CN115236332A - NETs含量的检测方法及检测髓过氧化物酶和中性粒细胞弹性蛋白酶的产品的用途 - Google Patents

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Abstract

本申请一方面提供一种NETs含量的检测方法，包括以下步骤：S1、提供标准品、待测样本、髓过氧化物酶捕获抗体和中性粒细胞弹性蛋白酶捕获抗体；S2、在孔板上铺设髓过氧化物酶捕获抗体和中性粒细胞弹性蛋白酶捕获抗体，得到混合铺板，其中，在混合铺板中，髓过氧化物酶和中性粒细胞弹性蛋白酶的比例为1:1至8:1；S3、基于混合铺板，采用酶联免疫吸附剂测定待测样本中的NETs含量。另一方面提供检测髓过氧化物酶和中性粒细胞弹性蛋白酶的产品的用途，其用于制备检测循环中游离NETs含量的用品，以及，用于制备疾病的诊断用品，和/或预后用品。通过使用MPO与NE的捕获抗体混合铺板来对待测样本进行检测，相比于单纯的MPO‑DNA法检测NETs而言，具有更高的精确度。

Description

NETs含量的检测方法及检测髓过氧化物酶和中性粒细胞弹性 蛋白酶的产品的用途
技术领域
本发明涉及一种NETs含量的检测方法及检测髓过氧化物酶和中性粒细胞弹性蛋白酶的产品的用途，属于医疗检测技术领域。
背景技术
中性粒细胞胞外诱捕网(NETs)是中性粒细胞将核内或线粒体的DNA释放到细胞外当作骨架，并携带多种酶组成的网络结构，机体感染时，中性粒细胞释放NETs，可以包裹和杀灭细菌等病原体。但是如果中性粒细胞过度释放NETs，则会损害细胞，引起器官功能障碍，从而加重感染，导致脓毒症；同时，中性粒细胞过度释放NETs还与自身性免疫性疾病、肿瘤等多种疾病密切相关。因此，目前已经将循环中游离NETs的水平作为判断和预测疾病严重程度的重要指标之一。
目前检测循环中游离NETs的水平的方法主要包括：免疫荧光(SYTOX染色)和ELISA法(MPO-DNA)。由于免疫荧光法需要将患者中性粒细胞提纯后在体外刺激，并不能反映患者体内NETs的实时情况，并且此方法操作繁琐。因此临床检测时常用ELISA法测患者血浆等体液内MPO-DNA含量。然而，MPO-DNA法检测NETs含量并不准确，单纯使用MPO捕获抗体并不能将所有NETs捕获，并且与健康对照组区别不大。
发明内容
本申请的目的在于提供一种NETs含量的检测方法及检测髓过氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)和中性粒细胞弹性蛋白酶(ELANE，NE)的产品的用途，能通过检测髓过氧化物酶和中性粒细胞弹性蛋白酶来精确检测样本中NETs的含量。
为达到上述目的，本申请提供如下技术方案：
第一方面，本申请提供一种NETs含量的非疾病诊断目的的检测方法，其包括以下步骤：
S1、提供标准品、待测样本、髓过氧化物酶捕获抗体和中性粒细胞弹性蛋白酶捕获抗体；
S2、在孔板上铺设髓过氧化物酶捕获抗体和中性粒细胞弹性蛋白酶捕获抗体，得到混合铺板，其中，在所述混合铺板中，髓过氧化物酶和中性粒细胞弹性蛋白酶的比例为1:1至8:1；
S3、基于所述混合铺板，采用酶联免疫吸附剂测定所述待测样本中的NETs含量。
在一些可能的实施方式中，在所述混合铺板中，髓过氧化物酶和中性粒细胞弹性蛋白酶的比例为2:1至4:1。
在一些可能的实施方式中，步骤S3中，所述基于所述捕获抗体混合铺板，采用酶联免疫吸附剂测定所述待测样本中的NETs含量，包括：
S31、洗涤所述混合铺板的板孔，向每个所述板孔中加入封闭液并孵育，随后向每个所述板孔中加入标准品；
S32、分次洗涤所述混合铺板的板孔，再加入所述待测样本、抗DNA抗体和3,3',5,5'-四甲基联苯胺；
S33、向所述板孔中加入显色终止液并测量样品的OD值并制作标准曲线，根据所述标准曲线计算得到所述待测样本中NETs的含量。
在一些可能的实施方式中，所述标准品为已知浓度的提纯DNA。
在一些可能的实施方式中，步骤S32具体包括：
洗涤所述混合铺板后，每孔加入所述待测样本，并在室温下孵育；
洗涤所述混合铺板后，每孔加入抗DNA抗体，并在室温下孵育；
洗涤所述混合铺板后，每孔加入3,3',5,5'-四甲基联苯胺，并在室温下孵育。
在一些可能的实施方式中，所述待测样本为血清、血浆或培养上清中的任一种。
第二方面，本申请提供一种对象的样本中检测髓过氧化物酶和中性粒细胞弹性蛋白酶的产品的用途，其用于制备检测循环中游离NETs含量的用品。
第三方面，本申请提供一种对象的样本中检测髓过氧化物酶和中性粒细胞弹性蛋白酶的产品的用途，其用于制备疾病的诊断用品，和/或预后用品。
在一些可能的实施方式中，所述产品通过所述检测髓过氧化物酶和中性粒细胞弹性蛋白酶来检测所述样本中NETs的含量。
在一些可能的实施方式中，所述疾病为中性粒细胞过度释放NETs引起的疾病
与现有技术相比，本申请的有益效果在于：本申请通过使用MPO与NE的捕获抗体混合铺板来对待测样本进行检测，能够提高NETs的捕获量，相比于单纯的MPO-DNA法检测NETs而言，具有更高的精确度，对于临床检测有重要意义。
上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如后。
附图说明
图1为本申请实施例提供的MPO&NE-DNA复合物的定量方法示意图；
图2为本申请实施例提供的健康志愿者和脓毒症患者在不同检测方法下的检测结果比对图；
图3为本申请实施例提供的在PMA、LPS和TNF-a刺激下的不同检测方法的检测结果比对图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
需要说明的是：本申请中，“精确度”是指测量或计算的数量(测试报告值)与其实际(或真实)值的符合程度。临床精确度是指真实输出(真阳性(TP)或真阴性(TN)与误分类输出(假阳性(FP)或假阴性(FN))的比例，并且除了别的测量以外，可以表述为灵敏度、特异性、阳性预测值(PPV)或阴性预测值(NPV)、Matheus相关系数(MCC)，或似然度、让步比、接受者操作特性(ROC)曲线、曲线下面积(AUC)。
对于本申请的诊断性(或预后性)干预，由于各输出(其在疾病分类诊断测试中可能为TP、FP、TN、或FN)承担不同成本，健康经济效用函数可能基于临床情况和个体输出成本和值，优选倾向灵敏度超过特异性，或PPV超过NPV，因此提供健康经济性能和值的另一个测量，该测量可能不同于更直接临床或分析性能测量。这些不同测量和相对折衷一般将仅在具有零误差率的完美测试(也称零预测对象输出误分类或FP和FN)的情况下会聚，所有性能测量将倾向不完美，但程度不同。
“测量”、“测定”、“检测”或“检查”是指评价临床中给定物质或者对象衍生样品(包含这种物质的定性或定量浓度水平的衍生)的存在、不存在、数量或量(其能是有效量)，或另外评估对象的非分析物临床参数或临床-决定因素的值或分类。
本申请上下文中的“样本”是从对象中分离的生物样品，并且能包括，例如但不限于，全血、血清、血浆、口水、黏液、呼吸的空气、尿液、CSF、唾液、汗、粪便、毛发、精液、活检物、鼻液溢、组织活检物、细胞学样品、血小板、网状细胞、白细胞、上皮细胞、或全血细胞。
本申请上下文中的数据均满足统计学要求(统计学显著)，所谓“统计学显著”指改变大于单独偶然发生可预期(可以是“假阳性”)。统计学显著能用本领域已知的任何方法测定。常用的显著性量度包括p值，其表示至少极限值在给定数据点获得结果的概率，假定该数据点是单独偶然结果。p值是0.05或更小时，通常认为结果显著性高。
需要说明的是，以下实施例中未注明具体技术或者条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购买获得的常规产品。
在本发明上下文中“对象”优选人类。对象可为男性或女性。对象是原先诊断或鉴定有感染，并且任选地已经经受或正在经受感染治疗干预的人。或者，对象也可以是先前未诊断有感染的对象。例如，对象可显示一种或多种有感染的风险因子。
并且，试验中所有受试者均签署知情同意书，患者一般资料差异无统计学意义。
实施例一MPO&NE-DNA复合物的定量方法
请参见图1，本实施例的定量方法具体为：
1、室温下，按MPO:NE＝2:1的比例，在高结合96孔板铺MPO与NE的捕获抗体，室温下孵育过夜。
2、用洗涤缓冲液(PBS中0.05％吐温-20)洗涤平板4-5次。
3、每个孔加入200μl封闭液(含有1％BSA的PBS缓冲液)封闭板孔，室温下孵育1小时。
4、使用已知浓度提纯DNA(15632-011，thermo)做标准品，将标准品浓度按10μg/ml为最大值，倍比稀释至最低浓度625ng/ml为最小值。将稀释好的标准品加入板孔，室温下孵育90分钟。
5、再次洗涤板孔4-5次，每孔加入样本100μl(血清、血浆或培养上清)，室温下孵育90分钟。
6、再次洗涤板孔4-5次，每孔加入抗链接与HRP的抗DNA抗体100μl，在室温下孵育90分钟
7、再次洗板孔4次后，每孔加入100μl 3,3′，5,5′-四甲基联苯胺(TMB),避光在室温下显色10-30分钟。
8、然后每孔加入显色终止溶液100μl，并尽快使用酶标仪(Biotek)进行双波长检测(30min内)，测定405nm最大吸收波长(OD值)。
9、根据标准品浓度和对应的浓度值制作标准曲线，并根据标准曲线，计算所测样品NETs的DNA含量。
实施例二健康志愿者和脓毒症患者的检测对比
收集5名健康志愿者和5名脓毒症患者外周血血浆，以备检测。
本实施例使用的材料和装置包括MPO(RD,DY DY3174,)、NE(RD,DY9167-05)、96孔板(RD,DY008)、封闭液(含有1％BSA的PBS缓冲液)、链接有HRP的抗DNA抗体(Cell DeathDetection ELISAPLUS,Rocha)和酶标仪(Biotek)。
首先按实施例1的方法以MPO:NE＝4:1、1:0、2:1、8:1、0:1和1:1的比例的捕获抗体在96孔板上混合铺板，并室温过夜。随后用洗涤液洗涤铺板3次，然后用封闭液封闭。再次洗板5次后，在板孔中加入样本血浆100μl，室温孵育90分钟；再次洗板5次后，在板孔中加入链接有HRP的抗DNA抗体100μl，室温孵育90分钟；再次洗板5次后，在板孔加入3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)100μl，室温避光孵育10-30分钟，然后加入显色终止液100μl。尽快使用酶标仪进行双波长检测(30min内)，测定405nm最大吸收波长。请参见图2，由图2可知，采用MPO和NE的混合铺板能捕获更多的NETs；其中，优选的，按MPO:NE＝2:1铺板更符合患者病情。
实施例三不同刺激下MPO&NE-DNA法与MPO-DNA的检测对比
继续在体外分别用PMA、LPS、TNF-a刺激中性粒细胞(2*106个细胞)，在1小时、2小时、4小时和8小时提取所释放NETs。按实施例1的方法以MPO:NE＝2:1的比例铺板检测NETs与单纯使用MPO铺板检测NETs对比，然后按实施例2方法检测NETs。请参见图3，由图3可知，按MPO:NE＝2:1铺板明显能捕获更多NETs。
基于上述实施例，人中性粒细胞其与人类许多疾病发生发展有关。在机体各种炎症反应、组织损伤重构(如肺炎)、成人呼吸窘迫综合征、肺纤维化、急(慢)性肺损伤、肺水肿、动脉粥样硬化、硬皮病等病理过程中都具有重要作用，并且具有促进病毒、细菌的侵入及癌细胞转移的功能。本申请的检测方法能更精确地检测样本中NETs的含量，因此，其对因中性粒细胞过度释放NETs引起的疾病的诊断和检测有重要应用价值和意义。
综上所述：本申请通过使用MPO与NE的捕获抗体混合铺板来对待测样本进行检测，能够提高NETs的捕获量，相比于单纯的MPO-DNA法检测NETs而言，具有更高的精确度，对于临床检测有重要意义。
应理解，本文中术语“和/或”，仅仅是一种描述关联对象的关联关系，表示存在三种关系，例如，A和/或B，表示：单独存在A，同时存在A和B，单独存在B这三种情况，其中A，B是单数或者复数。另外，本文中字符“/”，一般表示前后关联对象是一种“或”的关系，但也可能表示的是一种“和/或”的关系，具体可参考前后文进行理解。
应理解，在本申请的各种实施例中，上述各过程的序号的大小并不意味着执行顺序的先后，各过程的执行顺序应以其功能和内在逻辑确定，而不应对本申请实施例的实施过程构成任何限定。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种NETs含量的非疾病诊断目的的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、提供标准品、待测样本、髓过氧化物酶捕获抗体和中性粒细胞弹性蛋白酶捕获抗体；
S2、在孔板上铺设髓过氧化物酶捕获抗体和中性粒细胞弹性蛋白酶捕获抗体，得到混合铺板，其中，在所述混合铺板中，髓过氧化物酶和中性粒细胞弹性蛋白酶的比例为1:1至8:1；
S3、基于所述混合铺板，采用酶联免疫吸附剂测定所述待测样本中的NETs含量。
2.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，在所述混合铺板中，髓过氧化物酶和中性粒细胞弹性蛋白酶的比例为2:1至4:1。
3.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤S3中，所述基于所述捕获抗体混合铺板，采用酶联免疫吸附剂测定所述待测样本中的NETs含量，包括：
S31、洗涤所述混合铺板的板孔，向每个所述板孔中加入封闭液并孵育，随后向每个所述板孔中加入标准品；
S32、分次洗涤所述混合铺板的板孔，再加入所述待测样本、抗DNA抗体和3,3',5,5'-四甲基联苯胺；
S33、向所述板孔中加入显色终止液并测量样品的OD值并制作标准曲线，根据所述标准曲线计算得到所述待测样本中NETs的含量。
4.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述标准品为已知浓度的提纯DNA。
5.如权利要求3所述的检测方法，其特征在于，步骤S32具体包括：
洗涤所述混合铺板后，每孔加入所述待测样本，并在室温下孵育；
洗涤所述混合铺板后，每孔加入抗DNA抗体，并在室温下孵育；
洗涤所述混合铺板后，每孔加入3,3',5,5'-四甲基联苯胺，并在室温下孵育。
6.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述待测样本为血清、血浆或培养上清中的任一种。
7.一种对象的样本中检测髓过氧化物酶和中性粒细胞弹性蛋白酶的产品的用途，其特征在于，用于制备检测循环中游离NETs含量的用品。
8.一种对象的样本中检测髓过氧化物酶和中性粒细胞弹性蛋白酶的产品的用途，其特征在于，用于制备疾病的诊断用品，和/或预后用品。
9.如权利要求8所述的用途，其特征在于，所述产品通过所述检测髓过氧化物酶和中性粒细胞弹性蛋白酶来检测所述样本中NETs的含量。
10.如权利要求8所述的用途，其特征在于，所述疾病为中性粒细胞过度释放NETs引起的疾病。
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