CN115219720A - 靶向分子atx在乙肝阳性肝癌中的应用及其研究方法 - Google Patents
靶向分子atx在乙肝阳性肝癌中的应用及其研究方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN115219720A CN115219720A CN202210556684.8A CN202210556684A CN115219720A CN 115219720 A CN115219720 A CN 115219720A CN 202210556684 A CN202210556684 A CN 202210556684A CN 115219720 A CN115219720 A CN 115219720A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- liver cancer
- atx
- hepatitis
- cells
- positive
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 201000007270 liver cancer Diseases 0.000 title claims abstract description 109
- 208000014018 liver neoplasm Diseases 0.000 title claims abstract description 109
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 title claims abstract description 79
- 230000008685 targeting Effects 0.000 title claims abstract description 26
- 238000011160 research Methods 0.000 title claims abstract description 23
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 18
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 83
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims abstract description 32
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 claims abstract description 20
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 claims abstract description 13
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims abstract description 9
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 claims abstract description 7
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims abstract description 7
- 230000009456 molecular mechanism Effects 0.000 claims abstract description 4
- 210000004024 hepatic stellate cell Anatomy 0.000 claims description 27
- 230000028327 secretion Effects 0.000 claims description 17
- 206010073071 hepatocellular carcinoma Diseases 0.000 claims description 14
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 claims description 14
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims description 13
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 claims description 12
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 claims description 12
- 238000011580 nude mouse model Methods 0.000 claims description 11
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 claims description 10
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 10
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 9
- 239000000047 product Substances 0.000 claims description 9
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 7
- 238000011532 immunohistochemical staining Methods 0.000 claims description 7
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims description 7
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 6
- 238000001262 western blot Methods 0.000 claims description 6
- 101000600434 Homo sapiens Putative uncharacterized protein encoded by MIR7-3HG Proteins 0.000 claims description 5
- 102100037401 Putative uncharacterized protein encoded by MIR7-3HG Human genes 0.000 claims description 5
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 claims description 5
- 238000001890 transfection Methods 0.000 claims description 5
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 claims description 4
- 230000004913 activation Effects 0.000 claims description 4
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 claims description 4
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 claims description 4
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 claims description 4
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 claims description 3
- 235000021588 free fatty acids Nutrition 0.000 claims description 3
- 230000002055 immunohistochemical effect Effects 0.000 claims description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 claims description 3
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 claims description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 3
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 claims description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 claims description 2
- -1 ATX small molecule Chemical class 0.000 claims 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 abstract description 8
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 6
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 abstract description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 abstract description 4
- 230000003993 interaction Effects 0.000 abstract description 4
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 abstract 1
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 abstract 1
- RYCNUMLMNKHWPZ-SNVBAGLBSA-N 1-acetyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CC(=O)OC[C@@H](O)COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C RYCNUMLMNKHWPZ-SNVBAGLBSA-N 0.000 description 11
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 11
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 6
- WRGQSWVCFNIUNZ-GDCKJWNLSA-N 1-oleoyl-sn-glycerol 3-phosphate Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OC[C@@H](O)COP(O)(O)=O WRGQSWVCFNIUNZ-GDCKJWNLSA-N 0.000 description 5
- AWUCVROLDVIAJX-UHFFFAOYSA-N alpha-glycerophosphate Natural products OCC(O)COP(O)(O)=O AWUCVROLDVIAJX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 5
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 5
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 4
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 4
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 4
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 4
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- JMSUDQYHPSNBSN-UHFFFAOYSA-N (3,5-dichlorophenyl)methyl 4-[3-oxo-3-(2-oxo-3h-1,3-benzoxazol-6-yl)propyl]piperazine-1-carboxylate Chemical compound ClC1=CC(Cl)=CC(COC(=O)N2CCN(CCC(=O)C=3C=C4OC(=O)NC4=CC=3)CC2)=C1 JMSUDQYHPSNBSN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940122849 Autotaxin inhibitor Drugs 0.000 description 2
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 2
- 230000012292 cell migration Effects 0.000 description 2
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 238000009509 drug development Methods 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 210000002536 stromal cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- 239000005411 L01XE02 - Gefitinib Substances 0.000 description 1
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 1
- 102000004137 Lysophosphatidic Acid Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108090000642 Lysophosphatidic Acid Receptors Proteins 0.000 description 1
- 208000015914 Non-Hodgkin lymphomas Diseases 0.000 description 1
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 1
- 230000003305 autocrine Effects 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000009702 cancer cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 229940121647 egfr inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 229960002584 gefitinib Drugs 0.000 description 1
- XGALLCVXEZPNRQ-UHFFFAOYSA-N gefitinib Chemical compound C=12C=C(OCCCN3CCOCC3)C(OC)=CC2=NC=NC=1NC1=CC=C(F)C(Cl)=C1 XGALLCVXEZPNRQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 1
- 230000031146 intracellular signal transduction Effects 0.000 description 1
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 1
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 1
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 108010082117 matrigel Proteins 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000011242 molecular targeted therapy Methods 0.000 description 1
- 230000000771 oncological effect Effects 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 238000002271 resection Methods 0.000 description 1
- 229960004641 rituximab Drugs 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 229960000575 trastuzumab Drugs 0.000 description 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
- G01N33/57407—Specifically defined cancers
- G01N33/57438—Specifically defined cancers of liver, pancreas or kidney
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
- A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/573—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for enzymes or isoenzymes
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
- G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/92—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving lipids, e.g. cholesterol, lipoproteins, or their receptors
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
- G01N2333/914—Hydrolases (3)
- G01N2333/916—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1), e.g. phosphatases (3.1.3), phospholipases C or phospholipases D (3.1.4)
- G01N2333/918—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2405/00—Assays, e.g. immunoassays or enzyme assays, involving lipids
- G01N2405/04—Phospholipids, i.e. phosphoglycerides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Oncology (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了靶向分子ATX在乙肝阳性肝癌中的应用及其研究方法，所述研究方法包括以下步骤，S1：从宿主细胞和肿瘤微环境两个角度分析乙肝感染促进肝癌进展的分子机理；S2：根据步骤S1的研究结果，确定ATX分子在调控乙肝阳性肝癌进展中的作用；S3：实验验证靶向分子ATX在乙肝阳性肝癌中的作用。本发明利用酶及其底物分别来源于肝癌细胞及基质细胞，而酶促产物是最终的促肿瘤生长效应分子，从肿瘤细胞和肿瘤微环境两个方面以及两者相互作用的角度分析靶向ATX在调控乙肝相关肝癌进展中的作用，从而有望将靶向ATX开发成针对治疗乙肝阳性肝癌病人的分子靶向药物。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，尤其涉及靶向分子ATX在乙肝阳性肝癌中的应用及其研究方法。
背景技术
分子靶向药物是利用肿瘤细胞与正常细胞之间分子生物学上的差异(包括基因、酶、信号转导等不同特性)，抑制肿瘤细胞的生长增殖，最后使其死亡。分子靶向治疗比目前的化疗更为有效、副作用更小，是非常有希望的一种肿瘤治疗方法。例如:表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂吉非替尼主要用于治疗肺癌，利妥昔单抗主要用于治疗非霍奇金淋巴瘤，曲妥珠单抗用于治疗乳腺癌等，但目前并没有针对治疗肝癌，特别是乙肝相关肝癌的分子靶向药物，究其原因主要是对乙肝感染导致肝癌发生和发展的机制还不够了解，且过往关于乙肝感染在肝癌进展中的作用研究通常聚焦在宿主细胞本身，研究思路和角度比较局限和单一。
发明内容
针对上述存在的问题，本发明旨在提供一种靶向分子ATX在乙肝阳性肝癌中的应用及其研究方法，利用酶及其底物分别来源于肝癌细胞及基质细胞，而酶促产物是最终的促肿瘤生长效应分子，从肿瘤细胞和肿瘤微环境两个方面以及两者相互作用的角度分析靶向ATX 在调控乙肝相关肝癌进展中的作用，从而有望将靶向ATX开发成针对治疗乙肝阳性肝癌病人的分子靶向药物。
为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案如下：
靶向分子ATX在乙肝阳性肝癌中的应用，其特征在于：靶向分子ATX通过抑制肝癌细胞增殖及肝星状细胞活性发挥功能，实现对乙肝阳性肝癌细胞生长的抑制。
进一步的，靶向分子ATX在乙肝阳性肝癌中应用的研究方法，其特征在于，包括以下步骤，
S1：从宿主细胞和肿瘤微环境两个角度分析乙肝感染促进肝癌进展的分子机理；
S2：根据步骤S1的研究结果，确定ATX分子在调控乙肝阳性肝癌进展中的作用；
S3：实验验证靶向分子ATX在乙肝阳性肝癌中的作用。
进一步的，步骤S1的具体操作包括以下步骤，
S101：对临床样本进行分析，明确乙肝感染与肝癌复发的关系；
S102：免疫组化研究分析ATX的表达分泌与乙肝感染的关系；
S103：体外细胞及分子实验研究分析乙肝感染与宿主细胞表达分泌ATX的关系，以及乙肝感染与肝星状细胞活化之间的关系；
S104：研究分析肝癌细胞表达分泌的ATX与活化的肝星状细胞分泌出来的LPC形成的酶促产物与肝癌进展之间的关系。
进一步的，步骤S102的具体操作包括以下步骤，
S1021：对肝癌病人肿瘤组织样本进行ATX免疫组化染色；
S1022：调取肝癌病人临床信息，结合ATX免疫组化染色结果，分析ATX的表达分泌与乙肝感染之间的关系。
进一步的，步骤S103的具体操作包括以下步骤，
S1031：用肝癌细胞系HepG2作为母本细胞，通过细胞转染试验获得能够稳定表达乙肝全基因组的肝癌细胞系，命名为HepG2-HBV；
S1032：对肝癌细胞系HepG2和HepG2-HBV进行细胞培养，细胞培养稳定后收集细胞裂解液及细胞培养上清，通过SDS-PAGE变性电泳及蛋白免疫印记试验检测两种细胞中ATX的表达和分泌情况；
S1032：分别使用肝癌细胞系HepG2和HepG2-HBV的细胞培养上清刺激肝星状细胞LX-2，然后通过蛋白免疫印迹试验检测不同处理后LX-2胞内活化因子a-SMA的表达水平。
进一步的，步骤S104的具体操作包括以下步骤，
S1041：选取活化的肝星状细胞LX-2及两株肝癌细胞系HepG2 和Huh7作为对照，用不含游离脂肪酸的血清培养基对三株细胞进行培养，培养48小时后收集细胞培养上清进行脂质含量检测；
S1042：根据步骤S1041的检测结果，确定肿瘤微环境中ATX酶促底物LPC的主要来源为活化的肝星状细胞LX-2；
S1043：对肝癌细胞表达分泌的ATX与活化的肝星状细胞分泌出来的LPC形成的酶促产物LPA与肝癌进展之间的关系进行理论分析。
进一步的，步骤S3的具体操作包括以下步骤，
S301：使用ATX小分子抑制剂进行肝癌细胞功能学实验；
S302：通过体外细胞实验和裸鼠体内荷瘤实验证明ATX小分子抑制剂对乙肝阳性肝癌细胞增殖的抑制作用。
本发明的有益效果是：
本发明中提出的靶向分子ATX在乙肝阳性肝癌中应用的研究方法，通过从肿瘤细胞和肿瘤微环境两个方面以及二者之间相互作用的角度分析ATX分子在调控乙肝阳性肝癌进展中的作用，利用分析研究结果得出ATX可以作为乙肝阳性肝癌的分子药物开发靶点；在此基础上，通过使用ATX小分子抑制剂，进行肿瘤细胞功能学实验和裸鼠体内荷瘤实验证明ATX不仅可以通过自分泌的方式促进肝癌细胞的增殖，还可以和活化的肝星状细胞协同促进肝癌的进展，进一步的证明ATX作为治疗靶点的可靠性，从而使得本发明为乙肝阳性肝癌的抗肿瘤治疗提供新的药物研发方向。
附图说明
图1为本发明中对临床样本进行分析，得出的肝癌患者无瘤生存曲线。
图2为本发明中乙肝阳性肝癌患者和乙肝阴性肝癌患者ATX表达分布情况代表图。
图3为本发明中体外细胞实验中HepG2-HBV和HepG2细胞裂解液及细胞培养上清中ATX表达分泌水平。
图4为本发明中使用肝癌细胞系HepG2和HepG2-HBV的细胞培养上清刺激肝星状细胞LX-2后LX-2胞内活化因子a-SMA的表达水平检测结果。
图5为本发明中活化的肝星状细胞LX-2及肝癌细胞系HepG2和 Huh7培养上清质谱分析结果中六种LPC的表达水平。
图6为本发明中ATX通过水解LPC产生具有生物活性的LPA示意图。
图7为本发明中ATX在调控乙肝阳性肝癌进展中的作用原理图。
图8为本发明中ATX小分子抑制剂的肿瘤细胞功能学实验结果。
图9为本发明中乙肝稳转体系HepG2-HBV、活化肝星状细胞LX-2、及ATX小分子抑制剂对肝癌细胞的肿瘤学功能影响。
图10为本发明中ATX小分子抑制剂裸鼠皮下荷瘤模型试验结果。
具体实施方式
为了使本领域的普通技术人员能更好的理解本发明的技术方案，下面结合附图和实施例对本发明的技术方案做进一步的描述。
靶向分子ATX(自毒素，autotoxin)在乙肝阳性肝癌中应用的研究方法，利用酶及其底物分别来源于肝癌细胞及基质细胞，而酶促产物是最终的促肿瘤生长效应分子，从肿瘤细胞和肿瘤微环境两个方面以及两者相互作用的角度分析靶向分子ATX在调控乙肝相关肝癌进展中的作用，从而有望将靶向ATX开发成针对治疗乙肝阳性肝癌病人的分子靶向药物。该研究方法具体包括以下步骤，
S1：从宿主细胞和肿瘤微环境两个角度分析乙肝感染促进肝癌进展的分子机理；
S2：根据步骤S1的研究结果，确定ATX分子在调控乙肝阳性肝癌进展中的作用；
S3：实验验证靶向分子ATX在乙肝阳性肝癌中的作用。
具体的，步骤S1的具体操作包括以下步骤，
S101：对临床样本进行分析，明确乙肝感染与肝癌复发的关系；
对临床774例肝癌患者进行样本分析，结果如附图1所示，从附图1中可以看出，乙肝阴性肝癌病人只有115例，只占14.8％，乙肝阳性肝癌病人高达659例，高达85.2％，且从两组病人的无瘤生存曲线图可以看出乙肝阳性肝癌病人在行外科切除手术后肿瘤更容易发生复发和转移，两组病人无瘤生存时间具有统计学差异，P<0.05，由此可以明确的得出乙肝感染可以促使肝癌病人更容易肿瘤复发。
进一步的，S102：免疫组化研究分析ATX的表达分泌与乙肝感染的关系；
更具体的，该操作包括以下步骤，
S1021：对肝癌病人肿瘤组织样本进行ATX免疫组化染色；
选取158例肝癌患者进行分析，其中133例为乙肝阳性患者，25 例为乙肝阴性患者，对158例患者进行ATX免疫组化染色分析(具体操作步骤采用现有的免疫组化染色分析方法，本申请中不做赘述)，结果如附图2和下表1所示。
表1 158例患者ATX免疫组化染色统计分析结果
从表1中可以看出，在乙肝阳性组别中，有96例病人高表达ATX，所占比例为72.2％；而在乙肝阴性组别中，只有10例高表达ATX，所占比例为40％，两组间ATX表达水平具有统计学差异(P<0.01)，由此暗示ATX表达与乙肝感染呈正相关关系。
S1022：调取肝癌病人临床信息，结合ATX免疫组化染色结果，分析ATX的表达分泌与乙肝感染之间的关系。
根据步骤S1021的研究结果，结合肝癌患者的乙肝阳性和阴性结果可得，ATX表达分布与HBV感染呈现正相关关系。
进一步的，S103：体外细胞及分子实验研究分析乙肝感染与宿主细胞表达分泌ATX的关系，以及乙肝感染与肝星状细胞活化之间的关系；
更具体的，S1031：用肝癌细胞系HepG2作为母本细胞，通过慢病毒载体构建多个具有细胞转染及感染能力的表达体系，再利用细胞转染试验最终获得能够稳定表达乙肝全基因组的肝癌细胞系，命名为 HepG2-HBV。
S1032：对肝癌细胞系HepG2和HepG2-HBV进行细胞培养，细胞培养稳定后收集细胞裂解液及细胞培养上清，通过SDS-PAGE变性电泳及蛋白免疫印记试验检测两种细胞中ATX的表达和分泌情况，结果如附图3所示，从附图3中可以看出，相比较于HepG2， HepG2-HBV不管是胞内还是上清中ATX的水平都更高，由此说明 HBV可以促进肝癌细胞内ATX的表达和分泌。
S1032：分别使用肝癌细胞系HepG2和HepG2-HBV的细胞培养上清刺激肝星状细胞LX-2，然后通过蛋白免疫印迹试验检测不同处理后LX-2胞内活化因子a-SMA的表达水平，结果如附图4所示。
从附图4中可以看出，两种肝癌细胞系的上清都可以促进LX-2 表达a-SMA，且相比较于HepG2，HepG2-HBV上清刺激LX-2表达更多的a-SMA，但ATX抑制剂却可以抑制两种肝癌细胞系上清促LX-2表达a-SMA的能力，由此暗示HBV可能通过促进肝癌细胞分泌ATX，后者进而可以促进肝星状细胞的活化。
进一步的，S104：研究分析肝癌细胞表达分泌的ATX与活化的肝星状细胞分泌出来的LPC(溶血软磷脂，Lysophosphatidylcholine) 形成的酶促产物与肝癌进展之间的关系。
更具体的，S1041：选取活化的肝星状细胞LX-2及两株肝癌细胞系HepG2和Huh7作为对照，用不含游离脂肪酸的血清培养基对三株细胞进行培养，培养48小时后收集细胞培养上清进行脂质含量检测(用19：0/0：0LPC作为质谱分析的内标)，质谱分析结果如附图 5所示。
从附图5中可以看出，相比较于两株肝癌细胞系HepG2、Huh7 的上清，活化的LX-2上清中分泌更多的脂质，其中有六种LPC含量显著高于肝癌细胞系(P<0.05)，由此暗示肿瘤微环境中ATX酶促底物LPC可能主要来源于活化的肝星状细胞。
S1042：根据步骤S1041的检测结果，确定肿瘤微环境中ATX酶促底物LPC的主要来源为活化的肝星状细胞LX-2；
S1043：对肝癌细胞表达分泌的ATX与活化的肝星状细胞分泌出来的LPC形成的酶促产物LPA(溶血磷脂酸，lysophosphatidic acid) 与肝癌进展之间的关系进行理论分析。
ATX可以通过水解LPC产生具有生物活性的产物LPA，后者通过与细胞表面广谱表达的受体LPAR结合激活胞内多种信号通路，进而参与多种细胞活动，包括促进肿瘤细胞的增殖、转移、血管生成等，如附图6所示。
根据以上步骤S1的具体分析可以确定ATX分子可以促进乙肝阳性肝癌的进展，进而通过抑制ATX的分泌和表达可以实现对肝癌细胞增殖和迁移的抑制，如附图7所示。为了进一步的验证靶向分子 ATX在乙肝阳性肝癌中的作用，采用如下具体操作步骤，
S301：使用ATX小分子抑制剂 (3,5-Dichlorobenzyl-[4-[3-oxo-3-(2-oxo-2,3-dihydrobenzoxazol-6-yl)pr opyl]]piperazine-1-carboxylate)进行肝癌细胞增殖、迁移及克隆形成等肿瘤细胞体外功能学实验，结果如附图8所示，在图8中，A为 ATX小分子抑制剂与肝癌细胞增殖曲线图，B和C均为ATX小分子抑制剂与肝癌细胞迁移关系示意图；从附图8中可以看出，ATX小分子抑制剂是可以抑制肝癌细胞的增殖和迁移的。
S302：通过体外细胞实验和裸鼠体内荷瘤实验证明ATX小分子抑制剂对乙肝阳性肝癌细胞增殖的抑制作用。
裸鼠皮下荷瘤试验具体方法：消化收集细胞，离心后用PBS重悬计数,按每只裸鼠注射5×106个细胞(其中，混合注射中LX-2与肝癌细胞的比例为1：3)，50uL PBS/只体系，取相应数量的细胞后PBS 补齐体积后，加入等体积预冷的Matrigel基质胶轻轻混匀；裸鼠注射前，先用巴氏管将细胞悬液混匀后，用胰岛素针吸取100uL细胞悬液接种至裸鼠体侧腰部靠上部位。接种时避免针头在皮内或者肌肉内，注射完毕后退出针头，定期观察裸鼠状态；待第十天时，选定组别腹腔注射DMSO或PF-8380抑制剂，每天两次，连续注射2周。
体外细胞实验的结果如附图9所示，从附图9中可以看出，LX-2 可以协同HBV共同促进肝癌细胞的增殖、克隆形成及迁移，但ATX 小分子抑制剂可以抑制LX-2及HBV的促肝癌细胞增殖(图9A)、克隆形成(图9B)及迁移能力(图9C)。
裸鼠体内荷瘤实验结果如附图10所示，从附图10中可以看出，稳定表达HBV的肝癌细胞系HepG2-HBV可以皮下成瘤，而HepG2、 LX-2、HepG2+LX-2三组裸鼠皮下不成瘤，且共注射 LX-2+HepG2-HBV组比单独注射HepG2-HBV组裸鼠皮下瘤子体积更大，但ATX抑制剂可以显著抑制LX-2+HepG2-HBV组瘤子的生长。
综上所述，ATX分泌和表达能够促进肝癌发展，因此靶向分子 ATX能够通过抑制肝癌细胞增殖及肝星状细胞活性发挥功能，实现对乙肝阳性肝癌细胞生长的抑制。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
Claims (7)
1.靶向分子ATX在乙肝阳性肝癌中的应用，其特征在于：靶向分子ATX通过抑制肝癌细胞增殖及肝星状细胞活性发挥功能，实现对乙肝阳性肝癌细胞生长的抑制。
2.靶向分子ATX在乙肝阳性肝癌中应用的研究方法，其特征在于，包括以下步骤，
S1：从宿主细胞和肿瘤微环境两个角度分析乙肝感染促进肝癌进展的分子机理；
S2：根据步骤S1的研究结果，确定ATX分子在调控乙肝阳性肝癌进展中的作用；
S3：实验验证靶向分子ATX在乙肝阳性肝癌中的作用。
3.根据权利要求2所述的靶向分子ATX在乙肝阳性肝癌中应用的研究方法，其特征在于，步骤S1的具体操作包括以下步骤，
S101：对临床样本进行分析，明确乙肝感染与肝癌复发的关系；
S102：免疫组化研究分析ATX的表达分泌与乙肝感染的关系；
S103：体外细胞及分子实验研究分析乙肝感染与宿主细胞表达分泌ATX的关系，以及乙肝感染与肝星状细胞活化之间的关系；
S104：研究分析肝癌细胞表达分泌的ATX与活化的肝星状细胞分泌出来的LPC形成的酶促产物与肝癌进展之间的关系。
4.根据权利要求3所述的靶向分子ATX在乙肝阳性肝癌中应用的研究方法，其特征在于，步骤S102的具体操作包括以下步骤，
S1021：对肝癌病人肿瘤组织样本进行ATX免疫组化染色；
S1022：调取肝癌病人临床信息，结合ATX免疫组化染色结果，分析ATX的表达分泌与乙肝感染之间的关系。
5.根据权利要求4所述的靶向分子ATX在乙肝阳性肝癌中应用的研究方法，其特征在于，步骤S103的具体操作包括以下步骤，
S1031：用肝癌细胞系HepG2作为母本细胞，通过细胞转染试验获得能够稳定表达乙肝全基因组的肝癌细胞系，命名为HepG2-HBV；
S1032：对肝癌细胞系HepG2和HepG2-HBV进行细胞培养，细胞培养稳定后收集细胞裂解液及细胞培养上清，通过SDS-PAGE变性电泳及蛋白免疫印记试验检测两种细胞中ATX的表达和分泌情况；
S1032：分别使用肝癌细胞系HepG2和HepG2-HBV的细胞培养上清刺激肝星状细胞LX-2，然后通过蛋白免疫印迹试验检测不同处理后LX-2胞内活化因子a-SMA的表达水平。
6.根据权利要求5所述的靶向分子ATX在乙肝阳性肝癌中应用的研究方法，其特征在于，步骤S104的具体操作包括以下步骤，
S1041：选取活化的肝星状细胞LX-2及两株肝癌细胞系HepG2和Huh7作为对照，用不含游离脂肪酸的血清培养基对三株细胞进行培养，培养48小时后收集细胞培养上清进行脂质含量检测；
S1042：根据步骤S1041的检测结果，确定肿瘤微环境中ATX酶促底物LPC的主要来源为活化的肝星状细胞LX-2；
S1043：对肝癌细胞表达分泌的ATX与活化的肝星状细胞分泌出来的LPC形成的酶促产物LPA与肝癌进展之间的关系进行理论分析。
7.根据权利要求6所述的靶向分子ATX在乙肝阳性肝癌中应用的研究方法，其特征在于，步骤S3的具体操作包括以下步骤，
S301：使用ATX小分子抑制剂进行肝癌细胞功能学实验；
S302：通过体外细胞实验和裸鼠体内荷瘤实验证明ATX小分子抑制剂对乙肝阳性肝癌细胞增殖的抑制作用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210556684.8A CN115219720A (zh) | 2022-05-20 | 2022-05-20 | 靶向分子atx在乙肝阳性肝癌中的应用及其研究方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210556684.8A CN115219720A (zh) | 2022-05-20 | 2022-05-20 | 靶向分子atx在乙肝阳性肝癌中的应用及其研究方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN115219720A true CN115219720A (zh) | 2022-10-21 |
Family
ID=83607674
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202210556684.8A Pending CN115219720A (zh) | 2022-05-20 | 2022-05-20 | 靶向分子atx在乙肝阳性肝癌中的应用及其研究方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN115219720A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2024246264A1 (en) * | 2023-05-31 | 2024-12-05 | iOnctura BV | Methods of treatment of non-pancreatic gastrointestinal cancers |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111328287A (zh) * | 2017-07-04 | 2020-06-23 | 库瑞瓦格股份公司 | 新型核酸分子 |
| CN113273421A (zh) * | 2021-04-21 | 2021-08-20 | 上饶师范学院 | 一种三叶青高光效高山设施栽培工艺及其研究方法 |
-
2022
- 2022-05-20 CN CN202210556684.8A patent/CN115219720A/zh active Pending
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111328287A (zh) * | 2017-07-04 | 2020-06-23 | 库瑞瓦格股份公司 | 新型核酸分子 |
| CN113273421A (zh) * | 2021-04-21 | 2021-08-20 | 上饶师范学院 | 一种三叶青高光效高山设施栽培工艺及其研究方法 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| WAN YU DENG等: ""Hepatitis B Virus Promotes Hepatocellular Carcinoma Progression Synergistically With Hepatic Stellate Cells via Facilitating the Expression and Secretion of ENPP2"", 《FRONTIERSIN MOLECULAR BIOSCIENCES》, vol. 8, 5 November 2021 (2021-11-05), pages 1 - 12 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2024246264A1 (en) * | 2023-05-31 | 2024-12-05 | iOnctura BV | Methods of treatment of non-pancreatic gastrointestinal cancers |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Nieszporek et al. | Molecular mechanisms of epithelial to mesenchymal transition in tumor metastasis | |
| Parashar et al. | miRNA551b-3p activates an oncostatin signaling module for the progression of triple-negative breast cancer | |
| Liu et al. | FTO promotes cell proliferation and migration in esophageal squamous cell carcinoma through up-regulation of MMP13 | |
| Zhang et al. | Targeting super-enhancer–associated oncogenes in osteosarcoma with THZ2, a covalent CDK7 inhibitor | |
| Lin et al. | Epigenetic switch between SOX2 and SOX9 regulates cancer cell plasticity | |
| Li et al. | MiR-124 down-regulation is critical for cancer associated fibroblasts-enhanced tumor growth of oral carcinoma | |
| Xia et al. | miR-153 inhibits epithelial-to-mesenchymal transition in hepatocellular carcinoma by targeting Snail | |
| Wu et al. | N6-methyladenosine and rheumatoid arthritis: a comprehensive review | |
| Yang et al. | Downregulation of microRNA-196a inhibits human liver cancer cell proliferation and invasion by targeting FOXO1 | |
| Sethuraman et al. | SMARCE1 regulates metastatic potential of breast cancer cells through the HIF1A/PTK2 pathway | |
| Zheng et al. | Propofol affects non–small-cell lung cancer cell biology by regulating the miR-21/PTEN/AKT pathway in vitro and in vivo | |
| Huang et al. | NEDD4 promotes cell growth and migration via PTEN/PI3K/AKT signaling in hepatocellular carcinoma | |
| Peppicelli et al. | The Carbonic Anhydrase IX inhibitor SLC-0111 as emerging agent against the mesenchymal stem cell-derived pro-survival effects on melanoma cells | |
| Li et al. | Soft substrate promotes osteosarcoma cell self-renewal, differentiation, and drug resistance through miR-29b and its target protein spin 1 | |
| Deng et al. | Long non-coding RNA HOTTIP promotes tumor growth and inhibits cell apoptosis in lung cancer | |
| Li et al. | MELK as a potential target to control cell proliferation in triple‑negative breast cancer MDA‑MB‑231 cells | |
| Lee et al. | Tpl2 kinase impacts tumor growth and metastasis of clear cell renal cell carcinoma | |
| Cheng et al. | Long noncoding RNA-SNHG20 promotes silica-induced pulmonary fibrosis by miR-490-3p/TGFBR1 axis | |
| Safi et al. | The role of noncoding RNAs in metabolic reprogramming of cancer cells | |
| Liu et al. | DEPDC1B promotes migration and invasion in pancreatic ductal adenocarcinoma by activating the Akt/GSK3β/Snail pathway | |
| Zhao et al. | RETRACTED ARTICLE: LncRNA SNHG7 Functions as an Oncogene in Cervical Cancer by Sponging miR-485-5p to Modulate JUND Expression | |
| Zhong et al. | Epigenetic silencing of GCH1promotes hepatocellular carcinoma growth by activating superoxide anion-mediated ASK1/p38 signaling via inhibiting tetrahydrobiopterin de novo biosynthesis | |
| Park et al. | Anti-proliferative effect of engineered neural stem cells expressing cytosine deaminase and interferon-beta against lymph node-derived metastatic colorectal adenocarcinoma in cellular and xenograft mouse models | |
| CN115219720A (zh) | 靶向分子atx在乙肝阳性肝癌中的应用及其研究方法 | |
| Sun et al. | Novel evidence for retinoic acid‐induced G (Rig‐G) as a tumor suppressor by activating p53 signaling pathway in lung cancer |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |