CN115177746A - 用于治疗脊髓损伤的非病毒基因载体转染干细胞复合物 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了用于治疗脊髓损伤的非病毒基因载体转染干细胞复合物，所述的非病毒基因载体为氧化响应电荷反转型阳离子基因载体，通过搭载特异性表达神经营养因子的基因，对干细胞进行基因修饰。对于转染后的干细胞，可以通过静脉注射定植于脊髓损伤区域，高效表达神经营养因子，同时消耗活性氧，改善微环境，两者协同促进神经功能恢复。本发明克服了非病毒载体难以高效转染干细胞的难题，为脊髓损伤后的神经再生修复提供新思路。

Description

用于治疗脊髓损伤的非病毒基因载体转染干细胞复合物
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，涉及一种用于治疗脊髓损伤的纳米复合物，具体涉及用于治疗脊髓损伤的非病毒基因载体干细胞转染系统。
背景技术
脊髓损伤(Spinal Cord Injury,SCI)是由创伤、炎症、感染等多种原因导致的一种严重的中枢神经系统损伤性疾病。脊髓损伤治疗难、预后差，现阶段在临床上常使用手术减压和甲强龙冲击疗法抑制与减轻继发性损伤，但都无法对受损的神经功能进行修复，治疗效果不理想。因此，开发有效的脊髓损伤治疗方法，仍是极具挑战和亟待解决的全球性医疗难题。对脊髓损伤后轴突再生和功能重建是决定脊髓损伤治疗成败的关键，也是骨科领域长期致力解决的难题。
脊髓损伤后功能重建的难点在于：神经细胞死亡后的低可生性、神经营养因子合成及分泌的调控、轴突再生的引导及抑制信号的表达、细胞间的信号传导以及炎症反应的调控等。如何有效的解决这些问题是重建脊髓功能的重点。干细胞具有自身多分化潜能，能迁移、定植于损伤部位，在脊髓损伤治疗中能起到替代、营养、神经保护、促进神经回路重建等作用，成为脊髓损伤移植治疗的理想“种子细胞”。脊髓损伤后通过静脉注射使干细胞经血液循环到达脊髓损伤部位进而发挥治疗作用，是一种更为便捷的方法，也是临床治疗中最希望采用的给药途径。然而干细胞本身分泌神经营养因子不足，对神经再生的促进作用十分有限，同时极易受脊髓损伤区域富含活性氧(ROS)微环境影响。脊髓损伤后神经营养因子的缺乏也是导致神经再生障碍和神经功能恢复不良的重要原因之一。因此促进神经的再生，需要额外补充神经营养因子。
通过基因治疗，可以将神经营养因子基因导入体内，在局部产生神经营养因子，这种方法具有局部浓度高、分泌时间与空间可调控等优点。然而病毒载体的免疫原性、致癌性、基因容量小、价格昂贵等问题，限制了其作为基因药物在临床治疗中的应用。非病毒载体具有良好的安全性，基因携载量大，易于人工合成并进行各种化学修饰以及大规模生产，但较低的基因转染效率一直是困扰其应用的瓶颈，兼具高转染效率及高安全性的非病毒基因载体的缺乏极大限制了干细胞移植的应用。设计出能够响应细胞内微环境从而能够快速释放出DNA等核酸的基因载体，是提高基因转染效率的关键。
综上所述，单独的细胞移植治疗或基因治疗脊髓损伤都有其局限性。一方面，细胞移植本身极易受到各种有害因素的影响，脊髓损伤区域富含ROS的疾病微环境，影响干细胞的增殖和迁移，限制了干细胞治疗的功效，如何提高干细胞在脊髓损伤区域的存活率是细胞移植的短板。另一方面，基因治疗不能替代脊髓损伤过程中损伤或死亡的细胞，而且高ROS的微环境往往使得目的基因表达低效，不能达到预期目标。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提出了用于治疗脊髓损伤的非病毒基因载体转染干细胞复合物，采用高转染效率的非病毒基因载体，搭载特异性表达神经营养因子的基因，对干细胞进行基因修饰，从而令干细胞在到达脊髓损伤区域后，能够高效表达神经营养因子，促进神经元分化、轴突再生；同时通过载体消耗ROS，改善微环境，提高干细胞存活率，促进其分化替代死亡的组织细胞，两者协同促进神经功能恢复。
用于治疗脊髓损伤的非病毒基因载体转染干细胞复合物系统，包括非病毒基因载体、基因和干细胞。
所述非病毒基因载体为氧化响应电荷反转型阳离子基因载体，基因为特异性表达神经营养因子的质粒。氧化响应电荷反转型阳离子基因载体通过静电相互作用，与带负电的特异性表达神经营养因子的质粒自组装形成稳定的纳米复合物，转染干细胞后，对干细胞进行基因修饰，形成用于脊髓损伤的复合物。
作为优选，所述氧化响应电荷反转型阳离子基因载体为含有硼酸或硼酯取代苄基季铵盐的阳离子聚合物，可以被细胞内的ROS氧化触发电荷反转。具体是B-PDEAEA，B-PDEAEA被ROS氧化时会发生去酚基苄醇反应，季铵盐转变为三级胺，随后通过自催化酯键水解生成带负电的聚丙烯酸，从而与搭载的带负电的DNA相互排斥，快速解离，释放出DNA进行有效转染。
作为优选，所述神经营养因子为睫状神经营养因子(CNTF)、脑源性神经营养因子(BDNF)、胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)、神经生长因子(NGF)、神经营养因子3(NT-3)或成纤维细胞生长因子(FGF)。其中，睫状神经营养因子具有增强髓鞘蛋白合成和分泌的作用，使脊髓白质中传导束髓鞘再生，以维持神经信号传导，并促进前体细胞分化和维持少突胶质细胞存活，可以用于维持中枢和周围运动神经元的生物活性，和诱导轴突与失神经终板区域的突触重建，促进轴突再生。
作为优选，所述氧化响应电荷反转型阳离子基因载体与特异性表达神经营养因子的质粒的氮磷比为5～30。
作为优选，所述干细胞为间充质干细胞(MSCs)、神经干细胞(NSCs)、多能胚胎干细胞(ESCs)、少突胶质组细胞、干细胞分化细胞、诱导性多能干细胞(iPSCs)、嗅鞘细胞(OECs)或Schwann细胞(SCs)。其中，间充质干细胞中的骨髓间充质干细胞(BMSCs)从骨髓中获得的一种可以自我更新的多能干细胞，具有多向分化潜能、可塑性强、迁移性好，来源丰富、扩增迅速、体内移植反应弱，无免疫原性、无伦理道德问题等优势，可分泌多种神经营养因子，抑制损伤部位炎症反应，有助于损伤脊髓的恢复，是脊髓损伤移植治疗的理想“种子细胞”。
用于治疗脊髓损伤的非病毒基因载体转染干细胞复合物的制备方法，包括以下步骤：
步骤1、使用pH为7.4的HEPES缓冲溶液溶解氧化响应电荷反转型阳离子基因载体。
步骤2、使用pH为7.4的HEPES缓冲溶液配置质粒DNA溶液。
步骤3、按照氧化响应电荷反转型阳离子基因载体与特异性表达神经营养因子的质粒的氮磷比为5～30，对步骤2得到的溶液浓度进行稀释。
步骤4、将步骤3稀释后的溶液与步骤1得到的溶液按照1:1的体积比混合，涡旋振荡10s后在室温下静置30min，得到纳米复合物溶液。
步骤5、向培养皿中的干细胞加入步骤4得到的纳米复合物溶液，无血清培养4小时后，得到用于治疗脊髓损伤的非病毒基因载体转染干细胞复合物。
本发明具有以下有益效果：
利用氧化响应的电荷反转型阳离子聚合物作为输送载体，克服了干细胞难以被高效转染的瓶颈，同时能够改善脊髓损伤区域高ROS的微环境，下调ROS水平，缓解脊髓损伤区域氧化应激状态，为干细胞的存活，提供有利的环境，促进神经元分化、轴突再生，提高其脊髓损伤修复效果。
附图说明
图1为实施例1中制备的不同N/P比纳米复合物粒径分布和Zeta电位图；
图2为实施例1中N/P＝10的纳米复合物透射电镜图；
图3为实施例1中不同N/P比纳米复合物的凝胶阻滞实验电泳图；
图4为实施例2中纳米复合物在BMSCs的细胞转染效果；
图5为实施例3中纳米复合物对BMSCs的细胞毒性；
图6为实施例4中纳米复合物在氧化条件下的细胞转染效果；
图7为实施例5中氧化条件下纳米复合物处理后BMSCs胞内ROS水平的变化；
图8为实施例6中氧化条件下纳米复合物处理对BMSCs细胞存活率的影响；
图9为实施例7中经荧光探针标记的BMSCs在脊髓损伤大鼠体内的分布；
图10为实施例8中不同治疗组对脊髓损伤大鼠的BBB行为学评分、脚步印迹分析和病理学分析结果。
具体实施方式
以下结合附图对本发明作进一步的解释说明；
实施例1
本实施例选择B-PDEAEA作为氧化响应电荷反转型阳离子基因载体，制作一系列氧化响应电荷反转型阳离子基因载体与特异性表达神经营养因子的质粒的氮磷比为5～30的氧化响应的电荷反转型纳米复合物。具体步骤为：
步骤1、将B-PDEAEA溶于10mM、pH为7.4的HEPES缓冲溶液。
步骤2、使用10mM、pH为7.4的HEPES缓冲溶液将质粒DNA稀释至浓度为40μg/mL的溶液。
步骤3、按照5～30的氧化响应电荷反转型阳离子基因载体与特异性表达神经营养因子的质粒的氮磷比对步骤1得到的溶液进行稀释。
步骤4、将步骤3稀释后的溶液与步骤2得到的溶液按照1:1的体积比混合，涡旋振荡10s后在室温下静置30min，得到一系列氮磷比为5～30的B-PDEAEA/DNA纳米复合物溶液。
利用动态光散射仪(DLS)对得到的B-PDEAEA/DNA纳米复合物的粒径和电势进行表征，实验结果如图1所示，聚合物与DNA形成均一稳定的纳米复合物，粒径可以被压缩到40nm左右，Zeta电位分布在20～25mV之间。通过透射电镜的观察如图2所示，N/P＝10的B-PDEAEA/DNA纳米复合物呈现出类球形的纳米颗粒，形态规则、均匀，粒径在40nm左右，跟DLS所测的结果基本一致。凝胶阻滞电泳结果如图3所示，可以看出B-PDEAEA可以很好地压缩DNA，阻滞DNA的迁移，从而能有效地在基因转染过程中保护DNA不受细胞内各种酶的降解。
实施例2
本实施例使用实施例1制备得到的一系列B-PDEAEA/DNA纳米复合物，对间充质干细胞中的骨髓间充质干细胞(BMSCs)进行转染，证明了本申请提出的纳米复合物相较于常见的非病毒载体PEI，可以显著提高对干细胞的转染效率，并且提升目的基因的表达量。具体实验如下：
1、转染实验
(1)荧光素酶基因转染
将BMSCs接种于96孔板中，细胞密度为15000个/孔，每孔含有0.2mL的培养基，在37℃下培养24h。然后使用0.2mL新鲜无血清培养基替换原本孔中的培养基，并加入25μL含0.5μg luciferase pGL4.13质粒DNA的B-PDEAEA/DNA纳米复合物溶液，培养4h后弃尽板中含有纳米复合物的培养基，替换为新鲜的培养基。继续培养48h后弃去培养基，每孔加入50μL细胞裂解液，离心取上清液，加入荧光素酶底物，用化学发光检测仪测定化学发光强度。用BCA蛋白检测试剂盒测定蛋白浓度。化学发光强度利用蛋白浓度归一化，单位是每毫克蛋白发光强度RLU/mg protein。如图4a所示，荧光素酶基因的转染结果相比于常用的非病毒载体PEI，B-PDEAEA/DNA对BMSCs的转染效率提高了70倍。
(2)绿色荧光蛋白基因转染
将BMSCs按照300000个/孔的细胞浓度培养于半径为15mm的玻璃底培养皿中(NESTbiotechnology)，每孔加入1.5mL培养基，在37℃下培养24h。之后将每孔中的培养基替换为1.5mL的新鲜无血清培养基，并加入300μL含6μg pEGFP质粒DNA的B-PDEAEA/DNA纳米复合物溶液，培养4h后弃尽板中含有纳米复合物的培养基，替换为新鲜的培养基继续培养48h。然后置于激光共聚焦显微镜下进行观察。绿色荧光蛋白的激发波长为488nm，发射波长为500-550nm，所有照片均在10倍物镜下拍摄，始终使用同一光强，观察结果如图4b所示，PEI/pEGFP纳米复合物只转染了少数细胞，大部分细胞无绿色荧光蛋白表达，而本申请提出的B-PDEAEA/pEGFP纳米复合物转染的细胞更均一，大部分细胞都有不同程度的绿色荧光蛋白表达。
2、目的基因表达
(1)将BMSCs细胞按照300000/孔的细胞浓度接种于6孔板中，每孔含有2mL培养基，在37℃下培养24h后，将每孔中的培养基替换为2mL的无血清培养基，并加入200μL pCNTF质粒浓度为2μg/mL的纳米复合物，培养4h后弃尽板中含有纳米复合物的培养基，替换为新鲜培养基继续培养至48h。弃去各组的细胞培养上清液，并用预冷的PBS进行洗涤，然后加入NP40裂解液冰上裂解细胞，将裂解液转移至冰上并离心，上清液中加入5×SDS-loadingbuffer进行变性，置于100℃金属浴上煮沸5分钟。采用SDS-PAGE电泳及免疫印迹技术分析各组CNTF的表达情况，结果如图4c所示，B-PDEAEA/pCNTF能够显著增加BMSCs内CNTF的表达。
(2)按照同样的转染方法，转染48h后用RNA提取试剂盒提取RNA，进行逆转录后利用qPCR进行检测。检测结果如图4d所示，相较于PEI/pCNTF组和BMSCs组，B-PDEAEA/pCNTF组在48h的mRNA表达水平分别提高了4倍和41倍。
(3)将BMSCs细胞按照100000个/孔的细胞密度接种于24孔板中，每孔含有0.8mL培养基，在37℃下培养24h后，将每孔中的培养基替换为0.8mL的新鲜无血清培养基，并加入200μL pCNTF质粒DNA 浓度为2μg/mL的纳米复合物溶液，培养4h后弃尽板中含有纳米复合物的培养基，替换为新鲜的培养基，分别培养24h、48h后，离心收集上清液，替换新鲜的培养基，用ELISA试剂盒检测收集的上清培养基中CNTF的含量，检测结果如图4e所示，与PEI/pCNTF组和BMSCs组相比，B-PDEAEA/pCNTF组在24h和48h的CNTF表达量都显著增加。
实施例3
本实施例通过对照实验，分析纳米复合物溶液不同氮磷比下的的细胞存活率，对其细胞毒性进行研究。具体步骤如下：
将BMSCs按照4000个/孔的细胞密度接种于96孔板中，每孔含有100μL培养基，在37℃下培养24h后向每个孔中加入100μL含有0.5μg DNA的不同氮磷比的纳米复合物溶液，空白组加入100μL的培养基溶液，继续培养48h后，向每孔加入10μL CCK-8溶液，继续培养2h后，用酶标仪测定450nm处的吸光度，计算各组细胞存活率。细胞存活率以实验组的吸光度值去除以空白组的吸光度值来表示。计算结果如图5所示，纳米复合物具有较高的细胞存活率，在BMSCs上无细胞毒性。
实施例4
本实施例研究B-PDEAEA/DNA纳米复合物溶液在不同氧化条件下的细胞转染情况，具体步骤如下：
分别在培养基中加入10μM、50μM、100μM、200μM的过氧化氢配制成一系列高氧化环境，模拟脊髓损伤氧化，按实施例2所述的荧光素酶基因转染方法，将BMSCs按照15000个/孔的细胞密度接种于96孔板中，每孔含有0.2mL培养基，在37℃下培养24h后，将每孔中培养基替换为0.2mL新鲜无血清培养基，并加入一系列氮磷比不同的纳米复合物溶液20μL，其中包括0.1μg luciferase pGL4.13质粒DNA，培养4h后弃尽板中含有纳米复合物的培养基，替换为新鲜的高氧化环境培养基继续培养24h后，弃去培养基，在每孔中加入100μL1×细胞裂解液，离心取上清，加入荧光素酶底物，用化学发光检测仪测定化学发光强度。用BCA蛋白检测试剂盒测定蛋白浓度。化学发光强度利用蛋白浓度归一化，单位是每毫克蛋白发光强度RLU/mg protein。测定结果如图6所示，在适当升高胞外活性氧水平后，纳米复合物的转染效率会进一步提高，说明在脊髓损伤部位的高活性氧环境中，B-PDEAEA对干细胞的高效转染不仅不会受限制，反而会被氧化应激条件促进而加快释放DNA进而实现更高效的转染。
实施例5
本实施例研究B-PDEAEA/DNA纳米复合物溶液在不同氧化条件下对ROS水平的影响，具体步骤如下：
细胞内ROS浓度采用2,7-二氯二氢荧光素二乙酸酯(dichlorodihydrofluorescein diacetate,H2DCFDA)试剂盒进行检测。H2DCFDA是活性氧族的细胞渗透性指示剂，其本身不具有荧光性。一旦H2DCFDA被细胞吞噬，在细胞内酯酶的作用下转化为非荧光的2,7-二氯二氢荧光素(dichlorodihydrofluorescein,H2DCF)，并很快被ROS氧化成具有绿色荧光的2,7-二氯荧光素(dichlorofluorescein,DCF)。通过流式细胞仪和激光共聚焦显微镜检测细胞内的绿色荧光强度，可以反应细胞内ROS的相对浓度。
1、将BMSCs按照80000/孔的细胞浓度培养于半径15mm玻璃底培养皿中，每孔含有1.5mL培养基，在37℃下培养24h后，向每孔加入含100μM H2O2的培养基，并加入B-PDEAEA/DNA纳米复合物培养24h后，弃尽培养基，然后加入含有10μM H2DCFDA的无血清培养基，在37℃下用培养箱孵育30min，同时用Hoechst 33342对细胞核进行15min染色。孵育结束后，弃尽培养基，用PBS洗涤细胞3次，之后用激光共聚焦显微镜观察细胞内DCF荧光并拍摄照片，比较纳米复合物组和空白组细胞内ROS浓度的变化。DCF的激发波长为488nm，发射波长为525nm。结果如图7a、7b所示，加入纳米复合物后胞内荧光强度显著下降，且随着纳米复合物量的增加荧光强度降低。
2、将BMSCs按照150000个/孔的细胞密度接种于6孔板中，每孔含有2mL培养基，在37℃下培养24h后，向每孔加入含有100μM H2O2的培养基与B-PDEAEA/DNA纳米复合物，培养24h后弃尽培养基，并用冷的PBS洗涤2次，再用0.25％胰酶/0.02％EDTA溶液消化细胞并收集于流式管中，900rpm离心5min后用PBS洗涤2次，最后将细胞悬浮于500μL含有10μMH2DCFDA的PBS中，在37℃的培养箱中孵育30min。孵育结束后，用流式细胞仪进行检测DCF荧光。DCF的激发波长为488nm，发射波长为525nm。每个样品计数10000个细胞，并用CellQuestPro软件进行分析。结果与激光共聚焦显微镜观察的结果一致，如图7c、7d所示。
本实施例中的两个实验均证明本申请所述的纳米复合物能够消耗ROS，具有抗氧化作用。
实施例6
本实施例研究在氧化条件下B-PDEAEA/DNA纳米复合物对细胞活性的影响，具体步骤如下：
将BMSCs按照4000个/孔的细胞密度接种于96孔板中，每孔含有100μL培养基，在37℃下培养24h后，向每孔加入含1mM H2O2的培养基，并加入不同剂量的B-PDEAEA/DNA纳米复合物，空白组加入100μL的培养基溶液，继续培养48h后，向每孔加入10μL CCK-8溶液，继续培养2h后，用酶标仪测定450nm处的吸光度，计算各组细胞存活率。结果如图8所示，纳米复合物的加入可以显著提高BMSCs的细胞存活率，证明纳米复合物能够缓解脊髓损伤区域氧化应激状态，促进BMSCs的存活。
实施例7
本实施例研究B-PDEAEA/DNA纳米复合物在SD大鼠的体内靶向性，具体步骤如下：
构建SD大鼠T9段脊髓损伤模型，将BMSCs加入荧光标记的纳米复合物无血清培养4h，其中pCNTF的浓度为2μg/mL。得到荧光标记的基因修饰的BMSCs(CNTFBMSCs)。造模3天后，尾静脉注射3×106个荧光标记的CNTFBMSCs，分别于4h、24h后处死大鼠，取出损伤部位脊髓组织、心、肝、脾、肺、肾进行活体成像拍摄。结果如图9所示，基因修饰的BMSCs经静脉注射后4h即可到达脊髓损伤区域，随着时间延长，24h时可以发现其主要蓄积在脊髓损伤区域，在其他器官分布相对较少。说明基因修饰的BMSCs能够通过血液循环定植于脊髓损伤部位，具有靶向性。
实施例8
本实施例研究B-PDEAEA/DNA纳米复合物对脊髓损伤修复的结果，具体步骤如下：
将SD大鼠分为假手术(Sham)组、脊髓损伤(SCI)组、BMSCs组和基因修饰的BMSCs(eBMSCs)组。其中，BMSCs组和eBMSCs组分别于造模后3天，尾静脉注射3×106个细胞，SCI组注射等体积的PBS，假手术组不给予注射。在造模后的1～4周内，每周对各组大鼠进行BBB行为学评分。4周后进行脚步印迹分析，取出组织，进行HE染色，观察脊髓损伤的修复情况。各组大鼠的BBB评分结果如图10a所示，造模后大鼠后肢失去运动功能，BMSCs组和eBMSCs组的运动功能恢复显著优于SCI组，在2周时eBMSCs组的评分显著优于其他两组，并且一直持续到4周。脚步印迹分析结果如图10b所示，正常大鼠步态平稳，后肢脚步清晰，着地有力，而SCI组大鼠仍足背着地，前肢拖着后肢行走，BMSCs组大鼠有掌面着地的现象，但行走轨迹不协调，偶尔伴有一定程度的后肢拖拽行走，但相比于SCI组有了明显的改善，eBMSCs组大鼠基本实现后肢掌面着，脚步清晰，已接近正常大鼠水平。HE染色结果显示损伤后4周SCI组可见损伤区局部有空泡形成，灰质中心明显坏死、轴索紊乱不规则。治疗后病理学有显著改善，空洞减少，eBMSCs组效果尤为明显，如图10c所示。
综上所述，本申请针对脊髓损伤区域富含活性氧的微环境和缺少神经营养因子等特点，提出了一种可用于治疗脊髓损伤的非病毒基因载体转染干细胞，克服了非病毒载体难以高效转染干细胞的难题，提高BMSCs神经营养因子CNTF的表达水平，将干细胞治疗和基因治疗完美结合，显著提高其脊髓损伤修复效果，具有良好的应用前景。

Claims (8)

1.用于治疗脊髓损伤的非病毒基因载体转染干细胞复合物，其特征在于：包括非病毒基因载体、基因和干细胞；
所述非病毒基因载体为氧化响应电荷反转型阳离子基因载体，基因为特异性表达神经营养因子的质粒；氧化响应电荷反转型阳离子基因载体通过静电相互作用，与带负电的特异性表达神经营养因子的质粒自组装形成稳定的纳米复合物，转染干细胞后，对干细胞进行基因修饰，形成用于脊髓损伤的治疗系统；
其中，氧化响应电荷反转型阳离子基因载体与特异性表达神经营养因子的质粒的氮磷比为5～30。
2.如权利要求1所述用于治疗脊髓损伤的非病毒基因载体转染干细胞复合物，其特征在于：所述氧化响应电荷反转型阳离子基因载体为含有硼酸或硼酯取代苄基季铵盐的阳离子聚合物。
3.如权利要求2所述用于治疗脊髓损伤的非病毒基因载体转染干细胞复合物，其特征在于：所述氧化响应电荷反转型阳离子基因载体为聚合物B-PDEAEA。
4.如权利要求1所述用于治疗脊髓损伤的非病毒基因载体转染干细胞复合物，其特征在于：所述神经营养因子为睫状神经营养因子、脑源性神经营养因子、胶质细胞源性神经营养因子、神经生长因子、神经营养因子3或成纤维细胞生长因子。
5.如权利要求1～4任一所述用于治疗脊髓损伤的非病毒基因载体干细胞复合物系统，其特征在于：氧化响应电荷反转型阳离子基因载体与特异性表达神经营养因子的质粒的氮磷比为10。
6.如权利要求1所述用于治疗脊髓损伤的非病毒基因载体转染干细胞复合物，其特征在于：所述干细胞为间充质干细胞、神经干细胞、多能胚胎干细胞、少突胶质组细胞、干细胞分化细胞、诱导性多能干细胞、嗅鞘细胞或Schwann细胞。
7.如权利要求6所述用于治疗脊髓损伤的非病毒基因载体转染干细胞复合物，其特征在于：所述干细胞为间充质干细胞中的骨髓间充质干细胞。
8.如权利要求1～4或6、7任一所述用于治疗脊髓损伤的非病毒基因载体转染干细胞复合物，其特征在于：该复合物的制备过程包括以下步骤：
步骤1、使用pH为7.4的HEPES缓冲溶液溶解氧化响应电荷反转型阳离子基因载体；
步骤2、使用pH为7.4的HEPES缓冲溶液配置质粒DNA溶液；
步骤3、按照氧化响应电荷反转型阳离子基因载体与特异性表达神经营养因子的质粒的氮磷比为5～30，对步骤2得到的溶液浓度进行稀释；
步骤4、将步骤3稀释后的溶液与步骤1得到的溶液按照1:1的体积比混合，涡旋振荡10s后在室温下静置30min，得到纳米复合物溶液；
步骤5、向培养皿中的干细胞加入步骤4得到的纳米复合物溶液，无血清培养4小时后，得到用于治疗脊髓损伤的非病毒基因载体转染干细胞复合物。
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