CN115247201B - 一种测定植物精油最小抑菌浓度的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种测定植物精油最小抑菌浓度的方法，属于生物技术领域。本发明提供了一种测定植物精油最小抑菌浓度的方法，所述步骤为先将植物精油稀释(液体直接稀释，固体粉末先用溶剂溶解)后与同体积的双倍固体培养基(55℃～60℃)混合，倒入35mm培养皿中凝固待用，再接入菌悬液培养观察，最终菌落生长被完全抑制的最低抑菌液浓度为该样品对受试菌的最小抑菌浓度(图1)。该方法用量较少，节约成本，体系均一，准确性和重复性高，普遍适用于植物精油不溶性物质最小抑菌浓度的测定。
Description
技术领域
本发明涉及一种测定植物精油最小抑菌浓度的方法，属于生物技术领域。
背景技术
植物精油是许多植物的次生代谢产物，广泛分布于桃金娘科、唇形科、芸香科、伞形科、樟科、姜科、菊科等植物中，主要集中在植物的根、茎、皮、叶和花中，种子、芽、树枝等部位也会存在一些。目前，被挖掘植物精油已有上千种，最常见的有百里香油、牛至油、薰衣草精油、桉叶油等。植物精油中不同的化合物具有不同的功能和特性，如芳香族化合物产生特定的风味和气味，萜类和苯丙烯类具有杀菌消炎等作用，他们赋予了植物精油多种生物活性，如抗菌抑菌、抗病毒、抗糖尿病、抗癌、抗炎、抗氧化、保护神经、保护心脏、保护肝脏和抗色素沉积等，其中抗菌抑菌最为典型，因此被广泛用于研究和应用。
最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration,MIC)，为抑制病原微生物繁殖的最小药物浓度，主要应用于评估细菌对药物的敏感性和抗菌剂的抑菌活性。关于MIC评估细菌对药物敏感性的报道较多，一些研究者们发现MIC的测定结果受很多因素的影响，如选用的方法、培养基、缓冲液、接菌量、终点判定方法等。由于在不同的实验条件下，实验结果差异很大，美国国家临床实验室标准化委员会(National Committee for ClinicalLaboratory Standards，NCCLS)、欧洲抗生素敏感性试验委员会(EUCAST)等组织对此程序进行标准化，并得到广泛应用。但关于MIC测定抗菌剂的抑菌活性，许多研究者直接借鉴NCCLS推荐的微量肉汤稀释法进行测定，对于一些不溶于水的抗菌剂来说，存在结果不稳定且重复性低，导致结果偏差较大。而《消毒技术规范》(2002年版)中“2.1.8.3最小抑菌浓度测定试验(琼脂稀释法)”采用琼脂稀释法对不溶性物质进行测定，仍存在许多缺陷：①使用抗菌物质量较多(5mL或5g)，对于成本较高或难获取的抗菌物质存在一定难度；②使用磷酸缓冲液将抗菌物质配成10％的抗菌溶液，然后对倍稀释，由于某些抗菌物质不溶于磷酸缓冲液，在极短时间就出现分层，存在分布不均一的情况，造成后续稀释过程中的量取不精确；③采用抗菌液和双倍琼脂培养基在90mm培养皿中进行摇晃混合，温度在45℃～50℃，培养基很快凝固，抗菌液与双倍琼脂培养基很难混合均一；④若要针对10mL双倍琼脂培养基进行精确量取，在45℃～50℃下培养基会快速凝固，影响与抗菌液进行均一的混合。因此，不适合植物精油最小抑菌浓度的测定。
MIC除了测定最小抑菌浓度外，对于后续细菌生物膜的抑制评估以及最小杀菌浓度(minimum fungicidal concentration，MFC)测定范围选取也具有重要参考意义。因此，有必要对植物精油这一类不溶性抗菌物质的MIC测定方法进行完善，开发一种有效、简单、普适性高的方法来测定其MIC值。
发明内容
针对现有方法存在的问题，本发明提供了一种测定植物精油最小抑菌浓度的方法，解决不溶性植物精油在最小抑菌浓度测定中用量大、分布不均匀、结果不稳定、重复性低等问题。
本发明提供了一种测定不溶性抗菌物质最小抑菌浓度的方法，包括以下步骤：
(1)不溶性抗菌物质稀释液的配制：
不溶性抗菌物质有液体和固体粉末2种形态，分别按以下方式配制：
(a)不溶性抗菌物质液体稀释液的配制：精确量取不同体积的液体不溶性抗菌物质样品分别加入无菌管中，并加入灭菌的生理盐水或磷酸缓冲液直接配制成总体积2～4mL不同浓度的稀释液。
(b)不溶性抗菌物质粉末稀释液的配制：先用溶剂溶解不溶性抗菌物质粉末，制备成50％浓度溶液，再按照(a)的方法配制成不同浓度的稀释液。
(2)含不溶性抗菌物质培养基的配制：往步骤(1)中不同浓度的稀释液中加入同体积的双倍固体培养基，充分摇匀后，倒入培养皿中，待凝固备用。
(3)接种待测微生物：取待测微生物的悬液点种于步骤(2)中的培养皿。
(4)最小抑菌浓度判定：将接种后的培养皿倒置培养，观察结果，无菌落生长的最低浓度为对应的最小抑菌浓度。
本发明的一种实施方式中，步骤(1)中，所述不同浓度的稀释液成对倍系列递减。
本发明的一种实施方式中，步骤(1)中，当液体不溶性抗菌物质的稀释液终浓度低于1‰时，先用溶剂配制成50％浓度溶液后，再用灭菌的生理盐水或磷酸缓冲液直接稀释。
本发明的一种实施方式中，所述磷酸缓冲液pH 7.2～7.4。
本发明的一种实施方式中，步骤(1)中，所述不溶性抗菌物质包括植物精油。
本发明的一种实施方式中，所述植物精油为百里香酚、丁香酚、香芹酚、桉叶油、百里香油、肉桂醛、柠檬醛、肉桂油、薰衣草精油等中的一种或几种。
本发明的一种实施方式中，步骤(1)中，所述无菌管为带刻度的离心管。
本发明的一种实施方式中，步骤(1)中，所述溶剂为甲醇、乙醇、二甲亚砜或吐温等中的一种或几种。
本发明的一种实施方式中，所述溶剂中甲醇、乙醇或二甲亚砜在体系中的最终体积浓度低于1％，吐温在体系中的最终体积浓度低于0.3％。
本发明的一种实施方式中，步骤(2)中，所述培养皿为35mm小型培养皿。
本发明的一种实施方式中，步骤(3)中，微生物的接种量为1×104cfu～9×104cfu。
本发明的一种实施方式中，所述方法全程无菌操作。
在本发明的一种实施方式中，所述微生物包括细菌或真菌。
在本发明的一种实施方式中，步骤(4)中，细菌在35～38℃下培养16～25h，真菌在25～30℃下培养24～48h。
有益效果：
(1)本发明中开发的测定植物精油最小抑菌浓度的方法，总体系为4～8mL(2～4mL植物精油稀释液+同体积双倍琼脂培养基)，使用35mm小型培养皿，用量较少，节约成本。
(2)本发明中开发的测定植物精油最小抑菌浓度的方法，取用7mL、10mL或15mL等带刻度的离心管，在其中混合均匀后再倒入平板，保证了混合的充分均一性。
(3)本发明中开发的测定液体植物精油最小抑菌浓度的方法，利用移液枪精确量取精油，直接与生理盐水或磷酸缓冲液混合，配制不同浓度的稀释液，避免了多次稀释过程中的不均匀问题。
(4)本发明中开发的测定粉末植物精油最小抑菌浓度的方法，对于稀释液终浓度低于1‰或者固体粉末，均采用溶剂提前溶解或稀释，以保证取样或混合的一致性。
(5)本发明中开发的测定植物精油最小抑菌浓度的方法，准确性和重复性高。
附图说明
图1本发明实施例提供的植物精油最小抑菌浓度流程图；
图2香芹酚在培养基中的分布状态(6mL体系)；
图3百里香酚在培养基中的分布状态(6mL体系)；
图4植物精油与水/培养基混合后放置情况(96孔板体系，含液量200μL)(A：水+香芹酚；B：水+含β-胡萝卜素的香芹酚；C：TSB+香芹酚；D：TSB+含β-胡萝卜的香芹酚)；
图5植物精油与水/培养基混合后放置情况(离心管放大体系，含液量1mL)(A：水+香芹酚；B：水+含β-胡萝卜素的香芹酚；C：TSB+香芹酚；D：TSB+含β-胡萝卜的香芹酚)；
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明了，下面结合实施例对本发明的技术内容做进一步说明，下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。
植物精油一般为晶体粉末(如百里香酚)和液体(如香芹酚、丁香酚、肉桂醛等)2种状态，因此本发明中，晶体粉末精油选取百里香酚，液体精油选取香芹酚为代表，抑菌实验选取大肠杆菌为代表菌株进行。
胰蛋白胨大豆肉汤(TSB)培养基的配制：称取胰蛋白胨15g，大豆蛋白胨5g，氯化钠5g，用去离子水溶解定容至1000mL。
胰蛋白胨大豆琼脂(TSA)培养基的配制：TSB培养基中加入15g琼脂。
生理盐水(0.9％NaCl)的配制：称取9gNaCl，用去离子水溶解定容至1000mL。
磷酸盐缓冲液(pH7.2～7.4)的配制：称取磷酸二氢钾(KH2PO4)0.20g，磷酸氢二钠(Na2HPO4.12H2O)2.89g，氯化钾(KCl)0.20g，氯化钠(NaCl)8.00g，用去离子水溶解定容至100mL。
大肠杆菌(Escherichia coli)培养：大肠杆菌的培养条件如下：温度37℃，好氧条件，液体培养采用TSB培养基摇瓶培养12h，固体平板培养采用TSA培养基倒置培养12h，本实验中均采用第6代培养物。
实施例1琼脂稀释法(6mL)中植物精油在培养基中的分布状态
针对《消毒技术规范》(2002年版)中“2.1.8.3最小抑菌浓度测定试验(琼脂稀释法)”中的缺陷，本发明改用琼脂稀释法(6mL，3mL植物精油+3mL双倍琼脂培养基)体系，在35mm培养皿中进行。为了探究该方法是否存在混合均一性问题，选取百里香酚为粉末精油样品代表，香芹酚为液体精油样品代表。香芹酚在培养基中的混合状态如图2所示，百里香酚在培养基中的混合状态如图3所示。
植物精油液体稀释液的配制：以无菌操作取不同体积的香芹酚分别加入无菌管中，并加入灭菌的生理盐水或磷酸缓冲液(pH 7.2～7.4)，直接配制成总体积3mL浓度为50μg/mL～250μg/mL的香芹酚溶液；当目标浓度低于1‰时，利用溶剂(甲醇、乙醇、二甲亚砜、吐温等)稀释成50％香芹酚溶液，在进行成对倍系列递减，制备得到低浓度香芹酚溶液，最终获得系列稀释的。
植物精油粉末稀释液的配制：用灭菌的生理盐水溶解百里香酚，制备成50％百里香酚溶液，作为样品1；用磷酸缓冲液(pH 7.2～7.4)溶剂溶解百里香酚，制备成50％百里香酚溶液，作为样品2。
将3mL双倍TSA固体培养基(55℃～60℃)加入含有不同浓度香芹酚溶液或百里香酚溶液的无菌管中，震荡混合均匀，倒入35mm培养皿中，静止等待凝固。
从图2可以看出，香芹酚从低浓度到高浓度下，均可以在培养基中混合充分，并且倒入培养皿中2min内培养基已凝固，可以有效地将精油样品分布其中，保证样品的均一性。
从图3可以看出，2组百里香酚粉末与培养基混合实验中，均出现结块现象，由于混合后需要快速倒入培养皿中，在培养皿中也呈现分布不均匀的现象，但是静置12h后，粉末会慢慢渗透溶于培养皿中，但如果粉末聚集较严重时，会出现部分不溶现象。为了防止粉末出现这种情况，固体粉末统一先采用溶剂(甲醇、乙醇、二甲亚砜、吐温等)稀释成液体后，按照液体方法进行操作。
对比例1微量肉汤稀释法中植物精油在培养基中的分布状态
微量肉汤稀释法一般在96孔板中进行，孵育16～24h后通过测定OD值判定MIC。液体植物精油直接量取，固体粉末植物精油一般提前用甲醇或乙醇溶解成液体进行测定，因此这里只讨论微量肉汤稀释法中液体精油在培养基中的分布状态。
将香芹酚与水或TSB培养基在96孔无菌微孔板中进行混合观察，由于香芹酚颜色比较淡，很难观察到其与水或培养基的分布情况，将油溶性β-胡萝卜素与香芹酚预先混合(β-胡萝卜素添加量为1‰)做比较，结果图4所示。由于体系较小，低浓度(10μg/mL香芹酚)下很难观察，另外将其放大到1mL，在离心管进行混合观察，结果如图5所示。
从图4的96孔板小体系和图5的离心管放大体系中可以看出，香芹酚与水混合2min后出现明显的分层(图4和图5中A、B管)，且香芹酚一直处于上层；而香芹酚与TSB培养基混合时，在低浓度(10μg/mL香芹酚)下，香芹酚能与TSB混合形成一定的乳液状，但是高浓度下，精油也明显分层且大部分处于上层。
在利用微量肉汤稀释法检进行抑菌实验过程中，细菌往往均匀悬浮在培养基中或者沉在底部，精油与菌液的不均匀接触，导致了抑菌实验的不准确性，因此微量肉汤稀释法测定植物精油MIC值时存在不稳定性的弊端，并不适用。
实施例2溶剂单独使用对大肠杆菌生长的影响
为了判断溶解精油的溶剂是否本身对大肠杆菌生长会有影响，是否会导致植物精油MIC结果出现误差，将不同浓度的溶剂与TSA固体培养基1:1混合后制成平板，接入大肠杆菌，观察大肠杆菌的生长情况，结果见表1所示。
表1溶剂对大肠杆菌生长情况的影响
注：表中以“○○○○”代表抑菌率＝100％，以“⊙○○○”代表75％≤抑菌率＜100％，以“⊙⊙○○”代表50％≤抑菌率＜75％，以“⊙⊙⊙○”代表25％≤抑菌率＜50％，以“⊙⊙⊙⊙”代表0％≤抑菌率＜25％。
从表1可以看出，甲醇、乙醇和二甲亚砜试剂在低浓度(0％～5％)下，大肠杆菌仍在平板上生长，但在4％以上会部分抑制；当浓度≥10％时，大肠杆菌均不生长，完全被抑制住(其中浓度＞10％，结果未显示在表里)，说明甲醇、乙醇和二甲亚砜随着浓度的增加，本身对大肠杆菌的生长抑制作用越来越强，使用时需限制其使用浓度；而吐温-20和吐温-80存在下，大肠杆菌生长不受影响，说明不存在抑制作用。
实施例3溶剂对香芹酚抑制大肠杆菌效果的影响
溶解试剂如甲醇、乙醇、二甲亚砜在高浓度下完全抑制大肠杆菌的生长，因此，他们可被用作抗菌剂，但是出于毒性安全性考虑，只有乙醇常被用作醇类消毒剂或者凝胶的原材料。另外，观察到低浓度下对大肠杆菌的生长没有显著影响，但是可能会在某些浓度下与植物精油存在着协同、相加或拮抗作用，影响到精油MIC值的判断。吐温是一种大分子物质，可能会降低植物精油的抑菌效果，存在着拮抗作用。因此，为了探究这些溶解试剂对精油抑菌效果的影响，以香芹酚抑制大肠杆菌为例，探究其影响，以1MIC香芹酚为对照(不添加溶剂)，利用不同浓度的溶剂对1MIC香芹酚进行稀释，得到不同浓度的溶剂溶解的不同浓度的香芹酚。在(香芹酚)、/>(香芹酚)和1MIC(香芹酚)浓度下进行抑菌效果测定，结果如表2所示。
表2溶剂对香芹酚抑制大肠杆菌效果的影响
注：表中以“○○○○”代表抑菌率＝100％，以“⊙○○○”代表75％≤抑菌率＜100％，以“⊙⊙○○”代表50％≤抑菌率＜75％，以“⊙⊙⊙○”代表25％≤抑菌率＜50％，以“⊙⊙⊙⊙”代表0％≤抑菌率＜25％。
从表2可以看出，不存在溶剂(浓度为0％)的情况下，测定香芹酚对大肠杆菌的抑菌效果，结果显示，1MIC浓度下平板未生长，大肠杆菌被完全抑制，而在和/>浓度下，大肠杆菌会生长出来。当在1MIC浓度下，加入甲醇、乙醇或二甲亚砜后，大肠杆菌仍不生长；当香芹酚在/>浓度下，甲醇、乙醇或二甲亚砜终浓度为1％的情况下，大肠杆菌生长情况和不添加的一致，但增加至2％或2％以上时，大肠杆菌完全受到抑制；当香芹酚在浓度下，甲醇、乙醇或二甲亚砜终浓度为1％的情况下，大肠杆菌生长情况和不添加的一致，增加至2％时，部分抑制，但增加至3％或3％以上时，原本生长的大肠杆菌却完全受到抑制。以上现象说明甲醇、乙醇或二甲亚砜的加入(浓度＞1％)对香芹酚抑制大肠杆菌效果存在明显的促进作用，造成香芹酚的MIC值测定值偏低，使用时需限定浓度范围低于1％。
当在1MIC浓度下，加入吐温-20或吐温-80，当它们终浓度达到0.5％时，大肠杆菌会生长出来；当在浓度下，吐温-20浓度或吐温-80的终浓度为0.4％时，与不添加的相比，抑菌率从50％～75％降到25％～50％，减弱了香芹酚对大肠杆菌的抑制作用；当在浓度下，与不添加的相比，全部生长出来。以上现象说明吐温-20或吐温-80对香芹酚抑制大肠杆菌的生长具有拮抗作用。综上，在使用吐温做溶解试剂测定香芹酚的MIC值时，需限制终浓度在0.3％以下。
实施例4重复性实验比较
将微量肉汤稀释法、琼脂稀释法(《消毒技术规范》)、琼脂稀释法(6mL体系)，在技术人员熟练的情况下，测定香芹酚对大肠杆菌的最小抑菌浓度，重复10次，以MIC值出现频率最多的一次结果为准，并记录其在10次中重复的次数，结果如表3所示。
表3重复性实验比较结果
从表3可以看出，本发明中使用的琼脂稀释法(6mL体系)在10次重复实验中，结果都一致，准确性达到100％，而其他2种方法在测定植物精油最小抑菌浓度时的准确性只有50％和60％。因此，本发明中的测定方法准确性较高。
实施例5薰衣草精油对白色念珠菌最小抑菌浓度的检测
(1)薰衣草精油稀释液的配制：
精确量取不同体积(60、30、15、7.5、3.75μL)的薰衣草精油样品分别加入无菌管中，并加入灭菌的生理盐水直接配制成总体积3mL不同浓度的稀释液(稀释液中薰衣草精油终浓度依次为2％、1％、0.5％、0.25％、0.125％)；将薰衣草精油样品先用乙醇溶液配制50％浓度，再量取3.75μL加入无菌管中，并加入灭菌的生理盐水直接配制成总体积3mL，此时稀释液中薰衣草终浓度为0.0625％。
(2)含薰衣草精油培养基的配制：往步骤(1)中含有不同浓度的稀释液的无菌管中加入3mL双倍PDA培养基，使得体系中薰衣草精油的终浓度为1％、0.5％、0.25％、0.125％、0.0625％、0.03125％，分别标记为①～⑥，充分摇匀后，倒入培养皿中，待凝固备用。
(3)接种白色念珠菌：取白色念珠菌的悬液点种于步骤(2)中的培养皿。
(4)最小抑菌浓度判定：将接种后的培养皿倒置，于25℃培养24h，观察结果，无菌落生长的最低浓度为对应的最小抑菌浓度。
经培养后观察，①～③平板上无菌落生长，④～⑥均长出菌落，经5次重复实验，均同样结果，因此，薰衣草精油对白色念珠菌的最小抑菌浓度为0.125％。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (6)
1.一种测定不溶性抗菌物质最小抑菌浓度的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)不溶性抗菌物质稀释液的配制：
按(a)或(b)方式配制植物精油稀释液：
(a)精确量取不同体积的液体不溶性抗菌物质样品分别加入无菌管中，并加入灭菌的生理盐水或磷酸缓冲液直接配制成总体积2～4mL不同浓度的稀释液；
(b)先用溶剂溶解不溶性抗菌物质粉末，制备成50％浓度溶液，再按照(a)的方法配制成不同浓度的稀释液；
(2)含不溶性抗菌物质培养基的配制：往步骤(1)中不同浓度的稀释液中加入同体积的双倍固体培养基，充分摇匀后，倒入培养皿中，待凝固备用；
(3)接种待测微生物：取待测微生物的悬液点种于步骤(2)中的培养皿；
(4)最小抑菌浓度判定：将接种后的培养皿倒置培养，观察结果，无菌落生长的最低浓度为对应的最小抑菌浓度；
步骤(1)中，稀释至终浓度低于1‰，先用溶剂配制成50％浓度溶液后，再用灭菌的生理盐水或磷酸缓冲液直接稀释；所述不同浓度的稀释液成对倍系列递减；
所述溶剂为终体积浓度低于1％的甲醇、终体积浓度低于1％的乙醇、终体积浓度低于1％的二甲亚砜或终体积浓度低于0.3％吐温。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述植物精油为百里香酚、丁香酚、香芹酚、桉叶油、百里香油、肉桂醛、柠檬醛、肉桂油、薰衣草精油等中的一种或几种。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，微生物接种量为1×104cfu～9×104cfu。
4.根据权利要求1或3所述的方法，其特征在于，所述微生物包括细菌或真菌。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，细菌在35～38℃下培养16～25h，真菌在25～30℃下培养24～48h。
6.根据权利要求1～5任一所述的方法，其特征在于，所述方法全程无菌操作。
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Legal Events
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| GR01 | Patent grant | ||
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