CN113273421A - 一种三叶青高光效高山设施栽培工艺及其研究方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种三叶青高光效高山设施栽培工艺及其研究方法，包括步骤一：选地，选择连栋温室进行三叶青栽培；步骤二：配置底肥，以菜籽饼、草木灰配合钙镁磷肥作为底肥；步骤三：栽培，选用栽培容器进行定植；步骤四：光照条件，在三叶青块根形成期，进行补光；步骤五：灌溉条件，调亏灌溉的条件为，地上部分生长期，灌溉量的土壤含水量为50‑60％，块根形成期灌溉量的土壤含水量为30％‑40％；通过对三叶青生长环境的探索，证明led红光及蓝光补充光照对于三叶青块根产的形成及品质优化具有促进作用，并通过验证，利用高光效高山设施栽培工艺培养三叶青，可以大幅提高三叶青的产量，相比现有技术具有绿色、优质、高产栽培的特点。

Description

一种三叶青高光效高山设施栽培工艺及其研究方法
技术领域
本发明涉及三叶青栽培技术领域，具体涉及一种三叶青高光效高山设施栽培工艺及其研究方法。
背景技术
三叶青(Tetrastigma hemsleyanum Diels et Gilg)学名为三叶崖爬藤，属葡萄科崖爬藤属多年生蔓生藤本植物，具地下块根；三叶青是中国特有珍稀药用植物，具有抗炎、镇痛、解毒及解热等作用，特别对治疗小儿高热惊厥有奇效，被誉为“植物抗生素”；近年来药理学研究表明，其块根提取物对肿瘤的治疗有卓越的效果，有巨大的抗肿瘤临床应用价值；随着三叶青药用价值的深入挖掘，三叶青正成为一种新兴的大宗中药材；江西是三叶青重要的种质资源地，2016年1月江西省上饶市怀玉山三叶青被农业部核准为国家地理标志农产品；
江西的三叶青野生资源濒危且尚未完全实现人工产业化栽培，其产业化发展程度远低于，浙江、福建等省份；分析其根本原因是没有适合江西地区高产优质栽培模式；现在江西三叶青栽培多采用粗放高山林下的仿野生栽培模式，这种种植模式突出的问题是三叶青种苗难以越冬，成活率极低，加之栽培条件可操作性差及管理粗放等问题，使该模式在江西高山地区难以推广；
发明内容
针对上述存在的问题，本发明旨在提供一种三叶青高光效高山设施栽培工艺及其研究方法，通过对三叶青生长环境的探索，证明蓝光及红光补充光照对于三叶青块根发育及黄酮类化合物的合成具有促进作用，并通过实验验证，利用高光效高山设施栽培工艺培养三叶青，可以大幅提高三叶青的产量，相比现有技术具有绿色、优质、高产栽培的特点。
为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案如下：
一种三叶青高光效高山设施栽培工艺，所述工艺包括：
步骤一：选地，选择海拔在600-1000m，1月平均气温在5.5℃，7月平均气温在28.8℃的无遮挡、采光好、非低洼积水地、以自然通风为主的连栋温室进行三叶青的栽培；
步骤二：配置底肥，以菜籽饼240kg/hm2、施用500kg/hm2的草木灰配合 90kg/hm2的钙镁磷肥作为底肥；
步骤三：栽培，选用架高200cm，容器直径为35cm，高30cm的栽培容器进行定植栽培，且每个容器内栽培2株三叶青幼苗，与叶菜类轮作；
步骤四：光照条件，在三叶青块根形成期(9月中旬-11月中旬)，栽培地最大昼夜温差10℃以上，补光时间为45天；
步骤五：灌溉条件，调亏灌溉的条件为地上部分生长期(6月-9月)，土壤含水量为50-60％为宜，块根形成期(9月中旬-11月中旬)土壤含水量为30％-40％。
优选的，步骤四所述的补光过程按照以下过程进行补光：
自然光条件为：光强度为500μmol/m2s-800μmol/m2s，光照时间为自然昼夜周期；
紫外光条件为：395-410nmLed光源，光照时间为20min间隔，光照强度为 4-10μmol/m2s，补光20min，间隔20min，重复5次，于日下午3点后进行；
补光条件为：在每天18:00后进行，补充光照LED红蓝光质配比为1:1，Led 红光波长为665-670nm，蓝光为445-450nm，补充光照强度20-30μmol/m2s，补充光照时间为3h。
一种三叶青高光效高山设施栽培工艺的研究方法，包括步骤：
S1.设置试验地点及栽培处理规格；S2.确定三叶青生长的最佳补充光照条件；S3.确定三叶青生长的最佳土壤条件；S4.确定三叶青生长的最佳灌溉方法；S5.确定三叶青的种植模式；S6.确定三叶青的轮作种植措施；S7.评估不同栽培处理中三叶青产量及品质。
优选的，步骤S1所述的拟设置试验地点及栽培处理规格包括：
(1)选取平均海拔1000米，年平均气温12—16℃，一月份平均气温5.5℃，七月份平均气温28.8℃，气压917.9hPa，土壤为红壤的大棚作为培养基地，种植前测定土壤中的氮磷钾状况；
(2)大棚环境：采用塑料大棚，棚内顶层设置数层遮阳网，四周设置遮阳网；
(3)采光：在每年9月份后进行30-45d的不同光质驯化栽培试验，每处理 9-12株，三个重复；每天18：00以后补充光照，以正常条件生长的三叶青为对照。
优选的，步骤S2所述的三叶青生长的最佳补充光照条件的确定过程包括：
S201.最优补充光谱组合的筛选：
利用led红光(665-670nm)，蓝光(445-450nm)，采用红光：蓝光＝10：1，红光：蓝光＝5：1，红光：蓝光＝1：1，红光：蓝光＝1：5，四种光质配比；
S202.最优补充光强度筛选：
利用红光与蓝光的混合光照强度为5μmol/m2s、10μmol/m2s、20μmol/m2s、 50μmol/m2s为光强梯度进行测试；
S203.最优补充光照时间的筛选：
采用1h、2h、3h、4h为补充光照时间梯度；
S204.补充光照最优条件的实验设计：
按照补充光照红蓝光比例、补充光强度及补充光照时间，三因素四水平的正交实验表，设计实验，每个处理9-12株，生物学重复3次，重复两年；
S205.评估紫外光干扰处理对于三叶青产量及药效物质影响：
处理光谱参照植物叶绿素及类胡萝卜素吸收光谱，采用波长为395nm-410nm 的紫外光，光强为4-10μmol/m2s的低光强进行处理，处理时间为10min，20min， 30min三个水平，对其产量、主要药效物质构成及含量进行分析，筛选出最优处理时间，三个生物学重复，每个重复5-9株，重复两年。
优选的，步骤S3所述的三叶青生长的最佳土壤条件的确定过程包括：
S301.首先测量土壤中氮磷钾的含量，氮磷钾的测定方法为：先对土壤样品进行消煮，全氮用半微量开氏法、全磷用紫外分光光度法、全钾采用火焰光度法测定；
S302.前期采用腐熟的菜籽饼与草木灰为底肥，对其最佳用量进行筛选用 180kg/hm2、240kg/hm2及300kg/hm23个基肥梯度结合施用500kg/hm2的草木灰；筛选最佳磷肥形态，设计不同形态的P素对三叶青块根产量及品质的影响，施用量90kg/hm2，肥料形式采用过磷酸钙、钙镁磷肥、磷酸二铵，氮肥和磷肥采用二因素三水平的实验设计，考察基肥用量及磷肥形态对于三叶青产量及品质的影响。
优选的，步骤S4所述的三叶青生长的最佳灌溉方法的确定过程包括：
S401.实验组采用水分亏缺灌溉，以常规灌溉为对照，设计三叶青不同发育时期进行土壤水分控制量；
S402.对土壤微生物数量、酶活性如脲酶、H2O2酶和酸性磷酸酶活性进行测定；
S403.每隔1-2天测定0-10cm，10-20cm，20-30cm，30-40cm，40-50cm土层处的土壤含水率、贮水量、灌水量，灌溉水利用效率进行测定；
S404.收获后对各个处理的生物学性状、生物产量、块根产量、药效物质构成及含量进行检测，评估最优水分控制模式。
优选的，步骤S5所述的三叶青的种植模式确定过程包括：
S501.种植模式选用容器立体、容器平作、大田立体和大田平作(CK)，立体架高200cm，限根容器口径为35cm、高30cm，每个容器种植2株种苗，对其产量及品质进行评估；
S502.大田平作(CK)，种植垄高35～40cm，垄宽30cm，左右各种一株，整个生育期管理措施相同。
优选的，步骤S6所述的三叶青的轮作种植措施的确定过程包括：设计实验与番茄、辣椒、瓜类、叶菜类等设施进行轮作，对其生物学性状、生物产量、块根产量、药效物质构成及含量进行检查，评估最优轮作模式。
优选的，步骤S7所述的不同栽培处理中三叶青产量及品质的评估过程包括：
S701.测定地上部分生长指标
(1)植株生长势评估：
叶片生长势评估测定各处理三叶青的株高，分支数量、分支数、分枝长度、叶长，叶宽；使用电子数显卡尺在距离地面0.02m处测定分支粗；于9月在各处理中随机选取长势完好的三叶青植株各9株以上，测定其根系的根长，块根直径，块根数量、根系重量；并放置在烘箱中保持45℃烘干至恒重，测定三叶青的地上和地下干物质量；
(2)叶绿素含量的测定：
用SPAD-502手持式叶绿素仪测定叶片叶绿素含量，随机选取30片叶，每片叶片测3个数据，取平均值；；
S702.光合指标的测定
采用Li-6400光合测定仪对不同处理环境条件下，三叶青光饱和曲线进行测定，根据光饱和点，评估不同光质处理对于三叶青光和能力的影响；测定各个处理的净光合速率Pn，蒸腾速率Tr，气孔导度Gs，叶肉细胞间二氧化碳浓度Ci；每个处理重复三次，测定时间为晴天上午9:00-11:00或下午2:00到5:00，每个处理6个以上重复；
S703.不同光处理组产量的测定
对不同光组合处理进行总产量、叶片产量、地上部分产量、总根重量、块根重量、纤维根重量进行测量，评估不同光组合处理对于三叶青产量的影响；
S704.地上部分、块根及纤维根黄酮类化合物产量、单体成分分析及抗氧化分析采用超声提取法进行黄酮类化合物的提取，采用紫外定量分析方法和液质联用色谱仪法，结合外标法对芦丁、异槲皮苷、异荭草苷、荭草苷、紫云英苷、山奈酚、槲皮素等黄酮类化合物进行靶向定性及定量分析；平行样品三个重复，生物学重复三次以上；然后测定各处理块根黄酮提取物对于清除1,1－二苯基－2－三硝基苯肼自由基(DPPH)、3-氧代-2-苯基-4，4，5，5-四甲基咪唑啉-1-氧(PTIO) 及3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸的能力，研究其抗氧化作用；
S705.数据分析
基于以上处理及分析，研究三叶青块根产量、黄酮类化合物构成及含量变化规律；并利用canoco5.0、SPSS20.0软件分析三叶青产量、黄酮类化合物构成及含量变化与设施栽培因子的相关性，探讨影响三叶青药材质量的主要设施环境因子，筛选最佳的设施栽培光环境条件及其他配套栽培条件。
本发明的有益效果是：本发明公开了一种三叶青高光效高山设施栽培工艺及其研究方法，与现有技术相比，本发明的改进之处在于：
针对三叶青现有的栽培模式中存在问题，本发明通过从高光效环境包括自然光照强度、补光光照中红蓝光质配比、补充光照时间、补充光照强度、紫外光干扰处理等最优光环境条件筛选等方面对三叶青生长光环境进行探索和研究，筛选出与高光效环境相适应的最适合三叶青高山设施栽培条件，设计了一种三叶青高光效高山设施栽培工艺，通过设施栽培的精耕细作模式，水肥便于控制及管理，项目前期进行了两年测产实验，设施栽培比仿野生栽培产量提高了3-6倍；另外，江西地区无霜期长，特别是秋季日照充足，大棚及温室内不用任何加温措施，而大棚一般使用寿命10年以上，成本10-20元/m2,成本低适用广泛推广；因此，本发明所设计的三叶青高光效高山设施栽培工艺具有绿色、优质、高产栽培的优点。
附图说明
图1为本发明三叶青高光效高山设施栽培工艺的流程图。
图2为本发明实施例1三叶青高光效高山设施栽培工艺研究方法的技术路线图。
图3为本发明实施例1不同光质驯化栽培三叶青块根产量图。
图4为本发明实施例1不同光质驯化栽培三叶青叶片、纤维根及块根中总黄酮含量图。
图5为本发明实施例1不同光质驯化栽培三叶青不同器官中黄酮提取物的 PTIO测试结果图。
图6为本发明实施例1不同光质驯化栽培三叶青不同器官中黄酮提取物的 ABTS测试结果图。
图7为本发明实施例1不同光质驯化栽培三叶青不同器官中黄酮提取物的 DPPH测试结果图。
图8为本发明实施例2不同光质处理怀玉山三叶青光饱和曲线图。
图9为本发明实例3仿野生栽培与设施栽培三叶青2年及3年的块根产量对比图。
图10为本发明实施例3不同光质驯化栽培三叶青块根黄酮代谢组总离子流图。
图11为本发明实施例3不同光质驯化栽培三叶青块根黄酮代谢组KEGG差异比较分析图。
其中：在图4中：(a)表示不同光质驯化栽培三叶青叶片中的黄酮含量，(b) 表示不同光质驯化栽培三叶青块根中的黄酮含量，(c)表示不同光质驯化栽培三叶青纤维根中的黄酮含量；
在图5中：(a)表示不同光质驯化栽培三叶青叶片中黄酮提取物的PTIO测试结果图，(b)表示不同光质驯化栽培三叶青纤维根中黄酮提取物的PTIO测试结果图，(c)表示不同光质驯化栽培三叶青块根中黄酮提取物的PTIO测试结果图；
在图6中：(a)表示不同光质驯化栽培三叶青叶片中黄酮提取物的ABTS测试结果图，(b)表示不同光质驯化栽培三叶青纤维根中黄酮提取物的ABTS测试结果图，(c)表示不同光质驯化栽培三叶青块根中黄酮提取物的ABTS测试结果图；
在图7中：(a)表示不同光质驯化栽培三叶青叶片中黄酮提取物的DPPH测试结果图，(b)表示不同光质驯化栽培三叶青纤维根根中黄酮提取物的DPPH测试结果图，(c)表示不同光质驯化栽培三叶青块根中黄酮提取物的DPPH测试结果图；
在图10中：(a)表示CK的总(+)离子流图，(b)表示蓝光处理组的总(+) 离子流图，(c)表示CK的总(-)离子流图，(d)表示蓝光处理组的总(-)离子流图。
具体实施方式
为了使本领域的普通技术人员能更好的理解本发明的技术方案，下面结合附图和实施例对本发明的技术方案做进一步的描述。
针对：(1)江西三叶青现有的栽培模式中存在问题
三叶青在浙江、江西、广西、福建、台湾地区、湖北、广东、四川、贵州、云南等省区都有分布；目前人工栽培产业化推广度较高的为福建省；江西多以山地丘陵为主，高山地区凉爽气候及较大的昼夜温差为三叶青的生长提供了良好的环境，江西的三叶青野生资源濒危且尚未完全实现人工产业化栽培，其产业化发展程度远低于浙江、福建等省份；分析其根本原因是没有适合江西地区高产优质栽培模式，现在江西三叶青栽培多采用粗放高山林下的仿野生栽培模式，这种栽培模式起源于浙江省，虽然江西省与浙江省均属中亚热带温暖湿润季风气候，浙江省受海洋气候的影响，冬季变温幅度小(3℃-9℃)，但是江西省冬季温度变幅更大温度更低(-3℃-8℃)，山区地区比平原低(以上海拔每升高100米，温度降低0.6℃)；由于冬季低温因素影响，林下仿野生栽培三叶青扦插苗越冬困难，越冬成活率低，是掣肘江西省三叶青仿野生栽培的最主要原因，2018年冬季，上饶红日农业技术有限公司在怀玉山地区投放的100万盆三叶青1年生扦插苗，越冬成活率不足 10％，直接经济损失达千万；第二是仿野生栽培管理过于粗放，难以实现精耕细作，水肥条件无法控制，产量极低。第三，广阔的开放空间，人为及野生动物出入频繁，盆栽破坏严重，也是该种栽培模式难以推广的原因之一；
(2)设施园艺栽培对于三叶青栽培适用性
设施栽培又称设施园艺，主要是利用一定的设施(如温室、大棚等)，构建适宜的生长环境，从而实现园艺作物栽培的可控化；国外亚热带如意大利、以色列、日本等国的集约型农业都以发展设施园艺为主要策略；江西气候特点夏季较长且炎热，平原地区最高气温可达40℃，是长江中游最热地区之一；然而江西多以山地丘陵为主，山区气候凉爽，适合发展高山园艺设施栽培。高山设施栽培可以克服山区冬季极端低温因素限制，充分利用高山地区较大的昼夜温差，光照充足等优势，生产高品质的园艺产品；对于三叶青高产优质推广栽培是可借鉴的模式；
对于江西推广三叶青设施栽培而言，首先，设施栽培可以有效抵抗冬季低温，两年的设施栽培实验证明三叶青1年生扦插苗越冬成活率达99％以上；其次，设施栽培可以显著延长三叶青的生育期，在玉山地区10月后气温在下降到10℃时，三叶青基本停止生长，而设施栽培可以显著提高室内温度5-10℃，即在块根膨大的关键时期9月下旬到10月中旬可显著延长其生长期20-30天，是产量增加的根本原因；再次，设施栽培是典型的精耕细作模式，水肥便于控制及管理，项目前期进行了两年测产实验，设施栽培比仿野生栽培产量提高了3-6倍；另外，江西地区无霜期长，特别是秋季日照充足，大棚及温室内不用任何加温措施，而大棚一般使用寿命10年以上，成本10-20元/m2，成本低适用广泛推广。
(3)三叶青栽培学的相关研究
1)三叶青栽培特性的研究
野外调查发现三叶青对生长环境要求高，喜冷凉气候，野生主要生长在海拔 200m以上的深山山谷、林间、灌木丛、悬崖峭壁等背阴面。三叶青耐旱，忌积水，对土壤要求不是十分严格，以在含腐殖质丰富或石灰质、土地肥沃、疏水性好的壤质土中生长最为适宜。
2)三叶青对于土壤肥力条件的要求
三叶青的生长过程中不宜过量使用氮肥，随着氮素水平的降低，茎叶中多糖的含量无明显变化，而总黄酮、总酚含量和抗氧化活性均呈稳定上升趋势；三叶青仿生态优质栽培表明，为了保证三叶青的块根质量，三叶青通常用腐熟的菜籽饼、兔粪(兔粪18750kg/hm2)、结合翻耕每亩施腐熟农家肥1500～2000kg或饼肥150～200kg加草木灰500～650kg作基肥，结合施用草木灰；生长过程中应该控制氮肥，所以三叶青在栽培过程中施用有机肥底肥即可满足其需求，不需要另外添加氮肥；钾对三叶青生物量及其茎叶化学成分、抗氧化活性的影响，研究表明三叶青栽培时宜不施或少施钾肥；P肥对于三叶青产量形成的影响还未见报道，本项目前期研究表明，在块根形成前期(怀玉山地区8月中旬)，适当的使用P肥，可以显著促进三叶青块根的形成；江西地区土壤以酸性红壤为主，土壤固磷能力强、土壤磷残留量高、磷肥利用率低，因而减少磷肥在土壤中的固定，提高磷肥利用效率，因此研究不同形态磷肥施用在酸性红壤上三叶青对磷肥利用效率有重要意义；
实施例1：参照附图1-7所示的一种三叶青高光效高山设施栽培工艺的研究方法：包括步骤：
S1.设置试验地点及栽培处理规格，具体为：
(1)选地：在怀玉山的上饶红日农业开发有限公司的三叶青怀玉山三叶青栽培基地(118.070452N，28.014668E)的大棚中进行，试验区属亚热带季风气候特征，平均海拔1000米，年平均气温12—16℃，一月份平均气温5.5℃，七月份平均气温28.8℃，气压917.9hPa；试验区为红壤土，种植前测定土壤中的氮磷钾状况；
(2)大棚环境：采用塑料大棚，棚内顶层设置数层遮阳网，四周设置遮阳网，每个遮阳网长3m，宽1.5m；
(3)采光：在每年9月份后进行30-45d的不同光质驯化栽培试验，每处理 9-12株，三个重复；每天18：00以后补充光照，以正常条件生长的三叶青为对照；
S2.确定三叶青生长的最佳补充光照条件，确定过程包括：
S201.最优补充光谱组合的筛选：
利用led红光(665-670nm)，蓝光(445-450nm)，采用红光：蓝光＝10：1，红光：蓝光＝5：1，红光：蓝光＝1：1，红光：蓝光＝1：5，四种光质配比；
S202.最优补充光强度筛选：
利用红光与蓝光的混合光照强度为5μmol/m2s、10μmol/m2s、20μmol/m2s、 50μmol/m2s为光强梯度进行测试，光强度用li-6400光合仪进行光强测定；
S203.最优补充光照时间的筛选：
采用1h、2h、3h、4h为补充光照时间梯度；
S204.补充光照最优条件的实验设计：
按照补充光照红蓝光比例(10：1、5：1、1：1及1：5)、补充光强度(5μmol/m2s、 10μmol/m2s、20μmol/m2s、50μmol/m2s)及补充光照时间(1h、2h、3h、4h)，三因素四水平的正交实验表，设计实验，每个处理9-12株，三重复，重复两年；对其产量、主要药效物质构成、含量及抗氧化性进行分析；
S205.评估紫外光干扰处理时间对于三叶青产量及药效物质影响：
处理光谱参照植物叶绿素及类胡萝卜素吸收光谱，采用波长为395nm-410nm 的紫外光，光强为4-10μmol/m2s的低光强进行处理，处理时间为10min，20min， 30min三个水平，对其产量、主要药效物质构成及含量进行分析，筛选出最优处理时间，三个生物学重复，每个重复5-9株，重复两年。
S3.确定三叶青生长的最佳土壤条件，确定过程包括：
S301.首先测量土壤中氮磷钾的含量，氮磷钾的测定方法为：先对土壤样品进行消煮，全氮用半微量开氏法、全磷用紫外分光光度法、全钾采用火焰光度法测定；
S302.前期采用腐熟的菜籽饼与草木灰为底肥，对其最佳用量进行筛选用 180kg/hm2、240kg/hm2及300kg/hm23个基肥梯度结合施用500kg/hm2的草木灰；筛选最佳磷肥形态，设计不同形态的P素对三叶青块根产量及品质的影响，施用量90kg/hm2，肥料形式采用过磷酸钙(SSP)、钙镁磷肥(CMP)、磷酸二铵(DAP)，采用二因素三水平的实验设计，考察基肥用量及磷肥形态对于三叶青产量及品质的影响；
S4.确定三叶青生长的最佳灌溉方法，确定过程包括：
S401.实验组采用水分亏缺灌溉，以常规灌溉为对照，设计三叶青不同发育时期进行土壤水分控制量如表1所示：
表1：不同生育阶段灌水处理(灌水上下限为田间持水量的百分数)
Figure BDA0003031354860000141
S402.对土壤微生物数量(稀释平板法)、酶活性如脲酶(苯酚钠–次氯酸钠比色法)、H2O2酶(KMnO4滴定法测定)和酸性磷酸酶活性(磷酸苯二钠比色法) 进行测定；
S403.每隔1-2天测定0-10cm，10-20cm，20-30cm，30-40cm，40-50cm土层处的土壤含水率(烘干法)、贮水量(W＝θ×γ×h×10)、灌水量(Q＝10×ρ×H×(θ 1-θ2))，灌溉水利用效率(IUE＝G/T)进行测定；
S404.收获后对各处理生物学性状、生物产量、块根产量、药效物质构成及含量进行检测，评估最优水分控制模式。
S5.确定三叶青的种植模式，确定过程包括：
S501.种植模式选用容器立体、容器平作、大田立体和大田平作(CK)，立体架高200cm，实验所用限根容器口径为30cm、高35cm，每个容器种植2株种苗，对其产量及品质进行评估；
S502.常规栽培(CK)，种植垄高35～40cm，垄宽30cm，左右各种一株，整个生育期管理措施相同；
S6.确定三叶青的轮作种植措施，确定过程包括：设计实验与番茄、辣椒、瓜类、叶菜类等设施进行轮作，对其生物学性状、生物产量、块根产量、药效物质构成及含量进行检查，评估最优轮作模式；
S7.评估不同栽培处理中三叶青产量及品质，评估过程包括：
S701.测定地上部分生长指标
(1)植株生长势评估：
叶片生长势评估测定三叶青的株高，分支数量、分支数、分枝长度、叶长，叶宽；使用电子数显卡尺在距离地面0.02m处测定分支粗；于9月在各处理中随机选取长势完好的三叶青植株各9株，测定其根系的根长，块根直径，块根数量、根系重量；并放置在烘箱中保持45℃烘干至恒重，测定三叶青的地上和地下干物质量；
(2)叶绿素含量的测定：用SPAD-502手持式叶绿素仪测定叶片叶绿素含量，随机选取30片叶，每片叶片测3个数据，然后取平均值；
S702.光合指标的测定
采用Li-6400光合测定仪对不同处理环境条件下，三叶青光饱和曲线进行测定，根据光饱和点，评估不同光质处理对于三叶青光和能力的影响。测定各个处理的净光合速率Pn，蒸腾速率Tr，气孔导度Gs，叶肉细胞间二氧化碳浓度Ci；每个处理重复三次，测定时间为晴天上午9:00-11:00或下午2:00到5:00，每个处理6个以上重复；
S703.不同光质处理组产量的测定
对不同光质组合处理进行总产量、叶片产量、地上部分产量、总根重量、块根重量、纤维根重量进行测量，评估不同光组合处理对于三叶青产量的影响；
S704.地上部分、块根及纤维根黄酮类化合物的产量、单体成分分析及抗氧化分析
三叶青地上部位及块根中主要含黄酮类及其单体构成分析；拟采用超声提取法进行黄酮类化合物的提取，采用紫外定量分析方法和液质联用色谱仪 (HPLC-MS)法，结合外标法对芦丁、异槲皮苷、异荭草苷、荭草苷、紫云英苷、山奈酚、槲皮素等进行定性及定量分析；平行样品三个重复，生物学重复三次以上；然后测定各处理块根黄酮提取物对于清除1,1－二苯基－2－三硝基苯肼自由基(DPPH)、3-氧代-2-苯基-4，4，5，5-四甲基咪唑啉-1-氧(PTIO)及 3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸的能力，研究其抗氧化作用；
S705.数据分析
基于以上处理及分析，研究三叶青块根产量、黄酮类化合物单体及含量的变化规律；并利用canoco5.0、SPSS20.0软件分析三叶青产量、黄酮类化合物单体及含量与设施栽培因子的相关性，探讨影响三叶青药材质量的主要设施环境因子，筛选最佳的设施栽培光环境条件及其他配套栽培条件。
实验结果及分析：
(1)不同光质处理驯化栽培三叶青块根产量分析
以三叶青1年苗龄的怀玉2号扦插苗为实验试材，在玉山三叶青繁育基地(118.070452N,28.014668E)的大棚中，进行2年不同光质驯化栽培试验。以LED 为光源，光谱采用叶绿素吸收最大光谱，蓝光为445-450(nm)、红光为660-670 (nm)及白光；处理面积为2.5m2，平均8-10株；补充光照强度为20-30μmolm-2s-1 (采点测量，大约采十个点的光照强度计算平均值)；每天18：00以后补充光照 3小时，处理时间为2018年9月15日至10月21日及2019年9月13日至10月27日，以正常条件生长的三叶青为对照，统计形成块根的产量，不同光质驯化栽培三叶青产量如图3所示；
通过图3可以看出：蓝光处理组块根产量最高53.00g/株，显著高于红光 (42.67g/株)、白光处理(21.67g/株)及对照(32.67g/株)，其中白光最低。
(2)LED不同光质处理的对三叶青黄酮提取物的含量测定
如图4所示：经过1个月的不同光质补充光照栽培，纤维根中蓝光 (43.71mg/gDW)与CK(41.94mg/gDW)黄酮类化合物含量最高，且与其他处理呈显著差异；在块根中蓝光处理的黄酮含量最高(29.48mg/g DW)，而红光次之为27.94mg/g DW，显著性分析发现并无显著差异；而对照(20.1mg/g DW)及白光(15.94mg/g DW)较低，且白光最低；叶片中黄酮CK(48.17)含量最高且显著高于其他三个处理，其他三个处理差异并不显著；综上所述，通过LED 蓝光驯化栽培，不仅可以获得最高的块根生物产量及最高的总黄酮含量，因此可获得单株总黄酮产量最高。
(3)LED不同光质处理的对三叶青黄酮提取物的抗氧化性测试
为了评估不同光质条件下黄酮类化合物的抗氧化性，我们对不同光质处理叶片、纤维根及块根中黄酮提取物进行体外抗氧化测试(PTIO、ABTS及DPPH)：
①PTIO带有中性的氧自由基，可用于检测抗氧化物质对于中性氧自由基清除速率，IC50值是表示活性氧清除率达50％的时候抗氧化剂的用量(mg/ml)，IC50 越小表示清除氧自由基能力越强；
从图5中可以看出，从器官水平来看，块根中黄酮类化合物清除活性氧自由基能力最强，有最强的抗氧化效应；其次是纤维根但其清除能力与块根相差近1 倍左右；叶片中黄酮类化合物抗氧化能力最弱，比块根低十倍多；
从图5(a)可以看出在叶片中，蓝光(40.62327mg/ml)与CK(38.3125) 的IC50值最低，可见其黄酮类化合物清除活性氧速率较高；从图5(b)纤维根中蓝光(12.79)和红光(12.73)处理的IC50值最低，表示蓝光和CK处理中黄酮清除氧自由基的能力较其他处理强，但两者之间差别不显著；从图5(c)可以看出蓝光处理中的IC50值最低，表示块根中黄酮提取物的活性氧清除率最高，与CK相比高于17％，与白光处理相比16.04％，与红光相比高于58.81％，差异显著；
②ABTS+带有阳离子的氮自由基，可用于检测抗氧化物质对于阳性氮自由基清除速率，IC50值是表示活性氧清除率达50％的时候抗氧化剂的用量(mg/ml)， IC50越小表示清除氧自由基能力越强；
从图6中可以看出，不同器官黄酮提取物清除阳性氮自由基的能力差别不大，但块根中的黄酮提取物清除阳性氮自由基的能力最强，叶片最差；而块根中蓝光处理组清除阳性氮自由基的能力最强，比对照组提高了38.75％，是白光的5.77 倍，比红光处理提高了53.59％；纤维根中各处理间黄酮提取物清除阳性氮自由基的能力差别不大；叶片中对照黄酮提取物清除阳性氮自由基的能力最差，几乎是其他处理的两倍，其他处理差异显著；
③如图7所示，DPPH带有中性的氮自由基，表示抗氧化物质对于氮自由基清除速率，IC50值是表示活性氮清除率达50％的时候抗氧化剂的用量，IC50越小表示清除氮自由基能力越强；纤维根差(低于2-3倍)，块根及纤维根中并无显著差异；
不同光质处理在器官内也有差异，在叶片中受到白光、蓝光及红光驯化的叶片中黄酮提取物的活性氮清除率高于对照组，且不同处理间差别不大；而在纤维根中黄酮提取物的氮自由基清除率最高的是CK(高6-9倍)，接受光驯化处理的 IC50值差别不显著；而块根中的黄酮提取物对氮自由基清除率无差异，DPPH蓝光驯化对三叶青黄酮清除中性氮自由基影响不大；
从不同光质补充光照条件下不同器官中的黄酮提取物抗氧化测试表明，从器官水平分析，块根清除能力最强，叶片最弱；虽然叶片中黄酮提取物含量显著高于其他器官，但是其抗氧化能力无论是在PTIO测试中还是ABTS及DPPH测试中，抗氧化能力最弱；再次，在氮自由基测试中，光质驯化对中性氮自由基(DPPH) 是不敏感的，而虽然蓝光处理块根黄酮提取物在抗阳性氮自由基(ABTS+)表现最优，但是其叶片表现不敏感(与其他光处理无显著差异)，因此我们认为蓝光处理中黄酮提取物的生物合成提高与氮自由基关联性较小；但是对于中性氧自由基清除实验(PTIO)表明，无论是在叶片、纤维根及块根中，都表现出最优的抗氧化能力，因此我们认为LED蓝光诱导叶片活性氧的产生对三叶青黄酮生物合成及抗氧化生理的稳定性存在必然关系；
综上所述，三叶青高山高光效栽培模式不仅可以提高三叶青块根的产量而且可以提高三叶青块根中主要药效物质的含量，从而提高块根品质。实施例2：
我们测量了不同光质驯化条件下三叶青的光饱和曲线，采用Li-6400红蓝光源叶室，光强(PAR)设定为0、20、50、100、200、400、600、800、1000、 1200、1400、1600(μmolm-2s-1)，在晴朗的天气上午8：00-11：300，下午2：00-5： 00，CO2浓度为380μmol/mol，4-5个生物学重复，结果如图8所示；
通过图8的结果我们发现：怀玉山三叶青在正常生长条件下，光饱和点在 1000μmol/ms，而经过蓝光、红光及白光长期补光驯化后，其光饱和点显著减低，大约在500μmol/ms，而经过测量，光质驯化所用的光强在大约10-15μmol/ms，所以我们认为蓝光驯化对怀玉山三叶青的净光合速率影响并不大，而是作为一种信号分子，促进了光合产物的有效积累及黄酮化合物含量的提高。
实施例3：通过上述两个实施例，我们可以得到一种可以有效保证产量的三叶青高光效高山设施栽培工艺，具体为：
步骤一：选地，选择海拔在600-1000m，1月平均气温在5.5℃，7月平均气温在28.8℃的无遮挡、采光好、非低洼积水地、以自然通风为主的连栋温室作为三叶青的栽培环境；其中：所述温室跨度为10m，开间在4m，檐高3.5m，三叶青的育龄周期为3年；
步骤二：配置底肥，以菜籽饼240kg/hm2、施用500kg/hm2的草木灰配合 90kg/hm2的钙镁磷肥(CMP)作为底肥；
步骤三：栽培，选用架高200cm，容器直径为35cm，高30cm的栽培容器进行定植栽培，且每个容器内栽培2株三叶青幼苗，与叶菜类轮作；
步骤四：光照条件，在三叶青块根形成期，栽培地最大昼夜温差10℃以上，补光时间为45天，其中：自然光条件为：光强度500μmol/m2s-800μmol/m2s，光照时间为自然昼夜周期；紫外光条件为：395-410nmLed光源，光照时间为20min 间隔，光照强度4-10μmol/m2s，补光20min重复5次，于日下午3点后进行；补光条件为：在每天18:00后进行，补充光照LED红蓝光质配比为1:1，Led红光波长为665-670nm，蓝光为445-450nm，补充光照强度20-30μmol/m2s，补充光照时间为3h；
步骤五：灌溉条件，调亏灌溉的条件为，地上部分生长期(6月-9月)，灌溉量为50-60％为宜，块根形成期(9月中旬-11月中旬)土壤含水量为30％-40％。
通过本工艺对三叶青进行栽培，设施栽培条件下三叶青块根的产量是仿野生栽培的3-6倍(图9)，两年的测产实验证明，以2年生的三叶青扦插苗为试材，设施栽培是仿野生栽培3倍，而连续两年的设施栽培其产量是仿野生栽培的6倍；另外，江西地区无霜期长，特别是秋季日照充足，大棚及温室内不用任何加温措施，而大棚一般使用寿命10年以上，成本10-20元/m2，成本低适用广泛推广。
通过高光效栽培模式下三叶青块根中黄酮类化合物靶向代谢组学分析，从图10的高光效栽培模式下三叶青块根内黄酮类化合物与对CK(普通温室栽培)的总离子流图可以看出，三叶青靶向代谢组一共检测到187种黄酮单体，在高光效栽培模式下，72种黄酮差异表达，占总检测代谢物的38.5％；通过图11差异代谢物KEGG分类表明，黄酮、二氢黄酮、二氢黄酮醇及黄酮醇显著上调表达与 CK呈显著差异。其中野黄芩素、香橙素-7-O-葡萄糖苷、芹菜素-4'-O-鼠李糖苷、芹菜素-5-O-葡萄糖苷、异野漆树苷、烟花苷、山奈酚-3-O-鼠李糖基(1→2)葡萄糖苷、山奈酚-3,7-二-O-葡萄糖苷、金圣草黄素-8-C-阿拉伯糖苷-7-O-槐糖苷、山茶苷A、山奈酚-6,8-二-C-葡萄糖苷-7-O-葡萄糖苷、高圣草酚、圣草酚-8-C-葡萄糖苷、异鼠李素-3-O-没食子酸酯、槲皮素-3-O-(2”-O-阿拉伯糖基)芸香糖苷、异鼠李素-3-O-新橙皮糖苷、山奈酚-3-O-芸香糖苷-7-O-葡萄糖苷、山奈酚-3-O-葡萄糖苷-7-O-鼠李糖苷、山奈酚-3-O-洋槐糖苷、没食子酰异鼠李素等56种黄酮类化合物显著上调。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims (10)

1.一种三叶青高光效高山设施栽培工艺，其特征在于：所述工艺包括：
步骤一：选地，选择海拔在600-1000m，1月平均气温在5.5℃，7月平均气温在28.8℃的无遮挡、采光好、非低洼积水地、以自然通风为主的连栋温室进行三叶青的栽培；
步骤二：配置底肥，以菜籽饼240kg/hm2、施用500kg/hm2的草木灰配合90kg/hm2的钙镁磷肥作为底肥；
步骤三：栽培，选用架高200cm，容器直径为35cm，高30cm的栽培容器进行定植栽培，且每个容器内栽培2株三叶青幼苗，与叶菜类轮作；
步骤四：光照条件，在三叶青块根形成期，栽培地最大昼夜温差10℃以上，补光时间为45天；
步骤五：灌溉条件，调亏灌溉的条件为，地上部分生长期土壤含水量为50-60％，块根形成期土壤含水量为30％-40％。
2.根据权利要求1所述的一种三叶青高光效高山设施栽培工艺，其特征在于：步骤四所述的补光过程按照以下过程进行补光：
自然光条件为：光强度为500μmol/m2s-800μmol/m2s，光照时间为自然昼夜周期；
紫外光条件为：395-410nm的Led光源，光照强度为4-10μmol/m2s，补光20min，间隔20min，重复5次，于日下午3点后进行；
补光条件为：在每天18:00后进行，补充光照LED红蓝光质配比为1:1，Led红光波长为665-670nm，蓝光为445-450nm，补充光照强度20-30μmol/m2s，补充光照时间为3h。
3.一种如权利要求1所述的三叶青高光效高山设施栽培工艺的研究方法，其特征在于：包括步骤
S1.设置试验地点及栽培处理规格；
S2.确定三叶青生长的最佳补充光照条件；
S3.确定三叶青生长的最佳土壤条件；
S4.确定三叶青生长的最佳灌溉方法；
S5.确定三叶青的种植模式；
S6.确定三叶青的轮作种植措施；
S7.评估不同栽培处理中三叶青产量及品质。
4.根据权利要求3所述的一种三叶青高光效高山设施栽培工艺的研究方法，其特征在于：步骤S1所述的拟设置试验地点及栽培处理规格包括：
(1)选取平均海拔1000米，年平均气温12—16℃，一月份平均气温5.5℃，七月份平均气温28.8℃，气压917.9hPa，土壤为红壤的大棚作为培养基地；
(2)大棚环境：采用塑料大棚，棚内顶层和四周设置遮阳网；
(3)采光：在每年9月份后进行30-45d的不同光质驯化栽培试验，每处理9-12株，三个重复；每天18：00以后补充光照，以正常条件生长的三叶青为对照。
5.根据权利要求3所述的一种三叶青高光效高山设施栽培工艺的研究方法，其特征在于：步骤S2所述的三叶青生长的最佳补充光照条件的确定过程包括：
S201.最优补充光谱组合的筛选：
利用led红光蓝光光源，采用红光：蓝光＝10：1，红光：蓝光＝5：1，红光：蓝光＝1：1，红光：蓝光＝1：5，四种光质配比；
S202.最优补充光强度筛选：
利用红光与蓝光的混合光照强度为5μmol/m2s、10μmol/m2s、20μmol/m2s、50μmol/m2s为光强梯度进行测试；
S203.最优补充光照时间的筛选：
采用1h、2h、3h、4h为补充光照时间梯度；
S204.补充光照最优条件的实验设计：
按照补充光照红蓝光比例、补充光强度及补充光照时间，根据三因素四水平的正交实验表，设计实验，每个处理9-12株，生物学重复3次，重复两年；
S205.评估紫外光干扰处理对于三叶青产量及药效物质影响：
处理光谱参照植物叶绿素及类胡萝卜素吸收光谱，采用波长为395nm-410nm的紫外光，光强为4-10μmol/m2s的低光强进行处理，处理时间为10min，20min，30min三个水平，对产量、药效物质构成及含量进行分析，重复两年。
6.根据权利要求3所述的一种三叶青高光效高山设施栽培工艺的研究方法，其特征在于：步骤S3所述的三叶青生长的最佳土壤条件的确定过程包括：
S301.首先测量土壤中氮磷钾的含量；
S302.前期采用腐熟的菜籽饼与草木灰为底肥，对其最佳用量进行筛选，采用180kg/hm2、240kg/hm2及300kg/hm23个基肥梯度结合施用500kg/hm2的草木灰；设计不同形态的P素对三叶青块根产量及品质的影响，施用量90kg/hm2，肥料形式采用过磷酸钙、钙镁磷肥、磷酸二铵，氮肥和磷肥，采用二因素三水平的正交实验设计。
7.根据权利要求3所述的一种三叶青高光效高山设施栽培工艺的研究方法，其特征在于：步骤S4所述的三叶青生长的最佳灌溉方法的确定过程包括：
S401.实验组采用水分亏缺灌溉，以常规灌溉为对照，设计在三叶青不同发育时期进行土壤水分控制量；
S402.对土壤微生物数量、酶活性如脲酶、H2O2酶和酸性磷酸酶活性进行测定；
S403.每隔1-2天测定0-10cm，10-20cm，20-30cm，30-40cm，40-50cm土层处的土壤含水率、贮水量和灌水量，对灌溉水利用效率进行测定；
S404.收获后对各个处理的生物学性状、生物产量、块根产量、药效物质构成及含量进行检测，评估最优水分控制模式。
8.根据权利要求3所述的一种三叶青高光效高山设施栽培工艺的研究方法，其特征在于：步骤S5所述的三叶青的种植模式确定过程包括：
S501.种植模式选用容器立体、容器平作、大田立体和大田平作(CK)，立体架高200cm，限根容器口径为35cm、高30cm，每个容器种植2株种苗，评估三叶青的产量及品质；
S502.大田平作(CK)，种植垄高35～40cm，垄宽30cm，左右各种一株，整个生育期管理措施相同。
9.根据权利要求3所述的一种三叶青高光效高山设施栽培工艺的研究方法，其特征在于：步骤S6所述的三叶青的轮作种植措施的确定过程包括：设计实验与番茄、辣椒、瓜类、叶菜类等设施进行轮作，对其生物学性状、生物产量、块根产量、药效物质构成及含量进行检查，评估最优轮作模式。
10.根据权利要求3所述的一种三叶青高光效高山设施栽培工艺的研究方法，其特征在于：步骤S7所述的不同栽培处理中三叶青产量及品质的评估过程包括：
S701.测定地上部分生长指标
(1)植株生长势评估：
叶片生长势评估测定各处理三叶青的株高，分支数量、分支数、分枝长度、叶长，叶宽；在距离地面0.02m处测定分支粗；于9月在各处理中随机选取长势完好的三叶青植株各9株以上，测定其根系的根长，块根直径，块根数量、根系重量；并放置在烘箱中保持45℃烘干至恒重，测定三叶青的地上和地下干物质量；
(2)叶绿素含量的测定：
测定叶片叶绿素含量，随机选取30片叶，每片叶片测3个数据，取平均值；；
S702.光合指标的测定
对不同处理环境条件下，三叶青光饱和曲线进行测定，根据光饱和点，评估不同光质处理对于三叶青光和能力的影响；测定各个处理的净光合速率Pn，蒸腾速率Tr，气孔导度Gs，叶肉细胞间二氧化碳浓度Ci；每个处理重复三次，测定时间为晴天上午9:00-11:00或下午2:00到5:00，每个处理6个以上重复；
S703.不同光质处理组产量的测定
对不同光质组合处理进行总产量、叶片产量、地上部分产量、总根重量、块根重量、纤维根重量进行测量，评估不同光质组合处理对三叶青产量的影响；
S704.地上部分、块根及纤维根中黄酮类化合物的产量、单体成分分析及抗氧化分析
提取三叶青中的黄酮类化合物，对芦丁、异槲皮苷、异荭草苷、荭草苷、紫云英苷、山奈酚、槲皮素等黄酮类化合物单体进行靶向定性及定量分析，研究其抗氧化作用；
S705.数据分析
基于以上处理及分析，研究三叶青块根产量、黄酮类化合物单体构成及含量的变化规律；并分析三叶青产量、黄酮类化合物单体构成及含量与设施栽培因子的相关性，筛选最佳的设施栽培光环境条件及配套栽培条件。
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