清液为下述方案所用第二上清液。
本发明提供了上述技术方案所述制备方法制备得到的儿茶酚纳米颗粒,由儿茶酚和蛋白质自组装形成,所述儿茶酚纳米颗粒的平均粒径为413.89±202.95nm或230.34±59.48nm。本发明中,植物药中的儿茶酚类化合物与植物药本身存在的蛋白质自组装形成儿茶酚蛋白质纳米复合物。
本发明提供了一种没食子儿茶酚蛋白质纳米颗粒的制备方法,包括以下步骤:
按照上述技术方案所述制备方法制备植物药提取液;
将所述植物药提取液进行第一离心分离,将所得第一上清液第二离心分离后,将所得第二上清液、水和蛋白质混合,在加热条件下进行自组装,分离后,得到儿茶酚蛋白质纳米颗粒。
本发明对所述制备植物药提取液、第一离心分离、第二离心分离的过程没有特殊的限定,按照上述技术方案所述过程进行即可。
在本发明中,所述第二上清液中,植物药提取物的浓度优选为10mg/mL。
在本发明中,所述水优选为超纯水;所述水的体积与第二上清液的质量之比优选为60mL:600mg。
在本发明中,所述蛋白质优选包括牛血清白蛋白(BSA)、溶菌酶(LYZ)、细胞色素C(CYC)、β-乳球蛋白(bLG)、胃蛋白酶(Pepsin)、β-半乳糖苷酶(β-gal)、牛血红蛋白(Hgb)、牛血纤维蛋白源(FGN)、免疫球蛋白G(IgG)、辣根过氧化物酶(HRP)和葡萄糖氧化酶(GOX);所述蛋白质与第二上清液的质量比为(10~300):600。
本发明对所述第二上清液、水和蛋白质混合的过程没有特殊的限定,按照本领域熟知的过程进行即可。
在本发明中,所述加热的温度优选为100℃;所述自组装的时间优选为2h;所述加热优选在搅拌条件下进行,所述搅拌的速率优选为200rpm。
在本发明中,所述分离的方式优选为离心分离,所述离心分离的离心力为5000g,时间为10min。
完成所述分离后,本发明优选将所得沉淀物水洗3次,干燥,得到没食子儿茶酚蛋白质纳米颗粒;所述水洗的方式优选为离心洗涤;所述水洗的离心力优选为5000g,时间优选为5min。在本发明中,所述干燥的方式优选为冷冻干燥;本发明对所述冷冻干燥的具体过程没有特殊的限定,按照本领域熟知的过程进行即可。本发明优选将所得儿茶酚蛋白质纳米颗粒置于-20℃冰箱保存。
本发明提供了上述技术方案所述制备方法制备得到的儿茶酚蛋白质纳米颗粒。
本发明提供了上述技术方案所述儿茶酚纳米颗粒或本发明提供了上述技术方案所述儿茶酚蛋白质纳米颗粒在药物载体中的应用。本发明对所述应用的方法没有特殊的限定,按照本领域熟知的方法应用即可。
图1为本发明制备儿茶酚纳米颗粒的流程、机理和性能示意图;本发明将植物药提取液(以没食子为例)分离后即可得到天然儿茶酚纳米颗粒;纳米颗粒形成机制的为植物药提取液中的儿茶酚类化合物和微量蛋白质的自组装;所制备的儿茶酚纳米颗粒具有pH响应性和清除自由基的能力。
下面将结合本发明中的实施例,对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
以下实施例中,所用试剂来源:
乙腈,色谱级,购自美国赛默飞世尔科技公司;甲酸,优级,购自天津光复精细化工研究所);1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)购自Sigma-Aldrich公司;2,2'-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)购自上海兰季生物有限公司。K2S2O8购自上海麦克林生化有限公司;维生素C(VC)、牛血清白蛋白(BSA)、和溶菌酶(LYZ)均购自北京索莱宝科技有限公司。葡萄糖氧化酶(GOX)、牛血红蛋白(Hgb)、免疫球蛋白G(IgG)、牛纤维源蛋白原(FGN)、辣根过氧化物酶(HRP)、细胞色素C(CYC)、β-半乳糖苷酶(β-gal)购自中国上海源叶生物科技有限公司。
实施例1
将没食子粗粉末(40.00g)加入8倍量超纯水(320.00mL),在100℃回流提取2小时,趁热用无菌纱布过滤,弃掉滤渣,收集滤液,得到没食子提取液(TGE);
将所述没食子提取液TGE进行离心(6577g,10min),收集上清液,标记为TG-LS,沉淀物用超纯水洗3次(6577g,3min),标记为TG-LP NPs;再将TG-LS进行离心(9500g,10min),收集上清液,标记为TG-HS,所得沉淀物用超纯水洗3次(9500g,5min),标记为TG-HP NPs;将上清液(TG-HS)和沉淀物(TG-LP NPs和TG-HP NPs)分别冷冻干燥,置于-20℃冰箱保存。
表征
1)扫面电子显微镜(SEM)
将实施例1制备的没食子儿茶酚纳米颗粒TG-LP NPs、TG-HP NPs分别均匀分散在超纯水中,滴加在硅片上,干燥后喷金,使用SEM观察其形貌和粒径,采用Image J软件随机选取100个纳米颗粒进行粒径测定,所得结果见图2。
2)透射电子显微镜(TEM)
将实施例1制备的没食子儿茶酚纳米颗粒TG-LP NPs、TG-HP NPs分别均匀分散在超纯水中,滴加在铜网上,干燥后使用TEM观察其形貌,所得结果见图2。
3)紫外-可见吸收分光光谱
将没食子提取液TGE、没食子儿茶酚纳米颗粒TG-LP NPs和TG-HP NPs均匀分散到超纯水中,在200-800nm波长范围内对其进行光谱扫描,所得结果见图2。
4)傅里叶变换红外光谱
分别取等量冻干的TGE、TG-LP NPs和TG-HP NPs粉末与干燥的溴化钾(KBr)粉末在玛瑙研钵中混匀,充分研细至颗粒直径小于2μm,取适量放入压片模具内,在压片机上压成透明薄片,通过傅里叶变换红外光谱仪测定样品在4500-500cm-1范围内的官能团特征,所得结果见图2。
5)对实施例1制备的没食子儿茶酚纳米颗粒进行电位分析,所得结果见图2。
图2为实施例1制备的没食子儿茶酚纳米颗粒TG-LP NPs和TG-HP NPs的表征结果;其中,(a)TG-LP纳米颗粒的SEM图(左)和TEM图(右);(b)TG-HP NPs的SEM图(左)和TEM图(右);插图:纳米颗粒的代表性形态;(c)TG-LP NPs的粒径分布大小;(d)TG-HP NPs的粒径分布大小;(e)相同浓度的TGE、TG-LP NPs和TG-HP NPs的紫外可见吸收光谱图;(f)TGE、TG-LP NPs和TG-HP NPs的傅里叶红外光谱图;(g)没食子儿茶酚纳米颗粒TG-LP NPs和TG-HPNPs的Zeta电位图。
图2中a和b为没食子儿茶酚纳米颗粒TG-LP NPs和TG-HP NPs的形貌图像,插图是更高倍数的放大图像;由图2可知,通过差速离心法可以从没食子提取液中分级分离得到没食子儿茶酚纳米颗粒TG-LP NPs和TG-HP NPs,其表面粗糙甚至有些孔洞。
图2中c和d为没食子儿茶酚纳米颗粒的粒径分布图,显示没食子儿茶酚纳米颗粒TG-LP NPs的平均粒径为413.89±202.95nm,TG-HP NPs的平均粒径为230.34±59.48nm。说明随着离心力的增加,TG-NPs的平均粒径减小,粒径更加均一。
图2中e为TGE、TG-LP NPs和TG-HP NPs的紫外可见光谱,由图2中e可知,TGE、TG-LPNPs和TG-HP NPs显示出类似的没食子儿茶酚类的特征吸收峰(大约在270nm处)。
图2中f显示了TGE、TG-LP NPs和TG-HP NPs的傅里叶变换红外光谱图,在1527、1442和1620cm-1处显示了芳香环(C-C/C=C)的伸缩振动。在1720cm-1处的吸收属于芳香酯(C=O)的伸缩振动,表明纳米颗粒富含没食子儿茶酚类化合物或者它们的衍生物。TG-LPNPs和TG-HP NPs在1658cm-1处出现的吸收峰表明纳米颗粒中可能存在酰胺基团。这些结果清楚地说明了纳米颗粒的化学组成可能有儿茶酚类结构和酰胺基团。
图2中g为实施例1制备的没食子儿茶酚纳米颗粒的电位图;由图2中g可知,没食子儿茶酚纳米颗粒TG-LP NPs和TG-HP NPs的电位值分别是-27.97mV和-29.83mV,表明这两种纳米颗粒的稳定性良好。
性能测试
1、实施例1制备的TGE、没食子儿茶酚纳米颗粒(TG-LP NPs和TG-HP NPs)的抗氧化活性
1)DPPH·清除率测定
精密称取DPPH 19.7mg,加25mL甲醇,配置成浓度为2mM的DPPH工作液,吸取2mL上述工作液,再加18mL甲醇,定容至20mL,配制成浓度为0.2mM的DPPH工作液,于4℃冰箱避光保存。吸取150μL待测样品和75μL DPPH工作液,混合均匀,在室温环境中避光反应30min,使用酶标仪测量其在517nm处的吸光度。每个样品平行实验3次。DPPH·清除率计算公式为:
式2-1中,Abs0为空白对照组吸光度(去离子水代替待测样品),Abs1为待测样品吸光值,Abs2为样品对照吸光度(甲醇溶液代替DPPH工作液)。
2)ABTS+清除率测定
精密称取K2S2O833 mg,加少量去离子水溶解后,定容至50.00mL,配制成浓度为2.45mM的K2S2O8溶液。精密称取ABTS 38.00mg,加少量去离子水溶解,定容至10mL,配制成浓度为7.0mM的ABTS溶液。取K2S2O8溶液和ABTS溶液各10mL,均匀混合,在室温环境中避光孵育12h,用甲醇稀释混合溶液,使得其在734nm处的吸光度为0.70±0.02,得到ABTS自由基工作液。吸取50μL待测样品和150μLABTS自由基工作液,混合均匀,在室温环境中避光反应6min,使用酶标仪测量其在734nm处的吸光度。每个样品平行实验3次,ABTS+清除率计算公式如下:
按照上述测定步骤,以VC为对照样品进行对比,所得抗氧化活性结果见图3中a和b;通过DPPH和ABTS自由基清除实验评估实施例1制备的没食子儿茶酚纳米颗粒(TG-LP NPs和TG-HP NPs)的抗氧化活性,插图直观地展示了结果。TG-LP NPs和TG-HP NPs清除自由基的效率呈浓度依赖性,DPPH和ABTS溶液的颜色也随浓度的增加而逐渐消退。与VC和没食子提取液TGE相比,没食子儿茶酚纳米颗粒TG-LPNPs和TG-HP NPs的抗氧化活性有所降低,但仍然保留了原有的抗氧化活性。
2、实施例1制备的没食子儿茶酚纳米颗粒的pH响应性
1)将2.00mg实施例1制备的TG-HP NPs置于4.00mL pH值分别为2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0的不同缓冲溶液中(pH 2.0使用氯化钾-盐酸缓冲液;pH 3.0、4.0、5.0使用柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液;pH 6.0、7.0、8.0使用磷酸盐缓冲液;pH 9.0使用tris-HCl缓冲液;pH 10.0、11.0使用碳酸氢钠-氢氧化钠缓冲液),用涡旋混合器将溶液剧烈混合1分钟,在恒温振荡器中振荡30min(200rpm,37℃),然后取出观察溶液颜色变化,是否存在丁达尔效应,同时将混合溶液离心(9500g,15min),收集沉淀物分散在去离子水中,滴加在硅片上,干燥后喷金使用SEM观察pH值分别为2.0、5.0、7.0、9.0、10.0和11.0时所得没食子儿茶酚纳米颗粒的形貌变化。
图3中c为没食子儿茶酚纳米颗粒与水以及不同pH值的缓冲溶液共孵育振荡30分钟后丁达尔效应的强度变化图,可以看出,当pH值为8.0、9.0、10.0和11.0时,丁达尔效应的红光强度明显减弱。
图3中d为没食子儿茶酚纳米颗粒与不同pH值的缓冲溶液共孵育振荡30分钟后,没食子儿茶酚纳米颗粒的SEM图。可以明显地看到,在纳米颗粒与pH 9.0、pH 10.0和pH 11.0的缓冲液振荡后,大量的TG-HP NPs已经分解成小颗粒,当pH值为2.0、5.0和7.0时,纳米颗粒的形貌没有发生明显变化。
2)福林酚法测定儿茶酚的含量变化
A、制定没食子酸(GA)的标准曲线
取没食子酸对照品10.00mg,置50mL棕色量瓶中,加水溶解并稀释至刻度,摇匀,即得(每1mL中含没食子酸0.2mg);
精密量取对照品溶液100μL、150μL、200μL、250μL、300μL、350μL,分别置10mL棕色容量瓶中,各加入福林酚试剂0.5mL,摇匀,2min内加入2mL质量分数为15%的碳酸钠溶液,加水稀释至刻度,加塞拧紧,摇匀,以相应试剂为空白,转移至具塞棕色试管中,70℃水浴15min后迅速冷却,放置10分钟,照紫外-可见分光光度法(通则0401),在760nm的波长处测定吸光度,以吸光度为纵坐标,浓度为横坐标,绘制标准曲线,见图4;
B、测定TG-HP NPs在不同pH缓冲溶液中的儿茶酚含量变化:将实施例1制备的没食子儿茶酚纳米颗粒TG-HP NPs与不同pH值的缓冲液共孵育的溶液通过离心(9500g,15min)收集沉淀物,并加入1mL超纯水重悬,取250μL溶液置10mL棕色量瓶中,照标准曲线的制备(上述A中方法)中的方法,自“加入福林酚试剂0.5mL”开始,依法测定吸光度,根据标准曲线测得TG-HP NPs在不同pH缓冲溶液中没食子儿茶酚的量(μg),所得结果见图3中c。
图3中c为没食子儿茶酚纳米颗粒与水以及不同pH值的缓冲溶液共孵育振荡30分钟后纳米颗粒的质量和多酚含量随pH值的变化图;可以看出,当pH值大于7.0后,纳米颗粒的质量和多酚含量显著降低。
图3中c和d的实验结果均说明本发明制备的TG-HP NPs在碱性条件下(pH>7.0)更容易发生降解。
没食子儿茶酚纳米颗粒的成分分析
1)成分分析:将实施例1制备的TGE、没食子儿茶酚纳米颗粒TG-LP NPs和TG-HPNPs分别进行高效液相色谱-质谱分析联用(LC-MS)分析:取TGE、TG-LP NPs和TG-HP NPs分别用超纯水稀释至浓度为10mg/mL,过0.22μm滤膜,进样20μL于高效液相色谱系统中。流动相由溶剂A(蒸馏水/0.2%甲酸,499:1,v/v)和溶剂B(乙腈)的组成。采用梯度程序分离化合物:0-4min(93%-93%A),4-8min(93%-90%A)8-40min(90%-80%A),40-50min(80%-70%A),50-65min(70%-0%A),流速为1mL/min。
紫外检测器检测波长分别是254nm和269nm;ESI-MS条件:负离子模式;扫描范围:100-1250(m/z);离子源温度:120℃;去溶剂化温度:250℃;毛细管电压:2.8kV;锥电压:50V。
根据不同分子量的物质的质谱离子碎片以及化合物信息,推断纳米球TG-NPs的基础物质成分信息,所得结果见图5。图5为采用LC-MS测定TGE、TG-LP NPs和TG-HP NPs的化学组成的结果图。经分析鉴定后确认没食子多酚纳米球中含有2种主要成分,9个化合物,分别为没食子酸酚酸类(没食子酸和间双没食子酸)和没食子酸鞣质类(一-O-没食子酰基葡萄糖、二-O-没食子酰基葡萄糖、三-O-没食子酰基葡萄糖、四-O-没食子酰基葡萄糖、五-O-没食子酰基葡萄糖、六-O-没食子酰基葡萄糖、七-O-没食子酰基葡萄糖)。具体的质谱信息和鉴定结果如表1所示。
表1 TGE、TG-LP NPs和TG-HP NPs的化学组成、保留时间、质荷比和峰面积
图6为通过计算峰面积来比较不同纳米颗粒中主要成分的含量变化的热图,可以清楚地看到,TGE制备成纳米颗粒后,质荷比大于635的化合物的峰面积显著减少,表明没食子儿茶酚纳米颗粒TG-LP NPs和TG-HP NPs的形成主要由分子量较小的没食子儿茶酚低聚物(质荷比<635)组成的。图7为没食子中9种儿茶酚系列的化学结构式。
2)纳米颗粒的元素分析
将适量TG-LP NPs均匀分散在超纯水中,滴加于硅片上,干燥后喷金,使用SEM观察其形貌以及元素分析,所得结果见图8。图8为TG-LP NPs的EDX元素映射分析图,比例尺:200nm。结果表明,TG-LP NPs中存在C、O和N元素。N元素的存在提示没食子儿茶酚纳米颗粒的形成很可能与没食子中含有少量蛋白质的虫瘿有关。没食子是昆虫没食子蜂寄生于没食子树Quercus infectoria Oliv.上所形成的干燥虫瘿。没食子都是在树上所形成的干燥虫瘿。此外,它们都含有丰富的儿茶酚类结构。因此,推断没食子提取液中形态规则的纳米颗粒的形成实际上是由分子量小于等于635的儿茶酚类化合物和蛋白质的自组装形成的。
3)茚三酮显色反应
分别称取10.00mg的BSA、干燥后TGE、TG-LP NPs和TG-HP NPs,再加入5.00mL茚三酮显色溶液(1.50g茚三酮粉末+100.00mL正丁醇+3.00mL冰醋酸),搅拌均匀,随后置于沸水浴中加热10分钟,观察颜色变化并及时拍照。
图9为茚三酮反应的示意图,茚三酮反应是指在加热条件及弱酸环境下,α-氨基酸和一切蛋白质都能与茚三酮作用生成蓝紫色物质。
图10为阳性对照组(牛血清白蛋白(BSA))和样品组(没食子提取液TGE、没食子儿茶酚纳米颗粒TG-LP NPs和TG-HP NPs)中加入茚三酮显色液后的溶液图片。可以看到,对照组为蓝紫色溶液,样品组为紫黑色溶液,这是因为TGE、TG-LP NPs和TG-HP NPs本身的颜色是黄棕色的,所以最终叠加颜色是黑紫色的。这一结果表明TGE、TG-LP NPs和TG-HP NPs中确实存在蛋白质。
通过化学成分鉴定、元素分析以及茚三酮显色反应结果,没食子中形态规则的纳米颗粒是由较小分子量(质荷比<635)的儿茶酚类化合物和蛋白质的自组装形成的。
实施例2
精确称取600.00mg实施例1制备的TG-HS溶液(10mg/mL),加入60.00mL超纯水,搅拌均匀,再加入不同量的牛血清白蛋白(BSA)(10.00mg、30.00mg、50.00mg、100.00mg、200.00mg、300.00mg、400.00mg、500.00mg、600.00mg),在100℃加热回流搅拌(200rpm,2h),通过离心(5000g,10min)收集沉淀物,水洗3次(5000g,5min),弃掉上清液,得到纳米颗粒,分别标记为TG-BSA-1 NPs、TG-BSA-2 NPs、TG-BSA-3 NPs、TG-BSA-4 NPs、TG-BSA-5 NPs、TG-BSA-6 NPs、TG-BSA-7 NPs、TG-BSA-8 NPs和TG-BSA-9 NPs,冷冻干燥后,置于-20℃冰箱保存。
1)图11中a为没食子儿茶酚类化合物与BSA反应过程示意图;采用不同投料量BSA与TG-HS溶液反应,具体参数和所得纳米颗粒的质量见表2:
表2没食子儿茶酚蛋白质纳米颗粒TG-BSA NPs合成参数
表2显示加入不同投料量BSA后,得到的纳米颗粒的质量结果。由表2可知,随着蛋白质的不断加入,得到的纳米颗粒也越来越多,但是当TG-HS的投料量大于600mg,BSA的投料量大于400mg后,得到的纳米颗粒的量没有再显著增多,这说明,当BSA的投料量大于400mg后,TG-HS的儿茶酚类化合物已经消耗完毕,所以即使再投入更多的BSA,纳米颗粒的产量也不再增加。
2)对实施例2制备的没食子儿茶酚蛋白质纳米颗粒的pH响应性测定:
将4.00mg的TG-BSA NPs置于4mL pH值分别为3.0、7.0、9.0、11.0的不同缓冲溶液(pH 3.0使用柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液;pH 7.0使用磷酸盐缓冲液;pH 9.0使用tris-HCl缓冲液;pH 11.0使用碳酸氢钠-氢氧化钠缓冲液)中,用涡旋混合器将溶液剧烈混合1分钟,在恒温振荡器中振荡30min(200rpm,37℃),然后取出观察溶液颜色变化,同时将混合溶液离心(9500g,15min),收集沉淀物分散在去离子水中,滴加在硅片上,干燥后喷金使用SEM观察其形貌变化,所得结果见图11中d。
图11中d为实施例2制备的没食子儿茶酚蛋白质纳米颗粒TG-BSA-2 NPs(30mgBSA)和不同pH缓冲溶液孵育30分钟后的SEM图;插图:TG-BSA NPs加入不同pH缓冲溶液中(3.0,7.0,9.0和11.0)的照片,说明TG-BSA NPs也显示出明显的pH响应性。当TG-BSA NPs与不同pH值(3.0、7.0、9.0和11.0)的缓冲液混合时,溶液的颜色发生相应变化。在pH值为9.0和11.0的碱性缓冲溶液中,溶液由浑浊的乳白色迅速转变为清澈的黄褐色溶液。SEM图像显示,当pH值为3.0或7.0时,纳米颗粒的形貌变化不大,仍为形态规则的球状纳米颗粒。pH值为9.0和11.0时,纳米颗粒发生变形甚至消失。
3)图11中b为TG-HS溶液和添加不同BSA含量(b1-b6依次对应:10.00、30.00、50.00、100.00、200.00、300.00mg)形成的TG-BSA NPs的SEM图;b7、b8为BSA投量为30.00mg的TG-BSA NPs不同倍率条件的TEM图;说明该方法也能得到大量形态规则的球状纳米颗粒,与没食子提取液中存在的纳米颗粒的形貌十分相似。
4)图11中c为没食子儿茶酚蛋白质纳米颗粒TG-BSA NPs的EDX元素映射分析图,标尺均为100nm。结果表明,TG-BSA NPs中也存在C、O和N元素,这与TG-LP NPs的元素分析结果一致。
实施例3
精确称取600.00mg的TG-HS溶液(浓度为10mg/mL),加入60.00mL超纯水,搅拌均匀,再分别滴加10mL浓度为1mg/mL的牛血清白蛋白(BSA)、溶菌酶(LYZ)、细胞色素C(CYC)、β-乳球蛋白(bLG)、胃蛋白酶(Pepsin)、β-半乳糖苷酶(β-gal)、牛血红蛋白(Hgb)、牛血纤维蛋白源(FGN)、免疫球蛋白G(IgG)、辣根过氧化物酶(HRP)和葡萄糖氧化酶(GOX),机械搅拌(200rpm,2h),通过离心(5000g,10min)收集沉淀物,水洗3次(5000g,5min),收集所得沉淀物,标记为TG-protein NPs,分别冷冻干燥,置于-20℃冰箱保存。
精确称取600.00mg的TG-HS溶液(浓度为10mg/mL),加入60.00mL超纯水,搅拌均匀,再分别滴加10mL浓度为1mg/mL的牛血清白蛋白(BSA)、溶菌酶(LYZ)、细胞色素C(CYC)、β-乳球蛋白(bLG)、胃蛋白酶(Pepsin)、β-半乳糖苷酶(β-gal)、牛血红蛋白(Hgb)、牛血纤维蛋白源(FGN)、免疫球蛋白G(IgG)、辣根过氧化物酶(HRP)和葡萄糖氧化酶(GOX),在100℃加热回流搅拌(200rpm,2h),通过离心(5000g,10min)收集沉淀物,水洗3次(5000g,5min),收集所得沉淀物,标记为TG-protein NPs(△),分别冷冻干燥,置于-20℃冰箱保存。
图12中a为不同分子量、脂肪指数和等电点的模型蛋白图。(x轴:等电点;y轴:分子量;z轴:脂肪族指数);b为没食子提取物TG-HS与10种蛋白质自组装形成纳米颗粒过程中不同提取状态的SEM变化图。
由图12可知,相对于TG-LP NPs和TG-HP NPs粗糙的表面,TG-protein NPs具有较为光滑完整的表面,这是因为TG-protein NPs的形成涉及到较高的蛋白质投料量,这有助于多酚与蛋白质之间的高粘附。且通过SEM结果可以看出,采用加热回流提取进行自组装过程,可以得到形态更加规则的球状纳米颗粒。该结果表明即使是不同类型的蛋白质,没食子提取物也能与该蛋白质形成形态规则的球状纳米颗粒。
蛋白质活性验证:
A549细胞内β-Gal酶活性测定,按照β-半乳糖苷酶染色试剂盒的制造商的规程进行:
原理:β-半乳糖苷酶染色试剂盒,以X-Gal为底物,在衰老特异性的β-半乳糖苷酶催化下会生成深蓝色产物,从而在光学显微镜下很容易观察到变成蓝色的表达β-半乳糖苷酶的细胞。
TG-β-gal NPs:制备过程不回流加热,单纯的混匀搅拌。
TG-β-gal NPs(△):制备过程伴随着回流搅拌。
方法:以β-半乳糖苷酶(β-gal)为例,将负载β-gal的儿茶酚蛋白纳米颗粒(TG-β-gal NPs)与A549细胞共孵育24h,然后用PBS洗涤2次,用固定液固定10分钟。PBS洗涤细胞3次,每次3分钟,加入含体积分数5%的5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃半乳糖苷(X-Gal)的工作液,在37℃,无CO2的培养箱中孵育过夜,用光学显微镜观察并拍照记录,所得结果见图13。
如图13所示,与给予游离β-Gal的对照组(Control)相比,TG-β-gal NPs组的细胞显蓝色,颜色较深;TG-β-gal NPs(△)组的部分细胞显蓝色,颜色较淡。
结果说明:通过简单自组装得到的儿茶酚蛋白纳米颗粒可以保留蛋白质的活性。如果纳米颗粒的制备过程伴随着回流加热,可以保留部分蛋白质自身的活性。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种儿茶酚纳米颗粒的制备方法,包括以下步骤:
将含鞣质类化合物的天然植物药和水混合,进行加热回流提取,得到植物药提取液;所述加热回流使儿茶酚类化合物和蛋白质发生自组装;
将所述植物药提取液分级分离后,得到儿茶酚纳米颗粒;
所述加热回流提取的方式为常压回流提取或减压回流提取;所述常压回流提取的时间为2h;所述减压回流提取的时间为2h;
所述儿茶酚纳米颗粒为球状纳米颗粒,由儿茶酚和蛋白质自组装形成,所述儿茶酚纳米颗粒的平均粒径为413.89±202.95nm;
所述含鞣质类化合物的天然植物药为没食子。
2.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,所述含鞣质类化合物的天然植物药的质量和水的体积之比为1g:8mL;所述常压回流提取的温度为100℃;所述减压回流提取的温度为50℃。
3.根据权利要求1或2所述的制备方法,其特征在于,所述分级分离包括:将所述植物药提取液进行第一离心分离后,得到上清液和儿茶酚纳米颗粒;所述第一离心分离的离心力为6577g,离心时间为10min。
4.根据权利要求3所述的制备方法,其特征在于,所述分级分离还包括:将所述上清液进行第二离心分离后,得到儿茶酚纳米颗粒;所述第二离心分离的离心力为9500g,时间为10min。
5.权利要求1~4任一项所述制备方法制备得到的儿茶酚纳米颗粒,其特征在于,由儿茶酚和蛋白质自组装形成,所述儿茶酚纳米颗粒的平均粒径为413.89±202.95nm或230.34±59.48nm。
6.一种儿茶酚蛋白质纳米颗粒的制备方法,包括以下步骤:
按照权利要求1所述制备方法制备植物药提取液;
将所述植物药提取液进行第一离心分离,将所得第一上清液第二离心分离后,将所得第二上清液、水和蛋白质混合,在加热条件下进行自组装,分离后,得到儿茶酚蛋白质纳米颗粒。
7.根据权利要求6所述的制备方法,其特征在于,所述蛋白质包括牛血清白蛋白、溶菌酶、细胞色素C、β-乳球蛋白、胃蛋白酶、β-半乳糖苷酶、牛血红蛋白、牛血纤维蛋白源、免疫球蛋白G、辣根过氧化物酶或葡萄糖氧化酶;所述蛋白质与第二上清液的质量比为(10~300):600。
8.根据权利要求6所述的制备方法,其特征在于,所述加热的温度为100℃;所述自组装的时间为2h;所述分离的方式为离心分离,所述离心分离的离心力为5000g,时间为10min。
9.权利要求6~8任一项所述制备方法制备得到的儿茶酚蛋白质纳米颗粒。
10.权利要求5所述儿茶酚纳米颗粒或权利要求9所述儿茶酚蛋白质纳米颗粒在制备药物载体中的应用。
Priority Applications (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202210932024.5A CN115300496B (zh) | 2022-08-04 | 2022-08-04 | 一种儿茶酚纳米颗粒、儿茶酚蛋白质纳米颗粒及其制备方法和应用 |
US18/228,761 US20240091170A1 (en) | 2022-08-04 | 2023-08-01 | Catechol Nanoparticle, Catechol Protein Nanoparticle, and Preparation Method and Use Thereof |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202210932024.5A CN115300496B (zh) | 2022-08-04 | 2022-08-04 | 一种儿茶酚纳米颗粒、儿茶酚蛋白质纳米颗粒及其制备方法和应用 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN115300496A CN115300496A (zh) | 2022-11-08 |
CN115300496B true CN115300496B (zh) | 2023-09-26 |
Family
ID=83859637
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202210932024.5A Active CN115300496B (zh) | 2022-08-04 | 2022-08-04 | 一种儿茶酚纳米颗粒、儿茶酚蛋白质纳米颗粒及其制备方法和应用 |
Country Status (2)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20240091170A1 (zh) |
CN (1) | CN115300496B (zh) |
Citations (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6509054B1 (en) * | 2000-05-05 | 2003-01-21 | American Fruits And Flavors | Food additives having enlarged concentration of phenolics extracted from fruits, and process of obtaining the same |
JP2006045121A (ja) * | 2004-08-04 | 2006-02-16 | Maruzen Pharmaceut Co Ltd | 抗菌性組成物 |
JP2009091315A (ja) * | 2007-10-10 | 2009-04-30 | Nth:Kk | ナチュラルヘナ抽出物とその用途 |
AU2009246081A1 (en) * | 2008-05-16 | 2009-11-19 | Ethical Solutions, Llc | Green synthesis of nanometals using plant extracts and use thereof |
KR20110019789A (ko) * | 2009-08-21 | 2011-03-02 | 박상재 | 카테킨화합물과 베타글루칸을 함유하는 기능성 쌀 코팅용 조성물 |
WO2016036882A1 (en) * | 2014-09-03 | 2016-03-10 | Plandai Biotechnology Inc. | Green tea compositions |
JP2016037461A (ja) * | 2014-08-06 | 2016-03-22 | ユーハ味覚糖株式会社 | 天然物由来成分を基材とするナノ粒子の製造方法 |
WO2019044672A1 (ja) * | 2017-08-28 | 2019-03-07 | 株式会社Nbcメッシュテック | ポリフェノールの製造方法 |
CA3120006A1 (en) * | 2018-11-15 | 2020-05-22 | Psigryph Inc. | Plant tissue-derived nanoparticles and food powders |
-
2022
- 2022-08-04 CN CN202210932024.5A patent/CN115300496B/zh active Active
-
2023
- 2023-08-01 US US18/228,761 patent/US20240091170A1/en active Pending
Patent Citations (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6509054B1 (en) * | 2000-05-05 | 2003-01-21 | American Fruits And Flavors | Food additives having enlarged concentration of phenolics extracted from fruits, and process of obtaining the same |
JP2006045121A (ja) * | 2004-08-04 | 2006-02-16 | Maruzen Pharmaceut Co Ltd | 抗菌性組成物 |
JP2009091315A (ja) * | 2007-10-10 | 2009-04-30 | Nth:Kk | ナチュラルヘナ抽出物とその用途 |
AU2009246081A1 (en) * | 2008-05-16 | 2009-11-19 | Ethical Solutions, Llc | Green synthesis of nanometals using plant extracts and use thereof |
KR20110019789A (ko) * | 2009-08-21 | 2011-03-02 | 박상재 | 카테킨화합물과 베타글루칸을 함유하는 기능성 쌀 코팅용 조성물 |
JP2016037461A (ja) * | 2014-08-06 | 2016-03-22 | ユーハ味覚糖株式会社 | 天然物由来成分を基材とするナノ粒子の製造方法 |
WO2016036882A1 (en) * | 2014-09-03 | 2016-03-10 | Plandai Biotechnology Inc. | Green tea compositions |
WO2019044672A1 (ja) * | 2017-08-28 | 2019-03-07 | 株式会社Nbcメッシュテック | ポリフェノールの製造方法 |
CA3120006A1 (en) * | 2018-11-15 | 2020-05-22 | Psigryph Inc. | Plant tissue-derived nanoparticles and food powders |
Non-Patent Citations (5)
Title |
---|
Green synthesis of plant-mediated metal nanoparticles: The role of polyphenols;Latif M S, Abbas S, Kormin F, et al.;Asian J. Pharm. Clin. Res.;全文 * |
Polyphenol nanoparticles from commonly consumed tea for scavenging free radicals, stabilizing pickering emulsions, and inhibiting cancer cell;Chen G, Yi Z, Chen X, et al.;ACS Applied Nano Materials;第4卷;全文 * |
Self-assembled micellar nanocomplexes comprising green tea catechin derivatives and protein drugs for cancer therapy;Chung JE, Tan S, Gao SJ;Nat Nanotechnol;第9卷;摘要、结果与讨论 * |
表没食子儿茶素没食子酸酯性质、稳定性及其递送体系的研究进展;闫晓佳;梁秀萍;李思琪;刘畅;刘夫国;;食品科学(01);全文 * |
闫晓佳 ; 梁秀萍 ; 李思琪 ; 刘畅 ; 刘夫国 ; .表没食子儿茶素没食子酸酯性质、稳定性及其递送体系的研究进展.食品科学.(01),全文. * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
US20240091170A1 (en) | 2024-03-21 |
CN115300496A (zh) | 2022-11-08 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Ntone et al. | Not sequentially but simultaneously: Facile extraction of proteins and oleosomes from oilseeds | |
Xue et al. | Physicochemical properties of soy protein isolates-cyanidin-3-galactoside conjugates produced using free radicals induced by ultrasound | |
Lu | Synthesis and characterization of amino-functionalized silica nanoparticles | |
CN106727428A (zh) | 一种芦丁‑玉米醇溶蛋白‑酪蛋白酸钠复合纳米粒子及其制备方法 | |
CN110558435A (zh) | 一种虾青素纳米脂质体及其制备方法和应用 | |
Wang et al. | Formation of soybean protein isolate-hawthorn flavonoids non-covalent complexes: Linking the physicochemical properties and emulsifying properties | |
Zhang et al. | Influence of environmental pH on the interaction properties of WP‐EGCG non‐covalent nanocomplexes | |
CN105651752B (zh) | 淀粉样蛋白的检测方法 | |
Araújo et al. | Physicochemical characterisation and release behaviour of curcumin-loaded lactoferrin nanohydrogels into food simulants | |
CN115300496B (zh) | 一种儿茶酚纳米颗粒、儿茶酚蛋白质纳米颗粒及其制备方法和应用 | |
Contreras-Machuca et al. | Chemical characterization and microencapsulation of extracellular fungal pigments | |
Xu et al. | Preparation and evaluation of a Rubropunctatin-loaded liposome anticancer drug carrier | |
CN107582421A (zh) | 一种具有抗衰老功效的化妆品用微球的制备方法 | |
Wang et al. | The phenolic profile of walnut meal protein isolate and interaction of phenolics with walnut protein | |
Berrecoso et al. | Quantification of the actual composition of polymeric nanocapsules: a quality control analysis | |
Li et al. | Effect of pH treatment on physical stability and antioxidant activity of buckwheat protein/soybean polysaccharide nanocomplex embedded pterostilbene | |
Li et al. | Different interactions between Tartary buckwheat protein and Tartary buckwheat phenols during extraction: Alterations in the conformation and antioxidant activity of protein | |
TW201924708A (zh) | 活性成分萃取方法 | |
Zhang et al. | Effect of the mass ratio of heat-treated whey protein isolate to anthocyanin on its composite properties | |
EP0142309B1 (en) | Method of preparing steroid compoundshaving a reduced particle size form | |
CN114306248B (zh) | 一种壳聚糖黄杞总黄酮纳米粒及其制备方法 | |
CN110642839A (zh) | 一种纳米探针及其制备方法与应用 | |
Pan et al. | Phospholipid complex of ICA and ICA II prepared by wet media milling for improving bioavailability | |
Li et al. | Effects of pH Values on physicochemical properties and antioxidant potential of whey protein isolate-safflower yellow complexes | |
CN111329838B (zh) | 一种紫杉醇脂质体药物组合物及其制备方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |