CN115279330A - 作为皮肤填充物的交联ha-胶原蛋白水凝胶 - Google Patents

Abstract

本公开涉及一种交联大分子基质，其包含：赖氨酸；透明质酸；和胶原蛋白；其中所述透明质酸通过胶原蛋白上的至少一个内源性胺基和/或通过赖氨酸上存在的至少一个胺基与胶原蛋白交联。

Description

作为皮肤填充物的交联HA-胶原蛋白水凝胶

相关申请的交叉引用

本申请要求2019年12月26日提交的美国专利申请第62/953,910号的优先权的权益，该申请的全部内容通过引用并入本文。

技术领域

本公开涉及包含透明质酸、胶原蛋白和赖氨酸的交联大分子基质。此类组合物可用作具有增强的组织整合的组织填充物。

背景技术

衰老是随时间发生的自然过程，其可能受遗传和生活方式因素(软性毒品、酒精滥用、烟草、UVA/UVB暴露、饮食)的影响。例如，面部皮肤老化的特征包括肌肉和脂肪萎缩、皮肤松弛、老年斑、下垂和肥胖。皮下组织松弛会导致皮肤过多和下垂，这可能会导致脸颊和眼睑下垂。增肥是指通过面部和颈部底部溶胀而增加多余的体重。这些变化可能与干燥、失去弹性和质地粗糙有关。

皮肤填充物已用于改善老化皮肤的外观。各种类型的皮肤填充物已被开发并用于治疗或改善/纠正身体上的缺陷，例如由于衰老的影响而导致的皱纹和体积损失。最初，包含牛胶原蛋白的皮肤填充物组合物在20世纪70年代进入市场。人源胶原蛋白于2003年获得FDA批准，优于牛源胶原蛋白，后者可能在患者体内产生过敏反应。然而，由于皮肤组织内的酶，人源胶原蛋白组合物在3至6个月内迅速降解。因此，使用这些早期组合物的患者需要频繁的手术过程来保持他们想要的矫正美学外观。

作为基于胶原蛋白的皮肤填充物的替代品，20世纪90年代引入了基于透明质酸(hyaluronan，也称为hyaluronic acid，缩写HA)的填充物。HA是一种天然存在的水溶性多糖，特别是糖胺聚糖，它是细胞外基质的主要成分，广泛分布于动物组织中。HA具有优异的生物相容性，当植入患者体内时不会引起过敏反应。此外，HA具有与大量水结合的能力，使其成为软组织的极好丰盈剂。HA类似于胶原蛋白，因为它也可能被皮肤中的内源性酶降解。例如，未交联的HA没有足够的持续时间或物理特性来充当皱纹填充物，因此已使用交联的HA来最大限度地延长它们在真皮组织中的寿命。因此，需要改善的皮肤填充物。

发明内容

本文的实施方案涵盖方法和组合物(例如，水凝胶或皮肤填充物)，其包括包含透明质酸、胶原蛋白和赖氨酸的交联大分子基质，其中透明质酸通过胶原蛋白上的至少一个内源性胺基和/或通过赖氨酸上存在的至少一个胺基与胶原蛋白交联。

在上述或下述实施方案各自中的任意一个或任意实施方案的一些实施方案中，交联大分子基质还包含利多卡因。在上述或下述实施方案各自中的任意一个或任意实施方案的一些实施方案中，利多卡因在基质中的浓度在约0.15％(w/w)至约0.45％(w/w)的范围之间。在上述或下述实施方案各自中的任意一个或任意实施方案的一些实施方案中，利多卡因在基质中的浓度在约0.27％(w/w)至约0.33％(w/w)的范围之间。在上述或下述实施方案各自中的任意一个或任意实施方案的一些实施方案中，利多卡因的浓度为基质的约0.15％(w/w)、约0.17％(w/w)、约0.19％(w/w)、约0.21％(w/w)、约0.23％(w/w)、约0.25％(w/w)、约0.27％(w/w)、约0.29％(w/w)、约0.31％(w/w)、约0.33％(w/w)、约0.35％(w/w)、约0.37％(w/w)、约0.39％(w/w)、约0.41％(w/w)、约0.43％(w/w)或约0.45％(w/w)、或在由任意两个上述值限定的范围之间的任意浓度。在上述或下述实施方案各自中的任意一个或任意实施方案的一些实施方案中，利多卡因在基质中的浓度为约0.3％(w/w)。

在上述或下述实施方案各自中的任意一个或任意实施方案的一些实施方案中，交联大分子基质还包含未交联的HA。在上述或下述实施方案各自中的任意一个或任意实施方案的一些实施方案中，未交联的HA在基质内的浓度高达约5％(w/w)。在上述或下述实施方案各自中的任意一个或任意实施方案的一些实施方案中，未交联的HA在基质中的浓度为0％(w/w)、约1％(w/w)、约2％(w/w)、约3％(w/w)、约4％(w/w)或约5％(w/w)或在由任意两个上述值限定的范围之间的任意浓度。在上述或下述实施方案各自中的任意一个或任意实施方案的一些实施方案中，未交联的HA在基质中的浓度为约1％(w/w)。在上述或下述实施方案各自中的任意一个或任意实施方案的一些实施方案中，未交联的HA在基质中的浓度为约2％(w/w)。在上述或下述实施方案各自中的任意一个或任意实施方案的一些实施方案中，未交联的HA在基质中的浓度为约5％(w/w)。在上述或下述实施方案各自中的任意一个或任意实施方案的一些实施方案中，未交联的HA改善了大分子基质的可挤出性。

在上述或下述实施方案各自中的任意一个或任意实施方案的一些实施方案中，交联大分子基质在至少约6个月、约12个月、约18个月、约24个月、约30个月、或约36个月或在由任意两个上述值限定的范围之间的任意时间量是稳定的。在上述或下述实施方案各自中的任意一个或任意实施方案的一些实施方案中，交联大分子基质在约4℃和约25℃之间的温度下是稳定的。在上述或下述实施方案各自中的任意一个或任意实施方案的一些实施方案中，交联大分子基质在约4℃是稳定的。在上述或下述实施方案各自中的任意一个或任意实施方案的一些实施方案中，交联大分子基质在约25℃是稳定的。在上述或下述实施方案各自中的任意一个或任意实施方案的一些实施方案中，交联大分子基质在约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10、约11、约12、约13、约14、约15、约16、约17、约18、约19、约20、约21、约22、约23、约24、约25、约26、约27、约28、约29、约30、约31、约32、约33、约34、约35、约36个月或在由任意两个上述值限定的范围之间的任意时间是稳定的。

在上述或下述实施方案各自中的任意一个或任意实施方案的一些实施方案中，交联大分子基质在约6个月、约12个月、约18个月、约24个月、约30个月或约36个月或在由任意两个上述值限定的范围内的任意时间量具有最小的降解。

在上述或下述实施方案各自中的任意一个或任意实施方案的一些实施方案中，交联大分子基质的弹性模量(G')为约30Pa至约10,000Pa。在上述或下述实施方案各自中的任意一个或任意实施方案的一些实施方案中，基质的弹性模量(G')为约30Pa、约40Pa、约50Pa、约60Pa、约70Pa、约80Pa、约90Pa、约100Pa、约200Pa、约300Pa、约400Pa、约500Pa、约600Pa、约700Pa、约800Pa、约900Pa、约1000Pa、约1100Pa、约1200Pa、约1300Pa、约1400Pa、约1500Pa、约1600Pa、约1700Pa、约1800Pa、约1900Pa、约2000Pa、约2100Pa、约2200Pa、约2300Pa、约2400Pa、约2500Pa、约2600Pa、约2700Pa、约2800Pa、约2900Pa、约3000Pa、约3100Pa、约3200Pa、约3300Pa、约3400Pa、约3500Pa、约3600Pa、约3700Pa、约3800Pa、约3900Pa、约4000Pa、约4100Pa、约4200Pa、约4300Pa、约4400Pa、约4500Pa、约4600Pa、约4700Pa、约4800Pa、约4900Pa、约5000Pa、约5100Pa、约5200Pa、约5300Pa、约5400Pa、约5500Pa、约5600Pa、约5700Pa、约5800Pa、约5900Pa、约6000Pa、约6100Pa、约6200Pa、约6300Pa、约6400Pa、约6500Pa、约6600Pa、约6700Pa、约6800Pa、约6900Pa、约7000Pa、约7100Pa、约7200Pa、约7300Pa、约7400Pa、约7500Pa、约7600Pa、约7700Pa、约7800Pa、约7900Pa、约8000Pa、约8100Pa、约8200Pa、约8300Pa、约8400Pa、约8500Pa、约8600Pa、约8700Pa、约8800Pa、约8900Pa、约9000Pa、约9100Pa、约9200Pa、约9300Pa、约9400Pa、约9500Pa、约9600Pa、约9700Pa、约9800Pa、约9900Pa或约10,000Pa或在由任意两个上述值限定的范围之间的任意弹性模量。

在上述或下述实施方案各自中的任意一个或任意实施方案的一些实施方案中，交联大分子基质的压缩力值为约10gmf、约20gmf、约30gmf、约40gmf、约50gmf、约60gmf、约70gmf、约80gmf、约90gmf、约100gmf、约110gmf、约120gmf、约130gmf、约140gmf、约150gmf、约160gmf、约170gmf、约180gmf、约190gmf、约200gmf、约210gmf、约220gmf、约230gmf、约240gmf、约250gmf、约260gmf、约270gmf、约280gmf、约290gmf、约300gmf、约310gmf、约320gmf、约330gmf、约340gmf、约350gmf、约360gmf、约370gmf、约380gmf、约390gmf、约400gmf、约410gmf、约420gmf、约430gmf、约440gmf、约450gmf、约460gmf、约470gmf、约480gmf、约490gmf、约500gmf、约510gmf、约520gmf、约530gmf、约540gmf、约550gmf、约560gmf、约570gmf、约580gmf、约590gmf或约600gmf、或在由任意两个上述值限定的范围之间的任意压缩力值。在上述或下述实施方案各自中的任意一个或任意实施方案的一些实施方案中，交联大分子基质的压缩力值为约100gmf、约200gmf、约300gmf、约400gmf、约500gmf或约600gmf或在由任意两个上述值限定的范围之间的任意压缩力值。

在上述或下述实施方案各自中的任意一个或任意实施方案的一些实施方案中，透明质酸的浓度为约5mg/mL、约6mg/mL、约8mg/mL、约10mg/mL、约12mg/mL、约14mg/mL、约16mg/mL、约18mg/mL、约20mg/mL、约22mg/mL、约24mg/mL、约26mg/mL、约28mg/mLml、约30mg/mL、约32mg/mL、约34mg/mL或约36mg/mL或在由任意两个上述值限定的范围之间的任意浓度。

在上述或下述实施方案各自中的任意一个或任意实施方案的一些实施方案中，胶原蛋白包括I型胶原蛋白。在上述或下述实施方案各自中的任意一个或任意实施方案的一些实施方案中，胶原蛋白包括II型胶原蛋白。在上述或下述实施方案各自中的任意一个或任意实施方案的一些实施方案中，胶原蛋白包括III型胶原蛋白。在上述或下述实施方案各自中的任意一个或任意实施方案的一些实施方案中，胶原蛋白包含约1％至3％的I型或III型胶原蛋白。在上述或下述实施方案各自中的任意一个或任意实施方案的一些实施方案中，胶原蛋白包含约0％至约3％的II型胶原蛋白。在上述或下述实施方案各自中的任意一个或任意实施方案的一些实施方案中，胶原蛋白包含约97％至约99％的I型胶原蛋白。在上述或下述实施方案各自中的任意一个或任意实施方案的一些实施方案中，胶原蛋白包括I型和III型胶原蛋白的混合物。在上述或下述实施方案各自中的任意一个或任意实施方案的一些实施方案中，基质包含约0％至约3％的III型胶原蛋白。

在上述或下述实施方案各自中的任意一个或任意实施方案的一些实施方案中，交联大分子基质被配制用于注射或与针和/或套管一起使用。

在上述或下述实施方案各自中的任意一个或任意实施方案的一些实施方案中，胶原蛋白的浓度为约1mg/mL、约2mg/mL、约4mg/mL、约6mg/mL、约8mg/mL、约10mg/mL、约12mg/mL、约14mg/mL或在由任意两个上述值限定的范围之间的任意浓度。在上述或下述实施方案各自中的任意一个或任意实施方案的一些实施方案中，胶原蛋白的浓度为约3mg/mL。在上述或下述实施方案各自中的任意一个或任意实施方案的一些实施方案中，胶原蛋白的浓度为约6mg/mL。在上述或下述实施方案各自中的任意一个或任意实施方案的一些实施方案中，胶原蛋白的浓度为约10mg/mL。在上述或下述实施方案各自中的任意一个或任意实施方案的一些实施方案中，胶原蛋白的浓度为约12mg/mL。

在上述或下述实施方案各自中的任意一个或任意实施方案的一些实施方案中，交联大分子基质还包含盐。在上述或下述实施方案各自中的任意一个或任意实施方案的一些实施方案中，交联大分子基质包含在约50mM至约400mM范围之间的NaCl。在上述或下述实施方案各自中的任意一个或任意实施方案的一些实施方案中，交联大分子基质包含NaCl，其中NaCl的浓度为约50mM、约75mM、约100mM、约125mM、约150mM、约175mM、约200mM、约225mM、约250mM、约275mM、约300mM、约325mM、约350mM、约375mM或约400mM、或在由任意两个上述值限定的范围之间的任意浓度。在上述或下述实施方案各自中的任意一个或任意实施方案的一些实施方案中，交联大分子基质包含约150mM的NaCl。在某些实施方案中，交联大分子基质不含盐。

在上述或下述实施方案各自中的任意一个或任意实施方案的一些实施方案中，交联大分子基质包含约0.01M的磷酸盐缓冲液、约137mM的NaCl和浓度为约2.7mM的KCl。

在上述或下述实施方案各自中的任意一个或任意实施方案的一些实施方案中，透明质酸的平均分子量为约20,000道尔顿至约10,000,000道尔顿。在上述或下述实施方案各自中的任意一个或任意实施方案的一些实施方案中，透明质酸的平均分子量为约20,000道尔顿、约40,000道尔顿、约60,000道尔顿、约80,000道尔顿、约100,000道尔顿、约200,000道尔顿、约300,000道尔顿、约400,000道尔顿、约500,000道尔顿、约600,000道尔顿、约700,000道尔顿、约800,000道尔顿、约900,000道尔顿、约1,000,000道尔顿、约1,500,000道尔顿、约2,000,000道尔顿、约2,500,000道尔顿、约3,000,000道尔顿、约3,500,000道尔顿、约4,000,000道尔顿、约4,500,000道尔顿、约5,000,000道尔顿、约5,500,000道尔顿、约6,000,000道尔顿、约6,500,000道尔顿、约7,500,000道尔顿、约8,000,000道尔顿、约8,500,000道尔顿、约9,000,000道尔顿、约9,500,000道尔顿或约1,000,000道尔顿、或在由任意两个上述值限定的范围之间的平均分子量。在上述或下述实施方案各自中的任意一个或任意实施方案的一些实施方案中，透明质酸的平均分子量为约20,000道尔顿至约10,000,000道尔顿。在上述或下述实施方案各自中的任意一个或任意实施方案的一些实施方案中，其中透明质酸包含具有不同分子量的透明质酸组分的混合物，其中混合物包含具有如下分子量的透明质酸：约20,000、约40,000道尔顿、约60,000道尔顿、约80,000道尔顿、约100,000道尔顿、约200,000道尔顿、约300,000道尔顿、约400,000道尔顿、约500,000道尔顿、约600,000道尔顿、约700,000道尔顿、约800,000道尔顿、约900,000道尔顿、约1,000,000道尔顿、约1,500,000道尔顿、约2,000,000道尔顿、约2,500,000道尔顿、约3,000,000道尔顿、约3,500,000道尔顿、约4,000,000道尔顿、约4,500,000道尔顿、约5,000,000道尔顿、约5,500,000道尔顿、约6,000,000道尔顿、约6,500,000道尔顿、约7,500,000道尔顿、约8,000,000道尔顿、约8,500,000道尔顿、约9,000,000道尔顿、约9,500,000道尔顿和/或约10,000,000道尔顿和/或分子量在任意两个上述值之间的范围内的任意透明质酸。

本发明还提供了一种组合物，其包含：透明质酸、胶原蛋白、赖氨酸和缓冲液；并且其中组合物是水性水凝胶。

在上述或下述实施方案各自中的任意一个或任意实施方案的一些实施方案中，透明质酸通过胶原蛋白上的至少一个内源性胺基和/或赖氨酸上存在的至少一个胺基与胶原蛋白交联。在上述或下述实施方案各自中的任意一个或任意实施方案的一些实施方案中，组合物还包含利多卡因。在上述或下述实施方案各自中的任意一个或任意实施方案的一些实施方案中，利多卡因在基质中的浓度在约0.15％(w/w)至约0.45％(w/w)的范围之间。在上述或下述实施方案各自中的任意一个或任意实施方案的一些实施方案中，利多卡因在组合物中的浓度在约0.27％(w/w)至约0.33％(w/w)的范围之间。在上述或下述实施方案各自中的任意一个或任意实施方案的一些实施方案中，利多卡因的浓度为组合物的约0.15％(w/w)、约0.17％(w/w)、约0.19％(w/w)、约0.21％(w/w)、约0.23％(w/w)、约0.25％(w/w)、约0.27％(w/w)、约0.29％(w/w)、约0.31％(w/w)、约0.33％(w/w)、约0.35％(w/w)、约0.37％(w/w)、约0.39％(w/w)、约0.41％(w/w)、约0.43％(w/w)或约0.45％(w/w)或在由任意两个上述值限定的范围之间的任意浓度。

在上述或下述实施方案各自中的任意一个或任意实施方案的一些实施方案中，组合物还包含未交联的HA。在上述或下述实施方案各自中的任意一个或任意实施方案的一些实施方案中，未交联的HA在组合物中的浓度高达约5％(w/w)。在上述或下述实施方案各自中的任意一个或任意实施方案的一些实施方案中，未交联的HA在组合物中的浓度为约0％(w/w)、约1％(w/w)、约2％(w/w)、约3％(w/w)、约4％(w/w)或约5％(w/w)、或在由任意两个上述值限定的范围之间的任意浓度。在上述或下述实施方案各自中的任意一个或任意实施方案的一些实施方案中，未交联的HA在组合物中的浓度为约1％(w/w)。在上述或下述实施方案各自中的任意一个或任意实施方案的一些实施方案中，未交联HA在组合物中的浓度为约2％(w/w)。在上述或下述实施方案各自中的任意一个或任意实施方案的一些实施方案中，未交联HA在组合物中的浓度为约5％(w/w)。在上述或下述实施方案各自中的任意一个或任意实施方案的一些实施方案中，未交联的HA改善了组合物的可挤出性。在上述或下述实施方案各自中的任意一个或任意实施方案的一些实施方案中，缓冲液是磷酸盐缓冲盐水。

在上述或下述实施方案各自中的任意一个或任意实施方案的一些实施方案中，组合物的透明质酸的平均分子量为约20,000道尔顿至约10,000,000道尔顿。

在上述或下述实施方案各自中的任意一个或任意实施方案的一些实施方案中，透明质酸包含具有不同分子量的透明质酸组分的混合物，其中混合物包含具有如下分子量的透明质酸：约20,000道尔顿、约40,000道尔顿、约60,000道尔顿、约80,000道尔顿、约100,000道尔顿、约200,000道尔顿、约300,000道尔顿、约400,000道尔顿、约500,000道尔顿、约600,000道尔顿、约700,000道尔顿、约800,000道尔顿、约900,000道尔顿、约1,000,000道尔顿、约1,500,000道尔顿、约2,000,000道尔顿、约2,500,000道尔顿、约3,000,000道尔顿、约3,500,000道尔顿、约4,000,000道尔顿、约4,500,000道尔顿、约5,000,000道尔顿、约5,500,000道尔顿、约6,000,000道尔顿、约6,500,000道尔顿、约7,500,000道尔顿、约8,000,000道尔顿、约8,500,000道尔顿、约9,000,000道尔顿、约9,500,000道尔顿和/或约10,000,000道尔顿和/或分子量在任意两个上述值之间的范围内的任意透明质酸。

在上述或下述实施方案各自中的任意一个或任意实施方案的一些实施方案中，组合物的胶原蛋白包含I型胶原蛋白。在上述或下述实施方案各自中的任意一个或任意实施方案的一些实施方案中，胶原蛋白包括II型胶原蛋白。在上述或下述实施方案各自中的任意一个或任意实施方案的一些实施方案中，胶原蛋白包括III型胶原蛋白。

在上述或下述实施方案各自中的任意一个或任意实施方案的一些实施方案中，组合物在约6个月、约12个月、约18个月、约24个月、约30个月或约36个月、或在由任意两个上述值限定的范围之间的任意时间量是稳定的。在上述或下述实施方案各自中的任意一个或任意实施方案的一些实施方案中，组合物在约4℃是稳定的。在上述或下述实施方案各自中的任意一个或任意实施方案的一些实施方案中，组合物在约25℃是稳定的。在上述或下述实施方案各自中的任意一个或任意实施方案的一些实施方案中，组合物在约6个月、约12个月、约18个月、约24个月、约30个月或约36个月、或在由任意两个上述值限定的范围内的任意时间量具有最小降解。

在上述或下述实施方案各自中的任意一个或任意实施方案的一些实施方案中，组合物还包含未交联的HA。在上述或下述实施方案各自中的任意一个或任意实施方案的一些实施方案中，未交联的HA在组合物中的浓度高达约5％(w/w)。在上述或下述实施方案各自中的任意一个或任意实施方案的一些实施方案中，未交联的HA改善了组合物的可挤出性。在上述或下述实施方案各自中的任意一个或任意实施方案的一些实施方案中，组合物在约6个月、约12个月、约18个月、约24个月、约30个月或约36个月、或在由任意两个上述值限定的范围之间的任意时间量是稳定的。在上述或下述实施方案各自中的任意一个或任意实施方案的一些实施方案中，组合物在4℃是稳定的。在上述或下述实施方案各自中的任意一个或任意实施方案的一些实施方案中，组合物在25℃是稳定的。在上述或下述实施方案各自中的任意一个或任意实施方案的一些实施方案中，组合物在6个月、12个月、18个月、24个月、30个月或36个月或在由任意两个上述值限定的范围内的任意时间量具有最小降解。

在上述或下述实施方案各自中的任意一个或任意实施方案的一些实施方案中，组合物的粘度为约4,000Pa S、约4100Pa S、约4200Pa S、约4300Pa S、约4400Pa S、约4500PaS、约4600Pa S、约4700Pa S、约4800Pa S、约4900Pa S、约5000Pa S、约5100Pa S、约5200PaS、约5300Pa S、约5400Pa S、约5500Pa S、约5600Pa S、约5700Pa S、约5800Pa S、约5900PaS、约6000Pa S、约6100Pa S、约6200Pa S、约6300Pa S、约6400Pa S、约6500Pa S、约6600PaS、约6700Pa S、约6800Pa S、约6900Pa S、约7000Pa S、约7100Pa S、约7200Pa S、约7300PaS、约7400Pa S、约7500Pa S、约7600Pa S、约7700Pa S、约7800Pa S、约7900Pa S、约8000PaS、约8100Pa S、约8200Pa S、约8300Pa S、约8400Pa S、约8500Pa S、约8600Pa S、约8700PaS、约8800Pa S、约8900Pa S、约9000Pa S、约9100Pa、约9200Pa S、约9300Pa S、约9400Pa S、约9500Pa S、约9600Pa S、约9700Pa S、约9800Pa S、约9900Pa S或约10,000Pa S或在由任意两个上述值限定的范围之间的任意粘度。

在上述或下述实施方案各自中的任意一个或任意实施方案的一些实施方案中，组合物的介质损耗角正切值参数(G"/G')为约0.01至约0.5。在上述或下述实施方案各自中的任意一个或任意实施方案的一些实施方案中，组合物的介质损耗角正切值参数(G"/G')为约0.01、约0.05、约0.10、约0.15、约0.20、约0.25、约0.30、约0.35、约0.40、约0.45或约0.50或在由任意两个上述值限定的范围之间的任意介质损耗角正切值参数。在上述或下述实施方案各自中的任意一个或任意实施方案的一些实施方案中，缓冲液包括磷酸盐缓冲盐水。

本发明还提供了一种交联透明质酸和胶原蛋白的方法。该方法包括将胶原蛋白、透明质酸和赖氨酸溶解在水溶液中以形成预反应水溶液，其中该预反应水溶液的pH在4和6之间，以及制备第二溶液，其包含：水溶性碳二亚胺；和N-羟基琥珀酰亚胺或N-羟基磺基琥珀酰亚胺；将第二溶液添加到预反应水溶液中，形成交联反应混合物，通过使透明质酸和胶原蛋白与赖氨酸交联，使交联反应混合物反应，其中透明质酸通过胶原蛋白上的至少一个内源性胺基和/或通过赖氨酸上存在的至少一个胺基与胶原蛋白交联，其中HA和胶原蛋白的降解最小，且HA和胶原蛋白的结构保持完整，由此形成交联大分子基质。在上述或下述实施方案各自中的任意一个或任意实施方案的一些实施方案中，预反应水溶液的pH为约4.0、约4.5、约5.0、约5.5或约6.0、或在由任意两个上述值限定的范围之间的任意pH。在上述或下述实施方案各自中的任意一个或任意实施方案的一些实施方案中，该方法还包括提供活化剂，该活化剂包含三唑、氟化苯酚、琥珀酰亚胺或磺基琥珀酰亚胺。

在上述或下述实施方案各自中的任意一个或任意实施方案的一些实施方案中，该方法还包括将利多卡因添加到交联大分子基质中。在上述或下述实施方案各自中的任意一个或任意实施方案的一些实施方案中，利多卡因在基质中的浓度在约0.15％(w/w)至约0.45％(w/w)的范围之间。在上述或下述实施方案各自中的任意一个或任意实施方案的一些实施方案中，利多卡因在基质中的浓度在约0.27％(w/w)至约0.33％(w/w)的范围之间。在上述或下述实施方案各自中的任意一个或任意实施方案的一些实施方案中，其中利多卡因的浓度为基质的约0.15％(w/w)、约0.17％(w/w)、约0.19％(w/w)、约0.21％(w/w)、约0.23％(w/w)、约0.25％(w/w)、约0.27％(w/w)、约0.29％(w/w)、约0.31％(w/w)、约0.33％(w/w)、约0.35％(w/w)、约0.37％(w/w)、约0.39％(w/w)、约0.41％(w/w)、约0.43％(w/w)或约0.45％(w/w)、或在由任意两个上述值限定的范围之间的任意浓度。在上述或下述实施方案各自中的任意一个或任意实施方案的一些实施方案中，利多卡因在基质中的浓度为约0.3％(w/w)。

在上述或下述实施方案各自中的任意一个或任意实施方案的一些实施方案中，该方法还包括将未交联的HA添加到交联大分子基质中。在上述或下述实施方案各自中的任意一个或任意实施方案的一些实施方案中，未交联的HA在交联大分子基质中的浓度高达约5％w/w。在上述或下述实施方案各自中的任意一个或任意实施方案的一些实施方案中，添加的基质中的未交联的HA的浓度为约0％(w/w)、约1％(w/w)、约2％(w/w)、约3％(w/w)、约4％(w/w)或约5％(w/w)、或任何两个上述值限定的范围之间的任何浓度。在上述或下述实施方案各自中的任意一个或任意实施方案的一些实施方案中，添加到基质中的未交联的HA的浓度为约1％(w/w)。在上述或下述实施方案各自中的任意一个或任意实施方案的一些实施方案中，添加到基质中的未交联的HA的浓度为约3％(w/w)。在上述或下述实施方案各自中的任意一个或任意实施方案的一些实施方案中，添加到基质中的未交联的HA的浓度为约5％(w/w)。

在上述或下述实施方案各自中的任意一个或任意实施方案的一些实施方案中，反应步骤在约4℃和约35℃之间进行。在上述或下述实施方案各自中的任意一个或任意实施方案的一些实施方案中，反应步骤在约4℃、约5℃、约7℃、约9℃、约11℃、约13℃、约15℃、约17℃、约19℃、约21℃、约23℃、约25℃、约27℃、约29℃、约31℃、约33℃、约35℃或在由任意两个上述值限定的范围之间的任意温度进行。在上述或下述实施方案各自中的任意一个或任意实施方案的一些实施方案中，反应步骤在约4℃或约22℃进行。

在上述或下述实施方案各自中的任意一个或任意实施方案的一些实施方案中，该方法还包括纯化交联大分子基质，其中使用透析纯化进行纯化步骤。在上述或下述实施方案各自中的任意一个或任意实施方案的一些实施方案中，透析在约2℃和约30℃之间进行。在上述或下述实施方案各自中的任意一个或任意实施方案的一些实施方案中，透析在约2℃、约3℃、约4℃、约5℃、约6℃、约7℃、约8℃、约9℃、约10℃、约11℃、约12℃、约13℃、约14℃、约15℃、约16℃、约17℃、约18℃、约19℃、约20℃、约21℃、约22℃、约23℃、约24℃、约25℃、约26℃、约27℃、约28℃、约29℃或约30℃、或在由任意两个上述值限定的范围之间的任意温度进行。在上述或下述实施方案各自中的任意一个或任意实施方案的一些实施方案中，纯化步骤在约2℃和约8℃之间进行。在上述或下述实施方案各自中的任意一个或任意实施方案的一些实施方案中，纯化步骤在约2℃、约4℃、约6℃、约8℃或在由任意两个上述值限定的范围之间的任意温度进行。

在上述或下述实施方案各自中的任意一个或任意实施方案的一些实施方案中，该方法在低于室温的温度下进行。在上述或下述实施方案各自中的任意一个或任意实施方案的一些实施方案中，该方法在约2℃、约4℃、约6℃、约8℃、约10℃、约12℃、约14℃、约16℃、约18℃、约20℃、约22℃、约24℃、约26℃、约28℃、约30℃、约32℃、约34℃或约36℃的温度或在由任意两个上述值限定的范围之间的温度下进行。

在上述或下述实施方案各自中的任意一个或任意实施方案的一些实施方案中，交联反应混合物的pH在约4至约6.0之间。在上述或下述实施方案各自中的任意一个或任意实施方案的一些实施方案中，交联反应混合物的pH为约4.0、约4.5、约5.0、约5.5或约6.0、或在由任意两个上述值限定的范围之间的任意pH。

在上述或下述实施方案各自中的任意一个或任意实施方案的一些实施方案中，反应前溶液包含盐，其中在交联反应混合物中的盐包含的氯化钠浓度为约50mM、约75mM、约100mM、约125mM、约150mM、约175mM、约200mM、约225mM、约250mM、约275mM、约300mM、325mM、约350mM、约375mM或约400mM、或在由任意两个上述值限定的范围之间的任意浓度。

在上述或下述实施方案各自中的任意一个或任意实施方案的一些实施方案中，水溶性碳二亚胺是1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺，该1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺在交联反应混合物中浓度为约20mM至约200mM。在上述或下述实施方案各自中的任意一个或任意实施方案的一些实施方案中，水溶性碳二亚胺是1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺，该1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺的浓度为约20mM、约40mM、约60mM、约80mM、约100mM、约120mM、约140mM、约160mM、约180mM或约200mM、或在由任意两个上述值限定的范围之间的任意浓度。

在上述或下述实施方案各自中的任意一个或任意实施方案的一些实施方案中，水溶性碳二亚胺和透明质酸的水溶性碳二亚胺:透明质酸重复单元的摩尔比为约0.5至约2.0。在上述或下述实施方案各自中的任意一个或任意实施方案的一些实施方案中，水溶性碳二亚胺和透明质酸的水溶性碳二亚胺:透明质酸重复单元的摩尔比为约0.5、约0.6、约0.7、约0.8、约0.9、约1.0、约1.1、约1.2、约1.3、约1.4、约1.5、约1.6、约1.7、约1.8、约1.9或约2.0。

在上述或下述实施方案各自中的任意一个或任意实施方案的一些实施方案中，赖氨酸和透明质酸的摩尔:摩尔(赖氨酸:HA重复单元)比在约0.01和约0.6之间。在上述或下述实施方案各自中的任意一个或任意实施方案的一些实施方案中，赖氨酸和透明质酸的摩尔:摩尔(赖氨酸:HA重复单元)比为约0.01、约0.02、约0.03、约0.04、约0.05、约0.06、约0.07、约0.08、约0.09、约0.10、约0.11、约0.12、约0.13、约0.14、约0.15、约0.16、约0.17、约0.18、约0.19、约0.2、约0.21、约0.22、约0.23、约0.24、约0.25、约0.26、约0.27、约0.28、约0.29、约0.3、约0.31、约0.32、约0.33、约0.34、约0.35、约0.36、约0.37、约0.38、约0.39、约0.4、约0.41、约0.42、约0.43、约0.44、约0.45、约0.46、约0.47、约0.48、约0.49、约0.5、约0.51、约0.52、约0.53、约0.54、约0.55、约0.56、约0.57、约0.58、约0.59或约0.6。

在上述或下述实施方案各自中的任意一个或任意实施方案的一些实施方案中，该方法还包括对交联大分子基质进行灭菌，该方法包括：将交联大分子基质转移到容器中，进行蒸汽灭菌；和通过蒸汽灭菌对水凝胶进行灭菌。在上述或下述实施方案各自中的任意一个或任意实施方案的一些实施方案中，容器是注射器。

在上述或下述实施方案各自中的任意一个或任意实施方案的一些实施方案中，该方法还包括透析交联大分子基质，其中透析通过具有约1000道尔顿至约100,000道尔顿的截留分子量的膜进行，并且其中在灭菌前进行透析。在上述或下述实施方案各自中的任意一个或任意实施方案的一些实施方案中，在磷酸盐缓冲盐水中进行透析。

在上述或下述实施方案各自中的任意一个或任意实施方案的一些实施方案中，在添加第二溶液之前，预反应溶液中的透明质酸水合至少60分钟。

在上述或下述实施方案各自中的任意一个或任意实施方案的一些实施方案中，反应混合物进行交联约16小时至约24小时。在上述或下述实施方案各自中的任意一个或任意实施方案的一些实施方案中，反应混合物进行交联约16小时、约18小时、约20小时、约22小时或约24小时、或在由任意两个上述值限定的范围内的时间量。

在上述或下述实施方案各自中的任意一个或任意实施方案的一些实施方案中，交联反应在约2℃至约35℃的温度下进行。在上述或下述实施方案各自中的任意一个或任意实施方案的一些实施方案中，交联反应在约2℃、约3℃、约4℃、约5℃、约7℃、约9℃、约11℃、约13℃、约15℃、约17℃、约19℃、约21℃、约23℃、约25℃、约27℃、约29℃、约31℃、约33℃、约35℃或在由任意两个上述值限定的范围之间的任意温度下进行。

在上述或下述实施方案各自中的任意一个或任意实施方案的一些实施方案中，交联反应在约2℃至约8℃的温度下进行。在上述或下述实施方案各自中的任意一个或任意实施方案的一些实施方案中，交联反应在约2℃、约4℃、约6℃或约8℃、或在由任意两个上述值限定的范围之间的任意温度下进行。

本发明还提供了一种通过上述实施方案或下述实施方案中任一项的方法制备的交联大分子基质。

此外，本公开提供了一种改善人类解剖特征的美学质量的方法。该方法包括：将组合物注射到人体组织中，从而提高解剖特征的美学质量；其中组合物包含交联大分子基质，基质包含：透明质酸；赖氨酸；和胶原蛋白；其中透明质酸通过胶原蛋白上的至少一个内源性胺基和/或通过赖氨酸上存在的至少一个胺基与胶原蛋白交联。

本公开还提供了一种改善个体外观的方法。该方法包括在注射部位将组合物注射到个体的组织中，从而改善解剖特征的美学质量，其中来自组织的浸润细胞在注射部位内整合到组合物中，在组合物中沉积新的胶原蛋白；其中组合物包括交联大分子基质，交联大分子基质包含：透明质酸；赖氨酸；和胶原蛋白；其中透明质酸通过胶原蛋白上的至少一个内源性胺基和/或通过赖氨酸上存在的至少一个胺基与胶原蛋白交联；并且其中由组合物注射的组织显示具有组织整合和胶原蛋白沉积和血管形成。在上述或下述实施方案各自中的任意一个或任意实施方案的一些实施方案中，将组合物注射到鼻唇沟中。在上述或下述实施方案各自中的任意一个或任意实施方案的一些实施方案中，该方法改进了面部特征之间的对称性。在上述或下述实施方案各自中的任意一个或任意实施方案的一些实施方案中，该方法增强和恢复面部特征的体积。在上述或下述实施方案各自中的任意一个或任意实施方案的一些实施方案中，该方法恢复脸颊/和/或太阳穴的体积。在一些实施方案中，该方法在下巴、下颌线或鼻唇沟中增加、矫正、恢复或产生体积。在上述或下述实施方案各自中的任意一个或任意实施方案的一些实施方案中，将组合物注射到个体的泪沟中。在上述或下述实施方案各自中的任意一个或任意实施方案的一些实施方案中，将组合物注射到包括皮肤萎缩和/或脂肪垫萎缩的区域中。在上述或下述实施方案各自中的任意一个或任意实施方案的一些实施方案中，该方法在接受注射的组织中提供自然的外观、感觉和动作，其中该组合物使得注射部位周围组织的胶原蛋白浸润增加。在上述或下述实施方案各自中的任意一个或任意实施方案的一些实施方案中，由于组织整合到注射部位中，组合物的持续时间增加。在上述或下述实施方案各自中的任意一个或任意实施方案的一些实施方案中，该方法改善了注射部位周围皮肤的水合作用和弹性。

本公开还提供了一种在皮肤填充物植入物中增加组织浸润并沉积胶原蛋白的方法。该方法包括将组合物注射到个体的组织中，从而产生包含该组合物的皮肤填充物贮库，其中该组合物包含交联大分子基质，该交联大分子基质包含：透明质酸；赖氨酸；和胶原蛋白；其中透明质酸通过胶原蛋白上的至少一个内源性胺基和/或通过赖氨酸上存在的至少一个胺基与胶原蛋白交联；并且其中来自皮肤填充物贮库周围组织的细胞浸润包含组合物的皮肤填充物贮库，其中细胞整合到组合物中并将新的胶原蛋白沉积到组合物中，从而在组合物中产生浸润组织，并且其中血管将组合物中的浸润组织连接到个体身体的血液供应。

在上述或下述实施方案各自中的任意一个或任意实施方案的一些实施方案中，胶原蛋白包括I型胶原蛋白和/或III型胶原蛋白。

在上述或下述实施方案各自中的任意一个或任意实施方案的一些实施方案中，组合物包含约18mg/mL透明质酸、约20mg/mL透明质酸、约22mg/mL透明质酸、约24mg/mL的透明质酸、约26mg/mL的透明质酸、约28mg/mL的透明质酸或约30mg/mL的透明质酸或在由任意两个上述值所限定的范围之间的任意浓度。在上述或下述实施方案各自中的任意一个或任意实施方案的一些实施方案中，组合物包含约13mg/mL透明质酸。

在所述方法的上述或下述实施方案各自中的任意一个或任意实施方案的一些实施方案中，组合物或大分子基质还包含利多卡因。在上述或下述实施方案各自中的任意一个或任意实施方案的一些实施方案中，利多卡因在基质中的浓度在0.15％(w/w)至0.45％(w/w)的范围之间。在上述或下述实施方案各自中的任意一个或任意实施方案的一些实施方案中，利多卡因在基质中的浓度在0.27％(w/w)至0.33％(w/w)的范围之间。在上述或下述实施方案各自中的任意一个或任意实施方案的一些实施方案中，利多卡因在基质中的浓度为约0.15％(w/w)、约0.17％(w/w)、约0.19％(w/w)、约0.21％(w/w)、约0.23％(w/w)、约0.25％(w/w)、约0.27％(w/w)、约0.29％(w/w)、约0.31％(w/w)，约0.33％(w/w)、约0.35％(w/w)、约0.37％(w/w)、约0.39％(w/w)、约0.41％(w/w)、约0.43％(w/w)或约0.45％(w/w)、或在由任意两个上述值限定的范围之间的任意浓度。在上述或下述实施方案各自中的任意一个或任意实施方案的一些实施方案中，利多卡因在基质中的浓度为约0.3％(w/w)。

在所述方法的上述或下述实施方案各自中的任意一个或任意实施方案的一些实施方案中，组合物或大分子基质还包含未交联的HA。在上述或下述实施方案各自中的任意一个或任意实施方案的一些实施方案中，未交联的HA在组合物或基质中的浓度高达约5％(w/w)。在所述方法的上述或下述实施方案各自中的任意一个或任意实施方案的一些实施方案中，未交联的HA在组合物或基质中的浓度为约0％(w/w)、约1％(w/w)、约2％(w/w)、约3％(w/w)、约4％(w/w)或约5％(w/w)、或在由任意两个上述值限定的范围之间的任意浓度。在所述方法的上述或下述实施方案各自中的任意一个或任意实施方案的一些实施方案中，未交联的HA在组合物或基质中的浓度为约1％(w/w)。在所述方法的上述或下述实施方案各自中的任意一个或任意实施方案的一些实施方案中，未交联的HA在组合物或基质中的浓度为约2％(w/w)。在所述方法的上述或下述实施方案各自中的任意一个或任意实施方案的一些实施方案中，未交联的HA在组合物或基质中的浓度为约5％(w/w)。

附图说明

图1显示了与HA/胶原蛋白交联水凝胶制剂紧密接触的体外细胞活性细胞。

图2显示了所描绘的在仅含HA的水凝胶或HA/胶原蛋白交联的水凝胶上培养的成纤维细胞的肌动蛋白丝排列指数(2A)、细胞长宽比(2B)和凸包与细胞面积比(2C)。与在22℃水合温度下配制的类似水凝胶(制剂VI)相比，在5℃水合温度下配制的HA-胶原蛋白水凝胶(24:6HA:胶原蛋白)(制剂X)表现出显著更高的肌动蛋白丝排列指数、细胞长宽比和凸包与细胞面积比。*p<0.05，采用Tukey事后分析的ANOVA。与仅含HA的凝胶(制剂XIX)相比，在5℃水合温度下配制的HA:胶原蛋白比例为20:6的HA-胶原蛋白水凝胶表现出特别高的肌动蛋白丝排列指数、细胞长宽比和凸包与细胞面积比。*p<0.05，采用Tukey事后分析的ANOVA。图2D显示了HA-胶原蛋白水凝胶作为与仅含HA的水凝胶的欧几里得距离(包含肌动蛋白丝排列指数、细胞长宽比和凸包与细胞面积比的3维空间)的函数的排名。与低粘附性的仅含HA的凝胶相比，欧几里得距离增加表明细胞铺展和粘附性得到改善。总体而言，与仅含HA的凝胶相比，在5℃水合温度下配制的水凝胶的欧几里得距离更大。

图3显示了制剂I vs.制剂II vs.制剂III的提升曲线(平均值+/-SEM)。

图4显示了制剂XV vs.制剂III的提升曲线(平均值+/-SEM)。

图5显示了制剂II vs.制剂XV vs.制剂XVI的提升曲线(平均值+/-SEM)。

图6显示了水凝胶与4mg/mL胶原蛋白和增加的HA浓度的组织整合。(6A)H&E、(6B)胶原蛋白1a、(6C)波形蛋白、(6D)前胶原蛋白1、(6E)CD31。H&E染色表明随着HA浓度的增加，组织向内生长减少。如图所示，在13mg/mL HA制剂(制剂I)中观察到密集的胶原蛋白1a染色。20mg/mL HA制剂显示胶原蛋白1a填充减少，而25mg/mL HA制剂显示大面积没有胶原蛋白1a沉积。在所有制剂中均观察到波形蛋白阳性成纤维细胞\纤维细胞浸润，浸润程度随着HA浓度的增加而降低。与20mg/mL和25mg/mL HA制剂相比，低HA制剂(制剂I)中的前胶原蛋白I染色似乎减少了。在20mg/mL和25mg/mL HA制剂中存在前胶原蛋白I染色可能表明胶原蛋白随时间持续沉积。如CD31阳性染色所示，在20mg/mL和25mg/mL HA制剂中观察到水凝胶团注物(boluses)内的血管形成。未对13mg/mL HA制剂进行CD31染色。

图7显示了用相对于高分子量HA的更高比例的低分子量HA制备的水凝胶的组织整合。(A)胶体铁，(B)胶原蛋白1a，(C)波形蛋白，(D)前胶原蛋白1，(E)CD31。胶体铁染色显示了制剂XV水凝胶边缘的组织整合和整个制剂XVI凝胶团注物中强大的组织整合。在制剂XV团注物的背面观察到密集的胶原蛋白1a沉积，但沉积物并未完全填充凝胶。在整个制剂XVI水凝胶中观察到胶原蛋白1a阳性组织的细链。在所有制剂中均观察到波形蛋白阳性成纤维细胞\纤维细胞浸润。大部分制剂XVI团注物都被波形蛋白阳性细胞浸润。制剂XV和制剂XVI凝胶中存在前胶原蛋白I染色。前胶原蛋白I染色的存在可能表明随着时间的推移胶原蛋白持续沉积。在两种制剂(箭头)中均观察到水凝胶团注物内的血管形成。制剂XVI制剂在整个团注物中表现出最强大的血管形成。

图8显示了在室温(制剂VI)和5℃(制剂X)水合温度下制备的含有24mg/mL HA和6mg/mL胶原蛋白的水凝胶的组织整合。胶原蛋白1a染色显示在制剂VI水凝胶周围有细的胶原蛋白分布，水凝胶颗粒周围的沉积有限。制剂X凝胶的胶原蛋白1a染色显示水凝胶周围有强胶原蛋白沉积，水凝胶颗粒周围有密集的胶原蛋白沉积。

图9显示了大鼠皮下注射12周后水凝胶植入物的苏木精和曙红(H&E)和免疫组织化学(IHC)染色。H&E染色显示与制剂XIX中的水凝胶颗粒密切相关的组织沉积，而在仅含HA的水凝胶中的大水凝胶沉积物周围观察到稀疏的组织沉积。相比较仅含HA的凝胶，波形蛋白染色更广泛的纤维细胞/成纤维细胞浸润到制剂XIX水凝胶团注物中。正如广泛的CD31阳性标记所示，制剂XIX团注物也比仅含HA团注物的血管化程度更高。制剂XIX团注物的增强的细胞浸润和血管化使团注物内的组织沉积更致密和均匀，如胶原蛋白I标记所示。

图10显示阳性染色区域的免疫组织化学(IHC)定量，其显示与仅含HA的水凝胶相比，在大鼠皮下植入12周后，制剂XIX水凝胶团注物中波形蛋白(成纤维细胞)、胶原蛋白I和CD31(血管)的水平增加。

图11显示了大鼠皮下注射模型中的提升能力。制剂XIX在4至12周内表现出与24mg/mL HMW仅含HA的凝胶相似的提升能力。如图所示，该制剂表现出增强的组织整合，同时保持与仅含HA凝胶相似的提升能力。

图12显示了交联HA-胶原蛋白凝胶的28周提升能力数据。仅含HA的凝胶的提升能力随着时间的推移而稳步下降。HA-胶原蛋白凝胶的提升能力在12至28周内保持稳定。在不限制本公开的情况下，这可能表明HA-胶原蛋白凝胶比仅含HA的凝胶具有更长的治疗效果持续时间。延长的持续时间可能是更好的整合和组织向内生长的结果。如图所示，特别是制剂XIX比仅含HA的凝胶具有明显更好的组织向内生长。

图13显示了在高压灭菌之前和之后在24:6HA:胶原蛋白凝胶中观察到的差异。24:6HA:胶原蛋白凝胶(样品1和样品2重复运行)总体上具有较低的细胞活性。然而，高压灭菌和非高压灭菌的制剂都表现出比仅含HA的凝胶更高的细胞活性。如图所示，是在(B)之前和在(BA)高压灭菌之后，将含有24:6HA:胶原蛋白的凝胶重复进行的实验(样品1和样品2)。在样品1中观察到细胞活性的微小但显著的差异，而在高压灭菌后的样品2中未观察到显著差异。

图14显示了在大鼠模型中皮下植入4周后凝胶填充物团注物的H&E染色。制剂XXII(A；20mg HA:4mg胶原蛋白，5℃水合)显示出与制剂XIX(B；20mg HA:6mg胶原蛋白，5℃水合)相似或更好的组织整合。病理学家的盲审评分还证明了制剂XXII的增强整合，得分为2.33，而制剂XIX的得分为1.83。更高的分数表示更好的组织整合。相比之下，制剂XX(C；20mg HA:10mg胶原蛋白，25℃合成)表现出比制剂XXII和制剂XIX更差的组织整合。制剂XX的组织整合得分为1.13。该结果还表明，组织整合不遵循胶原蛋白浓度的线性趋势。相反，存在实现增强的组织反应的最佳合成条件和胶原蛋白浓度。

图15显示了用仅含HA和HA-胶原蛋白(制剂XXII和制剂XXIII)凝胶培养的人真皮成纤维细胞的体外细胞活性。

图16显示了用仅含HA或HA-胶原蛋白凝胶(制剂XXII和制剂XXIII)培养的人真皮成纤维细胞的长宽比的图像分析。

图17显示了在大鼠中皮下植入制剂XXII和制剂XXIII或仅含HA的对照物，4周后凝胶团注物的组织整合评分。

图18显示了与仅含HA的凝胶相比，制剂XXII和制剂XXIII的组织整合的胶原蛋白1a染色。

图19显示了在大鼠皮下植入制剂XXII 4周后，水凝胶团注物内的胶原蛋白1a染色阳性面积百分比的量化。

图20显示了在仅含HA、制剂XXII或制剂XXIII凝胶上培养48小时的人真皮成纤维细胞的共焦显微照片。对样品进行HA结合蛋白、Hoechst和小麦胚芽凝集素(细胞膜)染色。

图21显示了大鼠皮下植入4周后对仅含HA和HA-胶原蛋白水凝胶(制剂XXII和制剂XXIII)的组织反应的免疫组织化学分析。

图22显示了与仅含HA的凝胶相比，制剂XXII的52周提升能力数据。

图23显示了与仅含HA凝胶相比，制剂XXIII的26周提升能力数据。

图24显示了在仅含HA、制剂XXVI或制剂XXV凝胶上培养48小时的人真皮成纤维细胞的共焦显微照片。对样品进行HA结合蛋白、Hoechst和小麦胚芽凝集素(细胞膜)染色。

图25显示了在12周后仅含HA、制剂XXV或制剂XXIII的皮下团注物注射处理的大鼠中的二次谐波产生信号(白色)和组织自发荧光(绿色)的双光子成像。

图26显示了大鼠皮下植入4周后对制剂XXV的组织反应的免疫组织化学分析。

图27显示了大鼠皮下植入4周后对制剂XXVI的组织反应的免疫组织化学分析。

图28显示了与仅含HA凝胶相比，制剂XXV和XXVI的30周提升能力数据。

具体实施方式

在此使用的章节标题仅用于组织目的并且不应被解释为限制所描述的主题。

在说明书中使用的术语的定义偏离该术语的常用含义的情况下，除非特别指明，否则申请人旨在使用本文提供的定义。

本文公开了交联大分子基质、包含交联大分子基质的组合物、制备交联大分子基质的方法和改善个体外观的方法。包含实施方案中描述的交联大分子基质的填充物在注射后具有即时填充和提升能力，随后通过组织整合到注射部位，这可以产生长期和自然的效果。

有利地，交联方法提供具有可调节物理性质的HA/胶原蛋白材料，其产生一定范围的填充和提升特性，因此允许将此类材料注射到一定范围的组织深度、面部区域和用于不同目的(丰盈、严重皱纹、细纹等)。此外，该合成方法允许通过将胶原蛋白共价结合到交联水凝胶中来控制细胞从周围组织浸润注射的团注物中。此外，交联还可以保护胶原蛋白免于变性。提升和组织整合特性的组合有望提供卓越的面部美学增强效果，并具有自然的感觉、外观和动作。如本文所述，是改善填充物质量的方法，这些方法导致混合材料的性能优于以前的胶原蛋白填充物和当前的HA填充物。

除非另外限定，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

在描述本发明的上下文中(尤其是在以下权利要求的上下文中)使用的术语“一个(a、an)”“所述(the)”和类似的指称应被解释为涵盖单数和复数，除非本文另有说明或与上下文明显矛盾。如本文所用，当提及可测量值时，“约”是指包含与指定值相比+20％或+10％、更优选+5％、甚至更优选+1％、还更优选+0.1％的变化。

如本文所用，除非上下文另有要求，术语“包含”和该术语的变体，例如“包含(comprising，comprises和comprised)”，不旨在排除进一步的添加剂、组分、整数或步骤。

“交联大分子基质”是指HA与胶原蛋白交联而成的基质。HA和胶原蛋白可以通过活化HA和胶原蛋白上的天然羧酸部分来交联，从而这样的部分可以与胶原蛋白上存在的内源性胺基反应。此外，可以添加赖氨酸作为羧酸/二胺交联剂，以进一步增强HA和胶原蛋白的交联。这种赖氨酸的添加允许调节所得水凝胶的物理性质。交联大分子基质可用于医学美容的组合物或制剂中(例如，作为美容或皮肤填充物)。

如本文所述的“透明质酸(Hyaluronic acid或Hyaluronan)”是指广泛分布于整个人体的结缔组织、上皮组织和神经组织中的非硫酸化糖胺聚糖。透明质酸在皮肤的不同层中含量丰富，具有多种功能，例如，确保良好的水合作用、协助细胞外基质的组织、充当填充材料；并参与组织修复机制。

如本文所述的“胶原蛋白”是体内各种结缔组织的细胞外空间中的主要结构蛋白。胶原蛋白形成承受拉伸载荷的原纤维和薄片。胶原蛋白还具有用于细胞粘附的特定整合素结合位点，并且已知可促进细胞贴壁、迁移和增殖。胶原蛋白可能带正电荷，因为它含有高含量的碱性氨基酸残基，例如精氨酸、赖氨酸和羟赖氨酸。人体超过90％的胶原蛋白是I型胶原蛋白。III型胶原蛋白是网状纤维的主要成分，通常与I型胶原蛋白一起发现。本领域技术人员将理解，胶原蛋白可以由商业来源提供。在上述或下述实施方案各自中的任意一个或任意实施方案的一些实施方案中，所提供的胶原蛋白材料可以是包括约97％至约99％的I型胶原蛋白以及余量为约1％至3％的III型胶原蛋白的混合物。

在上述或下述实施方案各自中的任意一个或任意实施方案的一些实施方案中，胶原蛋白是交联胶原蛋白。在上述或下述实施方案各自中的任意一个或任意实施方案的一些实施方案中，胶原蛋白是非交联胶原蛋白。

在上述或下述实施方案各自中的任意一个或任意实施方案的一些实施方案中，HA与胺交联并且可以通过胶原蛋白或HA上的赖氨酸或通过另一个胺基而具有多个交联。

“弹性模量(Elastic modulus)”也称为弹性模数(the modulus of elasticity)，是指衡量物体或物质在对其施加应力时抵抗弹性变形(即，非永久性)的能力的量。

如本文所述，“压缩力”是指对物体施加力量、压力或用力，使其被挤压、压扁或压实。

如本文所述，“灭菌”是指使材料进行可能导致材料中的微生物死亡的灭菌过程。消毒和灭菌的方法可以是物理的、化学的和物理化学方式。

对于诸如水凝胶之类的材料，例如，可以在较少侵蚀性条件下完成消毒，例如较短的消毒时间、较低的温度和较低的暴露剂量。

非限制性地，灭菌可包括蒸汽热、干热和/或电离辐射

作为经历灭菌过程的结果，可以形成无菌制品，例如水凝胶。此类灭菌过程可在Chitre等人(US2014/0011980A1)、Chitre等人(US2018/0147307A1)和Chitre等人(US2016/0101200A1)中找到。

在一个实施方案中，组合物或基质包含麻醉剂。非限制性麻醉剂包括苯佐卡因、氯普卡因、普鲁卡因、丙美卡因、丁卡因、阿米罗卡因、奥布卡因、阿替卡因、布比卡因、地布卡因、依替卡因、左布比卡因、利多卡因、甲哌卡因、丙胺卡因、罗哌卡因、沙立啶、托尼卡因、辛可卡因。

方法

透明质酸和胶原蛋白可使用1-乙基-3-(N,N'-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)共交联，以激活存在于HA和胶原蛋白上的天然羧酸部分与存在于胶原蛋白上的内源性胺基发生反应。在一个实施方案中，添加赖氨酸作为额外的二胺交联剂以进一步增强HA和胶原蛋白化学改性并调节所得水凝胶的物理性质。

赖氨酸的添加使得可以独立调节交联，可以调节水凝胶物理性质而不改变HA:胶原蛋白组合物为或活化试剂的量。在一个实施方案中，交联反应在温和的pH和温度条件(pH5.5和4℃至25℃)下进行，而不是在HA皮肤填充物标准的BDDE交联所需的更高pH和温度下进行。令人惊讶的是，使用这些方法HA和敏感的胶原蛋白组分在交联过程中表现出最小的降解，并且它们的结构基本上保持完整，如实施例中所示。

在一个实施方案中，透明质酸在与胶原蛋白交联步骤之前水合至少60分钟。在进一步的实施方案中，透明质酸在低于室温的温度下水合。在又一个实施方案中，透明质酸在约2℃、约4℃、约6℃、约8℃、约10℃、约12℃、约14℃、约16℃、约20℃、约22℃、约24℃的温度或在由任意两个上述值限定的范围之间的任意温度下水合。在一个实施方案中，透明质酸在高于室温的温度下水合。因此，可以调整制造水凝胶的方法以调整水凝胶的性质，例如介质损耗角正切值参数(G"/G')。

在一个实施方案中，胶原蛋白可以在溶液中提供，其中溶液为酸性pH，其中所述胶原蛋白是可溶的。

在一个实施方案中，胶原蛋白作为预原纤维化胶原蛋白提供，其中胶原蛋白在交联之前被处理。在一个实施方案中，预原纤维化胶原蛋白在碱性溶液中。在一个实施方案中，胶原蛋白作为可溶性胶原蛋白提供，其中胶原蛋白处于酸性溶液中。在一个实施方案中，预原纤维化胶原蛋白在溶液中，其中所述溶液为中性pH。

在一个实施方案中，交联反应在4.0、5.0、5.5、6.0、6.5或7.0的pH或在由任意两个上述值限定的范围之间的任意pH下进行。

水凝胶的物理性质可取决于HA和胶原蛋白浓度、HA分子量、EDC浓度、EDC/NHS比、温度、pH、盐/缓冲液浓度和赖氨酸浓度。在一个实施方案中，获得范围为30Pa到几乎10,000Pa的弹性模量(G')值。在一个实施方案中，弹性模量取决于配方和合成参数。可以调整配方和合成参数。在一个实施方案中，压缩力值的范围为20gmf至大于500gmf，水凝胶溶胀的范围为原始凝胶体积的1.5倍至5倍。基于所获得的广泛物理特性，不同的HA/胶原蛋白配置可能会用作不同面部应用的皮肤填充物。

在交联反应的一个实施方案中，该方法包括停止交联步骤。

如本文实施方案中所述，具有低G'和压缩力值以及最小溶胀的制剂可用于非常表浅放置的细线填充物或可注射的皮肤质量增强剂，而具有更高G'和压缩力以及更多的溶胀的更稳健配置可用于中度至重度皱纹矫正和面部丰盈/塑形。

在一个实施方案中，填充细纹的方法包括向有需要的患者提供组合物的步骤，该组合物具有低G'和压缩力值。在一个实施方案中，提供了治疗中度至重度皱纹矫正和面部丰盈/塑形的方法，该方法包括向有需要的患者提供包含更高G'和压缩力的组合物。

考虑增加交联大分子基质的HA浓度。例如，增加HA浓度可能会导致水凝胶具有更高的G'、更高的压缩力值和更高的不透明度。不透明度的增加也可能降低注射部位由于丁达尔效应而出现蓝色变色的可能性。强交联大分子基质可提供提升组织和抵抗后续变形所需的力，这可产生所需的矫正和外观。因此，高提升能力可能需要高强度的基质。弹性模量(G')可以代表基质的刚度和基质的挤压难易程度。

弹性模量可以是透明质酸浓度的函数。在一个实施方案中，HA浓度在13mg/mL至28mg/mL的范围之间。在一个实施方案中，该组合物的G'为约30Pa、约40Pa、约50Pa、约60Pa、约70Pa、约80Pa、约90Pa、约100Pa、约200Pa、约300Pa、约400Pa、约500Pa、约600Pa、约700Pa、约800Pa、约900Pa、约1000Pa、约1100Pa、约1200Pa、约1300Pa、约1400Pa、约1500Pa、约1600Pa、约1700Pa、约1800Pa、约1900Pa、约2000Pa、约2100Pa、约2200Pa、约2300Pa、约2400Pa、约2500Pa、约2600Pa、约2700Pa、约2800Pa、约2900Pa、约3000Pa、约3100Pa、约3200Pa、约3300Pa、约3400Pa、约3500Pa、约3600Pa、约3700Pa、约3800Pa、约3900Pa、约4000Pa、约4100Pa、约4200Pa、约4300Pa、约4400Pa、约4500Pa、约4600Pa、约4700Pa、约4800Pa、约4900Pa、约5000Pa、约5100Pa、约5200Pa、约5300Pa、约5400Pa、约5500Pa、约5600Pa、约5700Pa、约5800Pa、约5900Pa、约6000Pa、约6100Pa、约6200Pa、约6300Pa、约6400Pa、约6500Pa、约6600Pa、约6700Pa、约6800Pa、约6900Pa、约7000Pa、约7100Pa、约7200Pa、约7300Pa、约7400Pa、约7500Pa、约7600Pa、约7700Pa、约7800Pa、约7900Pa、约8000Pa、约8100Pa、约8200Pa、约8300Pa、约8400Pa、约8500Pa、约8600Pa、约8700Pa、约8800Pa、约8900Pa、约9000Pa、约9100Pa、约9200Pa、约9300Pa、约9400Pa、约9500Pa、约9600Pa、约9700Pa、约9800Pa、约9900Pa或约10,000Pa或在由任意两个上述值限定的范围之间的任意弹性模量。

在一个实施方案中，需要更高的G'值。通过增加EDC:HA比或EDC:NHS比也可以获得更高的G'值。考虑了包含不同分子量的透明质酸组分的混合物，这可能会影响G'和压缩力值。例如，在HA:胶原蛋白制剂中，水合温度降低可能会导致G'值升高、溶胀降低和不透明度降低(增加半透明度)。使用这些合成参数和结果，可以有针对性地合成具有所需物理特性的HA-胶原蛋白制剂。

胶原蛋白浓度也可以影响物理性质。对于给定的水合温度，增加的胶原蛋白浓度可能导致不透明度增加、G'升高和溶胀减少。增加的不透明度可能导致填充物的丁达尔效应降低。HA-胶原蛋白水凝胶的物理和光学特性取决于胶原蛋白在合成步骤中的溶解程度。温度、pH和盐浓度等合成参数会影响胶原蛋白的溶解度。胶原蛋白溶解度可能会因温度、pH和盐浓度的升高而降低，合成过程中胶原蛋白溶解度的降低会导致凝胶的G'降低、溶胀度升高并且挤压力增加。HA还可以与胶原蛋白相互作用以降低胶原蛋白溶解度，如Taguchi及其同事所述(Taguchi等人，Journal of Biomedical Materials Research,2002,61(2),330-336；incorporated by reference herein；通过引用并入本文)。调节盐浓度可以改变HA和胶原蛋白之间的相互作用，从而调节胶原蛋白的溶解度并改变其物理性质。在一个实施方案中，组合物包含浓度在50mM和400mM之间的盐。在一个实施方案中，组合物包含约150mM的NaCl浓度。因此，在合成过程中，通过降低水合温度和优化盐/缓冲液浓度，对于给定的HA浓度，可以获得最大的G'和最小的溶胀值以及最大的胶原蛋白溶解度。

在一个实施方案中，组合物是透明的。在一个实施方案中，组合物是半透明的。在一个实施方案中，HA的浓度、水合温度、盐浓度和/或胶原蛋白浓度影响组合物的不透明度。增加的不透明度可能会降低丁达尔效应，即注射部位可能出现的蓝色变色。本领域技术人员可以理解测定组合物的不透明度的方法。

在一个实施方案中，已经表征了这些材料和组合物的生物学特性和组织反应。在一个实施方案中，与仅含HA的材料相比，制剂显示出增强的细胞活性。活性水平取决于胶原蛋白浓度，还取决于HA浓度和合成过程。在一个实施方案中，对于给定的胶原蛋白浓度，发现具有较低HA浓度(13mg/mL)的制剂比具有较高HA浓度(20mg/mL至28mg/mL)的制剂产生增强的体外反应。在一个实施方案中，具有相似HA浓度的组合物，例如具有较高胶原蛋白浓度的那些水凝胶，显示出更强的体外反应。另外，在一个实施方案中，在低于室温的温度下水合的制剂比在室温下水合的那些类似制剂刺激更高的细胞活性。对于特定的填充物适应症，可能需要特定的细胞活性水平，并且通过选择制剂和合成参数，可以实现优选的活性水平。

在一个实施方案中，还在组织整合模型中评估了HA/胶原蛋白制剂的组织反应。HA-胶原蛋白材料植入物的组织切片显示来自周围组织的细胞浸润以及注入的填充物团注物内的新胶原蛋白沉积和血管形成。不同制剂的浸润和组织整合程度不同。在本文所述制剂的一些实施方案中，胶原蛋白结构和交联在浸润和组织整合的程度中出人意料地重要。在一个实施方案中，胶原蛋白结构和交联在组织整合和浸润中可能是重要的(参见例如图14)。在本文所述制剂的一些实施方案中，组织整合随着HA浓度的增加而降低。在本文所述的制剂的一些实施方案中，注射到组织中的具有低HA浓度(13mg/mL)的制剂，发现周围组织在4周时浸润整个凝胶团注物。在这些实施方案中，发现细胞核和新沉积的胶原蛋白散布在凝胶中。这可以在使用制剂I的实施例7(图6B和6C)中看出。因此，这些制剂获得了组织浸润到凝胶团注物中的令人惊讶的结果。

在一些实施方案中，具有较高HA浓度(20mg/mL至25mg/mL)的制剂也表现出强组织整合，但与具有较低HA浓度的那些制剂一样，组织没有浸润整个团注物。

在一些实施方案中，HA分子量和/或凝胶颗粒特性也影响周围组织整合。

然而，另一个令人惊讶的结果表明结构/交联可能比组合物中的胶原蛋白浓度更重要。这一令人惊讶的发现的一个例子是，含有20:6HA:胶原蛋白的凝胶(其中HA在5℃水合)(分数＝2.0)比含有20:10HA:胶原蛋白的凝胶(在室温下水合)(分数＝0.5)表现出更好的组织整合分数。组织整合评分由不知情的组织病理学家进行，并根据研究内部对照(仅含HA凝胶)进行标准化。得分越高表明组织整合越好。

令人惊讶的是，结果的差异显示在混合凝胶结构不同的组合物中。与其中凝胶具有在5℃下与HA交联的胶原蛋白的组合物相比，其中混合有胶原蛋白的组合物具有不同的响应。

如本文实施方案所示，用在5℃水合的HA合成的制剂XIX证明了改善的体外和体内性能以及最佳的组织整合。

除了胶原蛋白浓度之外，组合物的水平或交联和结构显示出同样重要的意义。例如，在降低的温度下生产的组合物如凝胶制剂产生改善的体外和体内性能，例如改善的组织整合。这可以从制剂XIX(具有20:6HA:胶原蛋白比和约5℃的水合温度)中看出。制剂的制备还导致了令人惊讶的结果，例如体外和体内性能的改善。在一些实施方案中，在用于水合的低温(例如5℃)下制备凝胶制剂导致凝胶制剂具有改善的体外和体内性能。在一些实施方案中，凝胶制剂证明组织整合到注射制剂的部位。

具有20:6和20:4的HA:胶原蛋白比和约5℃的水合温度的制剂也产生了令人惊讶的结果，例如体外和体内性能的改善。

在一些实施方案中，提供了一种制剂，其中该制剂增加了胶原蛋白向组织中的渗透。该制剂包含13mg/mL透明质酸。在一些实施方案中，将制剂注射到组织中，从而产生包含制剂的贮库，其中来自贮库周围组织的细胞沉积到贮库中。在一个实施方案中，注射有该制剂的组织显示出具有组织整合和胶原蛋白沉积以及血管形成。在一个实施方案中，该制剂具有20:6的HA:胶原蛋白比和约5℃的水合温度。在一个实施方案中，该制剂具有20:4的HA:胶原蛋白比和约5℃的水合温度。

皮肤填充物的主要功能是填充皱纹并支撑其下注射有该填充物的覆盖组织。所需的提升量取决于特定的面部适应症。旨在丰盈适应症并放置在皮肤下更深处的制品将需要表现出更多的结构和更多的提升。用于置于表浅的细纹的制剂不需要表现出如此大的提升，但应该更平滑并融入现有组织。因此，在动物提升能力模型中评估HA/胶原蛋白制剂以确定提升能力。对于以类似方式交联的制剂，提升能力取决于HA浓度，较高的HA浓度提供增加的提升。

在一些实施方案中，添加了赖氨酸的交联HA:胶原蛋白制剂表现出随着HA浓度从13mg/mL增加到20mg/mL再到25mg/mL，提升增加。在一些实施方案中，HA分子量也影响提升。在一些实施方案中，含有25mg/mL大分子量HA的制剂表现出比由25mg/mL低和高分子量HA的混合物组成的制剂更大的提升。因此，可以通过选择最佳合成参数、HA浓度和HA分子量比来实现所需的提升。在上述或下述实施方案各自中的任意一个或任意实施方案的一些实施方案中，制剂包含具有不同分子量的透明质酸组分的混合物，其中混合物包含如下平均分子量的透明质酸：约20,000道尔顿、约40,000道尔顿、约60,000道尔顿、约80,000道尔顿、约100,000道尔顿、约200,000道尔顿、约300,000道尔顿、约400,000道尔顿、约500,000道尔顿、约600,000道尔顿、约700,000道尔顿、约800,000道尔顿、约900,000道尔顿、约1,000,000道尔顿、约1,500,000道尔顿、约2,000,000道尔顿、约2,500,000道尔顿、约3,000,000道尔顿、约3,500,000道尔顿、约4,000,000道尔顿、约4,500,000道尔顿、约5,000,000道尔顿、约5,500,000道尔顿、约6,000,000道尔顿、约6,500,000道尔顿、约7,500,000道尔顿、约8,000,000道尔顿、约8,500,000道尔顿、约9,000,000道尔顿、约9,500,000道尔顿和/或约10,000,000道尔顿和/或分子量在由任意两个上述值限定的范围之间的任意透明质酸。

合成赖氨酸交联HA-胶原蛋白水凝胶的方法

本公开提供的方法包括提供胶原蛋白溶液并将胶原蛋白溶液添加到包含赖氨酸·HCl、高分子量HA、MES缓冲液、NaCl和NaOH的第二溶液中。在一些实施方案中，水凝胶包含约24:12、约28:2、约20:4、约25:4、约22:6、约22:4、约24:6、约20:6或约13:4的透明质酸与胶原蛋白的重量比。在一些实施方案中，水凝胶包含约6mg/mL的胶原蛋白浓度。在一些实施方案中，搅拌水凝胶以进行均质化。在一些实施方案中，水凝胶在低于室温下水合。在一个实施方案中，HA在2℃和35℃之间的温度下水合。在一个实施方案中，HA在2℃、3℃、5℃、7℃、9℃、11℃、13℃、15℃、17℃、19℃、21℃、23℃、25℃、27℃、29℃、31℃、33℃、35℃的温度或在由任意两个上述值限定的范围之间的任意温度下水合。在一个实施方案中，HA在2℃和19℃之间的温度下水合。在一个实施方案中，HA在2℃、3℃、5℃、7℃、9℃、11℃、13℃、15℃、17℃或19℃的温度或在由任意两个上述值限定的范围之间的任意温度下水合。在一个实施方案中，HA在室温下水合至少60分钟。在一个实施方案中，HA在高于室温的温度下水合。在一个实施方案中，HA在至少35℃的温度下水合。在一些实施方案中，进行另一个水合步骤至少60分钟。在一些实施方案中，在MES缓冲液中以约5.5的pH进行水合。混合物可以被容纳在注射器内并且可以在两个注射器之间通过注射器至少五十次。可以将EDC/NHS溶液添加到混合物中。可以通过将溶液在两个注射器之间传递来进行混合。添加EDC/NHS溶液后，使混合物在2℃至8℃之间的温度下反应至少16小时。在一些实施方案中，使用NaOH将溶液的pH调节至7.4并使用透析纯化。可以使用流变仪获得所形成的水凝胶的性质。本领域技术人员可以测量组合物的若干参数，例如压缩力、溶胀特性和挤压力。

在一个实施方案中，大分子基质还包含未交联的HA，其可用于促进注射和降低挤压力。

在一个实施方案中，赖氨酸:HA比被优化以最大化交联效率。在一个实施方案中，赖氨酸:HA比在约0.0至0.5之间并且可以允许更有效的交联。没有赖氨酸的交联可能依赖于胶原蛋白来提供用于交联的胺，并且可能允许HA链之间更多的水不稳定酯交联。用高赖氨酸:HA比进行交联可能会使HA链上的活化羧酸饱和，并可能导致悬垂的赖氨酸分子仅在一侧连接到HA链上，而不是在链之间交联。通过为给定的适应症选择最佳的赖氨酸:HA比，可以调整所得水凝胶的物理性质并获得所需的特性。在一些实施方案中，最佳赖氨酸:HA比可能取决于组成。

组合物的灭菌

在通过注射或植入人类患者体内来施用组合物之前，开发的生物材料可能需要灭菌，或破坏不需要的生物材料，例如病原体、细菌微生物。这些组合物包括本文所述的实施方案，例如交联大分子基质等材料。这些材料中的蛋白质、多糖和碳水化合物在暴露于常规热温灭菌程序(例如高压釜)或受到电离辐射(例如γ辐射)时可能容易发生分子分解。传统上，这些能量敏感的生物材料中的许多通过旨在从组合物中物理去除微生物的微过滤工艺来批量灭菌。然后必须将过滤的组合物包装在注射器和/或小瓶中以供医生使用。

在一个实施方案中，交联大分子基质是无菌的。在一个实施方案中，制备交联大分子基质的方法还包括对交联大分子基质进行灭菌的步骤。

在一个实施方案中，该方法还包括使组合物或交联大分子基质经受一定剂量的宽带光谱辐射以有效灭活病原体、微生物和其他微生物的步骤。

在一个实施方案中，该方法还包括使组合物或交联大分子基质经受脉冲辐射(下文有时是脉冲光，包括宽带光谱辐射)的步骤。宽带光谱辐射可以具有在约100nm至约1100nm波长范围之间的波段。宽带光谱辐射包括紫外范围、可见光范围和红外范围内的波长。在一些实施方案中，具有约54％的UV波长、26％的可见光波长和约20％的红外线波长的波长分布。这种形式的辐射可以由氙灯提供。

在一个实施方案中，脉冲光使组合物中的微生物(microorganisms和microbes)在整个组合物中失活，而不会引起组合物的显著劣化，并且不会引起组合物的流变学的显著变化。

在一个实施方案中，脉冲光具有由在约100mJ/sqcm至约2000mJ/sqcm之间的254nm处的UV通量限定的能量。在一个实施方案中，脉冲光具有由在约300mJ/sqcm至约1800mJ/sqcm之间的254nm处的UV通量限定的能量。

在一个实施方案中，脉冲光具有约700mJ/sqcm至约800mJ/sqcm之间的由254nm处的UV通量限定的能量。在一个实施方案中，脉冲光具有由在约1400mJ/sqcm至约1600mJ/sqcm之间的254nm处的UV通量限定的能量。

在一个实施方案中，脉冲光具有在每秒约1个脉冲到每秒约10个脉冲之间的脉冲频率，例如，每秒约3个脉冲。

在一个实施方案中，组合物经受脉冲光作用不超过240秒的时间段。在一个实施方案中，组合物经受脉冲光作用不超过120秒的时间段。在一个实施方案中，组合物经受脉冲光作用不超过40秒的时间段。在一个实施方案中，组合物经受脉冲光作用不超过30秒的时间段。在一个实施方案中，组合物经受脉冲光作用不超过20秒的时间段。在一个实施方案中，组合物经受脉冲光作用10秒的时间段。

在一个实施方案中，组合物经受脉冲光作用5秒的时间段。在一个实施方案中，组合物经受脉冲光作用不超过一秒的时间段。

在一个实施方案中，脉冲光有效地对组合物进行灭菌而不使组合物的温度升高超过90℃。在一个实施方案中，脉冲光可有效地对组合物进行灭菌，而不会使组合物的温度升高超过20℃。在一个实施方案中，该剂量有效地对组合物进行灭菌而不使组合物的温度升高超过15℃，例如，超过10℃，例如，超过5℃。

在一个实施方案中，脉冲光以小于约10％、或小于约8％、或小于约5％的流变损失(G'/G")有效地对组合物进行灭菌。

在一个实施方案中，脉冲光有效地对组合物进行灭菌，即灭活组合物中的病原体、微生物(microbes)和其他微生物(microorganisms)，而不会引起显著劣化，例如，不会引起组合物流变性质的显著变化。

在一个实施方案中，辐射的有效灭菌剂量保持水凝胶的流变性。在一个实施方案中，该方法有效地以小于约10％、或小于约8％、或小于约5％的流变损失(G'/G")对水凝胶进行灭菌。

实施例

以下实施例，包括进行的实验和获得的结果，仅用于说明目的，不应解释为限制本公开。

实施例1–赖氨酸交联HA-胶原蛋白水凝胶的合成

将0.01M HCl中的4.96mg/mL胶原蛋白溶液与赖氨酸·HCl、HMW HA、MES缓冲液/NaCl固体和1M NaOH一起添加到30mL HSW Norm-Ject注射器中。相应地调整浓度以制备具有例如13:4mg/mL(制剂I)、20:4mg/mL(制剂II)和25:4(制剂III)的HA:胶原蛋白比例的水凝胶。搅拌混合物以使溶液均质化，并使HA在室温下水合约60分钟。约60分钟至约90分钟后，混合物在注射器之间通过并再次水合约30分钟至约60分钟。在第二次水合后，混合物在注射器之间多次通过。通过添加水、NHS和EDC，在第三个30mL注射器中制备EDC/NHS溶液，并摇晃混合。将EDC/NHS溶液添加到HA/胶原蛋白混合物中并在两个注射器之间通过，然后转移到允许在2℃至8℃反应的玻璃小瓶中。在一些实施方案中，反应时间为约16小时、约18小时、约20小时、约22小时、约24小时或在由任意两个上述值限定的范围之间的任意时间。此时间后，将凝胶转移到注射器中并再次在两个注射器之间通过。使用2M NaOH将凝胶的pH调节至约7.40，并使用PBS调节最终体积。凝胶制剂在2℃至8℃对PBS透析约70小时，在此期间更换若干次缓冲液以去除EDC/NHS。然后将凝胶从透析膜转移到注射器并通过不锈钢网(60μm孔至104μm孔)并在两个注射器之间通过。将凝胶转移到1mL注射器中，并对注射器进行蒸汽灭菌。使用流变学、压缩力测量、挤压力测量和溶胀来表征所得无菌水凝胶。

对于制剂XXVI，在交联过程中省略了NaCl。

对于制剂XXV和XXVI，在注射器填充和灭菌之前添加未交联的HMW HA(相对于总组合物的2％(w/w))和盐酸利多卡因(相对于总组合物的0.3％(w/w))。

实施例2–最终胶原蛋白浓度为6mg/mL的赖氨酸交联HA-胶原蛋白水凝胶的合成

将0.01M HCl中的7.16mg/mL胶原蛋白溶液与赖氨酸·HCl、HMW和/或LMWHA和MES缓冲液/NaCl固体一起添加到30mL HSW Norm-Ject注射器中。用1M NaOH调节pH。搅拌混合物以均质化，使HA在指定温度下水合约60分钟。约60分钟至90分钟后，混合物在两个注射器之间多次通过，并再次水合至少30分钟。在第二个水合步骤之后，混合物再次在两个注射器之间多次通过。通过添加水、NHS和EDC在第三个30mL注射器中制备EDC/NHS溶液，并摇晃混合。水合可以在约5℃、约6℃、约7℃、约8℃、约9℃、约10℃或在由上述任意两个限定的范围之间的任意温度下进行。将EDC/NHS溶液添加到HA/胶原蛋白混合物中并在两个注射器之间多次通过，然后转移到Thinky Mixer反应容器中，使其在2℃至8℃反应至少16小时。该时间段后，使用Thinky Mixer将凝胶均质化。使用2M NaOH将凝胶的pH调节至约7.40，并使用PBS调节最终体积。凝胶制剂在2℃至8℃针对PBS透析约70小时，在此期间多次更换缓冲液。然后将凝胶从透析膜转移到注射器中，并通过不锈钢网(104μm孔)并使用Thinky Mixer进行均质化。将凝胶转移到1mL注射器中，并对注射器进行蒸汽灭菌。所得无菌水凝胶如上述实施例所述表征。

在一些实施方案中，凝胶包含20mg/mL透明质酸。在一些实施方案中，凝胶包含6mg/mL胶原蛋白。在制备凝胶的方法的一些实施方案中，透明质酸在5℃的温度下水合。

实施例3–HA:胶原蛋白浓度为28:2mg/mL的赖氨酸交联HA-胶原蛋白水凝胶(制剂 XVI)的合成。

将0.01M HCl中的3.20mg/mL胶原蛋白溶液与0.01M HCl、赖氨酸·HCl、HMW HA、LMW HA和MES缓冲液/NaCl固体一起添加到30mL HSW Norm-Ject注射器中。使用NaOH调节pH。搅拌混合物以均质化，使HA在室温下水合约90分钟。90分钟后，将混合物在注射器之间多次通过并再次水合约30分钟。在第二个水合步骤之后，混合物在注射器之间多次通过。通过添加水、NHS和EDC在第三个30mL注射器中制备EDC/NHS溶液，并摇晃混合。将EDC/NHS溶液添加到HA/胶原蛋白混合物中，并在注射器之间多次通过，然后转移到玻璃小瓶中，使其在2℃至8℃反应至少16小时。此后，将凝胶转移到注射器中并在注射器之间通过。使用2M NaOH将凝胶的pH调节至约7.40，并使用PBS调节最终体积。凝胶制剂在2℃至8℃对PBS透析约70小时，在此期间更换几次缓冲液。然后将凝胶从透析膜转移到注射器中，并通过不锈钢网(104μm孔)并在注射器之间通过以进行均质化。将凝胶转移到1mL注射器中，并对注射器进行蒸汽灭菌。所得无菌水凝胶如上述实施例所述表征。

实施例4–以最终浓度的1.25x制备的HA:胶原蛋白浓度为25:4mg/mL的赖氨酸交联 HA-胶原蛋白水凝胶(-制剂XV)的合成。

将0.01M HCl中的5.67mg/mL胶原蛋白溶液与赖氨酸·HCl、HMW HA、LMW HA和MES缓冲液/NaCl固体一起添加到30mL HSW Norm-Ject注射器中。用1M NaOH调节pH。搅拌混合物以均质化，使HA在室温下水合约90分钟。然后将混合物在注射器之间通过数次并再次水合30分钟。在第二个水合步骤之后，混合物再次在注射器之间通过。通过添加水、NHS和EDC在第三个30mL注射器中制备EDC/NHS溶液，并摇晃混合。将EDC/NHS溶液添加到HA/胶原蛋白混合物中并在注射器之间多次通过，然后转移到玻璃小瓶中，使其在2℃至8℃反应至少16小时。此后，凝胶被转移到注射器中并在注射器之间通过。使用2M NaOH将凝胶的pH调节至约7.40，并使用PBS调节最终体积。凝胶制剂在2℃至8℃对PBS透析约70小时，在此期间更换几次缓冲液。然后将凝胶从透析膜转移到注射器中，并通过不锈钢网(104μm孔)并在注射器之间通过以进行均质化。将凝胶转移到1mL注射器中，并对注射器进行蒸汽灭菌。所得无菌水凝胶如上述实施例所述表征。

实施方案5–水凝胶的物理性质。

使用带有25mm平行板几何测量工具的Anton-Paar MCR301/302流变仪获得流变特性。通过频率扫描(10Hz至0.1Hz，1％应变)和幅度扫描(0.3％至300％应变，频率5Hz)测量在1mm间隙高度对样品进行分析。使用具有2.5mm间隙高度和垂直压缩的相同仪器测量压缩力。间隙高度设定为2.5mm并保持5分钟，然后以13.33μm/s的速度从2.5mm压缩到0.89mm。通过将凝胶样品与过量磷酸盐缓冲液混合并确定平衡后凝胶的体积来测量水凝胶溶胀。将溶胀的凝胶体积与添加缓冲液之前添加的原始凝胶体积进行比较。溶胀表示为额外的液体吸收占原始凝胶体积的百分比。使用设定为50mm/min的速度的质构分析仪在装有1/2”27GTSK针头(除非另有说明)的1mL COC注射器中测量凝胶制剂的凝胶挤压力。

Claims (129)

1.一种交联大分子基质，包括：

赖氨酸；

透明质酸；和

胶原蛋白；

其中所述透明质酸通过所述胶原蛋白上的至少一个内源性胺基和/或通过所述赖氨酸上存在的至少一个胺基与所述胶原蛋白交联。

2.根据权利要求1所述的交联大分子基质，其中所述交联大分子基质还包含利多卡因。

3.根据权利要求1或2所述的交联大分子基质，其其中所述利多卡因在所述基质中的浓度在约0.15％(w/w)至约0.45％(w/w)的范围之间。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的交联大分子基质，其中所述利多卡因在所述基质中的浓度为约0.15％(w/w)、约0.17％(w/w)、约0.19％(w/w)、约0.21％(w/w)、约0.23％(w/w)、约0.25％(w/w)、约0.27％(w/w)、约0.29％(w/w)、约0.31％(w/w)、约0.33％(w/w)、约0.35％(w/w)、约0.37％(w/w)、约0.39％(w/w)、约0.41％(w/w)、约0.43％(w/w)或约0.45％(w/w)、或在由任意两个上述值限定的范围之间的任意浓度。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的交联大分子基质，其中所述利多卡因在所述基质中的浓度在约0.27％(w/w)至约0.33％(w/w)的范围之间。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的交联大分子基质，其中所述基质还包含未交联的HA。

7.根据权利要求6所述的交联大分子基质，其中所述未交联的HA在所述基质中的浓度高达约5％(w/w)。

8.根据权利要求6或7所述的交联大分子基质，其中所述未交联的HA在所述基质中的浓度为约0％(w/w)、约1％(w/w)、约2％(w/w)、约3％(w/w)、约4％(w/w)或约5％(w/w)、或在由任意两个上述值限定的范围之间的任意浓度。

9.根据权利要求6至8中任一项所述的交联大分子基质，其中所述未交联的HA在所述基质中的浓度为约1％(w/w)。

10.根据权利要求6至8中任一项所述的交联大分子基质，其中所述未交联HA在所述基质中的浓度为约2％(w/w)。

11.根据权利要求6至8中任一项所述的交联大分子基质，其中所述未交联HA在所述基质中的浓度为约5％(w/w)。

12.根据权利要求6至11中任一项所述的交联大分子基质，其中所述未交联的HA改善了所述大分子基质的可挤出性。

13.根据权利要求1至12中任一项所述的交联大分子基质，其中所述交联大分子基质在约6个月、约12个月、约18个月、约24个月、约30个月、或约36个月或在由任意两个上述值限定的范围之间的任意时间量是稳定的。

14.根据权利要求1至13中任一项所述的交联大分子基质，其中所述交联大分子基质在约4℃和约25℃之间的温度下是稳定的。

15.根据权利要求1至14中任一项所述的交联大分子基质，其中所述交联大分子基质在约4℃是稳定的。

16.根据权利要求1至15中任一项所述的交联大分子基质，其中所述交联大分子基质在约25℃是稳定的。

17.根据权利要求1至16中任一项所述的交联大分子基质，其中所述交联大分子基质在约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10、约11、约12、约13、约14、约15、约16、约17、约18、约19、约20、约21、约22、约23、约24、约25、约26、约27、约28、约29、约30、约31、约32、约33、约34、约35、约36个月是稳定的、或在由任意两个上述值限定的范围之间的任意时间是稳定的。

18.根据权利要求1至17中任一项所述的交联大分子基质，其中所述交联大分子基质在约6个月、约12个月、约18个月、约24个月、约30个月或约36个月或在由任意两个上述值限定的范围内的任意时间量具有最小的降解。

19.根据权利要求1至18中任一项所述的交联大分子基质，其中所述基质包括约30Pa至约10,000Pa的弹性模量(G')、或在由任意两个上述值限定的范围之间的任意弹性模量。

20.根据权利要求1至19中任一项所述的交联大分子基质，其中所述基质的弹性模量(G')为约30Pa、约40Pa、约50Pa、约60Pa、约70Pa、约80Pa、约90Pa、约100Pa、约200Pa、约300Pa、约400Pa、约500Pa、约600Pa、约700Pa、约800Pa、约900Pa、约1000Pa、约1100Pa、约1200Pa、约1300Pa、约1400Pa、约1500Pa、约1600Pa、约1700Pa、约1800Pa、约1900Pa、约2000Pa、约2100Pa、约2200Pa、约2300Pa、约2400Pa、约2500Pa、约2600Pa、约2700Pa、约2800Pa、约2900Pa、约3000Pa、约3100Pa、约3200Pa、约3300Pa、约3400Pa、约3500Pa、约3600Pa、约3700Pa、约3800Pa、约3900Pa、约4000Pa、约4100Pa、约4200Pa、约4300Pa、约4400Pa、约4500Pa、约4600Pa、约4700Pa、约4800Pa、约4900Pa、约5000Pa、约5100Pa、约5200Pa、约5300Pa、约5400Pa、约5500Pa、约5600Pa、约5700Pa、约5800Pa、约5900Pa、约6000Pa、约6100Pa、约6200Pa、约6300Pa、约6400Pa、约6500Pa、约6600Pa、约6700Pa、约6800Pa、约6900Pa、约7000Pa、约7100Pa、约7200Pa、约7300Pa、约7400Pa、约7500Pa、约7600Pa、约7700Pa、约7800Pa、约7900Pa、约8000Pa、约8100Pa、约8200Pa、约8300Pa、约8400Pa、约8500Pa、约8600Pa、约8700Pa、约8800Pa、约8900Pa、约9000Pa、约9100Pa、约9200Pa、约9300Pa、约9400Pa、约9500Pa、约9600Pa、约9700Pa、约9800Pa、约9900Pa、或约10,000Pa或在由任意两个上述值限定的范围之间的任意弹性模量。

21.根据权利要求1至20中任一项所述的交联大分子基质，其中所述基质的压缩力值为约10gmf、约20gmf、约30gmf、约40gmf、约50gmf、约60gmf、约70gmf、约80gmf、约90gmf、约100gmf、约110gmf、约120gmf、约130gmf、约140gmf、约150gmf、约160gmf、约170gmf、约180gmf、约190gmf、约200gmf、约210gmf、约220gmf、约230gmf、约240gmf、约250gmf、约260gmf、约270gmf、约280gmf、约290gmf、约300gmf、约310gmf、约320gmf、约330gmf、约340gmf、约350gmf、约360gmf、约370gmf、约380gmf、约390gmf、约400gmf、约410gmf、约420gmf、约430gmf、约440gmf、约450gmf、约460gmf、约470gmf、约480gmf、约490gmf、约500gmf、约510gmf、约520gmf、约530gmf、约540gmf、约550gmf、约560gmf、约570gmf、约580gmf、约590gmf或约600gmf、或在由任意两个上述值限定的范围之间的任意压缩力值。

22.根据权利要求1至21中任一项所述的交联大分子基质，其中所述基质的压缩力值为约100gmf、约200gmf、约300gmf、约400gmf、约500gmf或约600gmf或在由任意两个上述值限定的范围之间的任意压缩力值。

23.根据权利要求1至22中任一项所述的交联大分子混合物，其中所述透明质酸的浓度为约5mg/mL、约6mg/mL、约8mg/mL、约10mg/mL、约12mg/mL、约14mg/mL、约16mg/mL、约18mg/mL、约20mg/mL、约22mg/mL、约24mg/mL、约26mg/mL、约28mg/mLml、约30mg/mL、约32mg/mL、约34mg/mL或约36mg/mL或在由任意两个上述值限定的范围之间的任意浓度。

24.根据权利要求1至23中任一项所述的交联大分子基质，其中所述胶原蛋白包括I型胶原蛋白。

25.根据权利要求1至24中任一项所述的交联大分子基质，其中所述胶原蛋白包括II型胶原蛋白。

26.根据权利要求1至25中任一项所述的交联大分子基质，其中所述胶原蛋白包括III型胶原蛋白。

27.根据权利要求1至26中任一项所述的交联大分子基质，其中所述胶原蛋白包含0％至3％的II型胶原蛋白。

28.根据权利要求1至27中任一项所述的交联大分子基质，其中所述胶原蛋白包含1％至3％的I型胶原蛋白。

29.根据权利要求1至28中任一项所述的交联大分子基质，其中所述基质包含约0％至约3％的III型胶原蛋白。

30.根据权利要求1至29中任一项所述的交联大分子基质，其中所述胶原蛋白包含约97％至约99％的I型胶原蛋白。

31.根据权利要求1至30中任一项所述的交联大分子基质，其中所述胶原蛋白包含I型和III型胶原蛋白两者的混合物。

32.根据权利要求1至31中任一项所述的交联大分子基质，其中所述胶原蛋白的浓度为约1mg/mL、约2mg/mL、约4mg/mL、约6mg/mL、约8mg/mL、约10mg/mL、约12mg/mL、约14mg/mL或在由任意两个上述值限定的范围之间的任意浓度。

33.根据权利要求1至32中任一项所述的交联大分子基质，其中所述交联大分子基质还包含盐。

34.根据权利要求33所述的交联大分子基质，其中所述交联大分子基质包含约50mM至约400mM范围之间的NaCl。

35.根据权利要求1至34中任一项所述的交联大分子基质，其中所述交联大分子基质包含NaCl，其中所述NaCl的浓度为约50mM、约75mM、约100mM、约125mM、约150mM、约175mM、约200mM、约225mM、约250mM、约275mM、约300mM、约325mM、约350mM、约375mM或约400mM、或在由任意两个上述值限定的范围之间的任意浓度。

36.根据权利要求1至35中任一项所述的交联大分子基质，其中所述交联大分子基质包含NaCl，其中所述NaCl的浓度为约150mM。

37.根据权利要求1至35中任一项所述的交联大分子基质，其中所述交联大分子基质包含约0.01M的磷酸盐缓冲液、约137mM的NaCl和浓度为约2.7mM的KCl。

38.根据权利要求1至37中任一项所述的交联大分子基质，其中所述交联大分子基质被配制用于注射或与针和/或套管一起使用。

39.根据权利要求1至38中任一项所述的交联大分子基质，其中所述透明质酸组分具有约20,000道尔顿至约10,000,000道尔顿的平均分子量。

40.根据权利要求39所述的交联大分子基质，其中所述透明质酸组分的平均分子量为约20,000道尔顿、约40,000道尔顿、约60,000道尔顿、约80,000道尔顿、约100,000道尔顿、约200,000道尔顿、约300,000道尔顿、约400,000道尔顿、约500,000道尔顿、约600,000道尔顿、约700,000道尔顿、约800,000道尔顿、约900,000道尔顿、约1,000,000道尔顿、约1,100,000道尔顿、约1,200,000道尔顿、约1,300,000道尔顿、约1,400,000道尔顿、约1,500,000道尔顿、约1,600,000道尔顿、约1,700,000道尔顿、约1,800,000道尔顿、约1,900,000道尔顿、约2,000,000道尔顿、约2,100,000道尔顿、约2,200,000道尔顿、约2,300,000道尔顿、约2,400,000道尔顿、约2,500,000道尔顿、约2,600,000道尔顿、约2,700,000道尔顿、约2,800,000道尔顿、约2,900,000道尔顿、约3,000,000道尔顿、约3,100,000道尔顿、约3,200,000道尔顿、约3,300,000道尔顿、约3,400,000道尔顿、约3,500,000道尔顿、约3,600,000道尔顿、约3,700,000道尔顿、约3,800,000道尔顿、约3,900,000道尔顿、约4,000,000道尔顿、约4,100,000道尔顿、约4,200,000道尔顿、约4,300,000道尔顿、约4,400,000道尔顿、约4,500,000道尔顿、约4,600,000道尔顿、约4,700,000道尔顿、约4,800,000道尔顿、约4,900,000道尔顿、约5,000,000道尔顿、约5,100,000道尔顿、约5,200,000道尔顿、约5,300,000道尔顿、约5,400,000道尔顿、约5,500,000道尔顿、约5,600,000道尔顿、约5,700,000道尔顿、约5,800,000道尔顿、约5,900,000道尔顿、约6,000,000道尔顿、约6,100,000道尔顿、约6,200,000道尔顿、约6,300,000道尔顿、约6,400,000道尔顿、约6,500,000道尔顿、约6,600,000道尔顿、约6,700,000道尔顿、约6,800,000道尔顿、约6,900,000道尔顿、约7,000,000道尔顿、约7,100,000道尔顿、约7,200,000道尔顿、约7,300,000道尔顿、约7,400,000道尔顿、约7,500,000道尔顿、约7,600,000道尔顿、约7,700,000道尔顿、约7,800,000道尔顿、约7,900,000道尔顿、约8,000,000道尔顿、约8,100,000道尔顿、约8,200,000道尔顿、约8,300,000道尔顿、约8,400,000道尔顿、约8,500,000道尔顿、约8,600,000道尔顿、约8,700,000道尔顿、约8,800,000道尔顿、约8,900,000道尔顿、约9,000,000道尔顿、约9,100,000道尔顿、约9,200,000道尔顿、约9,300,000道尔顿、约9,400,000道尔顿、约9,500,000道尔顿、约9,600,000道尔顿、约9,700,000道尔顿、约9,800,000道尔顿、约9,900,000道尔顿或约10,000,000道尔顿或任意两个上述值限定的范围内的任意分子量。

41.根据权利要求1至40中任一项所述的交联大分子基质，其中所述透明质酸包含具有不同分子量的透明质酸组分的混合物，其中所述混合物包含具有如下平均分子量的透明质酸：约20,000、约40,000道尔顿、约60,000道尔顿、约80,000道尔顿、约100,000道尔顿、约200,000道尔顿、约300,000道尔顿、约400,000道尔顿、约500,000道尔顿、约600,000道尔顿、约700,000道尔顿、约800,000道尔顿、约900,000道尔顿、约1,000,000道尔顿、约1,500,000道尔顿、约2,000,000道尔顿、约2,500,000道尔顿、约3,000,000道尔顿、约3,500,000道尔顿、约4,000,000道尔顿、约4,500,000道尔顿、约5,000,000道尔顿、约5,500,000道尔顿、约6,000,000道尔顿、约6,500,000道尔顿、约7,500,000道尔顿、约8,000,000道尔顿、约8,500,000道尔顿、约9,000,000道尔顿、约9,500,000道尔顿和/或约10,000,000道尔顿和/或分子量在任意两个上述值之间的范围内的任意透明质酸。

42.一种组合物，包括：

透明质酸；

胶原蛋白；

赖氨酸；和

缓冲液；

其中所述组合物是水性水凝胶。

43.根据权利要求42所述的组合物，其中所述透明质酸通过所述胶原蛋白上的至少一个内源性胺基和/或所述赖氨酸上存在的至少一个胺基与所述胶原蛋白交联。

44.根据权利要求42或43所述的组合物，其中所述组合物还包含利多卡因。

45.根据权利要求44所述的组合物，其中所述利多卡因在所述基质中的浓度在约0.15％(w/w)至约0.45％(w/w)的范围之间。

46.根据权利要求44或45所述的组合物，其中所述利多卡因的浓度为所述组合物的约0.15％(w/w)、约0.17％(w/w)、约0.19％(w/w)、约0.21％(w/w)、约0.23％(w/w)、约0.25％(w/w)、约0.27％(w/w)、约0.29％(w/w)、约0.31％(w/w)、约0.33％(w/w)、约0.35％(w/w)、约0.37％(w/w)、约0.39％(w/w)、约0.41％(w/w)、约0.43％(w/w)或约0.45％(w/w)或在由任意两个上述值限定的范围之间的任意浓度。

47.根据权利要求42至46中任一项所述的组合物，其中所述组合物还包含未交联的HA。

48.根据权利要求47中任一项所述的组合物，其中所述未交联-交联的HA在所述组合物中的浓度高达约5％(w/w)。

49.根据权利要求47或48中任一项所述的组合物，其中所述未交联的HA的浓度为组合物的约0％(w/w)、约1％(w/w)、约2％(w/w)、约3％(w/w)、约4％(w/w)、约5％(w/w)或在由任意两个上述值限定的范围之间的任意浓度。

50.根据权利要求47至49中任一项所述的组合物，其中所述未交联的HA在所述组合物中的浓度为约1％(w/w)。

51.根据权利要求47至49中任一项所述的组合物，其中所述未交联HA在所述组合物中的浓度为约2％(w/w)。

52.根据权利要求47至49中任一项所述的组合物，其中所述未交联的HA在所述组合物中的浓度为约5％(w/w)。

53.根据权利要求47至52中任一项所述的组合物，其中所述未交联的HA改善了所述组合物的可挤出性。

54.根据权利要求42至53中任一项所述的组合物，其中所述缓冲液是磷酸盐缓冲盐水。

55.根据权利要求42至54中任一项所述的组合物，其中所述透明质酸的平均分子量为约20,000道尔顿至约10,000,000道尔顿。

56.根据权利要求42至55中任一项所述的组合物，其中所述透明质酸包含具有不同分子量的透明质酸组分的混合物，其中所述混合物包含具有如下分子量的透明质酸：约20,000道尔顿、约40,000道尔顿、约60,000道尔顿、约80,000道尔顿、约100,000道尔顿、约200,000道尔顿、约300,000道尔顿、约400,000道尔顿、约500,000道尔顿、约600,000道尔顿、约700,000道尔顿、约800,000道尔顿、约900,000道尔顿、约1,000,000道尔顿、约1,500,000道尔顿、约2,000,000道尔顿、约2,500,000道尔顿、约3,000,000道尔顿、约3,500,000道尔顿、约4,000,000道尔顿、约4,500,000道尔顿、约5,000,000道尔顿、约5,500,000道尔顿、约6,000,000道尔顿、约6,500,000道尔顿、约7,500,000道尔顿、约8,000,000道尔顿、约8,500,000道尔顿、约9,000,000道尔顿、约9,500,000道尔顿和/或约10,000,000道尔顿和/或分子量在任意两个上述值之间的范围内的任意透明质酸。

57.根据权利要求42至56中任一项所述的组合物，其中所述胶原蛋白包括I型胶原蛋白。

58.根据权利要求42至57中任一项所述的组合物，其中所述胶原蛋白包括II型胶原蛋白。

59.根据权利要求42至58中任一项所述的组合物，其中所述胶原蛋白包括III型胶原蛋白。

60.根据权利要求42至59中任一项所述的组合物，其中所述组合物的粘度为：约4,000Pa S、约4100Pa S、约4200Pa S、约4300Pa S、约4400Pa S、约4500Pa S、约4600Pa S、约4700Pa S、约4800Pa S、约4900Pa S、约5000Pa S、约5100Pa S、约5200Pa S、约5300Pa S、约5400Pa S、约5500Pa S、约5600Pa S、约5700Pa S、约5800Pa S、约5900Pa S、约6000Pa S、约6100Pa S、约6200Pa S、约6300Pa S、约6400Pa S、约6500Pa S、约6600Pa S、约6700Pa S、约6800Pa S、约6900Pa S、约7000Pa S、约7100Pa S、约7200Pa S、约7300Pa S、约7400Pa S、约7500Pa S、约7600Pa S、约7700Pa S、约7800Pa S、约7900Pa S、约8000Pa S、约8100Pa S、约8200Pa S、约8300Pa S、约8400Pa S、约8500Pa S、约8600Pa S、约8700Pa S、约8800Pa S、约8900Pa S、约9000Pa S、约9100Pa、约9200Pa S、约9300Pa S、约9400Pa S、约9500Pa S、约9600Pa S、约9700Pa S、约9800Pa S、约9900Pa S、或约10,000Pa S或任意两个上述值限定的范围内的任意粘度。

61.根据权利要求42至60中任一项所述的组合物，其中所述组合物的介质损耗角正切值参数(G"/G')为约0.01至约0.5。

62.根据权利要求42至61中任一项所述的组合物，其中所述组合物的介质损耗角正切值参数(G"/G')为约0.01、约0.05、约0.10、约0.15、约0.20、约0.25、约0.30、约0.35、约0.40、约0.45或约0.50或在由任意两个上述值限定的范围之间的任意介质损耗角正切值参数。

63.根据权利要求42至62中任一项所述的组合物，其中所述组合物在约6个月、约12个月、约18个月、约24个月、约30个月或约36个月或在由任意两个上述值限定的范围之间的任意时间量是稳定的。

64.根据权利要求42至63中任一项所述的组合物，其中所述组合物在约4℃是稳定的。

65.根据权利要求42至64中任一项所述的组合物，其中所述组合物在约25℃是稳定的。

66.根据权利要求42至65中任一项所述的组合物，其中所述组合物在约6个月、约12个月、约18个月、约24个月、约30个月或约36个月或在由任意两个上述值限定的范围内的任意时间量具有最小降解。

67.一种交联透明质酸和胶原蛋白的方法，包括：

将胶原蛋白、透明质酸和赖氨酸溶解在水溶液中以形成预反应水溶液，其中所述预反应水溶液的pH在约4和约6之间；和

制备第二溶液，包括：

水溶性碳二亚胺；和

N-羟基琥珀酰亚胺或N-羟基磺基琥珀酰亚胺；和

将所述第二溶液添加到所述预反应水溶液中以形成交联反应混合物；和

通过使所述透明质酸和所述胶原蛋白与所述赖氨酸交联，使交联反应混合物反应；

其中所述透明质酸通过所述胶原蛋白上的至少一个内源性胺基和/或通过所述赖氨酸上存在的至少一个胺基与所述胶原蛋白交联；和

其中HA和胶原蛋白降解最少，并且HA和胶原蛋白的结构保持完整，从而形成交联大分子基质。

68.根据权利要求67所述的方法，其中所述预反应水溶液的pH为约4.0、约4.5、约5.0、约5.5或约6.0、或在由任意两个上述值限定的范围之间的任意pH。

69.根据权利要求67或68所述的方法，其中所述方法还包括将利多卡因添加到所述交联大分子基质中。

70.根据权利要求69所述的方法，其中在所述交联大分子基质中添加的所述利多卡因的浓度在约0.15％(w/w)至约0.45％(w/w)的范围之间。

71.根据权利要求69或70所述的方法，其中所述利多卡因在所述基质中的浓度为约0.15％(w/w)、约0.17％(w/w)、约0.19％(w/w)、约0.21％(w/w)、约0.23％(w/w)、约0.25％(w/w)、约0.27％(w/w)、约0.29％(w/w)、约0.31％(w/w)、约0.33％(w/w)、约0.35％(w/w)、约0.37％(w/w)、约0.39％(w/w)、约0.41％(w/w)、约0.43％(w/w)或约0.45％(w/w)、或在由任意两个上述值限定的范围之间的任意浓度。

72.根据权利要求67至71中任一项所述的方法，其中所述方法还包括提供活化剂，所述活化剂包含三唑、氟化苯酚、琥珀酰亚胺或磺基琥珀酰亚胺。

73.根据权利要求67至72中任一项所述的方法，其中，所述方法在约2℃、约4℃、约6℃、约8℃、约10℃、约12℃、约14℃、约16℃、约18℃、约20℃、约22℃、约24℃、约26℃、约28℃、约30℃、约32℃、约34℃、或约36℃的温度下进行或在任意两个上述值所限定的范围之间的温度下进行。

74.根据权利要求67至73中任一项所述的方法，其中所述反应步骤在约4℃和约35℃之间进行。

75.根据权利要求67至74中任一项所述的方法，其中所述反应步骤在约4℃或约22℃进行。

76.根据权利要求67至75中任一项所述的方法，其中所述方法还包括纯化所述交联大分子基质，其中使用透析进行所述纯化步骤。

77.根据权利要求76所述的方法，其中所述纯化步骤在2℃至30℃之间进行。

78.根据权利要求76或77所述的方法，其中，所述透析在约2℃、约3℃、约4℃、约5℃、约6℃、约7℃、约8℃下进行、约9℃、约10℃、约11℃、约12℃、约13℃、约14℃、约15℃、约16℃、约17℃、约18℃、约19℃、约20℃、约21℃、约22℃、约23℃、约24℃、约25℃、约26℃、约27℃、约28℃、约29℃、约30℃或上述任意两个值所定义的范围之间的任意温度下进行。

79.根据权利要求76至78中任一项所述的方法，其中所述纯化步骤在约2℃至约8℃进行。

80.根据权利要求67至79中任一项所述的方法，其中所述交联反应在约2℃至约35℃进行。

81.根据权利要求67至80中任一项所述的方法，其中所述交联反应在约2℃至约8℃进行。

82.根据权利要求67至81中任一项所述的方法，其中，所述方法在低于室温的温度下进行。

83.根据权利要求67至82中任一项所述的方法，其中所述交联反应混合物的pH在约4.0至约6.0之间。

84.根据权利要求67至83中任一项所述的方法，其中所述反应前溶液包含盐，其中在所述交联反应混合物中所述盐包含的氯化钠浓度为约50mM、约75mM、约100mM、约125mM、约150mM、约175mM、约200mM、约225mM、约250mM、约275mM、约300mM、325mM、约350mM、约375mM、或约400mM、或在由任意两个上述值限定的范围之间的任意浓度。

85.根据权利要求67至84中任一项所述的方法，其中所述水溶性碳二亚胺是1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺，该1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺在所述交联反应混合物中的浓度为约20mM至约200mM。

86.根据权利要求85所述的方法，其中所述水溶性碳二亚胺是1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺，该1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺的浓度为约20mM、约40mM、约60mM、约80mM、约100mM、约120mM、约140mM、约160mM、约180mM或约200mM或由任意至上述值限定的范围内的任意浓度。

87.根据权利要求67至86中任一项所述的方法，其中所述水溶性碳二亚胺和透明质酸的水溶性碳二亚胺:透明质酸重复单元的摩尔比在约0.5至约2.0之间。

88.根据权利要求87所述的方法，其中所述水溶性碳二亚胺和透明质酸的水溶性碳二亚胺:透明质酸重复单元的摩尔比为约0.5、约0.6、约0.7、约0.8、约0.9、约1.0、约1.1、约1.2、约1.3、约1.4、约1.5、约1.6、约1.7、约1.8、约1.9或约2.0。

89.根据权利要求67至88中任一项所述的方法，其中所述赖氨酸和透明质酸的摩尔:摩尔(赖氨酸:HA重复单元)比在约0.01至约0.6之间。

90.根据权利要求89所述的方法，其中所述赖氨酸和透明质酸的摩尔:摩尔(赖氨酸:HA重复单元)比为约0.01、约0.02、约0.03、约0.04、约0.05、约0.06、约0.07、约0.08、约0.09、约0.10、约0.11、约0.12、约0.13、约0.14、约0.15、约0.16、约0.17、约0.18、约0.19、约0.2、约0.21、约0.22、约0.23、约0.24、约0.25、约0.26、约0.27、约0.28、约0.29、约0.3、约0.31、约0.32、约0.33、约0.34、约0.35、约0.36、约0.37、约0.38、约0.39、约0.4、约0.41、约0.42、约0.43、约0.44、约0.45、约0.46、约0.47、约0.48、约0.49、约0.5、约0.51、约0.52、约0.53、约0.54、约0.55、约0.56、约0.57、约0.58、约0.59或约0.6。

91.根据权利要求67至90中任一项所述的方法，所述方法还包括将未交联的HA添加到所述交联大分子基质中。

92.根据权利要求91所述的方法，其中添加至所述交联大分子基质中的所述未交联的HA的浓度高达5％(w/w)。

93.根据权利要求91或92所述的方法，其中添加至所述基质中的所述未交联的HA的浓度为约0％(w/w)、约1％(w/w)、约2％(w/w)、约3％(w/w)、约4％(w/w)或约5％(w/w)、或在由任意两个上述值限定的范围之间的任意浓度。

94.根据权利要求91至93中任一项所述的方法，其中添加至所述基质中的所述未交联的HA的浓度为约1％(w/w)。

95.根据权利要求91至93中任一项所述的方法，其中添加至所述基质中的所述未交联的HA的浓度为约3％(w/w)。

96.根据权利要求91至93中任一项所述的方法，其中添加至所述基质中的所述未交联的HA的浓度为约5％(w/w)。

97.根据权利要求67至96中任一项所述的方法，还包括对所述交联大分子基质进行灭菌，所述方法包括：

将所述交联大分子基质转移到容器中，进行蒸汽灭菌；和

通过蒸汽灭菌对水凝胶进行灭菌。

98.根据权利要求97所述的方法，其中所述容器是注射器。

99.根据权利要求67至98中任一项所述的方法，其中所述方法还包括透析所述交联大分子基质，其中所述透析通过具有约1000道尔顿至约100,000道尔顿的截留分子量的膜进行，并且其中在灭菌前进行所述透析。

100.根据权利要求99所述的方法，其中在磷酸盐缓冲盐水中进行所述透析。

101.根据权利要求67至100中任一项所述的方法，其中在添加所述第二溶液之前，所述预反应溶液中的所述透明质酸水合至少约60分钟。

102.根据权利要求67至101中任一项所述的方法，其中使所述反应混合物进行交联约16小时至约24小时。

103.一种通过权利要求67至102中任一项的方法制备的交联大分子基质。

104.一种改善人体解剖特征的美学质量的方法，该方法包括：

将组合物注射到人体组织中，从而提高解剖特征的美学质量；

其中所述组合物包含交联大分子基质，所述基质包含：

透明质酸；

赖氨酸；和

胶原蛋白；

其中所述透明质酸通过所述胶原蛋白上的至少一个内源性胺基和/或通过所述赖氨酸上存在的至少一个胺基与所述胶原蛋白交联。

105.根据权利要求104所述的方法，其中所述交联大分子基质还包含利多卡因。

106.根据权利要求104或105所述的方法，其中所述交联大分子基质还包含未交联的HA。

107.根据权利要求104至106中任一项所述的方法，其中所述透明质酸组分具有如下的平均分子量：约20,000道尔顿、约40,000道尔顿、约60,000道尔顿、约80,000道尔顿、约100,000道尔顿、约200,000道尔顿、约300,000道尔顿、约400,000道尔顿、约500,000道尔顿、约600,000道尔顿、约700,000道尔顿、约800,000道尔顿、约900,000道尔顿、约1,000,000道尔顿、约1,100,000道尔顿、约1,200,000道尔顿、约1,300,000道尔顿、约1,400,000道尔顿、约1,500,000道尔顿、约1,600,000道尔顿、约1,700,000道尔顿、约1,800,000道尔顿、约1,900,000道尔顿、约2,000,000道尔顿、约2,100,000道尔顿、约2,200,000道尔顿、约2,300,000道尔顿、约2,400,000道尔顿、约2,500,000道尔顿、约2,600,000道尔顿、约2,700,000道尔顿、约2,800,000道尔顿、约2,900,000道尔顿、约3,000,000道尔顿、约3,100,000道尔顿、约3,200,000道尔顿、约3,300,000道尔顿、约3,400,000道尔顿、约3,500,000道尔顿、约3,600,000道尔顿、约3,700,000道尔顿、约3,800,000道尔顿、约3,900,000道尔顿、约4,000,000道尔顿、约4,100,000道尔顿、约4,200,000道尔顿、约4,300,000道尔顿、约4,400,000道尔顿、约4,500,000道尔顿、约4,600,000道尔顿、约4,700,000道尔顿、约4,800,000道尔顿、约4,900,000道尔顿、约5,000,000道尔顿、约5,100,000道尔顿、约5,200,000道尔顿、约5,300,000道尔顿、约5,400,000道尔顿、约5,500,000道尔顿、约5,600,000道尔顿、约5,700,000道尔顿、约5,800,000道尔顿、约5,900,000道尔顿、约6,000,000道尔顿、约6,100,000道尔顿、约6,200,000道尔顿、约6,300,000道尔顿、约6,400,000道尔顿、约6,500,000道尔顿、约6,600,000道尔顿、约6,700,000道尔顿、约6,800,000道尔顿、约6,900,000道尔顿、约7,000,000道尔顿、约7,100,000道尔顿、约7,200,000道尔顿、约7,300,000道尔顿、约7,400,000道尔顿、约7,500,000道尔顿、约7,600,000道尔顿、约7,700,000道尔顿、约7,800,000道尔顿、约7,900,000道尔顿、约8,000,000道尔顿、约8,100,000道尔顿、约8,200,000道尔顿、约8,300,000道尔顿、约8,400,000道尔顿、约8,500,000道尔顿、约8,600,000道尔顿、约8,700,000道尔顿、约8,800,000道尔顿、约8,900,000道尔顿、约9,000,000道尔顿、约9,100,000道尔顿、约9,200,000道尔顿、约9,300,000道尔顿、约9,400,000道尔顿、约9,500,000道尔顿、约9,600,000道尔顿、约9,700,000道尔顿、约9,800,000道尔顿、约9,900,000道尔顿或约10,000,000道尔顿或在由任意两个上述值限定的范围内的任意分子量。

108.根据权利要求104至107中任一项所述的方法，其中所述透明质酸包含具有不同分子量的透明质酸组分的混合物，其中所述混合物包含具有如下平均分子量的透明质酸：约20,000道尔顿、约40,000道尔顿、约60,000道尔顿、约80,000道尔顿、约100,000道尔顿、约200,000道尔顿、约300,000道尔顿、约400,000道尔顿、约500,000道尔顿、约600,000道尔顿、约700,000道尔顿、约800,000道尔顿、约900,000道尔顿、约1,000,000道尔顿、约1,500,000道尔顿、约2,000,000道尔顿、约2,500,000道尔顿、约3,000,000道尔顿、约3,500,000道尔顿、约4,000,000道尔顿、约4,500,000道尔顿、约5,000,000道尔顿、约5,500,000道尔顿、约6,000,000道尔顿、约6,500,000道尔顿、约7,500,000道尔顿、约8,000,000道尔顿、约8,500,000道尔顿、约9,000,000道尔顿、约9,500,000道尔顿和/或约1,000,000道尔顿和/或分子量在任意两个上述值之间的范围内的任意透明质酸。

109.根据权利要求104至108中任一项所述的方法，其中所述胶原蛋白包括I型胶原蛋白和/或III型胶原蛋白。

110.一种改善个体外观的方法，该方法包括：

在注射部位将组合物注射到个体的组织中，从而改善解剖特征的美学质量，其中来自所述组织的浸润细胞在注射部位整合到组合物中，在所述组合物中沉积新的胶原蛋白；

其中所述组合物包含交联大分子基质，所述交联大分子基质包含：

透明质酸；

赖氨酸；和

胶原蛋白；

其中所述透明质酸通过所述胶原蛋白上的至少一个内源性胺基和/或通过所述赖氨酸上存在的至少一个胺基与所述胶原蛋白交联；并且其中注射有所述组合物的组织显示具有组织整合和胶原蛋白沉积和血管形成。

111.根据权利要求110所述的方法，其中所述组合物还包含利多卡因。

112.根据权利要求110或111所述的方法，其中所述组合物还包含未交联的HA。

113.根据权利要求110至112中任一项所述的方法，其中将所述组合物注射到下巴、下颌线、嘴唇或鼻唇沟中。

114.根据权利要求110至113所述的方法，其中所述方法改善了面部特征之间的对称性。

115.根据权利要求110至114中任一项所述的方法，其中所述方法增强和恢复面部特征的体积。

116.根据权利要求115所述的方法，其中所述方法在下巴、下颌线、嘴唇或鼻唇沟中增加、矫正、恢复或产生体积。

117.根据权利要求110至112、114或115中任一项所述的方法，其中将所述组合物注射到个体的泪沟中。

118.根据权利要求110至117中任一项所述的方法，其中将所述组合物注射到包括皮肤萎缩和/或脂肪垫萎缩的区域中。

119.根据权利要求110至118中任一项所述的方法，其中所述方法在接受所述注射的组织中提供自然的外观、感觉和动作，其中所述组合物使得从所述注射部位周围的组织中产生增加的胶原蛋白浸润。

120.权利要求119所述的方法，其中由于组织整合到所述注射部位中，组合物的持续时间增加。

121.根据权利要求104至120中任一项所述的方法，其中所述方法改善了所述注射部位周围皮肤的水合作用和弹性。

122.一种增加胶原蛋白浸润到组织中的方法，该方法包括：

将组合物注射到个体的组织中，从而产生包含该组合物的皮肤填充物贮库，其中所述组合物包含交联大分子基质，所述基质包括：

透明质酸；赖氨酸；和胶原蛋白；其中所述透明质酸通过所述胶原蛋白上的至少一个内源性胺基和/或通过所述赖氨酸上存在的至少一个胺基与所述胶原蛋白交联；并且其中来自皮肤填充物贮库周围组织的细胞浸润包含所述组合物的皮肤填充物贮库，其中所述细胞整合到所述组合物中并将新的胶原蛋白沉积到所述组合物中，从而在所述组合物中产生浸润组织并且其中血管将组合物中的浸润组织连接到个体身体的血液供应。

123.根据权利要求122所述的方法，其中所述基质还包括利多卡因。

124.根据权利要求122或123所述的方法，其中所述组合物还包含未交联的HA。

125.根据权利要求122至124中任一项所述的方法，其中所述透明质酸的平均分子量为：约20,000道尔顿、约40,000道尔顿、约60,000道尔顿、约80,000道尔顿、约100,000道尔顿、约200,000道尔顿、约300,000道尔顿、约400,000道尔顿、约500,000道尔顿、约600,000道尔顿、约700,000道尔顿、约800,000道尔顿、约900,000道尔顿、约1,000,000道尔顿、约1,100,000道尔顿、约1,200,000道尔顿、约1,300,000道尔顿、约1,400,000道尔顿、约1,500,000道尔顿、约1,600,000道尔顿、约1,700,000道尔顿、约1,800,000道尔顿、约1,900,000道尔顿、约2,000,000道尔顿、约2,100,000道尔顿、约2,200,000道尔顿、约2,300,000道尔顿、约2,400,000道尔顿、约2,500,000道尔顿、约2,600,000道尔顿、约2,700,000道尔顿、约2,800,000道尔顿、约2,900,000道尔顿、约3,000,000道尔顿、约3,100,000道尔顿、约3,200,000道尔顿、约3,300,000道尔顿、约3,400,000道尔顿、约3,500,000道尔顿、约3,600,000道尔顿、约3,700,000道尔顿、约3,800,000道尔顿、约3,900,000道尔顿、约4,000,000道尔顿、约4,100,000道尔顿、约4,200,000道尔顿、约4,300,000道尔顿、约4,400,000道尔顿、约4,500,000道尔顿、约4,600,000道尔顿、约4,700,000道尔顿、约4,800,000道尔顿、约4,900,000道尔顿、约5,000,000道尔顿、约5,100,000道尔顿、约5,200,000道尔顿、约5,300,000道尔顿、约5,400,000道尔顿、约5,500,000道尔顿、约5,600,000道尔顿、约5,700,000道尔顿、约5,800,000道尔顿、约5,900,000道尔顿、约6,000,000道尔顿、约6,100,000道尔顿、约6,200,000道尔顿、约6,300,000道尔顿、约6,400,000道尔顿、约6,500,000道尔顿、约6,600,000道尔顿、约6,700,000道尔顿、约6,800,000道尔顿、约6,900,000道尔顿、约7,000,000道尔顿、约7,100,000道尔顿、约7,200,000道尔顿、约7,300,000道尔顿、约7,400,000道尔顿、约7,500,000道尔顿、约7,600,000道尔顿、约7,700,000道尔顿、约7,800,000道尔顿、约7,900,000道尔顿、约8,000,000道尔顿、约8,100,000道尔顿、约8,200,000道尔顿、约8,300,000道尔顿、约8,400,000道尔顿、约8,500,000道尔顿、约8,600,000道尔顿、约8,700,000道尔顿、约8,800,000道尔顿、约8,900,000道尔顿、约9,000,000道尔顿、约9,100,000道尔顿、约9,200,000道尔顿、约9,300,000道尔顿、约9,400,000道尔顿、约9,500,000道尔顿、约9,600,000道尔顿、约9,700,000道尔顿、约9,800,000道尔顿、约9,900,000道尔顿或约10,000,000道尔顿或在由任意两个上述值限定的范围内的任意其他分子量。

126.根据权利要求122至125中任一项所述的方法，其中所述透明质酸包含具有不同分子量的透明质酸组分的混合物，其中所述混合物包含具有如下平均分子量的透明质酸：约20,000道尔顿、约40,000道尔顿、约60,000道尔顿、约80,000道尔顿、约100,000道尔顿、约200,000道尔顿、约300,000道尔顿、约400,000道尔顿、约500,000道尔顿、约600,000道尔顿、约700,000道尔顿、约800,000道尔顿、约900,000道尔顿、约1,000,000道尔顿、约1,500,000道尔顿、约2,000,000道尔顿、约2,500,000道尔顿、约3,000,000道尔顿、约3,500,000道尔顿、约4,000,000道尔顿、约4,500,000道尔顿、约5,000,000道尔顿、约5,500,000道尔顿、约6,000,000道尔顿、约6,500,000道尔顿、约7,500,000道尔顿、约8,000,000道尔顿、约8,500,000道尔顿、约9,000,000道尔顿、约9,500,000道尔顿和/或约10,000,000道尔顿和/或分子量在任意两个上述值之间的范围内的任意透明质酸。

127.根据权利要求122至126中任一项所述的方法，其中所述胶原蛋白包括I型胶原蛋白、II型胶原蛋白和/或III型胶原蛋白。

128.根据权利要求122至127中任一项所述的方法，其中所述组合物包含约13mg/mL透明质酸。

129.根据权利要求122至127中任一项所述的方法，其中所述组合物包含约20mg/mL透明质酸、约22mg/mL透明质酸、约24mg/mL、约26mg/mL透明质酸、约28mg/mL透明质酸或约30mg/mL透明质酸。

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