CN115279915A

CN115279915A - 依托泊苷糖苷、其制备方法及其作为抗癌药物的用途

Info

Publication number: CN115279915A
Application number: CN202180021186.7A
Authority: CN
Inventors: 丁昇; Y-P·K·周; J·D·S·沃思; 许田; 翁经科
Original assignee: Derui Biomedical Co ltd
Current assignee: Derui Biomedical Co ltd
Priority date: 2020-03-16
Filing date: 2021-03-15
Publication date: 2022-11-01
Also published as: US20230192748A1; EP4121546A1; WO2021188457A1

Abstract

公开了依托泊苷糖苷和制备依托泊苷糖苷的方法。糖基转移酶催化一种或多种单糖加入依托泊苷以产生依托泊苷糖苷。合适的单糖可以是L‑或D‑构型并且通常具有5、6或7个碳。合适的单糖包括阿洛糖、芹菜糖、阿拉伯糖、果糖、岩藻糖醇、岩藻糖、半乳糖、葡萄糖、葡糖醛酸、甘露糖、N‑乙酰葡糖胺、鼠李糖或木糖。尿苷二磷酸糖基转移酶可以催化α或β糖苷键的形成。

Description

依托泊苷糖苷、其制备方法及其作为抗癌药物的用途

相关申请

本申请要求于2020年3月16日提交的美国临时申请第62/990,124号的权益。上述申请的全部教导通过引用并入本文。

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a)文件名称：57671002001SequenceListing.txt；创建于2021年3月15日，大小为18KB。

背景技术

癌症是特征为由于遗传和环境因素的组合而出现的异常细胞不受控制的生长和增殖的一组疾病。它是全球第二大死因，每天有六分之一的人死于癌症(美国癌症协会，2018年)。随着世界人口平均年龄的上升，预计新发癌症病例的数量将会增加。

发明内容

本文描述了含有特定单糖或寡糖的依托泊苷衍生物以及利用酶催化制备这些分子的方法。与依托泊苷相比，依托泊苷糖苷表现出增加的水溶性，这可能有助于改善药代动力学和/或药效学特征。这些化合物可以作为依托泊苷的前药。这些化合物可以显示出对抑制DNA拓扑异构酶II蛋白活性的效力的改进。这些化合物作为抗癌剂可以表现出增强的治疗效果。

因此，本发明提供了可以作为依托泊苷前药的化合物，其具有对抑制DNA拓扑异构酶II蛋白活性的效力的潜在改进和增强抗癌作用。

本文描述了由以下结构式表示的化合物：

或其药学上可接受的盐，其中，R和/或R'是单糖、二糖、三糖或具有4至10个单糖的寡糖。

本文描述了药物组合物，其包括依托泊苷糖苷或其药学上可接受的盐，及药学上可接受的载体或佐剂。

本文描述了制备依托泊苷糖苷的方法。所述方法包括：a)提供反应混合物；和b)使反应混合物将依托泊苷转化为依托泊苷的单糖、二糖或寡糖。所述反应混合物可以包括具有以下结构式的化合物

尿苷二磷酸糖基转移酶(UGT)；和尿苷二磷酸单糖。形成的化合物可以具有以下结构式：

其中，R、R’和/或R”是单糖、二糖、三糖、或具有4至10个单糖的寡糖。

在某些实施方式中，R、R'和/或R”是单糖。在某些实施方式中，单糖是戊糖单糖、己糖单糖或庚糖单糖。

在某些实施方式中，R、R'和/或R”是阿洛糖、芹菜糖、阿拉伯糖、果糖、岩藻糖醇、岩藻糖、半乳糖、葡萄糖、葡糖醛酸、甘露糖、N-乙酰葡糖胺、N-乙酰半乳糖胺、鼠李糖、或木糖。在某些实施方式中，R是葡糖胺、半乳糖胺、甘露糖胺、5-硫代-D-葡萄糖、野尻霉素、脱氧野尻霉素、1,5-脱水-D-山梨糖醇、2,5-脱水-D-甘露糖醇、2-脱氧-D-半乳糖、2-脱氧-D-葡萄糖、3-脱氧-D-葡萄糖、阿拉伯糖醇、半乳糖醇、葡萄糖醇、艾杜糖醇、来苏糖、甘露糖醇、L-鼠李糖醇、2-脱氧-D-核糖、核糖、核糖醇、核酮糖、木酮糖、阿卓糖、古洛糖、艾杜糖、左旋糖(levulose)、阿洛酮糖、山梨糖、塔格糖、塔罗糖、半乳醛、葡萄糖毒醛、岩藻烯糖、鼠李醛、阿拉伯醛、木糖醛(xylal)、3,4-二-O-乙酰-L-岩藻烯糖、3,4-二-O-乙酰-L-鼠李醛、3,4-二-O-乙酰-D-阿拉伯醛、3,4-二-O-乙酰-D-木糖醛、井冈胺、井冈霉胺、井冈霉醇胺、链霉菌醇、有效烯酮(valienone)、半乳糖醛酸、甘露糖醛酸、N-乙酰神经氨酸、N-乙酰胞壁酸、葡萄糖酸D-内酯、半乳糖酸γ-内酯、半乳糖酸δ-内酯、甘露酸γ-内酯、D-阿卓-庚酮糖、D-甘露-庚酮糖、D-甘油-D-甘露-庚糖、D-甘油-D-葡萄糖-庚糖、D-阿洛-庚酮糖(D-allo-heptulose)、D-阿卓-3-庚酮糖、D-甘油-D-甘露-庚糖醇、或D-甘油-D-阿卓-庚糖醇。

在某些实施方式中，R、R’和/或R”是二糖。在某些实施方式中，R、R’和/或R”是两个葡萄糖分子的二糖。在某些实施方式中，R、R’和/或R”是两个半乳糖分子的二糖。在某些实施方式中，R、R’和/或R”是两个木糖分子的二糖。对于任何前述二糖，二糖分子可以通过1→2糖苷键、1→3糖苷键或1→4糖苷键结合。

在某些实施方式中，R、R’和/或R”是三糖。在某些实施方式中，R、R’和/或R”是三个葡萄糖分子的三糖。在某些实施方式中，R、R’和/或R”是三个半乳糖分子的三糖。在某些实施方式中，R、R’和/或R”是三个木糖分子的三糖。对于任何前述三糖，三糖分子可以通过1→2糖苷键和通过1→4糖苷键结合。

在某些实施方式中，UGT包括与SEQ ID NO:1具有至少95％相似性的氨基酸序列。在某些实施方式中，UGT包括与SEQ ID NO:1的A340至Q382区域具有至少80％相似性的氨基酸序列。在某些实施方式中，UGT包括如下氨基酸序列：与SEQ ID NO:1的I84至S99区域具有至少90％相似性；与SEQ ID NO:1的D126至F134区域具有至少90％相似性；与SEQ ID NO:1的L147至S149区域具有至少90％相似性；和与SEQ ID NO:1的A340至Q382区域具有至少80％相似性。

在某些实施方式中，UGT包括与SEQ ID NO:2具有至少95％相似性的氨基酸序列。在某些实施方式中，UGT包括与SEQ ID NO:2的V278至Q318区域具有至少80％相似性的氨基酸序列。在某些实施方式中，UGT包括如下氨基酸序列：与SEQ ID NO:2的I67至D75区域具有至少90％相似性；与SEQ ID NO:2的D106至L114区域具有至少90％相似性；与SEQ ID NO:2的C127至S129区域具有至少90％相似性；和与SEQ ID NO:2的V278至Q318区域具有至少80％相似性。

在某些实施方式中，UGT包括与SEQ ID NO:3具有至少95％相似性的氨基酸序列。在某些实施方式中，UGT包括与SEQ ID NO:3的V291至Q331区域具有至少80％相似性的氨基酸序列。在某些实施方式中，UGT包括如下氨基酸序列：与SEQ ID NO:3的W74至V82区域具有至少90％相似性；与SEQ ID NO:3的D111至V119区域具有至少90％相似性；与SEQ ID NO:3的F132至N134区域具有至少90％相似性；和与SEQ ID NO:3的V291至Q331区域具有至少80％相似性。

在某些实施方式中，UGT包括与SEQ ID NO:4具有至少95％相似性的氨基酸序列。在某些实施方式中，UGT包括与SEQ ID NO:4的V280至Q320区域具有至少80％相似性的氨基酸序列。在某些实施方式中，UGT包括如下氨基酸序列：与SEQ ID NO:4的I67至D75区域具有至少90％相似性；与SEQ ID NO:4的D106至L114区域具有至少90％相似性；与SEQ ID NO:4的C127至S129区域具有至少90％相似性；和与SEQ ID NO:4的V280至Q320区域具有至少80％相似性。

在某些实施方式中，UGT包括与SEQ ID NO:5具有至少95％相似性的氨基酸序列。在某些实施方式中，UGT包括与SEQ ID NO:5的V283至Q323区域具有至少80％相似性的氨基酸序列。在某些实施方式中，UGT包括如下氨基酸序列：与SEQ ID NO:5的I67至Q79区域具有至少90％相似性；与SEQ ID NO:5的D110至L118区域具有至少90％相似性；与SEQ ID NO:5的C131至T133区域具有至少90％相似性；和与SEQ ID NO:5的V283至Q323区域具有至少80％相似性。

在某些实施方式中，尿苷二磷酸-单糖是尿苷二磷酸-葡萄糖(“UDP-葡萄糖”)、尿苷二磷酸-半乳糖(“UDP-半乳糖”)、尿苷二磷酸-木糖(“UDP-木糖”)、或尿苷二磷酸-N-乙酰葡糖胺(“UDP-N-乙酰葡糖胺”)。

本文描述了治疗癌症的方法。所述方法可以包括向有需要的患者施用治疗有效量的具有以下结构式的化合物：

或其药学上可接受的盐，其中，R和/或R’是单糖、二糖、三糖、或包含4至10个单糖的寡糖。

在某些实施方式中，所述方法进一步包括向患者施用一种或多种化疗剂(例如，贝伐单抗、博来霉素、卡莫司汀、顺铂、卡铂、环磷酰胺、阿糖胞苷、阿霉素、异环磷酰胺、甲氨蝶呤、米托蒽醌、丙卡巴肼、沙利度胺、长春花碱和/或长春新碱)和/或免疫系统抑制剂(例如，地塞米松、强的松或甲基强的松龙)。

在某些实施方式中，患者患有难治性睾丸肿瘤、小细胞肺癌、淋巴瘤、非淋巴细胞白血病、尤文氏肉瘤、卡波西肉瘤、中枢神经系统癌、前列腺癌、睾丸癌、卵巢癌、乳腺癌、胃癌或黑色素瘤。

附图说明

如附图中所示，从以下对示例实施方式的更具体的描述中，前述内容将变得显而易见，其中相同的附图标记在不同视图中指代相同的部分。附图不一定按比例绘制，而是重点放在说明性实施方式上。

图1显示当依托泊苷用作底物并且UDP-葡萄糖用作糖供体时，使用来自SEQ IDNO:2的细胞裂解物(2：顶部色谱图)和仅空载体对照(1：底部色谱图)的UGT筛选结果的HPLC色谱图。SEQ ID NO:2的色谱图中突出显示的两个额外峰是糖基化产物依托泊苷-3”-O-D-葡萄糖苷(色谱峰a)和依托泊苷-4'-O-D-葡萄糖苷(色谱峰b)。

图2显示当依托泊苷用作底物并且UDP-葡萄糖用作糖供体时，来自SEQ ID NO:3(2：中间色谱图)、SEQ ID NO:3(3：顶部色谱图)和不含糖基转移酶的对照反应(1：底部色谱图)的纯化重组糖基转移酶测定结果的HPLC色谱图。标记的峰显示依托泊苷-3”-O-D-葡萄糖苷(色谱峰a)和依托泊苷-4'-O-D-葡萄糖苷(色谱峰b)。

图3是显示依托泊苷和依托泊苷-3”-O-D-葡萄糖苷的水溶性的图表。

图4是五个UGT(SEQ ID NO:1-5)的多序列比对，突出显示了对催化功能重要的相似序列区域。PSPG盒带有下划线。受体结合残基以粗体显示。序列相似性由使用BLOSUM62评分矩阵的正BLAST相似性定义，存在：11，扩展：1空位罚分。

图5显示了UGT的3D结构，指示了对于底物和/或供体结合重要的序列区域。所有底物都用黑色碳棒着色(氧＝红色，氮＝蓝色，磷＝橙色)。Cartoon蛋白质从N端至C端是彩虹。中心：由多个UGT晶体结构和同源模型组成的全局结构叠加。如图所示，放大区域从右上角顺时针方向：I84-S99、L147-S129、A3407-Q382、D126-F134。所有编号遵循SEQ ID NO:1的序列，相关氨基酸显示为棒。

具体实施方式

下面是示例实施方式的描述。

癌症

癌症是特征为由于遗传和环境因素的组合而出现的异常细胞不受控制的生长和增殖的一组疾病。它是全球第二大死因，每天癌症引起死亡的六分之一(美国癌症协会，2018年)。随着世界人口平均年龄的上升，预计新发癌症病例的数量将会增加。

癌症患者的5年生存率在很大程度上取决于许多因素，包括癌症的类型、诊断时的癌症分期、患者年龄、可用医疗保健的质量和居住国。例如，从2010年至2014年，印度前列腺癌患者的5年生存率仅为44％，而美国前列腺癌患者的5年生存率为97％(美国癌症协会，2018年)。

标准癌症治疗方案通常包括手术、一种或多种化学治疗剂和放射疗法。根据癌症的特征，激素疗法、免疫疗法和靶向疗法也是可能的。通常需要许多额外的药物来控制这些治疗的副作用。

癌症的货币成本不仅来自治疗、护理和康复成本，还来自间接成本，如工作效率的损失和对家庭帮助和儿童保育的需求增加。全世界癌症的成本未知，但估计每年高达数千亿美元(美国癌症协会，2018年)。2015年美国与癌症相关的直接医疗费用约为802亿美元(美国癌症协会，2018年)。

依托泊苷

依托泊苷是由以下结构式表示的化合物：

依托泊苷(也称为VP-16)是一种半合成化疗药物，由Sandoz Pharmaceuticals于1966年从天然产物鬼臼毒素(Hande 1998)中首次合成。在1978年将该药授权给Bristol-Myers Squibb后，依托泊苷于1983年被FDA批准为VePesid，用于治疗各种癌症。依托泊苷可作为静脉内(IV)制剂或口服胶囊剂，用于治疗难治性睾丸肿瘤、小细胞肺癌、淋巴瘤、非淋巴细胞白血病、尤文氏肉瘤、卡波西肉瘤、中枢神经系统癌、前列腺癌、睾丸癌和卵巢癌(Hande 1998；“Etoposide”[2005]2020；“NCCN Chemotherapy Order Templates”n.d.)。在临床试验中，依托泊苷在乳腺癌、胃癌和黑色素瘤中也显示出某些疗效(Hande 1998)。

虽然鬼臼毒素与微管结合并抑制其组装，但依托泊苷仅在远高于与引起临床效果相关的浓度时才抑制微管组装。相反，依托泊苷通过毒化DNA拓扑异构酶II发挥其细胞毒性和抗肿瘤活性(Arnold 1979；van Maanen等1988；Hande 1998)。DNA拓扑异构酶II通过在DNA螺旋中临时引入双链断裂来调节DNA缠绕和解旋。依托泊苷稳定共价结合的拓扑异构酶-DNA切割复合物，导致瞬时DNA双链断裂的过度积累。当其他复制机制或解旋酶试图穿过这个共价连接的复合物时，复合物被破坏，双链断裂成为永久性的。然后这些断裂发生重组并产生插入、缺失和染色体重排，从而破坏基因组的稳定性并通过细胞凋亡导致细胞死亡。

自批准以来的几十年里，依托泊苷的生物物理特性和药代动力学/药效学(PK/PD)已得到很好的描述(Mylan Pharmaceuticals Inc.2016；Squibb 2019；Hande 1998)。依托泊苷具有高度亲脂性，97％的依托泊苷与血浆蛋白(主要是白蛋白)结合。依托泊苷经过代谢转化为次级代谢物，其特征在于开放的内酯环、O-去甲基化(主要通过细胞色素P450CYP3A4)或通过葡萄糖醛酸化和硫酸化结合。依托泊苷的半衰期为4-11小时。在小细胞肺癌患者中，发现长期暴露于低剂量依托泊苷比短期高剂量依托泊苷治疗更有效。接受5天依托泊苷治疗的患者中有89％显示出治疗反应，而在1天内接受相同剂量依托泊苷的患者中只有10％的患者表现出治疗反应(Slevin等，1990)。

尽管它作为抗癌治疗剂取得了成功，但依托泊苷具有限制其应用的特征。依托泊苷在水溶液中高度不溶(150-170μg/mL，37℃)，只能溶解在含有增溶剂的复杂制剂中，如聚乙二醇、吐温80和二甲基亚砜(DMSO)(Shah，Chen和Chow 1989；Hande 1998)。即使在溶解依托泊苷并成功地将药物稀释到生理液和常用的静脉注射制剂稀释剂中后，依托泊苷在低至1μg/mL的浓度下仅在几个小时后就会沉淀(Tian，He和Tang 2007；Arnold 1979；Hande1998)。由于水溶性低，通过静脉注射用依托泊苷治疗需要大量的静脉注射溶液。这导致了较长的给药时间并限制了患者在家中自行给药的能力。需要大的静脉注射注射量和加入增溶剂会导致不舒服和危险的副作用，包括药物过敏、低血压和心力衰竭(Hande 1998)。

此外，依托泊苷具有保持稳定的非常窄的pH范围(Beijnen等.1988)。在酸性(pH<5)水环境中，依托泊苷很容易失去C1糖部分。在酸性条件下的额外降解反应打开反式内酯环以形成依托泊苷苷元的羟基酸衍生物。在碱性(pH>5)水环境中，依托泊苷保留其C1糖基，但很容易将反式内酯环差向异构化为顺式内酯环并进一步降解为羟基酸衍生物。因为依托泊苷苷元和顺式-内酯衍生物比依托泊苷表现出更低的细胞毒性，这些降解途径导致活性化合物的可用性降低(van Maanen等.1988)。除了这种化学不稳定性之外，依托泊苷还是药物流出p-糖蛋白转运系统的底物，其进一步限制了活性依托泊苷的可用性(Squibb 2019)。

依托泊苷的口服制剂具有维持长期暴露于低剂量依托泊苷的益处。然而，口服依托泊苷制剂在患者间和患者体内的生物利用度差异显著(范围从25％至50％)，这可能是由于该化合物在体内代谢降解动力学中固有的不稳定性和可变性(Toffoli等.2001；Rezonja等.2013；Squibb 2019；Mylan Pharmaceuticals Inc.2016；Hande 1998)。

已经尝试解决这些问题。已经描述了含有依托泊苷的脂质乳剂制剂，其导致更长的保质期和稳定性。Tian等(Tian，He和Tang 2007)描述了一个实例，其中依托泊苷在脂质乳液中的保质期在25℃为47天(而在水溶液中为9.5天)，而半衰期在80℃和pH 5条件下为54.7小时(水溶液中为38.6分钟)。然而，即使在这种脂质乳剂配方中，半衰期仍会随着pH值的增加(在pH 8时下降至1.5小时的半衰期)和依托泊苷浓度的增加而显著降低。

已经描述了几种在4'羟基处具有可水解部分的依托泊苷前药。这些可水解基团包括丙酰基羧基、哌啶基哌啶、葡萄糖和磷酸基团(Hatfield等.2008；Wrasidlo等.2002；Keilholz等.2017；US 7,241,595，Kolar等.2004；Squibb 2019；Hande 1998)。已知4'羟基有助于依托泊苷的生物活性(van Maanen等.1988)。因此，在这些位置具有化学基团的依托泊苷前药将是无活性的，直至所述化学基团被去除。

丙酰基羧基依托泊苷衍生物和哌啶基哌啶依托泊苷衍生物通过在体内各种组织中表达的羧基酯酶或通过重组的、生物工程化的羧基酯酶转化为活性依托泊苷(Hatfield等.2008)。一种称为CAP7.1的丙酰基羧基依托泊苷衍生物以纳摩尔浓度对依托泊苷耐药细胞系具有细胞毒性，并且在I期临床试验中显示出有希望的安全性(Keilholz等.2017；Wrasidlo等.2002)。糖基化的依托泊苷衍生物在专利(US 7,241,595，Kolar等，2004)中被描述为被共价连接至肿瘤靶向抗体的重组糖苷酶水解。磷酸依托泊苷(Etopophos^TM)是FDA批准的一种依托泊苷前药衍生物(Squibb 2019；Hande 1998)。磷酸依托泊苷通过IV注射施用，并显示具有改善的水溶性(20mg/mL)。它被血液中表达的碱性去磷酸酶完全快速地转化为活性形式，并且可以以较低的体积安全地快速施用。在临床前试验和临床试验中，磷酸依托泊苷加顺铂或依托泊苷加顺铂治疗之间的PK/PD参数或总体响应率之间没有统计学上的显著差异。使用这种前药的主要限制是成本，因为非专利依托泊苷便宜得多。

依托泊苷的其他位置有望成为开发新的依托泊苷衍生物或前药的潜在修饰位点。例如，C1糖苷基团，尤其是葡萄糖上的两个羟基，是生物活性所必需的(van Maanen等.1988)。迄今为止，据信尚未描述在这些位置具有修饰的依托泊苷前药。因此，仍然存在开发具有改善的水溶性和增加的稳定性的依托泊苷衍生物或前药的未开发机会。这种药物衍生物可以允许使用更有效、更低的药物剂量，从而减少由依托泊苷的抗肿瘤活性及其溶解度问题引起的毒副作用。

糖基化

改善或调节基于小分子的治疗剂(如依托泊苷)的功效、安全性和/或PK/PD特征的潜在策略是通过糖基化修饰。通过将一个或多个糖基或两个以上糖基的链(称为寡糖)添加到苷元的亲核中心来修饰小分子或苷元。这些糖基可以是天然存在的糖，如葡萄糖、果糖、鼠李糖、甘露糖、半乳糖、岩藻糖、木糖、阿拉伯糖、葡糖醛酸或N-乙酰葡糖胺，或者它们可以是合成的糖(例如，6-Br-D-葡萄糖、2-脱氧-D-葡萄糖、5-硫代-D-葡萄糖)。这些糖可以通过α或β糖苷键连接到小分子或其他糖基上。

一般而言，小分子的糖基化可导致水溶性增加、与蛋白质和膜的相互作用改变、吸收和排泄改变、代谢稳定性改变以及PK/PD特征的其他改变(Gantt、Peltier-Pain和Thorson 2011；

2008；De Bruyn等，2015)。

糖基化可以增强或阻断糖苷转运到特定组织或器官中。糖基化可以通过糖苷部分与细胞表面上的凝集素或葡萄糖转运蛋白之间的相互作用来增强摄取。

在某些情况下，糖基化改变药物的药理活性，或者通过增强或降低效力，或者甚至通过改变作用机制(

2008；Gantt，Peltier-Pain，和Thorson 2011；De Bruyn等.2015)。

糖的特性和糖苷键的立体化学也可以影响糖苷的药理学活性或PK/PD特征。

糖基化也是开发用于将药物靶向递送至特定组织的前药和化合物的潜在策略。糖苷酶是催化糖苷键水解的酶，它们在不同的组织和器官中特异性表达，包括血浆、结肠、肠和肠道菌群。糖苷酶对不同的糖苷键立体化学或对不同的单糖表现出底物特异性。如果糖基化药物优先被组织特异性糖苷酶切割，则它可以用作前药或靶向药物。Zipp等已经证明了这一点：大麻素糖苷中的α-糖苷键已显示优先被小鼠大肠中存在的糖苷酶切割，而不是可能存在于小肠、胃、血浆或大脑中的其他化学或酶促过程(Zipp，Hardman，和Brooke2018；Hardman，Brooke，和Zipp 2017)。

报道了用4'-O-糖基团修饰的依托泊苷前药(US 7,241,595，Kolar等.2004)。通过传统化学方法合成，这种前药预计会被通过共价连接的抗体靶向肿瘤的重组糖苷酶激活(US 7,241,595，Kolar等.2004)。

总之，小分子的糖基化可以提高水溶性，但也可以以意想不到的方式改变与蛋白质和膜的相互作用、药理活性和/或PK/PD特征。

糖基转移酶

用于糖基化小分子的传统方法是非选择性的，并且特别难以控制糖基化的立体特异性和区域特异性(Zhu and Schmidt 2009；Gu等.2014)。苷元上通常有不止一个位置会与用于进行所需修饰的试剂发生反应。这使得有必要化学“阻断”或暂时不反应分子上的其他位置，以便选择性地修改所需的位置。典型的修饰将需要使用合成有机化学的标准方法进行多个保护和去保护步骤。

糖基转移酶(GTs)是具有作为催化剂产生新型糖基化治疗性小分子的潜力的一类酶。GT催化糖从活化的糖供体分子转移到受体分子(Lairso等.2008)。它们是在病毒、古细菌、细菌和真核生物中发现的一个大型且特征明确的家族。碳水化合物活性酶目录(www.cazy.org)中描述了超过600,000个GT，分为大约110个家族，并且报告了超过150个GT结构(www.rcsb.org)(Lombard等.2014；Berman 2000)。大多数GT使用核苷酸激活的糖供体并被称为Leloir GT，尽管也使用脂质磷酸盐和磷酸盐激活的糖供体(Breton，Fournel-Gigleux，和Palcic 2012；Lairson等.2008)。GT受体包括蛋白质、脂质、寡糖和小分子。

GT作为通用小分子糖基化平台中的潜在工具提供了若干优势(De Bruyn等.2015；Gantt，Peltier-Pain，和Thorson 2011；Yonekura-Sakakibara和Hanada 2011；Schmid等.2016)。GT的特点通常是转换效率非常高(高达100％)。因此，GT催化反应需要较低浓度的潜在昂贵或难以合成的底物。GT能够糖基化多种受体结构，许多GT对糖供体和受体表现出混杂性。此外，GT可以催化O-、N-、S-甚至C-糖苷的形成。由于这些特性，GT通常适用于体外和体内生物工程。

尿苷二磷酸GT(UGT)

尿苷二磷酸GT(UGT)利用尿苷二磷酸(UDP)糖供体，并在植物中形成最大的LeloirGT组(Yonekura-Sakakibara和Hanada 2011)。最近，新的UGT的鉴定和表征，特别是在植物和细菌中，已经爆炸式增长，这是对表征天然产物生物合成途径的兴趣增加的一部分。Torens-Spence等描述了这种方法(Torrens-Spence等.2018)。在该论文中，从金根(Goldenroot)植物中克隆了33个UGT酶编码基因，在酵母中表达，并筛选了在修饰酪醇以产生红景天苷或淫羊藿苷D2的区域特异性活性，它们是植物天然红景天苷生物合成途径中的酪醇代谢产物。另一组通过挖掘红花(Carthamus tinctorius)的表达基因，鉴定出具有混杂的N-和O-糖基转移酶活性的天然存在的酶。K.Xie等(Xie等.2017)描述了从红花中鉴定出一种混杂的糖基转移酶(UGT71E5)，它对多种不同的氮杂环芳族化合物具有N-糖基化酶活性。Zhang等(Zhang等.2019)描述了从红花中鉴定出对苄基异喹啉生物碱具有混杂的O-糖基转移酶活性的三种新的UGT(UGT 84A33、UGT 71AE1和UGT 90A14)，以及它们在制备糖基化衍生物中的用途。随着技术的不断改进和基因组和转录组测序和分析成本的降低，识别和表征天然存在的GT以开发新的小分子多样性生成平台变得越来越容易。

如本文所述，UGT序列内的四个区域被鉴定为对活性重要。与其他UGT相比，SEQ IDNO:1-4中所有四个区域的序列是独特的，但它们之间高度相似(图4)。这表明四个区域内的序列与这些酶对依托泊苷的独特活性之间存在很强的相关性。三个受体结合位点显示在晶体结构(或同源模型)中，准备与糖受体分子相互作用。“PSPG盒”区域涉及UGT供体和受体底物亲和力，并且可能是比活性的主要部分(图5)(Bairoch 1991；Hughes和Hughes 1994；Yamazaki，Gong等.1999；Hans，Brandt等.2004；Shao，He等.2005；He，Wang等.2006；Offen，Martinez-Fleites等.2006)。

表1：对活性重要的UGT酶区域

*序列相似性由使用BLOSUM62评分矩阵的正BLAST相似性定义，存在：11，扩展：1空位罚分(Altschul等.1990；Henikoff等.1992)。用于确定百分比序列同一性的常用工具是可从美国国立卫生研究院国家医学图书馆国家生物技术信息中心获得的蛋白质基本局部比对搜索工具(BLASTp)。

在某些实施方式中，UGT包括与SEQ ID NO:1具有至少80％(85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)相似性的氨基酸序列。在某些实施方式中，UGT包括与SEQ ID NO:1具有至少80％(85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的氨基酸序列。

在某些实施方式中，UGT包括与SEQ ID NO:1的A340至Q382区域具有至少80％(85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)相似性的氨基酸序列。在某些实施方式中，UGT包括与SEQ ID NO:1的A340至Q382区域具有至少80％(85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的氨基酸序列。

在某些实施方式中，UGT包括如下氨基酸序列：与SEQ ID NO:1的I84至S99区域具有至少90％(91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)的相似性；与SEQID NO:1的D126至F134区域具有至少90％(91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)的相似性；与SEQ ID NO:1的L147至S149区域具有至少90％(91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)的相似性；和与SEQ ID NO:1的A340至Q382区域具有至少80％(85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)的相似性。

在某些实施方式中，UGT包括如下氨基酸序列：与SEQ ID NO:1的I84至S99区域具有至少90％(91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)的同一性；与SEQID NO:1的D126至F134区域具有至少90％(91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)的同一性；与SEQ ID NO:1的L147至S149区域具有至少90％(91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)的同一性；和与SEQ ID NO:1的A340至Q382区域具有至少80％(85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)的同一性。

在某些实施方式中，UGT包括与SEQ ID NO:2具有至少80％(85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)的相似性的氨基酸序列。在某些实施方式中，UGT包括与SEQ ID NO:2具有至少80％(85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的的氨基酸序列。

在某些实施方式中，UGT包括与SEQ ID NO:2的V278至Q318区域具有至少80％(85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)的相似性的氨基酸序列。在某些实施方式中，UGT包括与SEQ ID NO:2的V278至Q318区域具有至少80％(85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的的氨基酸序列。

在某些实施方式中，UGT包括如下氨基酸序列：与SEQ ID NO:2的I67至D75区域具有至少90％(91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)的相似性；与SEQID NO:2的D106至L114区域具有至少90％(91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)的相似性；与SEQ ID NO:2的C127至S129区域具有至少90％(91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)的相似性；和与SEQ ID NO:2的V278至Q318区域具有至少80％(85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)的相似性。

在某些实施方式中，UGT包括如下氨基酸序列：与SEQ ID NO:2的I67至D75区域具有至少90％(91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)的同一性；与SEQID NO:2的D106至L114区域具有至少90％(91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)的同一性；与SEQ ID NO:2的C127至S129区域具有至少90％(91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)的同一性；和与SEQ ID NO:2的V278至Q318区域具有至少80％(85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)的同一性。

在某些实施方式中，UGT包括与SEQ ID NO:3具有至少80％(85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)相似性的氨基酸序列。在某些实施方式中，UGT包括与SEQ ID NO:3具有至少80％(85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的氨基酸序列。

在某些实施方式中，UGT包括与SEQ ID NO:3的V291至Q331区域具有至少80％(85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)相似性的氨基酸序列。在某些实施方式中，UGT包括与SEQ ID NO:3的V291至Q331区域具有至少80％(85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的氨基酸序列。

在某些实施方式中，UGT包括如下氨基酸序列：与SEQ ID NO:3的W74至V82区域具有至少90％(91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)的相似性；与SEQID NO:3的D111至V119区域具有至少90％(91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)的相似性；与SEQ ID NO:3的F132至N134区域具有至少90％(91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)的相似性；和与SEQ ID NO:3的V291至Q331区域具有至少80％(85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)的相似性。

在某些实施方式中，UGT包括如下氨基酸序列：与SEQ ID NO:3的W74至V82区域具有至少90％(91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)的同一性；与SEQID NO:3的D111至V119区域具有至少90％(91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)的同一性；与SEQ ID NO:3的F132至N134区域具有至少90％(91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)的同一性；和与SEQ ID NO:3的V291至Q331区域具有至少80％(85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)的同一性。

在某些实施方式中，UGT包括与SEQ ID NO:4具有至少80％(85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)相似性的氨基酸序列。在某些实施方式中，UGT包括与SEQ ID NO:4具有至少80％(85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的氨基酸序列。

在某些实施方式中，UGT包括与SEQ ID NO:4的V280至Q320区域具有至少80％(85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)相似性的氨基酸序列。在某些实施方式中，UGT包括与SEQ ID NO:4的V280至Q320区域具有至少80％(85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的氨基酸序列。

在某些实施方式中，UGT包括如下氨基酸序列：与SEQ ID NO:4的I67至D75区域具有至少90％(91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)的相似性；与SEQID NO:4的D106至L114区域具有至少90％(91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)的相似性；与SEQ ID NO:4的C127至S129区域具有至少90％(91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)的相似性；和与SEQ ID NO:4的V280至Q320区域具有至少80％(85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)的相似性。

在某些实施方式中，UGT包括如下氨基酸序列：与SEQ ID NO:4的I67至D75区域具有至少90％(91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)的同一性；与SEQID NO:4的D106至L114区域具有至少90％(91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)的同一性；与SEQ ID NO:4的C127至S129区域具有至少90％(91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)的同一性；和与SEQ ID NO:4的V280至Q320区域具有至少80％(85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)的同一性。

在某些实施方式中，UGT包括与SEQ ID NO:5具有至少80％(85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)相似性的氨基酸序列。在某些实施方式中，UGT包括与SEQ ID NO:5具有至少80％(85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的氨基酸序列。

在某些实施方式中，UGT包括与SEQ ID NO:5的V283至Q323区域具有至少80％(85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)相似性的氨基酸序列。在某些实施方式中，UGT包括与SEQ ID NO:5的V283至Q323区域具有至少80％(85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的氨基酸序列。

在某些实施方式中，UGT包括如下氨基酸序列：与SEQ ID NO:5的I67至Q79区域具有至少90％(91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)的相似性；与SEQID NO:5的D110至L118区域具有至少90％(91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)的相似性；与SEQ ID NO:5的C131至T133区域具有至少90％(91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)的相似性；和与SEQ ID NO:5的V283至Q323区域具有至少80％(85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)的相似性。

在某些实施方式中，UGT包括如下氨基酸序列：与SEQ ID NO:5的I67至Q79区域具有至少90％(91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)的同一性；与SEQID NO:5的D110至L118区域具有至少90％(91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)的同一性；与SEQ ID NO:5的C131至S133区域具有至少90％(91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)的同一性；和与SEQ ID NO:5的V283至Q323区域具有至少80％(85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)的同一性。

单糖、二糖、三糖和寡糖

糖基转移酶可以催化许多不同的单糖添加到依托泊苷中。通常，合适的单糖包括但不限于开链和闭链单糖。单糖可以是L-或D-构型。通常，单糖具有5、6或7个碳原子(分别为戊糖单糖、己糖单糖或庚糖单糖)。

合适的单糖包括阿洛糖、芹菜糖、阿拉伯糖、果糖、岩藻糖醇、岩藻糖、半乳糖、葡萄糖、葡糖醛酸、甘露糖、N-乙酰葡糖胺、N-乙酰半乳糖胺、鼠李糖和木糖。其他合适的单糖包括葡糖胺、半乳糖胺、甘露糖胺、5-硫代-D-葡萄糖、野尻霉素、脱氧野尻霉素、1,5-脱水-D-山梨糖醇、2,5-脱水-D-甘露糖醇、2-脱氧-D-半乳糖、2-脱氧-D-葡萄糖、3-脱氧-D-葡萄糖、阿拉伯糖醇、半乳糖醇、葡萄糖醇、艾杜糖醇、来苏糖、甘露糖醇、L-鼠李糖醇、2-脱氧-D-核糖、核糖、核糖醇、核酮糖、木酮糖、阿卓糖、古洛糖、艾杜糖、左旋糖(levulose)、阿洛酮糖、山梨糖、塔格糖、塔罗糖、半乳醛、葡萄糖毒醛、岩藻烯糖、鼠李醛、阿拉伯醛、木糖醛(xylal)、3,4-二-O-乙酰-L-岩藻烯糖、3,4-二-O-乙酰-L-鼠李醛、3,4-二-O-乙酰-D-阿拉伯醛、3,4-二-O-乙酰-D-木糖醛、井冈胺、井冈霉胺、井冈霉醇胺、链霉菌醇、有效烯酮(valienone)、半乳糖醛酸、甘露糖醛酸、N-乙酰神经氨酸、N-乙酰胞壁酸、葡萄糖酸D-内酯、半乳糖酸γ-内酯、半乳糖酸δ-内酯、甘露酸γ-内酯、D-阿卓-庚酮糖、D-甘露-庚酮糖、D-甘油-D-甘露-庚糖、D-甘油-D-葡萄糖-庚糖、D-阿洛-庚酮糖、D-阿卓-3-庚酮糖、D-甘油-D-甘露-庚糖醇和D-甘油-D-阿卓-庚糖醇。

合适的寡糖包括但不限于具有2至10个以上连接在一起的单糖(例如，2、3、4、5、6、7、8、9或10个连接在一起的单糖)的碳水化合物。构成单糖单元可以是例如戊糖单糖、己糖单糖或假糖(pseudosugar)(包括假氨基糖)。寡糖不包括通过将单糖与苯环、环己烷环或杂环稠合而形成的双环基团。可用于本发明的假糖是其中环状单糖的环氧原子被亚甲基取代的化合物类别的成员。假糖也被称为“卡巴糖(carba-sugars)”。

糖基转移酶可以催化单糖与依托泊苷的加成，单糖和依托泊苷之间的键可以是α或β糖苷键。二糖、三糖和寡糖是通过将两种以上单糖连续酶促添加到依托泊苷上而形成的。当通过连续酶促反应添加多于一种单糖时，连续的单糖可以通过α或β糖苷键与前一个单糖键合。

制备依托泊苷糖苷的方法

依托泊苷糖苷可以通过酶催化反应由依托泊苷制备。提供了包括依托泊苷、尿苷二磷酸糖基转移酶和尿苷二磷酸-单糖的反应混合物。经过一段时间(例如，1至72小时)后，依托泊苷转化为依托泊苷的单糖、二糖、三糖或寡糖。所形成的依托泊苷的单糖、二糖、三糖或寡糖对应于反应混合物中包含的尿苷二磷酸-单糖。

在某些实施方式中，将UGT酶和重组UGT表达细胞裂解物(例如，酵母细胞裂解物)置于反应容器中。为了形成裂解物，将表达UGT的细胞(例如，表达UGT的酵母细胞)裂解，并通过离心丢弃不溶性部分，从而使裂解物不含细胞。在其他实施方式中，不需要无细胞裂解物。例如，在某些实施方式中，可以使用重组UGT。在其他实施方式中，可以使用纯化的UGT。

依托泊苷糖苷

在某些实施方式中，依托泊苷糖苷是由以下结构式表示的化合物：

R和/或R'是氢、单糖、二糖、三糖或寡糖。寡糖可包括4至10个单糖(例如4、5、6、7、8、9或10个单糖)。R和R'中的每一个可以独立地是单糖、二糖或寡糖。在某些情况下，所述化合物是化合物(I)的药学上可接受的盐。

R、R'和/或R”是氢、单糖、二糖、三糖或包含4至10个单糖(例如4、5、6、7、8、9或10个单糖)的寡糖。R、R'和R”中的每一个可以独立地是单糖、二糖或寡糖。在某些情况下，所述化合物是化合物(II)的药学上可接受的盐。

在某些实施方式中，R”不是葡萄糖。

在一个实施方式中，R、R’和/或R”是葡萄糖，其可以是D-葡萄糖或L-葡萄糖。D-葡萄糖由以下结构式表示：

在一个实施方式中，R、R’和/或R”是半乳糖，其可以是D-半乳糖或L-半乳糖。D-半乳糖由以下结构式表示：

在一个实施方式中，R、R’和/或R”是木糖，其可以是D-木糖或L-木糖。木糖可以形成六元环和五元环。D-木糖的五元环由以下结构式表示：

在一个实施方式中，R、R'和/或R”是N-乙酰葡糖胺，其可以是D-N-乙酰葡糖胺或L-N-乙酰葡糖胺。D-N-乙酰葡糖胺由以下结构式表示：

单糖(例如葡萄糖)和依托泊苷之间的键可以是α或β糖苷键。二糖的单糖之间的键可以是α或β糖苷键。三糖的单糖之间的键可以是α或β糖苷键。寡糖的单糖之间的键可以是α或β糖苷键。二糖或三糖的单糖之间以及寡糖的单糖之间的糖苷键可以在每个单糖的任何羟基之间形成。换言之，单糖之间的键可以是例如1→2、1→3、1→4或1→6。

在某些实施方式中，R、R’和/或R”是二糖。

在一个实施方式中，R、R’和/或R”是由两个葡萄糖分子组成的二糖。一个实例是依托泊苷-3”-二-O-D-葡萄糖苷。另一个实例是依托泊苷-4'-二-O-D-葡萄糖苷。由两个葡萄糖单体组成的二糖，其中两个单体通过1→2糖苷键键合，其结构式如下：

在一个实施方式中，R、R’和/或R”是由两个半乳糖分子组成的二糖。一个实例是依托泊苷-3”-二-O-D-半乳糖苷。另一个实例是依托泊苷-4'-二-O-D-半乳糖苷。由两个半乳糖单体组成的二糖，其中两个单体通过1→2糖苷键键合，其结构式如下：

在一个具体实施方式中，R、R'和/或R”是由两个木糖分子组成的二糖。一个实例是依托泊苷-3”-二-O-D-木糖苷。另一个实例是依托泊苷-4'-二-O-D-木糖苷。由两个木糖单体组成的二糖，其中两个单体通过1→2糖苷键键合，其结构式如下：

在某些实施方式中，二糖包括两种不同的单糖。在某些实施方式中，寡糖包括两种以上不同的单糖。一个实例是依托泊苷-3”-O-木糖-葡萄糖苷。另一个实例是依托泊苷-4'-O-木糖-葡萄糖苷。

治疗疾病的方法

本文所述的依托泊苷糖苷可用于治疗疾病的方法中。将依托泊苷糖苷施用于有需要的患者。

可以通过施用本文公开的依托泊苷糖苷治疗的疾病包括但不限于癌症，如难治性睾丸肿瘤、小细胞肺癌、淋巴瘤、非淋巴细胞白血病、尤文氏肉瘤、卡波西肉瘤、卵巢癌、中枢神经系统癌、前列腺癌、睾丸癌、乳腺癌、胃癌和黑色素瘤。

依托泊苷糖苷可以作为联合疗法的一部分施用。

联合疗法的一个实例是与顺铂一起施用。其他实例包括与一种或多种化疗剂(例如，贝伐单抗、博来霉素、卡莫司汀、顺铂、卡铂、环磷酰胺、阿糖胞苷、阿霉素、异环磷酰胺、甲氨蝶呤、米托蒽醌、丙卡巴肼、沙利度胺、长春花碱和/或长春新碱)和/或免疫系统抑制剂(例如，地塞米松、强的松或或甲基强的松龙)一起施用。

本文所述的依托泊苷糖苷可以在那些联合疗法中用于替代或附加于依托泊苷。

药物组合物、剂量和施用

本文还提供了一种药物组合物，其包含本文公开的依托泊苷糖苷或其药学上可接受的盐，以及可选的药学上可接受的载体。所述组合物可用于本文所述的方法中，例如以提供本文所述的化合物或其药学上可接受的盐。

“药学上可接受的盐”是指在合理的医学判断范围内，适用于与哺乳动物的组织接触而没有过度毒性、刺激性、过敏反应等，并且与合理的收益/风险比相称。药学上可接受的盐是本领域众所周知的。例如，S.M.Berge等.在J.Pharmaceutical Sciences,1977,66,1-19中详细描述了药学上可接受的盐，其相关教导通过引用以其整体并入本文。本文所述化合物的药学上可接受的盐包括衍生自合适的无机和有机酸以及合适的无机和有机碱的盐。

药学上可接受的酸加成盐的实例是氨基与无机酸(如盐酸、氢溴酸、磷酸、硫酸和高氯酸)，或与有机酸(如乙酸、草酸、马来酸、酒石酸、柠檬酸、琥珀酸或丙二酸)或通过使用本领域中使用的其他方法(如离子交换)形成的盐。其他药学上可接受的酸加成盐包括己二酸盐、藻酸盐、抗坏血酸盐、天冬氨酸盐、苯磺酸盐、苯甲酸盐、硫酸氢盐、硼酸盐、丁酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、肉桂酸盐、柠檬酸盐、环戊烷丙酸盐、二葡萄糖酸盐、十二烷基硫酸盐、乙磺酸盐、甲酸盐、富马酸盐、葡庚糖酸盐、甘油磷酸盐、葡萄糖酸盐、戊二酸盐、乙醇酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、氢碘酸盐、羟基苯甲酸盐、2-羟基乙磺酸盐、羟基马来酸盐、乳糖醛酸盐(lactobionate)、乳酸盐、月桂酸盐、月桂基硫酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、甲磺酸盐、2-萘磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、油酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、双羟萘酸盐、果胶酸盐(pectinate)、过硫酸盐、2-苯氧基苯甲酸盐、苯乙酸盐、3-苯丙酸盐、磷酸盐、新戊酸盐、丙酸盐、丙酮酸盐、水杨酸盐、硬脂酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、对甲苯磺酸盐、十一烷酸盐、戊酸盐等。

可以形成单酸盐、二酸盐或三酸盐，并且此类盐可以水合、溶剂化或基本上无水的形式存在。

衍生自合适碱的盐包括衍生自无机碱(如碱金属、碱土金属和铵碱)的盐，以及衍生自脂肪族、脂环族或芳香族有机胺(如甲胺、三甲胺和甲基吡啶)的盐，或N+((C1-C4)烷基)₄盐。代表性的碱金属或碱土金属盐包括钠、锂、钾、钙、镁、钡等。其他药学上可接受的盐包括，如果合适的话，无毒的铵盐、季铵盐和使用反离子形成的胺阳离子，如卤化物、氢氧化物、羧基、硫酸盐、磷酸盐、硝酸盐、低级烷基磺酸盐和芳基磺酸盐。

“药学上可接受的载体”是指无毒载体或赋形剂，其不会破坏与其一起配制的试剂的药理学活性并且当以足以递送治疗量的试剂的剂量施用时是无毒的。可用于本文所述组合物的药学上可接受的载体包括但不限于离子交换剂、氧化铝、硬脂酸铝、卵磷脂、血清蛋白(如人血清白蛋白)、缓冲物质(如磷酸盐)、甘氨酸、山梨酸、山梨酸钾、饱和植物脂肪酸的部分甘油酯混合物、水、盐或电解质，如硫酸鱼精蛋白、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、氯化钠、锌盐、胶体二氧化硅、三硅酸镁、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素基物质、聚乙二醇、羧甲基纤维素钠、聚丙烯酸酯、蜡、聚乙烯-聚氧丙烯-嵌段聚合物、聚乙二醇和羊毛脂。

本文提供的组合物可以任何口服可接受的剂型口服施用，其包括但不限于胶囊、片剂、水性混悬剂、分散体和溶液。在口服片剂的情况下，常用的载体包括乳糖和玉米淀粉。通常还添加润滑剂，如硬脂酸镁。对于胶囊形式的口服施用，有用的稀释剂包括乳糖和干玉米淀粉。当口服使用需要水性混悬剂和/或乳液时，可以将活性成分悬浮或溶解在油相中并与乳化剂和/或助悬剂组合。如果需要，也可以添加某些甜味剂、调味剂或着色剂。

在某些实施方式中，口服制剂被配制用于立即释放或持续/延迟释放。

用于口服施用的固体剂型包括胶囊、片剂、丸剂、散剂和颗粒剂。在这样的固体剂型中，活性化合物与至少一种惰性的药学上可接受的赋形剂或载体(如柠檬酸钠或磷酸二钙)和/或(a)填充剂或增量剂(如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露糖醇和硅酸，(b)粘合剂，如羧甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯胶，(c)保湿剂，如甘油，(d)崩解剂，如琼脂、碳酸钙、马铃薯或木薯淀粉、藻酸、某些硅酸盐和碳酸钠，(e)溶液阻滞剂，如石蜡，(f)吸收促进剂，如季铵盐，(g)润湿剂，如乙酰醇(acetyl alcohol)和单硬脂酸甘油酯，(h)吸收剂，如高岭土和膨润土，和(i)润滑剂，如滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、十二烷基硫酸钠及其混合物混合。在胶囊、片剂和丸剂的情况下，剂型还可以包含缓冲剂。

用于口服施用的液体剂型包括药学上可接受的乳剂、微乳剂、溶液剂、混悬剂、糖浆剂和酏剂。除了本发明的依托泊苷，液体剂型还可以含有本领域常用的惰性稀释剂，如水或其他溶剂、增溶剂和乳化剂，如乙基醇(乙醇)、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1,3-丁二醇、油(特别是棉籽、花生、玉米、胚芽、橄榄油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氢呋喃醇、聚乙二醇和脱水山梨糖醇的脂肪酸酯，或其混合物。除了惰性稀释剂之外，口服组合物还可以包括佐剂，如润湿剂、乳化剂和助悬剂、甜味剂、调味剂、着色剂、香味剂和防腐剂。

适用于口腔或舌下施用的组合物包括片剂、锭剂和糖果锭剂，其中活性成分与载体(如糖和阿拉伯胶、黄蓍胶或明胶和甘油)一起配制。

类似类型的固体组合物也可用作使用赋形剂(如乳糖或牛奶糖)以及高分子量聚乙二醇等的软和硬填充明胶胶囊中的填充剂。片剂、糖衣丸、胶囊剂、丸剂和颗粒剂的固体剂型可以用包衣和壳来制备，如肠溶衣和药物制剂领域熟知的其他包衣。它们可以可选地包含遮光剂并且还可以是它们仅或优先地在肠道的某个部分中，可选地以延迟方式释放活性成分的组合物。可以使用的包埋组合物的实例包括聚合物和蜡。

如上所述，本文所述的依托泊苷糖苷也可以是具有一种或多种赋形剂的微囊化形式。在这样的固体剂型中，依托泊苷糖苷可以与至少一种惰性稀释剂(如蔗糖、乳糖或淀粉)混合。这种剂型还可以按照常规实践包含除惰性稀释剂以外的其他物质，例如压片润滑剂和其他压片助剂，例硬脂酸镁和微晶纤维素。

用于口服施用的组合物可设计成保护活性成分在其通过消化道时免于降解，例如，通过片剂或胶囊上的制剂外涂层。

在另一个实施方式中，本文所述的依托泊苷糖苷或药学上可接受的盐可以以延长(或“延迟”或“持续”)释放组合物的形式提供。该延迟释放组合物包括与延迟释放组分组合的依托泊苷糖苷或药学上可接受的盐。这种组合物允许将所提供的药剂靶向释放到下胃肠道中，例如，进入小肠、大肠、结肠和/或直肠。在某些实施方式中，缓释组合物进一步包括肠溶或pH依赖性包衣，如乙酸邻苯二甲酸纤维素和其他邻苯二甲酸酯(例如聚乙酸邻苯二甲酸乙烯酯、甲基丙烯酸酯(Eudragits))。作为另一种选择，缓释组合物通过提供对pH敏感的甲基丙烯酸酯包衣、对pH敏感的聚合物微球或通过水解进行降解的聚合物提供对小肠和/或结肠的控释。缓释组合物可以与疏水或胶凝赋形剂或包衣一起配制。结肠递送还可以通过被细菌酶(如直链淀粉或果胶)消化的包衣、pH依赖性聚合物、随时间溶胀的水凝胶塞(Pulsincap)、时间依赖性水凝胶包衣和/或与与偶氮芳香键包衣连接的丙烯酸进一步提供。

可与载体材料组合以产生单一剂型的组合物的本文所述的依托泊苷糖苷或其药学上可接受的盐的量将取决于所治疗的宿主、特定的施用模式和所用药剂的活性。优选地，组合物应当被配制使得可以向接受所述组合物的受试者施用剂量为约0.01mg/kg至约100mg/kg体重/天的依托泊苷糖苷或其药学上可接受的盐。

所需剂量可以方便地以单剂量或以适当间隔施用的多剂量施用，例如，每日施用2、3、4、5、6次以上。每日剂量可以分成若干次，例如2、3、4、5、6次以上施用，特别是当施用相对大量时，或视情况而定。

还应理解的是，任何特定患者的特定剂量和治疗方案将取决于多种因素，包括所使用的特定药剂的活性、年龄、体重、一般健康状况、性别、饮食、施用时间、排泄率、药物组合、主治医师的判断和所治疗的特定疾病的严重程度。组合物中依托泊苷糖苷的量也将取决于组合物中特定的依托泊苷糖苷。

可用于本发明组合物的其他药学上可接受的载体、佐剂和载体包括但不限于离子交换剂、氧化铝、硬脂酸铝、卵磷脂、自乳化药物递送系统(SEDDS)，如d-α-生育酚聚乙二醇1000琥珀酸酯，用于药物剂型的表面活性剂，如Tweens或其他类似的聚合物递送基质、血清蛋白，如人血清白蛋白、缓冲物质，如磷酸盐、甘氨酸、山梨酸、山梨酸钾、部分甘油酯饱和植物脂肪酸、水、盐或电解质的混合物，如硫酸鱼精蛋白、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、氯化钠、锌盐、胶体二氧化硅、三硅酸镁、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素基物质、聚乙二醇、羧甲基纤维素钠、聚丙烯酸酯、蜡、聚乙烯-聚氧丙烯-嵌段聚合物、聚乙二醇和羊毛脂。环糊精，如α-、β-和γ-环糊精，或化学改性的衍生物，如羟烷基环糊精，包括2-和3-羟丙基-β-环糊精，或其他溶解的衍生物也可以有利地用于增强本文所述的药剂的递送。

在某些实施方式中，包含本文所述的依托泊苷糖苷或其药学上可接受的盐的组合物还可包含一种或多种其他治疗剂，例如，组合。当本发明的组合物包含组合时，药剂的剂量水平应为单一疗法方案中正常施用剂量的约1％至100％，更优选约5％至约95％。

本文所述的组合物可以例如通过注射、静脉内、动脉内、眼内、玻璃体内、皮下、口服、口腔、经鼻、经粘膜、局部、在眼用制剂中或通过吸入施用，剂量范围为约0.5mg/kg至约100mg/kg体重，或者，以约1mg/剂至约1000mg/剂的剂量，每4至120小时一次，或根据具体药品的要求。通常，组合物将每日施用约1至约6(例如，1、2、3、4、5或6)次，作为另一种选择，作为输注(例如，连续输注)。可以与载体材料组合以产生单一剂型的活性成分的量将根据所治疗的宿主和特定的施用方式而变化。典型的制剂将含有约1％至约95％、约2.5％至约95％或约5％至约95％的依托泊苷糖苷(w/w)。作为另一种选择，制剂可含有约20％至约80％的依托泊苷糖苷(w/w)。

可能需要低于或高于上述剂量的剂量。任何特定患者的具体剂量和治疗方案将取决于多种因素，包括所用特定药物的活性、年龄、体重、一般健康状况、性别、饮食、施用时间、排泄率、药物组合、疾病、病症或症状的严重程度和病程、患者对疾病、病症或症状的处置以及治疗医师的判断。

如本文所用，“治疗”是指采取步骤将治疗递送给有需要的受试者，如哺乳动物(例如，通过向哺乳动物施用一种或多种治疗剂)。“治疗”包括抑制疾病或病症(例如，通过减缓或停止疾病或病症的进展或引起其消退)，以及缓解由疾病或病症引起的症状。

“治疗有效量”是在必要的剂量和时间段内有效实现期望的治疗结果(例如，生理响应或病症的治疗、愈合、抑制或改善等)的量。完全的治疗效果不一定要通过一剂的施用来实现，可以仅在施用一系列剂量后才会出现。因此，治疗有效量可以一次或多次施用。治疗有效量可以根据以下因素而变化，如疾病状态、年龄、性别和哺乳动物的体重、施用方式和治疗剂或治疗剂组合在个体中引发所需反应的能力。

待施用的药剂的有效量可以由普通技术的临床医生使用本文提供的指导和本领域已知的其他方法来确定。例如，合适的剂量可以是每次治疗约0.001mg/kg至约100mg/kg、约0.01mg/kg至约100mg/kg、约0.01mg/kg至约10mg/kg、约0.01mg/kg至约1mg/kg体重。确定特定试剂、受试者和疾病的剂量完全在本领域技术人员的能力范围内。优选地，所述剂量不会引起不良副作用或产生最小的不良副作用。

如本文所用，“受试者”包括人类、家养动物，如实验室动物(例如，狗、猴、猪、大鼠、小鼠等)、家庭宠物(例如，猫、狗、兔等)和牲畜(例如，猪、牛、绵羊、山羊、马等)和非家养动物。在某些实施方式中，受试者是人。“受试者”和“患者”在本文中可互换使用。

本文所述的依托泊苷糖苷或其药学上可接受的盐可以通过多种施用途径施用，包括例如口服、饮食、局部、透皮、直肠、肠胃外(例如，动脉内、静脉内、肌肉内、皮下注射、皮内注射)、静脉内输注和吸入(例如，支气管内、鼻内或口服吸入、鼻内滴剂)施用途径，其取决于依托泊苷和待治疗的特定疾病。如所示，施用可以是局部的或全身的。优选的施用模式可以根据所选择的具体依托泊苷糖苷而变化。

某些方法进一步指定递送途径，如静脉内、肌肉内、皮下、直肠、鼻内、肺部或口服。

本文所述的依托泊苷糖苷或其药学上可接受的盐也可以与一种或多种其他疗法(例如放射疗法、化学疗法，如化学治疗剂；免疫疗法，如免疫治疗剂)组合施用。当在联合疗法中施用时，依托泊苷糖苷或其药学上可接受的盐可以在其他疗法(例如放射疗法、另外的药剂)之前、之后或同时施用。当同时(例如并发)共同施用时，依托泊苷糖苷或其药学上可接受的盐和其他疗法可以在单独的制剂或相同的制剂中。作为另一种选择，依托泊苷糖苷或其药学上可接受的盐和其他疗法可以作为单独的组合物在由熟练临床医生确定的适当时间范围内(例如，足以允许疗法的药物作用重叠的时间)依次施用。

在某些实施方式中，本文所述的方法进一步包括向受试者施用治疗有效量的附加疗法(例如，附加治疗剂，如顺铂)。

概括

依托泊苷是一种亲脂性、低溶解度、高影响的治疗剂，可受益于糖基化修饰。

需要具有改善的水溶性和具有不同PK/PD特征的DNA拓扑异构酶II抑制剂，以提供对抑制DNA拓扑异构酶II蛋白活性的效力的潜在改进和增强的抗肿瘤作用。

实施例

实施例1：建立糖基转移酶(GT)文库和基于细胞裂解物的测定以鉴定药物修饰糖基转移酶

尽管GT是自然界中最大的酶家族之一，但大多数GT的天然底物是未知的。因此，鉴定可以使用非天然底物(如依托泊苷)的GT是一项非常重要的工作。筛选策略设计成满足这一需求。系统发育方法用于选择一组代表所需功能GT类别的结构和功能生物多样性的酶，即跨不同界和物种的尿苷二磷酸(UDP)糖基转移酶(UGT)。基于生物信息学分析，选择了328个UGT，包括来自不同物种的细菌、真菌、植物和人类的酶。为了建立GT文库，选择的UGT的cDNA通过核苷酸合成或通过RT-PCR从表达UGT的组织的RNA产生。将得到的每个UGT基因cDNA克隆到酵母TEF启动子表达质粒p426-TEF中。将质粒单独转化到野生型酵母(酿酒酵母，Saccharomyces cerevisiae)菌株BY4743中。在营养缺陷型选择之后，表达重组UGT蛋白的酵母菌落被培养、收获，并通过CelLytic Y细胞裂解试剂(Sigma-Aldrich)裂解。基于无细胞的细胞裂解物的糖基化测定设计成筛选能够糖基化目标底物的UGT(详见下文)。所有UGT在96孔板上平行测定，以进行高通量筛选。药物修饰UGT可以通过HPLC分析中新峰的出现来识别。可以通过专门的测定进一步评估新型药物糖苷的特性。

实施例2：使用基于细胞裂解物的测定法合成依托泊苷-3”-O-D-葡萄糖苷和依托泊苷-4'-O-D-葡萄糖苷

筛选根据实施例1制备的GT文库以鉴定当UDP-葡萄糖用作糖供体时能够催化依托泊苷的区域特异性糖基化的酶。将依托泊苷(最终浓度＝50μM)添加到96孔微量滴定板的每个孔中，反应混合物中含有独特的UGT酶(50mM Tris，pH 8.0，10mM UDP-葡萄糖和20μL重组UGT表达酵母细胞裂解物)，并在30℃使反应(总体积100μL)进行5小时，然后通过用100μL甲醇淬灭来终止修饰反应。作为阴性对照，与含有p426-TEF空载体的酵母裂解物进行反应。通过对每个孔的内容物进行HPLC分析来确定所需糖基化产物的存在。

从筛选可以看出，当使用UDP-葡萄糖作为糖供体时，三种UGT能够修饰依托泊苷。总转化率为：SEQ ID NO:1为94％，SEQ ID NO:2为45％，SEQ ID NO:5为16％，SEQ ID NO:3为10％，SEQ ID NO:4为5％。在五种UGT中，SEQ ID NO:2可以产生单糖依托泊苷-3”-O-D-葡萄糖苷(图1色谱峰a)和依托泊苷-4'-O-D-葡萄糖苷(图1色谱峰b)。SEQ ID NO:3只能产生依托泊苷-3”-O-D-葡萄糖苷。SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5只能产生依托泊苷-4'-O-D-葡萄糖苷。

依托泊苷糖苷的化学特性通过LC-MS分析来确认：对于a:m/z＝749.41[M-H]-，m/z＝768.31[M+NH4]⁺，m/z＝773.26[M+Na]⁺；对于b:m/z＝795.31[M+FA-H]^-，m/z＝768.25[M+NH4]⁺。

通过核磁共振(NMR)分析进一步证实了依托泊苷糖苷的化学特性：对于a(由SEQID NO:2产生):¹H NMR(DMSO-d₆，600MHz)，δ7.00(1H，s)，6.53(1H，s)，6.18(2H，s)，6.02(2H，d，J＝13.8Hz)，5.47(1H，d，J＝4.2Hz)，4.94(1H，d，J＝3.0Hz)，4.73(1H，dd，J＝10.2，4.8Hz)，4.65(1H，d，J＝7.8Hz)，4.53(1H，d，J＝7.8Hz)，4.48(1H，d，J＝5.4Hz)，4.26(1H，m)，4.09(1H，dd，J＝10.8，4.8Hz)，3.73(1H，t，J＝8.4Hz)，3.71(1H，d，J＝4.8Hz)，3.61(6H，s)，3.52(1H，t，J＝10.2Hz)，3.46(1H，m)，3.36(1H，t，J＝9.0Hz)，3.13(1H，m)，3.07(1H，m)，3.03(1H，m)，2.98(1H，m)，2.88(1H，m)，1.23(3H，d，J＝4.8Hz)。¹³C NMR(DMSO-d₆，150MHz)，δ175.1，148.2，147.6，146.6，135.2，133.3，130.7，129.1，110.4，110.3，108.9，103.3，101.8，101.3，99.1，80.6，79.0，77.4，77.0，74.6，74.4，72.5，70.5，68.1，67.8，66.0，61.5，56.5，43.4，40.9，37.7，20.7；对于b(由SEQ ID NO:1产生):¹H NMR(DMSO-d₆，500MHz)，δ7.01(1H，s)，6.54(1H，s)，6.22(2H，s)，6.02(2H，d，J＝3.0Hz)，5.22(1H，s)，5.21(1H，s)，4.93(2H，m)，4.88(1H，d，J＝5.0Hz)，4.84(1H，d，J＝7.0Hz)，4.81(1H，d，J＝3.5Hz)，4.71(1H，dd，J＝10.0，5.0Hz)，4.57(1H，d，J＝8.0Hz)，4.53(1H，d，J＝5.5Hz)，4.26(3H，m)，4.07(1H，dd，J＝10.5，5.0Hz)，3.57(1H，m)，3.50(1H，m)，3.40(1H，m)，3.34(1H，m)，3.24(1H，m)，3.15(4H，m)，3.04(2H，m)，2.87(1H，m)，1.23(3H，d，J＝5.0Hz)。¹³C NMR(DMSO-d₆，125MHz)，δ175.1，152.1，148.2，146.7，136.2，134.2，132.8，129.4，110.4，110.3，109.7，103.2，102.0，101.8，99.1，80.6，77.5，76.9，74.9，74.6，73.2，72.3，70.3，68.2，67.8，66.2，61.3，56.9，43.4，40.8，37.7，20.8。

鉴定为SEQ ID NO.:1-5的酶的序列在本文的序列部分中公开。

实施例3：使用纯化的重组糖基转移酶合成依托泊苷-3”-O-D-葡萄糖苷和依托泊苷-4'-O-D-葡萄糖苷

虽然基于酵母细胞裂解物的糖基化测定有助于初始筛选工作，但产生更大量依伐卡托(ivacaftor)葡萄糖苷的一种方法是在合成过程中使用精细控制的酶浓度。为此，将实施例2中鉴定的在C末端含有金属亲和纯化标签的两个UGT基因(SEQ ID NO:2和3)转化到BL21(DE3)大肠杆菌细胞中。细胞在37℃生长，直至培养物达到0.5-0.8的光密度(OD600)。然后，在18℃用1mM异丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导蛋白质过表达。培养物过夜生长16小时，然后收获。使用游离镍-IDA树脂或磁性载镍琼脂糖珠从收获的细胞中纯化所需的蛋白质。使用纯化的重组酶合成依伐卡托葡萄糖苷的体积范围为10-75mL。将依托泊苷(终浓度0.5mg/ml)加入反应混合物(终浓度为50mM HEPES、50mM KCl、pH 7.5、2mM UDP-葡萄糖、1μM UGT)中，使反应在37℃进行1-3天。通过加入1反应体积的冰冷甲醇终止反应。然后将反应在90℃温育以确保酶充分变性。通过HPLC分析确定所需糖基化产物的存在(图2)。从这些反应可以看出，SEQ ID NO:2和3可以产生单糖依托泊苷-3”-O-D-葡萄糖苷(图2色谱峰a)。SEQ ID NO:3也可以产生单糖依托泊苷-4'-O-D-葡萄糖苷(图2色谱峰b)。

依托泊苷糖苷的化学特性通过LC-MS分析确认：对于a：m/z＝751.12[M+H]⁺，m/z＝768.15[M+NH4]⁺；对于b:m/z＝751.15[M+H]⁺，m/z＝768.12[M+NH4]⁺。

使用SEQ ID NO:3(图2色谱峰a)产生的依托泊苷-3”-O-D-葡萄糖苷的化学特性通过核磁共振(NMR)分析进一步确认，并且结构被确定为与使用实施例2中基于细胞裂解物的测定产生的依托泊苷-3”-O-D-葡萄糖苷相同(图1色谱峰a)。

实施例4：使用基于细胞裂解物的测定法合成依托泊苷-3”-O-D-半乳糖苷和依托泊苷-4'-O-D-半乳糖苷

筛选根据实施例1制备的GT文库以鉴定当UDP-半乳糖用作糖供体时能够催化依托泊苷的区域特异性糖基化的酶。将依托泊苷(终浓度＝50μM)添加到96孔微量滴定板的每个孔中，所述微量滴定板在反应混合物(50mM Tris，pH 8.0，2mM UDP-半乳糖和20μL重组UGT表达酵母细胞裂解物)中含有独特的UGT酶，并让反应(总体积100μL)在30℃进行5小时，然后通过用100μL甲醇淬灭来终止修饰反应。作为阴性对照，进行与含有p426-TEF空载体的酵母裂解物的反应。通过对每个孔的内容物进行HPLC分析来确定所需糖基化产物的存在。

从筛选可以看出，当使用UDP-半乳糖作为糖供体时，三种UGT能够修饰依托泊苷。总转化率为：SEQ ID NO:1为32％，SEQ ID NO:2为3％，SEQ ID NO:3为2％。SEQ ID NO:3可产生单糖依托泊苷-3”-O-D-半乳糖苷。SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:1可以产生单糖依托泊苷-4'-O-D-半乳糖苷。

依托泊苷糖苷的化学特性通过LC-MS分析来确认：m/z＝768.30[M+NH4]⁺。

实施例5：使用基于细胞裂解物的测定法合成依托泊苷-O-D-木糖苷

筛选根据实施例1制备的GT文库以鉴定当UDP-木糖用作糖供体时能够催化依托泊苷的区域特异性糖基化的酶。将依托泊苷(终浓度＝50μM)添加到96孔微量滴定板的每个孔中，所述微量滴定板在反应混合物(50mM Tris，pH 8.0，2mM UDP-木糖和20μL重组UGT表达酵母细胞裂解物)中含有独特的UGT酶，并让反应(总体积100μL)在30℃进行5小时，然后通过用100μL甲醇淬灭来终止修饰反应。作为阴性对照，进行与含有p426-TEF空载体的酵母裂解物的反应。通过对每个孔的内容物进行HPLC分析来确定所需糖基化产物的存在。

从筛选可以看出，当使用UDP-木糖作为糖供体时，两个UGT能够修饰依托泊苷。总转化率为：SEQ ID NO:1为19％，SEQ ID NO:2为5％。SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:3均可产生单糖依托泊苷-O-D-木糖苷。

依托泊苷糖苷的化学特性通过LC-MS分析来确认：m/z＝738.27[M+NH4]⁺。

实施例6：使用纯化的重组糖基转移酶合成依托泊苷-O-N-乙酰葡糖酰胺

对实施例3中所述的纯化重组测定法进行了以下修改。使用UDP-N-乙酰葡糖胺代替UDP-葡萄糖，得到含有50mM HEPES、50mM KCl、pH 7.5、2mM UDP-N-乙酰葡糖胺、1μM UGT和0.5mg/ml依托泊苷的最终反应混合物。通过HPLC分析确定所需糖基化产物的存在。

从该测定可以看出，当使用UDP-N-乙酰葡糖胺作为糖供体时，一种UGT能够修饰依托泊苷。总转化率为：SEQ ID NO:3为4％。SEQ ID NO:3可以产生单糖依托泊苷-O-N-乙酰葡糖酰胺。

依托泊苷糖苷的化学特性通过LC-MS分析来确认：m/z＝792.14[M+H]⁺，m/z＝809.37[M+NH4]⁺。

实施例7：依托泊苷和依托泊苷-3”-O-D-葡萄糖苷的水溶性比较

依托泊苷和依托泊苷-O-D-葡萄糖苷的水溶性通过下述来研究：将过量的两种化合物在25℃悬浮在微量离心管中的200μl蒸馏水中，持续12小时。之后，将每个样品以12,000×g离心20分钟。然后将每个样品的上清液通过0.45-μm膜过滤器过滤，并使用HPLC通过其在254nm处的吸光度测量上清液中化合物(其定义为水溶性成分)的浓度，并参照浓度-吸光度标准曲线计算其绝对溶解度。如图3所示，依托泊苷的水溶性为56mg/L，而依托泊苷-3”-O-D-葡萄糖苷的水溶性为11200mg/L，高出200倍。

参考文献

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通过引用并入；等同物

本文引用的所有专利、公开申请和参考文献的教导通过引用以其整体并入。

虽然已经具体示出和描述了示例实施方式，但是本领域技术人员将理解，在不脱离所附权利要求所涵盖的实施方式的范围的情况下，可以在其中做出各种形式和细节的改变。

序列表

<110> 德瑞生物医药股份有限公司

<120> 依托泊苷糖苷、其制备方法及其作为抗癌药物的用途

<130> 5767.1002001

<150> US 62/990,124

<151> 2020-03-16

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 465

<212> PRT

<213> 东方山羊豆(Galega orientalis)

<400> 1

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1 5 10 15

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<212> PRT

<213> 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)

<400> 2

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<212> PRT

<213> 抗生链霉菌(Streptomyces antibioticus)

<400> 3

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<212> PRT

<213> 甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)

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370 375 380

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385 390

<210> 5

<211> 396

<212> PRT

<213> 地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)

<400> 5

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50 55 60

Gln Gln Ile Arg Glu Leu Met Lys Asn Lys Lys Asp Met Ser Gln Ala

65 70 75 80

Pro Leu Met Phe Ile Lys Glu Met Glu Glu Val Leu Pro Gln Leu Glu

85 90 95

Ala Leu Tyr Glu Asn Asp Lys Pro Asp Leu Ile Leu Phe Asp Phe Met

100 105 110

Ala Met Ala Gly Lys Leu Leu Ala Glu Lys Phe Gly Ile Glu Ala Val

115 120 125

Arg Leu Cys Ser Thr Tyr Ala Gln Asn Glu His Phe Thr Phe Arg Ser

130 135 140

Ile Ser Glu Glu Phe Lys Ile Glu Leu Thr Pro Glu Gln Glu Asp Ala

145 150 155 160

Leu Lys Asn Ser Asn Leu Pro Ser Phe Asn Phe Glu Asp Met Phe Glu

165 170 175

Pro Ala Lys Leu Asn Ile Val Phe Met Pro Arg Ala Phe Gln Pro Tyr

180 185 190

Gly Glu Thr Phe Asp Glu Arg Phe Ser Phe Val Gly Pro Ser Leu Ala

195 200 205

Lys Arg Lys Phe Gln Glu Lys Glu Thr Pro Ile Ile Ser Asp Ser Gly

210 215 220

Arg Pro Val Met Leu Ile Ser Leu Gly Thr Ala Phe Asn Ala Trp Pro

225 230 235 240

Glu Phe Tyr His Met Cys Ile Glu Ala Phe Arg Asp Thr Lys Trp Gln

245 250 255

Val Ile Met Ala Val Gly Thr Thr Ile Asp Pro Glu Ser Phe Asp Asp

260 265 270

Ile Pro Glu Asn Phe Ser Ile His Gln Arg Val Pro Gln Leu Glu Ile

275 280 285

Leu Lys Lys Ala Glu Leu Phe Ile Thr His Gly Gly Met Asn Ser Thr

290 295 300

Met Glu Gly Leu Asn Ala Gly Val Pro Leu Val Ala Val Pro Gln Met

305 310 315 320

Pro Glu Gln Glu Ile Thr Ala Arg Arg Val Glu Glu Leu Gly Leu Gly

325 330 335

Lys His Leu Gln Pro Glu Asp Thr Thr Ala Ala Ser Leu Arg Glu Ala

340 345 350

Val Ser Gln Thr Asp Gly Asp Pro His Val Leu Lys Arg Ile Gln Asp

355 360 365

Met Gln Lys His Ile Lys Gln Ala Gly Gly Ala Glu Lys Ala Ala Asp

370 375 380

Glu Ile Glu Ala Phe Leu Ala Pro Ala Gly Val Lys

385 390 395

Claims

1.一种由下列结构式表示的化合物：

或其药学上可接受的盐，

其中，R是氢、单糖、二糖、三糖或包含4至10个单糖的寡糖，

其中，R’是氢、单糖、二糖、三糖或包含4至10个单糖的寡糖，并且

其中，R和R'中的至少一个不是氢。

2.如权利要求1所述的化合物，其中，R是单糖。

3.如权利要求1所述的化合物，其中，R’是单糖。

4.如权利要求1至3中任一项所述的化合物，其中，所述单糖是戊糖单糖、己糖单糖或庚糖单糖。

5.如权利要求1至3中任一项所述的化合物，其中，R是阿洛糖、芹菜糖、阿拉伯糖、果糖、岩藻糖醇、岩藻糖、半乳糖、葡萄糖、葡糖醛酸、甘露糖、N-乙酰葡糖胺、N-乙酰半乳糖胺、鼠李糖或木糖。

6.如权利要求1至3中任一项所述的化合物，其中，R’是阿洛糖、芹菜糖、阿拉伯糖、果糖、岩藻糖醇、岩藻糖、半乳糖、葡萄糖、葡糖醛酸、甘露糖、N-乙酰葡糖胺、N-乙酰半乳糖胺、鼠李糖或木糖。

7.如权利要求1至3中任一项所述的化合物，其中，R是葡糖胺、半乳糖胺、甘露糖胺、5-硫代-D-葡萄糖、野尻霉素、脱氧野尻霉素、1,5-脱水-D-山梨糖醇、2,5-脱水-D-甘露糖醇、2-脱氧-D-半乳糖、2-脱氧-D-葡萄糖、3-脱氧-D-葡萄糖、阿拉伯糖醇、半乳糖醇、葡萄糖醇、艾杜糖醇、来苏糖、甘露糖醇、L-鼠李糖醇、2-脱氧-D-核糖、核糖、核糖醇、核酮糖、木酮糖、阿卓糖、古洛糖、艾杜糖、左旋糖、阿洛酮糖、山梨糖、塔格糖、塔罗糖、半乳醛、葡萄糖毒醛、岩藻烯糖、鼠李醛、阿拉伯醛、木糖醛、3,4-二-O-乙酰-L-岩藻烯糖、3,4-二-O-乙酰-L-鼠李醛、3,4-二-O-乙酰-D-阿拉伯醛、3,4-二-O-乙酰-D-木糖醛、井冈胺、井冈霉胺、井冈霉醇胺、链霉菌醇、有效烯酮、半乳糖醛酸、甘露糖醛酸、N-乙酰神经氨酸、N-乙酰胞壁酸、葡萄糖酸D-内酯、半乳糖酸γ-内酯、半乳糖酸δ-内酯、甘露酸γ-内酯、D-阿卓-庚酮糖、D-甘露-庚酮糖、D-甘油-D-甘露-庚糖、D-甘油-D-葡萄糖-庚糖、D-阿洛-庚酮糖、D-阿卓-3-庚酮糖、D-甘油-D-甘露-庚糖醇或D-甘油-D-阿卓-庚糖醇。

8.如权利要求1至3中任一项所述的化合物，其中，R’是葡糖胺、半乳糖胺、甘露糖胺、5-硫代-D-葡萄糖、野尻霉素、脱氧野尻霉素、1,5-脱水-D-山梨糖醇、2,5-脱水-D-甘露糖醇、2-脱氧-D-半乳糖、2-脱氧-D-葡萄糖、3-脱氧-D-葡萄糖、阿拉伯糖醇、半乳糖醇、葡萄糖醇、艾杜糖醇、来苏糖、甘露糖醇、L-鼠李糖醇、2-脱氧-D-核糖、核糖、核糖醇、核酮糖、木酮糖、阿卓糖、古洛糖、艾杜糖、左旋糖、阿洛酮糖、山梨糖、塔格糖、塔罗糖、半乳醛、葡萄糖毒醛、岩藻烯糖、鼠李醛、阿拉伯醛、木糖醛、3,4-二-O-乙酰-L-岩藻烯糖、3,4-二-O-乙酰-L-鼠李醛、3,4-二-O-乙酰-D-阿拉伯醛、3,4-二-O-乙酰-D-木糖醛、井冈胺、井冈霉胺、井冈霉醇胺、链霉菌醇、有效烯酮、半乳糖醛酸、甘露糖醛酸、N-乙酰神经氨酸、N-乙酰胞壁酸、葡萄糖酸D-内酯、半乳糖酸γ-内酯、半乳糖酸δ-内酯、甘露酸γ-内酯、D-阿卓-庚酮糖、D-甘露-庚酮糖、D-甘油-D-甘露-庚糖、D-甘油-D-葡萄糖-庚糖、D-阿洛-庚酮糖、D-阿卓-3-庚酮糖、D-甘油-D-甘露-庚糖醇或D-甘油-D-阿卓-庚糖醇。

9.如权利要求1所述的化合物，其中，R是二糖。

10.如权利要求1所述的化合物，其中，R’是二糖。

11.如权利要求9和10中任一项所述的化合物，其中，R是两个葡萄糖分子的二糖。

12.如权利要求9和10中任一项所述的化合物，其中，R’是两个葡萄糖分子的二糖。

13.如权利要求9和10中任一项所述的化合物，其中，R是两个半乳糖分子的二糖。

14.如权利要求9和10中任一项所述的化合物，其中，R’是两个半乳糖分子的二糖。

15.如权利要求9和10中任一项所述的化合物，其中，R是两个木糖分子的二糖。

16.如权利要求9和10中任一项所述的化合物，其中，R’是两个木糖分子的二糖。

17.如权利要求9和10中任一项所述的化合物，其中，所述二糖分子通过1→2糖苷键键合。

18.如权利要求9和10中任一项所述的化合物，其中，所述二糖分子通过1→3糖苷键键合。

19.如权利要求9和10中任一项所述的化合物，其中，所述二糖分子通过1→4糖苷键键合。

20.如权利要求1所述的化合物，其中，R或R’是三糖。

21.如权利要求20所述的化合物，其中，R或R’是三个葡萄糖分子的三糖。

22.如权利要求20所述的化合物，其中，R或R’是三个半乳糖分子的三糖。

23.如权利要求20所述的化合物，其中，R或R’是三个木糖分子的三糖。

24.如权利要求20所述的化合物，其中，所述三糖分子通过1→2糖苷键和1→4糖苷键键合。

25.一种药物组合物，其包含根据权利要求1至24中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，以及药学上可接受的载体或佐剂。

26.一种制备依托泊苷糖苷的方法，所述方法包括：

c)提供包含以下的反应混合物：

iv)具有以下结构式的化合物：

v)尿苷二磷酸糖基转移酶(UGT)；和

vi)尿苷二磷酸-单糖；

d)使所述反应混合物将依托泊苷转化为具有以下结构式的依托泊苷的单糖、二糖或寡糖：

其中，R是氢、单糖、二糖、三糖或包含4至10个单糖的寡糖，

其中，R’是氢、单糖、二糖、三糖或包含4至10个单糖的寡糖，

其中，R”是氢、单糖、二糖、三糖或包含4至10个单糖的寡糖，并且

其中，R、R’和R”中的至少一个不是氢。

27.如权利要求26所述的方法，其中，UGT包含与SEQ ID NO:1具有至少95％相似性的氨基酸序列。

28.如权利要求26所述的方法，其中，UGT包含与SEQ ID NO:1的A340至Q382区域具有至少80％相似性的氨基酸序列。

29.如权利要求26所述的方法，其中，UGT包含如下氨基酸序列：

e)与SEQ ID NO:1的I84至S99区域具有至少90％的相似性；

f)与SEQ ID NO:1的D126至F134区域具有至少90％的相似性；

g)与SEQ ID NO:1的L147至S149区域具有至少90％的相似性；和

h)与SEQ ID NO:1的A340至Q382区域具有至少80％的相似性。

30.如权利要求26所述的方法，其中，UGT包含与SEQ ID NO:2具有至少95％相似性的氨基酸序列。

31.如权利要求26所述的方法，其中，UGT包含与SEQ ID NO:2的V278至Q318区域具有至少80％相似性的氨基酸序列。

32.如权利要求26所述的方法，其中，UGT包含如下氨基酸序列：

e)与SEQ ID NO:2的I67至D75区域具有至少90％的相似性；

f)与SEQ ID NO:2的D106至L114区域具有至少90％的相似性；

g)与SEQ ID NO:2的C127至S129区域具有至少90％的相似性；和

h)与SEQ ID NO:2的V278至Q318区域具有至少80％的相似性。

33.如权利要求26所述的方法，其中，UGT包含与SEQ ID NO:3具有至少95％相似性的氨基酸序列。

34.如权利要求26所述的方法，其中，UGT包含与SEQ ID NO:3的V291至Q331区域具有至少80％相似性的氨基酸序列。

35.如权利要求26所述的方法，其中，UGT包含如下氨基酸序列：

e)与SEQ ID NO:3的W74至V82区域具有至少90％的相似性；

f)与SEQ ID NO:3的D111至V119区域具有至少90％的相似性；

g)与SEQ ID NO:3的F132至N134区域具有至少90％的相似性；和

h)与SEQ ID NO:3的V291至Q331区域具有至少80％的相似性。

36.如权利要求26所述的方法，其中，UGT包含与SEQ ID NO:4具有至少95％相似性的氨基酸序列。

37.如权利要求26所述的方法，其中，UGT包含与SEQ ID NO:4的V280至Q320区域具有至少80％同一性的氨基酸序列。

38.如权利要求26所述的方法，其中，UGT包含如下氨基酸序列：

e)与SEQ ID NO:4的I67至D75区域具有至少90％的相似性；

f)与SEQ ID NO:4的D106至L114区域具有至少90％的相似性；

g)与SEQ ID NO:4的C127至S129区域具有至少90％的相似性；和

h)与SEQ ID NO:4的V280至Q320区域具有至少80％的相似性。

39.如权利要求26所述的方法，其中，UGT包含与SEQ ID NO:5具有至少95％相似性的氨基酸序列。

40.如权利要求26所述的方法，其中，UGT包含与SEQ ID NO:5的V283至Q323区域具有至少80％同一性的氨基酸序列。

41.如权利要求26所述的方法，其中，UGT包含如下氨基酸序列：

e)与SEQ ID NO:5的I67至Q79区域具有至少90％的相似性；

f)与SEQ ID NO:5的D110至L118区域具有至少90％的相似性；

g)与SEQ ID NO:5的C131至T133区域具有至少90％的相似性；和

h)与SEQ ID NO:5的V283至Q323区域具有至少80％的相似性。

42.如权利要求26至41中任一项所述的方法，其中，所述尿苷二磷酸-单糖是尿苷二磷酸-葡萄糖(“UDP-葡萄糖”)。

43.如权利要求26至41中任一项所述的方法，其中，所述尿苷二磷酸-单糖是尿苷二磷酸-半乳糖(“UDP-半乳糖”)。

44.如权利要求26至41中任一项所述的方法，其中，所述尿苷二磷酸-单糖是尿苷二磷酸-木糖(“UDP-木糖”)。

45.如权利要求26至41中任一项所述的方法，其中，所述尿苷二磷酸-单糖是尿苷二磷酸-N-乙酰葡糖胺(“UDP-N-乙酰葡糖胺”)。

46.一种治疗癌症的方法，所述方法包括向有需要的患者施用治疗有效量的具有以下结构式的化合物：

或其药学上可接受的盐，

其中，R是氢、单糖、二糖、三糖或包含4至10个单糖的寡糖，

其中，R和R'中的至少一个不是氢。

47.如权利要求46所述的方法，其进一步包括向所述患者施用化疗剂和免疫系统抑制剂(例如，地塞米松、强的松或甲基强的松龙)中的一种或多种。

48.如权利要求47所述的方法，其进一步包括施用选自下组的化疗剂：贝伐单抗、博来霉素、卡莫司汀、顺铂、卡铂、环磷酰胺、阿糖孢苷、阿霉素、异环磷酰胺、甲氨蝶呤、米托蒽醌、丙卡巴肼、沙利度胺、长春花碱和长春新碱。

49.如权利要求47所述的方法，其进一步包括施用选自下组的免疫系统抑制剂：地塞米松、强的松和甲基强的松龙。

50.如权利要求46至49中任一项所述的方法，其中，所述患者具有难治性睾丸肿瘤、小细胞肺癌、淋巴瘤、非淋巴细胞白血病、尤文氏肉瘤、卡波西肉瘤、中枢神经系统癌、前列腺癌、睾丸癌、卵巢癌、乳腺癌、胃癌或黑色素瘤。