CN115226898B - 一种小肠缓释红酵母红素的胆汁体系及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种小肠缓释红酵母红素的胆汁体系及其制备方法与应用，属于功能化食品制备领域。本发明的小肠缓释红酵母红素的胆汁体系由红酵母红素和载体系统组成；所述载体系统由卵磷脂、吐温80和脱氧胆酸钠组成。该胆汁体系在模拟胃消化后保持完整(胆汁体系统中的释放率仅为10％左右，而普通脂质体却达到84％)，在模拟小肠消化期间缓慢裂解，具有缓释的效果，表明该胆汁体系在模拟小肠中具有更高的稳定性，小鼠药代动力学结果更显示胆汁体的缓释效果是普通乳液的2.73倍，半衰期最长为22.5h，该胆汁体系对于提高了红酵母红素在小肠中的生物利用度和缓释特性具有广泛的应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及一种小肠缓释红酵母红素的胆汁体系及其制备方法与应用，属于功能化食品制备领域。
背景技术
类胡萝卜素属于天然色素，通常是具有由9-11个双键组成的多烯链，具有抗炎和抗氧化等作用。但是，由于类胡萝卜素的疏水性决定了其胃肠道中的代谢命运-稳定性差和生物利用率低。红酵母红素是一种强抗氧化特性的类胡萝卜素，可从Sporidioboluspararoseus中提取。
发明人课题组前期多项研究发现红酵母红素具有抗炎抗氧化，降血脂和保护肝脏的作用。红酵母红素对人类健康具有巨大潜力，但也和其他类胡萝卜素一样存在急需解决的应用难点，比如水溶性差，对温度、氧气和光等环境条件敏感，开发有效的递送系统对提高其生物利用度和健康功能至关重要。
目前，纳米颗粒递送系统被认为是一种可以增加类胡萝卜素稳定性和在小肠生物利用度的载体，包括纳米乳液、纳米脂质体、蛋白质纳米颗粒。脂质体是具有双层脂质分子的封闭微泡，包裹内部水性介质。与其他载体系统相比，脂质体具有多种优势，例如能够同时携带疏水性和亲水性化合物、高封装效率和生物相容性。
尽管相对于传统的liposomes脂质体，由非离子表面活性剂和胆固醇组成的新型双层囊泡-niosomes脂质体具有更优异的递送潜力。但是，在口服给药后，肠道胆汁盐和酶会破坏niosomes脂质体的双层结构，导致包埋的大分子提前释放和驻留的时间减少。同时，某些胆汁体是通过将胆汁盐掺入niosomes脂质体脂质双层中形成的，可以为活性物质提供更高的生物利用度，因为它们可以更好地保护活性物质免受胃肠道胆汁盐和酶的侵害。
与普通脂质体和niosomes脂质体相比，胆汁体具有更高的肠道稳定性，也更加有利于增加肠道细胞的吸收。但是，目前研究的胆汁体在模拟胃肠消化液中的稳定性有待提高，其粘附到肠壁粘液上的停留时间还有待延长，以期为生物活性物质提供更好的小肠缓释作用。
此外，胆汁盐是食品级材料，尽管胆汁体已被广泛用于药物分子的递送，但它们在食品营养物质递送中的用途仍未探索。
因此，将胆汁体用作食品营养物质运输工具的可能性，尤其是在小肠的缓释吸收，具有科研发前景。
然而，到目前为止，负载红酵母红素的脂质体和胆汁体在小肠中的缓释效果和生物利用度仍然未知。
发明内容
[技术问题]
现有技术中红酵母红素稳定性差和生物利用率低，存在难以直接利用的问题；而现有的纳米颗粒递送系统，在经过胃和肠道吸收过程中，很容易被破坏结构，导致有效成分大量快速的释放，无法起到缓释的效果。
[技术方案]
针对上述技术问题，本发明提供了一种小肠缓释红酵母红素的胆汁体系及其制备方法与应用，该体系能够高效的对红酵母红素进行包覆，在模拟胃消化后保持完整，在模拟小肠消化期间缓慢裂解，具有缓释的效果，达到了增强红酵母红素的稳定性和在小肠中的生物利用度的效果；有效的解决目前存在的红酵母红素稳定性差，生物利用度低以及载体系统易破坏的、快速释放的问题。
本发明的第一个目的是提供一种小肠缓释红酵母红素的胆汁体系，所述胆汁体系由红酵母红素和载体系统组成；所述载体系统由卵磷脂、吐温80和脱氧胆酸钠组成。
在一种实施方式中，所述卵磷脂、吐温80和脱氧胆酸钠的质量比为12～15：2～4：1～3。
在一种实施方式中，所述卵磷脂、吐温80和脱氧胆酸钠的质量比为12：4：3。
在一种实施方式中，所述红酵母红素和载体系统的质量比为1：10～20。
在一种实施方式中，所述红酵母红素和载体系统的质量比为30：475。
在一种实施方式中，所述胆汁体系中红酵母红素的包封率为85～92％。
在一种实施方式中，所述胆汁体系为Bilosomes胆汁体系。
本发明的第二个目的是提供一种上述所述的小肠缓释红酵母红素的胆汁体系的制备方法，所述方法包括：
将红酵母红素，卵磷脂，吐温80和脱氧胆酸钠溶于氯仿溶液中，旋转蒸发除去溶剂，然后真空干燥；再用PBS缓冲溶液将其溶解，涡旋，超声，即得胆汁体系。
在一种实施方式中，所述旋转蒸发的温度为40～40℃。
在一种实施方式中，所述PBS缓冲溶液的浓度为0.01mol/L，pH值为7.4。
在一种实施方式中，所述涡旋的条件为在40～50℃条件下处理30～60min。
在一种实施方式中，所述超声的功率为200～240W，kHz，时间为10～15min。
本发明的第三个目的是提供一种由上述所述的小肠缓释红酵母红素的胆汁体系在制备含有红酵母红素的食品中的应用。
本发明的有益效果：
(1)本发明制备的Bilosomes胆汁体系在模拟胃部消化后保持完整，在模拟小肠消化期间缓慢破裂，具有缓释的效果；
(2)在小肠模拟消化2h后，liquid-lip乳液和liposomes脂质体中的脂质几乎完全被消化，导致红酵母红素完全释放。然而，胆汁体体系在模拟胃消化后保持完整(Bilosomes胆汁体系中红酵母红素释放率仅为10％左右，而对比例的普通脂质体却达到84％)，在模拟小肠消化期间缓慢裂解，具有缓释的效果，，说明了胆汁体系在模拟小肠中具有更高的稳定性。这可能是由于胆汁体中的脱氧胆酸钠与模拟肠液中的胆汁盐交换，阻止胆汁盐溶解脂质体膜时形成的瞬时孔隙形成，从而使更多的红酵母红素保留在囊泡中；
(3)胆汁体可以可逆地打开肠上皮细胞之间的紧密连接，增强肠细胞生物膜的渗透性，在小肠中具有更长的停留时间，从而促进了小肠对红酵母红素的缓慢吸收。
(4)小鼠药代动力学结果显示胆汁体中的AUC是对比例1liquid-lip乳液的2.73倍，t 1/2最长为22.5h，这也在体内验证了胆汁体封装是一种潜在的递送系统，可用于增强红酵母红素的消化稳定性和在小肠中的生物利用度；这些发现可能会指导胆汁体递送系统的潜在应用，以提高食品中类胡萝卜素的生物可及性。
附图说明
图1为本发明实施例1和对比例1～3制备的小肠缓释体系的制备流程(A)，封装率(B)，粒径(C)，电位(D)，PDI(E)和红外光谱(F)图；
图2为本发明实施例1和对比例1～3制备的小肠缓释体系的体外消化过程中，小肠控释系统的粒径(A)、电位(B)、PDI(C)、释放速率(D)和生物利用度(E)图；
图3为本发明实施例1和对比例1～3制备的小肠缓释体系在体外消化下的荧光图；
图4为本发明实施例1和对比例1～3制备的小肠缓释体系的体外消化特征的动力学方程模型，零级(A)，零级线性(B)，一级(C)，Higuchi(D)，Korsmeyer-Peppas(E)和Hixson-Crowell模型(F)图；
图5为本发明实施例1和对比例1～4制备的小肠缓释体系的体内药代动力学，血浆药代动力学(A)，胃药代动力学(B)，小肠药代动力学(C)，小肠缓释机制(D)，4℃贮藏稳定性(E)和37℃贮藏稳定性(F)图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的描述，但本发明的实施方式不限于此。
卵磷脂，胆固醇和Tween80购自国药化学试剂有限公司(中国上海)；脱氧胆酸钠，胃蛋白酶，胃脂肪酶，胰蛋白酶，胰脂肪酶，猪胆盐和玉米油购自上海源叶生物科技有限公司(中国上海)；丁基化羟基甲苯(BHT)购自上海麦克林生化科技有限公司(中国上海)。
1、小肠缓释体系封装效率的测定
首先将0.5ml样品和0.5ml的二甲亚砜混合，再加1mL萃取剂(正己烷：二氯甲烷＝4：1，v/v)，在摇床中震荡(200rpm，10min)后，离心(3000rpm，10min)取上清进行测定。使用带有DAD检测器的Agilent 1260HPLC系统(Agilent Technologies，California，USA)检测红酵母红素。
在25℃下将样品(20μL)注入色谱柱(Agilent SB-C18，4.6×250mm，5μm)。流动相由A(乙腈：水：甲酸(86：10：4，v/v/v))和B(乙酸乙酯：甲酸(96：4，v/v/v))组成，流速为1.0mL/min。A相在0-25min由100％线性降至0％，B相在25-30min由0％线性升至100％，A相在25-32min再线性升至100％。
配置0.1-100ug/mL溶于正己烷的红酵母红素标准溶液，通过吸收波长为492nm下的吸收峰面积和浓度的建立线性回归方程，绘制标准曲线。包封率的计算公式如下：
其中，C0为样品中总的红酵母红素的浓度，C1为样品中游离的红酵母红素的浓度。
2、小肠缓释体系的表征
在粒度和电位分析仪(Zetasizer Nano ZS，Malvern Panalytical，Worcestershire，UK)中测量ζ电位、粒度分布和多分散指数(PDI)。为了防止粒子的多重散射效应，所有体系在粒度测量之前都被稀释了1000倍。傅里叶变换红外光谱(FTIR)(Antaris II，Thermo Fisher Scientific，USA)用于分析红酵母红素与每个体系之间的相互作用。
3、小肠缓释体系的体外模拟消化
模拟口腔缓冲液(SSF)是将1.408g KCl、1.428g NaHCO3、0.629g KH2PO4、0.038gMgCl2(H2O)6和0.007g(NH4)2CO3溶解于1L去离子水中。
将5mL样品与4mL SSF溶液混合，37℃孵育。然后加入25μL 0.3M CaCl2溶液、0.975mL H2O混匀，37℃水浴震荡2min。
模拟胃缓冲液(SGF)是将0.643g KCl、2.625g NaHCO3、0.153g KH2PO4、0.031gMgCl2(H2O)6、0.06g(NH4)2CO3和2.808g NaCl溶解于1L去离子水中。
将上述经口腔消化的样品溶液与8mL SGF溶液混合，37℃孵育。然后加入5μL 0.3MCaCl2溶液、4mg胃脂肪酶(60U/mL)、400mg胃蛋白酶(2000U/mL)、1.895mL H2O混匀，调节pH为3.0，37℃水浴震荡，在不同时间点取样品进行检测。
模拟肠消化液(SIF)是将0.634g KCl、8.952g NaHCO3、0.136g KH2PO4、0.084gMgCl2(H2O)6和3.452g NaCl溶解于1L去离子水中。
将上述经胃消化后的样品溶液与8.5mL SGF溶液混合，37℃孵育。然后加入40μL0.3M CaCl2溶液、16mg胰蛋白酶(100U/mL)、2.67mg胰脂肪酶(2000U/mL)、272.38mg胆盐(10mM)、11.26mL H2O混匀，调节pH为7.0，37℃水浴震荡，在不同时间点取样品检测。
通过Axio Imager Z2荧光显微镜(Zeiss，Oberkochen，Germany)观察样品的显微结构。观察前，用20μL尼罗红染液(溶于乙醇，0.01％，w/v)添加到0.1mL的样品染色10min，在激发波长488nm下扫描图像。
游离红酵母红素的含量通过HPLC法测定，用以表达不同时刻的释放量。释放率公式如下：
其中，C1为样品中总的红酵母红素的浓度，C2为消化样品中游离的红酵母红素的浓度，C3为消化0h游离的红酵母红素的浓度。
在模拟消化期间的样品，在4℃条件下以10000rpm离心30min，上层为透明胶束层，下层则为未消化的部分和胆酸盐等所形成的致密不溶物质。通过检测胶束层中红酵母红素的含量，便可计算出生物可给率，公式如下：
其中，C4为胶束层中的红酵母红素的浓度，C5为消化样品中总的红酵母红素的浓度。
4、小肠缓释体系的体外释放动力学
通过六种不同的释放动力学模型(零级、零级线性、一级、Higuchi，Korsmeyer-Peppas和Hixson-Crowell)拟合实验数据，探索了小肠缓释体系释放红酵母红素的相关机制。当释放机制不熟悉或涉及多种类型的释放情况时，这些选择性模型方程经常用于描述聚合物体系中活性成分的释放。选择具有最高决定系数(R2)的模型作为描述红酵母红素释放的最佳动力学模型。
零级模型(Zero order model)：Ct＝k0t
零级线性模型(Zero order linear model)：Ct＝k1t+C0
一级模型(First order model)：
Higuchi模型(Higuchi model)：Ct＝k4t1/2+a
Korsmeyer-Peppas模型(Korsmeyer-Peppas model)：Ct/C∞＝k5tn
Hixson-Crowell模型(Hixson-Crowell model)：
*Ct是时间t后释放的红酵母红素n浓度，k0，k1，k2，k3，k4，k5和k6是速率常数，C0是红酵母红素的初始浓度，Ct/C∞是在时间t释放的红酵母红素分数，n是释放指数，a和b是常数。
5、小肠缓释体系的体内药代动力学
8周龄(雄性，25±2g)C57BL/6小鼠购自江苏集萃药康生物科技公司(中国江苏)，小鼠禁食12h后，随机分为4组(n＝50)。不同小肠缓释体系样品以50mg/kg的剂量单词灌胃小鼠，小鼠在给药后的时间(0.25、0.5、1、2、4、6、8、12、24和36h)被吸入异氟醚麻醉。每组的小鼠在每个时间点被采集血浆，然后对被颈椎脱位处死，小鼠组织(胃、小肠)被迅速收集，置于-80℃保存以供进一步分析。
红酵母红素萃取方法如下，1mL的血浆中被加入1mL的冰乙醇(含30mg/L BHT)，涡旋混合2min，然后加入800μL的正己烷混合萃取10min。重复两次萃取过程合并上清液，上清液在室温下在氮气流下蒸发。将残留物用萃取剂(正己烷：二氯甲烷＝4：1，v/v)复溶，以4000rpm的速度离心5min，取上清液按上述HPLC方法检测。小鼠组织先制备成匀浆后检测。
6、小肠缓释体系的稳定性测定
在不同的温度下(4℃，30℃)研究了红酵母红素小肠缓释体系的稳定性。使用上述HPLC方法，在不同的储存期内进行保留率的测定。
实施例1
Bilosomes胆汁体系的制备(工艺流程如附图1A所示)：首先将红酵母红素30mg，卵磷脂300mg，吐温80 100mg和脱氧胆酸钠75mg充分溶解在装有5mL氯仿的50mL圆底烧瓶中，45℃下旋转蒸发干燥(去除有机溶剂)，样品在烘箱中进一步真空干燥(45℃下)以确保完全去除有机溶剂；然后用10mL PBS缓冲溶液(0.01mol/L，pH值7.4)溶解，在45℃涡旋条件下水合60min，得胆汁体悬浮液；最后在冰浴条件下，将胆汁体悬浮液中超声处理(240W，kHz，10min)；4℃避光冷藏备用。
对比例1
Liquid-lip乳液体系的制备：首先将30mg红酵母红素溶于0.5g玉米油中，再加入吐温80 100mg和10mL PBS缓冲溶液(0.01mol/L，pH值7.4)，使用T18高速分散机(IKA，Germany)，在5000rpm条件下搅拌5min，制备成粗乳液；粗乳液再经过PandaPLUS 2000高压均质机(GEA，Parma，Italy)均质3次(100Mpa)，即得liquid-lip乳液。
对比例2
Liposome脂质体的制备：首先将红酵母红素30mg，卵磷脂300mg和吐温80 100mg充分溶解在装有5mL氯仿的50mL圆底烧瓶中，45℃下旋转蒸发干燥(去除有机溶剂)，样品在烘箱中进一步真空干燥(45℃下)以确保完全去除有机溶剂；然后用10mL PBS缓冲溶液(0.01mol/L，pH值7.4)溶解，在45℃涡旋条件下水合60min，得胆汁体悬浮液；最后在冰浴条件下，将悬浮液中超声处理(240W，kHz，10min)；4℃避光冷藏备用。
对比例3
Niosomes脂质体的制备：首先将红酵母红素30mg，卵磷脂300mg、吐温80 100mg和胆固醇75mg充分溶解在装有5mL氯仿的50mL圆底烧瓶中，45℃下旋转蒸发干燥(去除有机溶剂)，样品在烘箱中进一步真空干燥(45℃下)以确保完全去除有机溶剂；然后用10mL PBS缓冲溶液(0.01mol/L，pH值7.4)溶解，在45℃涡旋条件下水合60min，得胆汁体悬浮液；最后在冰浴条件下，将悬浮液中超声处理(240W，kHz，10min)；4℃避光冷藏备用。
对比例4
胆汁体系(含胆固醇)的制备(工艺流程如附图1A所示)：首先将红酵母红素30mg，卵磷脂300mg，吐温80 100mg，胆固醇75mg和脱氧胆酸钠75mg充分溶解在装有5mL氯仿的50mL圆底烧瓶中，45℃下旋转蒸发干燥(去除有机溶剂)，样品在烘箱中进一步真空干燥(45℃下)以确保完全去除有机溶剂；然后用10mL PBS缓冲溶液(0.01mol/L，pH值7.4)溶解，在45℃涡旋条件下水合60min，得胆汁体悬浮液；最后在冰浴条件下，将胆汁体悬浮液中超声处理(240W，kHz，10min)；4℃避光冷藏备用。
表1：小肠缓释系统制剂材料配比
小肠缓释体系性能测定
1、小肠缓释体系的封装效率与表征
从图1B所示，Bilosomes胆汁体系对红酵母红素的封装效率最高，达到了88.03±3.00％，而对比例1liquid-lip乳液的封装效率最低，只有78.66±2.51％。其他参数如图1C，D和E所示，Bilosomes胆汁体系的粒径在130nm左右，ζ电位均为-40mV，PDI也均小于0.24，说明了胆汁体体系为稳定的纳米体系。
FTIR进一步分析了红酵母红素与小肠缓释体系之间的相互作用，结果如图1F所示：在2923和2853cm-1附近出现的部分峰是由于烷基C-H基团的对称和不对称伸缩振动，而CH3基团的不对称和对称变形振动分别在1463和1366cm-1附近观察到。
根据类胡萝卜素在1200–700cm-1处具有指纹区，因此在约1022cm-1处的吸收峰可能属于类胡萝卜素的反式C-H变形振动带，其他峰存在于1742cm-1(主要归因于脂质和C-C酯基团)，1650-1550cm-1(C-C拉伸)，1463cm-1(C-H变形)。红酵母红素在被liquid-lip乳液和liposomes脂质体载体包封后，FTIR光谱发生轻微变化，可能说明红酵母红素和载体的结构没有发生明显变化。
如图1F所示，在Bilosomes胆汁体体系中，位于2050cm-1的峰偏移至2111cm-1，表明红酵母红素可能与脱氧胆酸钠相互作用，从而更好地包裹在胆汁体中。并且，负载红酵母红素的胆汁体中存在1200–700和1463cm-1附近的红酵母红素特征峰。总体而言，这些表明Bilosomes胆汁体体系可以很好地包裹红酵母红素，形成稳定的纳米体系。
2、小肠缓释体系的体外消化特征
通过测量红酵母红素小肠缓释体系的粒径、ζ电位、PDI、释放率以及倒置荧光图来评估模拟消化前后游离红酵母红素和小肠缓释体系的变化，结果如图2A所示：
体外小肠消化结束后，实施例1Bilosomes胆汁体系的粒径最大为370nm；对比例2Liposomes脂质体的粒径先增大后减小；通过倒置荧光结果也证明了脂质体粒径的变化趋势，由于消化环境的低pH值可以降低脂质体体系的表面电荷并促进脂质体聚集，提高了胆汁体的粒径和稳定性。
图2B中，在模拟小肠消化后，Bilosomes胆汁体系小肠缓释体系的ζ电位有降低的趋势，且最低为51mV。这可能是由于胆汁盐，游离脂肪酸和胶束中其他阴离子的存在，体系的电离度降低。
重点比较了胃肠消化过程中红酵母红素的释放，结果如图2D所示：
结果表明，在胃期2h内，对比例1liquid-lip乳液(85.2％)和对比例2liposomes脂质体(51.7％)快速释放，而对比例3niosomes脂质体(12.3％)和实施例1bilosomes胆汁体(8.1％)缓慢释放，说明实施例1制备的bilosomes胆汁体有利于保护胃消化过程中的红酵母红素。
同时，实施例1的胆汁体在接下来的3h内缓慢释放，到达小肠后的累积释放率达到54.7％左右，这也表明了胆汁体小肠缓释体系显着提高了模拟胃肠道中红酵母红素的稳定性。
通过测定红酵母红素的在小肠消化阶段生物可及性来评估不同体系在小肠的缓释效果。红酵母红素在模拟小肠消化早期均逐渐增加，直到达到平稳期(图2E)。一般来说，实施例1和对比例1～3的四种小肠缓释体系都呈现出相似的趋势，但是很明显的是，消化4h后，实施例1胆汁体的生物可及率最小，表明了胆汁体在小肠消化中具有缓释效果。
通过荧光显微镜也观察到类似的结果，结果如图3所示：
实施例1和对比例1～3的不同体系的球形形状在初始和胃阶段相对完好无损，但在小肠模拟消化2h后观察到显着变化。
对比例1的Liquid-lip乳液和对比例2的liposomes脂质体中的脂质几乎完全被消化，这可能导致小肠中的红酵母红素完全释放。但是，在实施例1的胆汁体中，由于粒径大，其表面积大，不能完全与脂肪酶接触，脂解反应速度降低，并且在小肠消化中也还可以观察到脂质，进一步地说明实施例1的胆汁体对红酵母红素的保护和缓释作用。
进一步分析表明，实施例1胆汁体在胃肠道中的高稳定性可能是由于胆汁体中添加了脱氧胆酸钠。脱氧胆酸钠可以与模拟肠液中的胆汁盐交换，从而阻止胆汁盐溶解脂质体膜时形成的瞬时孔隙的形成，或阻止模拟肠液中的胆汁盐通过静电排斥作用吸附到胆汁体上，从而使更多的红酵母红素保留在囊泡中，减少了渗出量，提高了缓释作用。
同时减少了胆固醇的添加，因为胆固醇的会对脂质体膜相变温度有一定影响，进而影响释放性和稳定性。为了降低相变温度时的稳定性，小肠迅速释放药物，可不添加胆固醇。同时，胆固醇会导致血浆胆固醇和甘油三酯的浓度升高，从而诱导心血管疾病的发病。
因此，本发明的胆汁体小肠缓释体系在提高脂质体的健康和靶向特性上，通过减少胆固醇的添加和脱氧胆酸钠的修饰作用，具有可控缓释性和靶向性，从而能够有效控制生物活性成分在人体小肠的分布和作用时机，显著提高效果，并且不会给人体带来心血管性疾病的负担。
3、缓释体系的体外小肠消化释放动力学
通过建立释放动力学模型建立红酵母红素在体外-体内的更优相关性，包括零级、一级、Higuchi，Korsmeyer-Peppas和Hixson-Crowell模型，也用来预测红酵母红素释放曲线。图4表示从不同脂质体系统在小肠消化阶段释放红酵母红素的动力学方程和参数。对于对比例1的liquid-lip乳液，在一级和Korsmeyer-Peppas模型的情况下观察到相关系数(R2)的最大值。而对比例2的liposomes脂质体的释放相关系数最大的模型是Hixson-Crowell模型。基于图中的R2，Hixson-Crowell模型也是最适合描述对比例3niosomes脂质体在小肠消化阶段的释放趋势。而对于实施例1的胆汁体，在Korsmeyer-Peppas的情况下观察到R2的最大值均为0.92。
Korsmeyer-Peppas模型主要用于通过评估释放指数n的值来描述具有一种以上释放现象的释放机制，指数n已被提议作为释放行为的指标，n≤0.45对应于Fickian扩散机制，0.45<n<0.89对应于非Fickian传输，n＝0.89对应于Case II传输，并且n>0.89对应于超级case II传输。由图4可知，胆汁体的释放指数(1.11)>niosomes脂质体(0.94)>liposomes脂质体(0.62)，反映出胆汁体属于超级case II传输，红酵母红素的释放主要以外壁的溶解为主，反映了胆汁体的缓释动力学机制。
本方案使用六种动力学模型在模拟小肠消化条件下评估了红酵母红素在不同小肠缓释体系下的释放动力学和机制。由于扩散和侵蚀的发生，胆汁体缓释体系释放遵循非Fickian机制。总体结果表明，胆汁体可作为食品行业中红酵母红素补充剂体外释放的有前途的载体。
4、小肠缓释体系的体内药代动力学
小鼠口服负载红酵母红素的实施例1和对比例1～4制备的不同小肠缓释体系后，血浆中红酵母红素浓度随时间的变化结果如图5A所示：
小鼠口服对比例1制备的liquid-lip乳液的T max为2h，血浆红酵母红素的Cmax浓度在700ng/mL；小鼠口服相同剂量的实施例1制备的胆汁体血浆红酵母红素浓度显著上升到980ng/mL(p<0.05)，明显高于对比例2制备的liposomes脂质体(868ng/mL)和对比例3制备的niosomes脂质体(844ng/mL)。
口服相同剂量的实施例1制备的胆汁体和对比例3制备的niosomes脂质体的AUC也有同样的趋势，分别为20014.1和14249hng/mL(表2)。
小鼠口服红酵母红素的药代动力学参数表明，实施例1的胆汁体在小鼠中达到更高C max所需的时间比对比例1～3制备的小肠缓释体系要长得多。同时，游离红酵母红素在与小肠消化吸收的条件下是高度不稳定的，血浆中红酵母红素浓度的快速下降证明了这一点。随着小鼠口服实施例1的胆汁体，血浆中红酵母红素的浓度即使在12h后仍保持在相对较高的血浆水平(659ng/mL)。这些结果表明，包裹在胆汁体中可以有效地延缓红酵母红素在体内的释放和降解，并对胆汁体发挥保护作用，从而延缓肠细胞吸收红酵母红素的时间。相关药代动力学参数(如表2所示)显示实施例1的胆汁体中的AUC是对比例1liquid-lip乳液的2.73倍，也表明了胆汁体可以作为一种有效的递送系统来提高红酵母红素在小肠中的生物利用度。
小鼠口服实施例1和对比例1～3制备的不同小肠缓释体系后，与对比例1的liquid-lip乳液相比，其他三种脂质体组小鼠小肠的C max值显着增加(所有p<0.05)，并且t1/2和MRT也更长(图5C)。对于实施例1制备的胆汁体，我们还发现了最长的t 1/2(9.2h)和MRT(15h)。在递送后24h的小鼠小肠中，对比例1的liquid-lip乳液几乎检测不到红酵母红素浓度，而对于实施例1的胆汁体仍可检测到(7ng/g)，这进一步证实了胆汁体在小肠中的较慢的清除速度和更长的保留时间，其主要原因可能是胆汁体可以可逆地打开肠上皮细胞之间的紧密连接，增强肠细胞生物膜的渗透性，从而延长其在小肠中的停留时间。
同时，对比实施例1和对比例4，发现加了胆固醇后，Bilosomes(含胆固醇)的缓释时间并没有得到改善，反而低于不加胆固醇的Bilosomes。因此，出于健康与缓释效果而言，实施例1的效果更好。
总之，上述结果表明胆汁体明显促进了小肠对红酵母红素靶向小肠的缓慢吸收，机制可以参考图5D。
因此，胆汁体包裹的红酵母红素生物利用度的增加也可能与其在胃肠道中相对较高的稳定性有关。与普通脂质体相比，阳离子胆汁体(添加脱氧胆酸钠)更有利于保护递送系统免受外部消化胆汁盐的破坏，具有较高的安全性。此外，纳米级胆汁体还可以增加包裹系统与上皮层之间的粘附表面积，从而更好地与肠膜层相互作用，在吸收部位缓慢释放红酵母红素。
表2：口服给药后红酵母红素在小鼠组织中的药代动力学(n＝5)
AUC：浓度时间曲线下的面积
C max：最大血浆浓度
T max：达到Cmax所需的时间
t1/2：药物浓度达到原值一半所需的时间
MRT：平均停留时间
*表示与液体唇相比有显着差异(p<0.05)。
5、小肠缓释体系的贮藏稳定性
食品加工和储存过程中经常遇到的不断变化的温度条件，温度升高可以显着加快红酵母红素的氧化速率。对小肠缓释体系进行稳定性测试结果如图5E所示：
从图中结果可知，在4℃时，除了对比例1的liquid-lip乳液，三个小肠缓释体系中的红酵母红素保留率均高于50％，并且实施例1的胆汁体的保留率最高，达到了92％。随着温度的升高，磷脂的氧化越来越大，脂质体中的氧化速率也越来愈大。如图5F所示，储存28d后，实施例1的胆汁体在37℃下的保留率为78.6％，明显高于对比例3的niosomes脂质体(70.7％)，对比例2的liposomes脂质体(48.3％)，更显著高于对比例1的liquid-lip乳液(26.1％)。这些发现表明，将红酵母红素封装在胆汁体中显着提高了红酵母红素的储藏稳定性，有利于其在食品工业的应用。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (6)
1.一种小肠缓释红酵母红素的胆汁体系，其特征在于，所述胆汁体系由红酵母红素和载体系统组成；所述载体系统由卵磷脂、吐温80和脱氧胆酸钠组成；所述卵磷脂、吐温80和脱氧胆酸钠的质量比为12~15：2~4：1~3；所述红酵母红素和载体系统的质量比为1：10~20；所述胆汁体系统中红酵母红素的包封率为85～92％；所述小肠缓释红酵母红素的胆汁体系的制备方法包括：将红酵母红素，卵磷脂，吐温80和脱氧胆酸钠溶于氯仿溶液中，旋转蒸发除去溶剂，然后真空干燥；再用PBS缓冲溶液将其溶解，涡旋，超声，即得胆汁体系。
2.根据权利要求1所述的小肠缓释红酵母红素的胆汁体系，其特征在于，所述卵磷脂、吐温80和脱氧胆酸钠的质量比为12：4：3。
3.根据权利要求1或2所述的小肠缓释红酵母红素的胆汁体系，其特征在于，所述红酵母红素和载体系统的质量比为30：475。
4.根据权利要求1或2所述的小肠缓释红酵母红素的胆汁体系，其特征在于，所述旋转蒸发的温度为45℃。
5.根据权利要求1或2所述的小肠缓释红酵母红素的胆汁体系，其特征在于，所述PBS缓冲溶液的浓度为0.01mol/L，pH值为7.4。
6.由权利要求1~5任一项所述的小肠缓释红酵母红素的胆汁体系在制备含有红酵母红素的食品中的应用。
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