CN115176760A - 一种构建视网膜色素变性疾病模型的方法、应用及繁育方法 - Google Patents

一种构建视网膜色素变性疾病模型的方法、应用及繁育方法 Download PDF

Info

Publication number
CN115176760A
CN115176760A CN202210802574.5A CN202210802574A CN115176760A CN 115176760 A CN115176760 A CN 115176760A CN 202210802574 A CN202210802574 A CN 202210802574A CN 115176760 A CN115176760 A CN 115176760A
Authority
CN
China
Prior art keywords
gene
mettl3
retinal pigment
modification
disease model
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202210802574.5A
Other languages
English (en)
Other versions
CN115176760B (zh
Inventor
杨业明
朱献军
江小艳
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
University of Electronic Science and Technology of China
Original Assignee
University of Electronic Science and Technology of China
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by University of Electronic Science and Technology of China filed Critical University of Electronic Science and Technology of China
Priority to CN202210802574.5A priority Critical patent/CN115176760B/zh
Publication of CN115176760A publication Critical patent/CN115176760A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN115176760B publication Critical patent/CN115176760B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
    • A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
    • A01K67/0276—Knock-out vertebrates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/0004—Screening or testing of compounds for diagnosis of disorders, assessment of conditions, e.g. renal clearance, gastric emptying, testing for diabetes, allergy, rheuma, pancreas functions
    • A61K49/0008—Screening agents using (non-human) animal models or transgenic animal models or chimeric hosts, e.g. Alzheimer disease animal model, transgenic model for heart failure
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1003—Transferases (2.) transferring one-carbon groups (2.1)
    • C12N9/1007—Methyltransferases (general) (2.1.1.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y201/00—Transferases transferring one-carbon groups (2.1)
    • C12Y201/01—Methyltransferases (2.1.1)
    • C12Y201/01062—Methyltransferases (2.1.1) mRNA (2'-O-methyladenosine-N6-)-methyltransferase (2.1.1.62)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/15—Animals comprising multiple alterations of the genome, by transgenesis or homologous recombination, e.g. obtained by cross-breeding
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2227/00—Animals characterised by species
    • A01K2227/10—Mammal
    • A01K2227/105—Murine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

本发明公开了一种构建视网膜色素变性疾病模型的方法、应用及繁育方法，涉及基因编辑技术领域。修饰非人目标动物的视网膜视杆细胞中的同源染色体上的Mettl3基因，修饰后使得同源染色体上的Mettl3基因产生如下至少一种的效果：使Mettl3基因不表达；Mettl3基因的表达被抑制；或Mettl3基因表达的蛋白不具有正常的生物活性功能。通过上述修饰，均可以使得修饰后的目标动物表现出视网膜色素变性疾病的特征。具有上述Mettl3基因修饰的目标动物可以作为视网膜色素变性疾病模型，可以用于预防或治疗视网膜色素变性疾病的药物筛选，也可以用于视网膜色素变性疾病研究。

Description

一种构建视网膜色素变性疾病模型的方法、应用及繁育方法
技术领域
本发明涉及基因编辑技术领域，具体而言，涉及一种构建视网膜色素变性疾病模型的方法、应用及繁育方法。
背景技术
目前,针对视网膜色素变性(Retinitis pigmentosa,RP)尚无有效的治疗手段。RP的诊断和治疗面临许多困难，这主要归因于其在临床表型和遗传上具有高度的异质性，并且针对其病理机制系统研究不足。典型的RP患者最早由于视杆细胞功能缺陷而出现夜盲和视野狭窄，逐步发展为管状视野，直至失明；眼底检查可见视网膜色素沉着。在病理学方面，典型的RP主要影响视杆细胞，造成视杆细胞死亡并继发视锥细胞死亡，主要表现为光感受器受损、变性，视网膜外核层逐渐变薄直至消失，视网膜外网层及其他相关细胞层出现相应病理改变。而导致RP的具体分子机制尚不清楚，这为RP的临床诊断和药物干预带来极大阻碍。
目前，RP疾病模型种类较少，需要更多的RP疾病模型和构建方法。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种构建视网膜色素变性疾病模型的方法、应用及繁育方法以解决上述技术问题。
本发明是这样实现的：
本发明提供了一种构建视网膜色素变性疾病模型的方法，其包括如下步骤：
修饰非人目标动物的视网膜视杆细胞中的同源染色体上的Mettl3基因，修饰后使得同源染色体上的Mettl3基因产生如下至少一种的效果：
(a)：Mettl3基因不表达；
(b)：Mettl3基因的表达被抑制；
(c)：Mettl3基因表达的蛋白不具有正常的生物活性功能。
METTL3蛋白(methyltransferase like 3)作为甲基转移酶复合体的核心酶介导RNA的m6A甲基化修饰过程，其广泛分布于各种类型的组织细胞中。m6A甲基化的形成过程主要是由甲基转移酶复合体介导，其核心成员为METTL3和METTL14，主要作用就是催化mRNA上特定腺苷酸发生m6A修饰。其中，METTL3是最早被鉴定为能够催化m6A甲基化的组分，负责mRNA上特定腺苷酸的甲基转移。m6A可能参与了mRNA转录、选择性剪切、出核转运、翻译以及降解等生物学过程，而导致RNA功能紊乱，进而影响一系列的动物生命活动。目前针对METTL3蛋白功能的研究逐渐增多，包括在肿瘤发生、机体发育等方面的影响，但其详细作用机制以及其在视网膜中的生物学功能还不甚明了，限制了其开发应用。
发明人创造性地发现，通过对目标动物的视网膜视杆细胞中的同源染色体上的Mettl3基因进行修饰，包括不限于使Mettl3基因不表达；Mettl3基因的表达被抑制；或Mettl3基因表达的蛋白不具有正常的生物活性功能；均可以使得修饰后的目标动物表现出视网膜色素变性疾病的特征。例如视杆细胞死亡，主要表现为光感受器受损、变性，视网膜外核层逐渐变薄直至消失，视网膜外网层及其他相关细胞层出现相应病理改变等。
因此，具有上述Mettl3基因修饰的目标动物可以作为视网膜色素变性疾病模型，可以用于预防或治疗视网膜色素变性疾病的药物筛选，也可以用于视网膜色素变性疾病研究，为视网膜色素变性疾病研究提供了新的模型基础，可以帮助阐明视网膜色素变性疾病的发病过程及机制，并为该疾病的治疗或预防提供新的靶标。
在本发明应用较佳的实施方式中，非人目标动物的视网膜视杆细胞中的同源染色体进行相同的修饰。
同源染色体上进行相同的修饰是指，位于同源染色体上的两个不同位置的Mettl3基因具有一样的修饰，即纯合修饰。具有如此修饰的目标动物，必然表现出视网膜色素变性疾病特征。
在本发明应用较佳的实施方式中，修饰为突变、缺失、插入中的一种或几种的组合。例如同时突变Mettl3基因的一些碱基，并缺失Mettl3基因的另一些序列，使得非人目标动物表现出视网膜色素变性疾病的特征，均在本发明的保护范围之内。本领域技术人员基于本发明公开的内容可以选择合适的核苷酸修饰方式。
突变包括不限于核苷酸的颠换、倒置等。
当采用突变修饰时，可以是一个或多个核苷酸的突变，通过突变修饰可以是的相应的蛋白位点发生氨基酸改变，通过突变修饰至少可以实现Mettl3基因表达的蛋白不具有正常的生物活性功能。
当采用缺失修饰时，可以是一个或多个核苷酸的缺失，例如可以优选为外显子上的一个或多个核苷酸的缺失；通过缺失修饰至少可以实现Mettl3基因不表达、Mettl3基因的表达被抑制以及Mettl3基因表达的蛋白不具有正常的生物活性功能等效果。
当采用插入修饰时，可以是在Mettl3基因中插入一个或多个核苷酸；例如在外显子中插入一个或多个核苷酸使其发生移码突变，导致表达的蛋白氨基酸序列和结构发生改变，进而可以实现Mettl3基因表达的蛋白不具有正常的生物活性功能。
因此，无论选用何种修饰，只要使其Mettl3基因产生如上效果(1)-(3)中的任意一种，使目标动物表现出视网膜色素变性疾病特征，即属于本发明的保护范围。
在本发明应用较佳的实施方式中，修饰是指修饰Mettl3基因外显子序列、修饰Mettl3基因上游的驱动Mettl3基因表达的启动子序列或修饰Mettl3基因的增强子序列。
对于修饰的位置，本领域技术人员容易想到将其控制在Mettl3基因的外显子上，但是可以将修饰控制在驱动Mettl3基因表达的启动子序列或增强子序列上，例如删除原始启动子的全部或部分使其驱动表达的功能丧失即相当于发生缺失修饰，或者使用其他的特异启动子序列代替原始的启动子即相当于发生突变修饰，通过对启动子的修饰也可使得Mettl3基因不表达或其表达被抑制；进而使得目标动物表现出视网膜色素变性疾病特征。例如原始增强子的全部或部分使其增强表达的功能丧失即相当于发生缺失修饰，通过对增强子的修饰也可使得Mettl3基因其表达被抑制；进而使得目标动物表现出视网膜色素变性疾病特征。
在本发明应用较佳的实施方式中，修饰通过如下技术中的一种或几种的联用实现：基因敲除技术和基因编辑技术；
在本发明应用较佳的实施方式中，基因敲除技术为Cre-loxP基因敲除技术。
在本发明应用较佳的实施方式中，基因编辑技术选自CRISPR/Cas9技术、人工核酸酶介导的锌指核酸酶技术(zinc-finger nucleases，ZFN)和转录激活因子样效应物核酸酶技术(transceription activator-like effector nucleases,TALEN)中的至少一种。
本领域的技术人员可以根据需要选择本领域现有的基因修饰技术(一种或几种的组合)对Mettl3基因进行修饰，从而使得目标动物表现出视网膜色素变性疾病特征，均属于本发明的保护范围。
在本发明应用较佳的实施方式中，非人目标动物为非人目标哺乳动物；
在本发明应用较佳的实施方式中，非人目标哺乳动物包括不限于小鼠、大鼠、马、牛、羊、兔、狗、猪、猴、猿和猩猩中的任意一种。本领域技术人员可以根据需要或兴趣，选择合适的非人哺乳动物作为目标动物，以构建视网膜色素变性疾病模型。因此，无论选择何种非人哺乳动物作为目标动物，均属于本发明的保护范围。
在本发明应用较佳的实施方式中，修饰为缺失，缺失为Mettl3基因中的一个或多个外显子序列被删除。
小鼠Mettl3基因(MGI:1927165)，该基因位于小鼠14号染色体52532298-52542585bp，全长10.29kb，其cDNA全长1743bp，包含11个外显子。
当所述目标动物为小鼠时，可以通过删除其Mettl3基因中的一个或多个外显子序列来构建小鼠视网膜色素变性疾病模型。
在一种可选的实施方式中，上述缺失为Mettl3基因中第2外显子-第3外显子序列被删除。
在一种可选的实施方式中，缺失为Mettl3基因中第2外显子-第3外显子以及第1号和第4-11号外显子中的至少一个外显子被删除。
由上述视网膜色素变性疾病模型的方法所得到的视网膜色素变性疾病模型在视网膜色素变性疾病研究中的应用，应用不以疾病的诊断或治疗为目的。
由上述构建视网膜色素变性疾病模型的方法所得到的视网膜色素变性疾病模型在筛选用于预防或治疗视网膜色素变性疾病药物中的应用。
在本发明的一些实施方案中，所述应用包括：向所述视网膜色素变性疾病模型施用候选药物，如果所述视网膜色素变性疾病模型在施用所述候选药物前后发生如下变化中的至少一种，则指示所述候选药物可以作为预防或治疗视网膜色素变性性疾病的药物：
(1)施用所述候选药物后，相较于施用所述候选药物前，所述视网膜色素变性疾病模型的视力提高；
(2)施用所述候选药物后，相较于施用所述候选药物前，所述视网膜色素变性疾病模型的视网膜外核层变厚；
(3)施用所述候选药物后，相较于施用所述候选药物前，所述视网膜色素变性疾病模型的视网膜外节增长。
本发明还提供了一种视网膜色素变性疾病模型的繁育方法，其包括：以上述构建视网膜色素变性疾病模型的方法所得到的视网膜色素变性疾病模型为亲本进行杂交。
在通过上述构建方法得到初代视网膜色素变性疾病模型后，为了获取更多数量后代视网膜色素变性疾病模型，本领域技术人员容易想到通过将上述的初代视网膜色素变性疾病模型进行相互交配的育种方法以获得更多数量的后代视网膜色素变性疾病模型，这种繁育视网膜色素变性疾病模型的方法也是属于本发明的保护范围。
本发明提供由如上任一项所述的构建视网膜色素变性疾病模型的方法所得到的视网膜色素变性疾病模型的鉴定方法，其包括：检测待鉴定动物的视网膜视杆细胞中的同源染色体上的Mettl3基因是否具有相同的所述修饰。
通过上述鉴定方法可以分辨出待鉴定动物是否属于本发明提供的构建视网膜色素变性疾病模型，如果存在所述修饰，则该待鉴定动物为本发明提供的视网膜色素变性疾病模型，如果不存在上述修饰则该待鉴定动物不属于本发明提供的视网膜色素变性疾病模型。
对于具体如何鉴定是否存在上述修饰，本领域技术人员可以采用本领域常规的技术例如测序技术、PCR技术、蛋白印迹技术等实现，这对本领域技术人员来说是容易实现的，无论采用何种技术进行鉴定，均属于本发明的保护范围。
本发明具有以下有益效果：
本发明通过对目标动物的视网膜视杆细胞中的同源染色体上的Mettl3基因进行修饰，包括不限于使Mettl3基因不表达；Mettl3基因的表达被抑制；或Mettl3基因表达的蛋白不具有正常的生物活性功能；均可以使得修饰后的目标动物表现出视网膜色素变性疾病的特征。例如视杆细胞死亡，主要表现为光感受器受损、变性，视网膜外核层逐渐变薄直至消失，视网膜外网层及其他相关细胞层出现相应病理改变等。
因此，具有上述Mettl3基因修饰的目标动物可以作为视网膜色素变性疾病模型，可以用于预防或治疗视网膜色素变性疾病的药物筛选，也可以用于视网膜色素变性疾病研究，为视网膜色素变性疾病研究提供了新的模型基础，可以帮助阐明视网膜色素变性疾病的发病过程及机制，并为该疾病的治疗或预防提供新的靶标。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为视网膜视杆细胞特异敲除Mettl3基因小鼠(RKO)的构建和鉴定结果图；
图2为Mettl3基因敲除效率检测结果图；
图3为暗适应视网膜电图(Electroretinogram,ERG)检测结果图；
图4为视网膜视杆细胞特异敲除Mettl3基因小鼠视网膜切片免疫组化染色结果图；
图5为视网膜视杆细胞特异敲除Mettl3基因小鼠IHC染色结果图(Rhodopsin抗体标记)；
图6为视网膜视杆细胞特异敲除Mettl3基因小鼠IHC染色结果图(GFAP神经胶质细胞标记物标记)。
具体实施方式
现将详细地提供本发明实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本发明。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。
除非另外指明，否则实践本发明将采用细胞生物学、分子生物学(包含重组技术)、微生物学、生物化学和免疫学的常规技术，所述常规技术在本领域技术人员的能力范围内。文献中充分解释了这种技术，如《分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning:ALaboratory Manual)》，第二版(Sambrook等人，1989)；《寡核苷酸合成(OligonucleotideSynthesis)》(M.J.Gait编，1984)；《动物细胞培养(Animal Cell Culture)》(R.I.Freshney编，1987)；《酶学方法(Methods in Enzymology)》(学术出版社有限公司(Academic Press，Inc.)；《实验免疫学手册(Handbook of Experimental Immunology)》(D.M.Weir和C.C.Blackwell编)；《哺乳动物细胞用基因转移载体(Gene Transfer Vectors forMammalian Cells)》(J.M.Miller和M.P.Calos编，1987)；《当代分子生物学方法(CurrentProtocols in Molecular Biology)》(F.M.Ausubel等人编，1987)；《PCR:聚合酶链反应(PCR:The Polymerase Chain Reaction)》(Mullis等人编，1994)；以及《当代免疫学方法(Current Protocols in Immunology)》(J.E.Coligan等人编，1991)，所述文献中的每个文献均通过引用明确并入本文中。
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本实施例提供了一种视网膜色素变性疾病模型的构建方法及视网膜色素变性疾病模型的鉴定方法。
构建方法如下：
本实施例以小鼠为目标动物，对本发明实施例提供的视网膜色素变性疾病模型的构建方法进行说明，Mettl3基因敲除的路线如图1中A所示，修饰方式为：删除小鼠Mettl3基因的第2-10外显子；通过CRISPR/Cas9技术和Cre-loxP基因敲除技术的联用实现修饰。具体操作如下：
1)Mettl3基因条件性敲除小鼠(Mettl3flox/flox，该小鼠Mettl3基因的第2外显子上游和第3外显子下游插入了同向的loxP位点)，购自上海南方模式生物科技股份有限公司；
2)将步骤1)的Mettl3基因条件性敲除杂合子小鼠相互交配繁育，得到Mettl3基因条件性敲除纯合子小鼠；
3)将步骤2)得到的Mettl3基因条件性敲除纯合子小鼠与转Rod-Cre基因小鼠(B6.Cg-Pde6b+Tg(Rho-icre)1Ck/Boc，购自美国杰克森实验室，MGI:4417915)交配，Rod驱动Cre基因在视网膜视杆细胞中特异性表达，得到视网膜视杆细胞敲除Mettl3基因小鼠，通过鉴定后(方法见后文)，将鉴定结果正确的小鼠作为视网膜色素变性疾病模型。
视网膜色素变性疾病模型的鉴定方法如下：
1)剪待鉴定小鼠尾梢少许组织样本，置于干净的1.5ml离心管中；
2)在离心管中加入100μl裂解液(40mM NaOH，0.2mM EDTA溶液)，并在金属浴100℃加热1h；
3)取出离心管，冷却至室温后，加入100μl的中和液(40mM Tris-HCl，pH5.5)，10000g离心2min后，取上清用于小鼠基因型鉴定。
4)PCR扩增：按照如下体系配置PCR反应体系
2×Taq Mix 10μL；
尾巴组织裂解液 2μL；
引物1(Mettl3-loxP-Forward或Rod-Cre-Forward)，1μL(浓度：10mM)；
引物2(Mettl3-loxP-Reverse或Rod-Cre-Reverse)，1μL(浓度：10mM)；
ddH2O 6μL。
引物序列如下：
Mettl3-loxP-Forward序列：5’-GTTTGCACAAGGAGTATTT-3’；
Mettl3-loxP-Reverse序列：5’-TCATCTGGGGAAGGAGGAGTG-3’；
Rod-Cre-Forward序列：5’-TCAGTGCCTGGAGTTGCGCTGTGG-3’；
Rod-Cre-Reverse序列：5’-CTTAAAGGCCAGGGCCTGCTTGGC-3’。
扩增程序：
PCR反应体系配制完后，在PCR仪上于95℃预加热5分钟使模板DNA充分变性，然后进入扩增循环。在每一个循环中，先于95℃保持30秒钟使模板变性，然后将温度降到复性温度58℃，保持30秒，使引物与模板充分退火；在72℃保持30秒，使引物在模板上延伸，合成DNA，完成一个循环。重复这样的循环25次，使扩增的DNA片段大量累积。最后，在72℃保持5分钟，使产物延伸完整，4℃保存。
5)凝胶电泳
称取1g琼脂糖放于100ml TAE buffer中,微波炉中融化后制成1％的琼脂糖胶。取10ul PCR产物于加样孔中，120V恒压琼脂糖电泳15min.用凝胶成像系统成像。
图1中B的上图为采用Mettl3-loxP的上下游引物分别对显示了对野生型对照小鼠(Mettl3+/+)、杂合子小鼠(Mettl3flox/+；Rho-Cre)和纯合子小鼠(Mettl3flox/flox；Rod-Cre)进行PCR扩增检测。图1B的下图为采用Rod-Cre的上下游引物分别对野生型对照小鼠(Mettl3+/+)、杂合子小鼠(Mettl3flox/+；Rho-Cre)和纯合子小鼠(Mettl3flox/flox；Rod-Cre)进行PCR扩增检测结果图。
对应的条带大小和分布参照图1所示，WT表示野生型对照，扩增loxP序列的条带大小为241bp，无扩增Rod-Cre基因的条带；
Het表示杂合子小鼠，有三个条带，有两个扩增loxP序列的条带，分布是241bp和402bp，有一个扩增Rod-Cre基因的条带大小约为232bp；
RKO表示纯合子小鼠，有两个条带，扩增loxP序列的条带大小为402bp，扩增Rod-Cre基因的条带大小约为232bp，具有如此条带分布和大小的结果，说明该待鉴定小鼠的同源染色体上的Mettl3基因具有相同的修饰，即为视网膜色素变性疾病模型。
实施例2
本实施例采用免疫印迹(Western blot)实验分析Rod-Cre敲除小鼠视网膜中基因敲除效率。
方法如下：
1)分别获取对照和敲除小鼠视网膜，充分研磨后加入200ul蛋白裂解液RIPA。
2)超声破碎细胞后，在冰上裂解20min。
3)4℃，16000g离心10min后，取上清转移至另一干净离心管，加入50μl的蛋白上样液，混匀后95℃加热5min。
4)待样本冷却后，分别取20μl，160V电压进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)以分离蛋白。
5)SDS-PAGE结束后，根据需要，裁剪适当大小的硝酸纤维素膜，按顺序铺上滤纸、胶、硝酸纤维素膜及滤纸，并赶去气泡，转膜槽放入冰水浴中，采用恒流0.28A的电流进行转膜，转膜2h。
6)转膜完毕后，纯水冲洗硝酸纤维素膜一遍，晾干并标记。然后用8％的脱脂牛奶封闭2h。
7)封闭完成后，加入一定量的按一定比例(按照抗体使用说明书)稀释于封闭液的一抗，4℃孵育过夜。
8)回收一抗，1×TBST缓冲液洗膜4次，每次10min，根据一抗来源，选择合适二抗，用1×TBST稀释辣根过氧化氢酶(HRP)标记的二抗，室温于摇床上孵育2h。
9)二抗孵育结束后，用1×TBST洗膜3次，每次10min，用Thermo的ELC发光试剂盒检测蛋白，所用仪器为Bio-Rad的化学发光凝胶成像系统。
2免疫组化(IHC)实验分析Rod-Cre敲除小鼠视网膜中基因敲除效率。
视网膜冰冻切片免疫染色：取3月龄的实施例1构建得到的视网膜视杆细胞特异敲除Mettl3基因小鼠断颈处死后，快速取眼球，并放入4％的PFA中，冰上固定15min后，在角膜上剪口，然后继续冰上固定。2h后，PBS缓冲液冲洗3遍，然后将眼球置于30％蔗糖溶液中脱水2h，然后解剖镜下剪去角膜及晶体，OCT包埋并迅速置于-80℃冰箱冷冻。大约10min后，取出OCT包埋的眼球，置于冰冻切片机-25℃平衡约30min后即可切片。切片厚度为12μm。
切片完成后，选取质量较高的片子于37℃烘箱放置30min，然后免疫组化笔在有视网膜组织的地方画圈，PBS洗三遍以去除OCT，然后5％的NDS(含有0.25％Triton)封闭通透2h，孵育一抗，4℃过夜。第二天，PBS清洗三次后，孵育相应的荧光二抗，然后再用PBS清洗三次，封片，观察。
结果见图2。在小鼠3月龄时，通过视网膜冰冻组织切片染色METTL3抗体后发现，相较于野生型小鼠，敲除型小鼠视网膜外核层以及视杆细胞内节METTL3表达消失，表明其在视网膜视杆细胞中被特异性敲除。
图2中A和B为:Western blot实验分析Mettl3敲除小鼠视网膜中基因敲除效率及相对蛋白表达水平统计结果图；
图2中C:视网膜视杆细胞特异敲除Mettl3基因小鼠IHC染色结果。
实施例3
本实施例对5月龄的Mettl3基因敲除小鼠进行ERG视力检测：
1)暗适应动物应整夜暗适应，环境应做到绝对没有光线；
2)次日麻醉：称重，腹腔内注射；宜深度麻醉；
3)动物固定及散瞳：麻醉完成后，在暗红光照明下将小鼠用胶带固定在动物试验平台的前方：需保证小鼠正"趴"，即相对于闪光刺激器的刺激口，双眼高度一致，充分暴露，滴加散瞳剂。
4)电极安装：将视网膜电图仪(Espion Visual Electrophysiology System,DiagnosysLLC,Lit-tleton,MA,USA)预热后，在电极涂上导电膏，夹住小鼠尾巴，插入放大器“地”接口；双头的针电极插入后颈皮(大约在两耳中间)，同时接两个通道的“负”接口；金环电极夹在动物实验平台的电极支架上，仔细调整其角度，轻微的接触角膜的中心顶端。一通道正极接右眼，二通道正极接左眼。通过针管对双眼滴生理盐水，改善金环电极及角膜的接触效果。保证两个金环电极以相同的角度、方式接触两眼角膜中心正端的相同位置。
5)记录示波信号确认无误后，关闭暗红光。可以先尝试记录一下暗适应光强为0.003cd/s·m2的ERG检测，确认一下信号的质量：如果双眼的振幅出现了与预期不同的较大差异，建议再次检查金环电极的安装位置。然后依次记录暗适应光强为0.03/0.3/3.0/20.0cd/s·m2的信号，记录后系统将自动打开背景光。
结果发现在5个月时，相较于WT(野生)小鼠，RKO(视网膜视杆细胞敲除)小鼠的a波和b波在暗适应条件下均明显降低，表明Mettl3在视杆细胞敲除后导致视力受损(图3)。
A,B:不同光强下Mettl3野生型和Mettl3基因敲除小鼠在暗适应视网膜电图波形；C：暗适应3.0和10.0以及光适应10.0的a波和b波统计，图3中C表明敲除小鼠视杆细胞功能显著下降；D,E:光适应3.0下Mettl3野生型和Mettl3基因敲除小鼠的视网膜电图波形；F：光适应3.0的a波,b波以及Flicker波幅统计，图3中F表明敲除小鼠视锥细胞功能下降略有下降，但a,b波振幅差异无统计学意义(P<0.05)。
实施例4
本实施例进行视网膜石蜡切片和H&E染色：
对3.5和5月龄小鼠的视网膜进行石蜡切片、苏木精-伊红染色法(H&E染色方法)染色，具体操作如下：
1)快速取小鼠眼球组织，并置于固定液中固定24h；
2)石蜡包埋，切片，厚度为4μm；
3)切片常规用二甲苯脱蜡，经多级乙醇至水洗：二甲苯(I)5min→二甲苯(II)5min→100％乙醇2min→95％的乙醇1min→80％乙醇1min→75％乙醇1min→蒸馏水洗2min；
4)苏木素染色5分钟，自来水冲洗；
5)盐酸乙醇分化30秒；
6)自来水浸泡15分钟；
7)置伊红液2分钟。
8)常规脱水，透明，封片：95％乙醇(I)1min→95％乙醇(II)1min→100％乙醇(I)1min→100％乙醇(II)1min→二甲苯石碳酸(3：1)1min→二甲苯(I)1min→二甲苯(II)1min→中性树脂封固。
9)显微镜下拍照。
图4的左图为视网膜视杆细胞特异敲除Mettl3基因小鼠视网膜石蜡切片H&E染色结果，外核层及内核层均变薄。右图为对不同部位的Mettl3敲除鼠视网膜外核层厚度统计图。结果发现在3.5个月时，相较于WT(野生)小鼠，RKO(视网膜视杆细胞敲除)小鼠的视网膜外核层已经开始变薄，而5月龄时外核层厚度显著变薄，表明感光细胞死亡(图4)。
实施例5
本实施例进行视网膜冰冻切片免疫染色：取5月龄的实施例1构建得到的视网膜视杆细胞特异敲除Mettl3基因小鼠断颈处死后，快速取眼球，并放入4％的PFA中，冰上固定15min后，在角膜上剪口，然后继续冰上固定。2h后，PBS缓冲液冲洗3遍，然后将眼球置于30％蔗糖溶液中脱水2h，然后解剖镜下剪去角膜及晶体，OCT包埋并迅速置于-80℃冰箱冷冻。大约10min后，取出OCT包埋的眼球，置于冰冻切片机-25℃平衡约30min后即可切片。切片厚度为12μm。
切片完成后，选取质量较高的片子于37℃烘箱放置30min，然后免疫组化笔在有视网膜组织的地方画圈，PBS洗三遍以去除OCT，然后5％的NDS(含有0.25％Triton)封闭通透2h，孵育一抗，4℃过夜。第二天，PBS清洗三次后，孵育相应的荧光二抗，然后再用PBS清洗三次，封片，观察。
结果见图5。在小鼠3月龄时，通过视网膜冰冻组织切片染色外节抗体Rhodopsin后发现，相较于野生型(WT)小鼠，视杆细胞敲除型(RKO)小鼠视网膜外节明显缩短，出现明显退化表征。
实施例6
本实施例进行视网膜冰冻切片免疫染色：取5月龄的实施例1构建得到的视网膜视杆细胞特异敲除Mettl3基因小鼠断颈处死后，快速取眼球，并放入4％的PFA中，冰上固定15min后，在角膜上剪口，然后继续冰上固定。2h后，PBS缓冲液冲洗3遍，然后将眼球置于30％蔗糖溶液中脱水2h，然后解剖镜下剪去角膜及晶体，OCT包埋并迅速置于-80℃冰箱冷冻。大约10min后，取出OCT包埋的眼球，置于冰冻切片机-25℃平衡约30min后即可切片。切片厚度为12μm。
切片完成后，选取质量较高的片子于37℃烘箱放置30min，然后免疫组化笔在有视网膜组织的地方画圈，PBS洗三遍以去除OCT，然后5％的NDS(含有0.25％Triton)封闭通透2h，孵育一抗，4℃过夜。第二天，PBS清洗三次后，孵育相应的荧光二抗，然后再用PBS清洗三次，封片，观察。
结果见图6。在小鼠5月龄时，通过视网膜冰冻组织切片染色神经胶质细胞标记物GFAP后发现，相较于野生型小鼠，敲除型小鼠视网膜出现明显胶质细胞增生，炎症反应增强，表明视网膜损伤。
综上，可以看出，本发明实施例以小鼠为例，通过Cre-loxP敲除技术在其视网膜视杆细胞中特异性敲除Mettl3基因，使小鼠表现出视力受损，视细胞外节变短退化以及视细胞丢失等视网膜色素变性疾病典型表征。由此充分说明，在视网膜视杆细胞条件性敲除Mettl3基因，可以使目标动物表现出视网膜色素变性疾病特征。视网膜视杆细胞条件性敲除Mettl3基因的动物，可以作为视网膜色素变性疾病模型。该疾病模型可以用于视网膜色素变性疾病研究等领域中，为该疾病的研究例如发病过程、机制以及相关药物的筛选提供一种新的疾病模型基础。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种构建视网膜色素变性疾病模型的方法，其特征在于，其包括如下步骤：
修饰非人目标动物的视网膜视杆细胞中的同源染色体上的Mettl3基因，修饰后使得同源染色体上的Mettl3基因产生如下至少一种的效果：
(a)：Mettl3基因不表达；
(b)：Mettl3基因的表达被抑制；
(c)：Mettl3基因表达的蛋白不具有正常的生物活性功能。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述非人目标动物的视网膜视杆细胞中的同源染色体进行相同的修饰。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述修饰为突变、缺失、插入中的一种或几种的组合。
4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，所述修饰是指修饰Mettl3基因外显子序列、修饰Mettl3基因上游的驱动Mettl3基因表达的启动子序列或修饰Mettl3基因的增强子序列。
5.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于，所述修饰通过如下技术中的一种或几种的联用实现：基因敲除技术和基因编辑技术；
优选地，所述基因敲除技术为Cre-loxP基因敲除技术；
优选地，所述基因编辑技术选自CRISPR/Cas9技术、ZFN技术和TALEN技术中的任意一种或几种的组合。
6.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于，所述非人目标动物为非人目标哺乳动物；
优选地，所述非人目标哺乳动物选自小鼠、大鼠、马、牛、羊、兔、狗、猪、猴、猿和猩猩中的任意一种。
7.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，所述修饰为缺失，所述缺失为Mettl3基因中的一个或多个外显子序列被删除；
优选的，所述缺失为Mettl3基因中第2外显子-第3外显子序列被删除；
优选的，所述缺失为Mettl3基因中第2外显子-第3外显子以及第1号和第4-11号外显子中的至少一个外显子被删除。
8.由权利要求1-7中任一项所述的视网膜色素变性疾病模型的方法所得到的视网膜色素变性疾病模型在视网膜色素变性疾病研究中的应用，所述应用不以疾病的诊断或治疗为目的。
9.由权利要求1-7中任一项所述的构建视网膜色素变性疾病模型的方法所得到的视网膜色素变性疾病模型在筛选用于预防或治疗视网膜色素变性疾病药物中的应用。
10.一种视网膜色素变性疾病模型的繁育方法，其特征在于，其包括：以权利要求1-7中任一项所述的构建视网膜色素变性疾病模型的方法所得到的视网膜色素变性疾病模型为亲本进行杂交。
CN202210802574.5A 2022-07-07 2022-07-07 一种构建视网膜色素变性疾病模型的方法、应用及繁育方法 Active CN115176760B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210802574.5A CN115176760B (zh) 2022-07-07 2022-07-07 一种构建视网膜色素变性疾病模型的方法、应用及繁育方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210802574.5A CN115176760B (zh) 2022-07-07 2022-07-07 一种构建视网膜色素变性疾病模型的方法、应用及繁育方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN115176760A true CN115176760A (zh) 2022-10-14
CN115176760B CN115176760B (zh) 2023-11-17

Family

ID=83517938

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210802574.5A Active CN115176760B (zh) 2022-07-07 2022-07-07 一种构建视网膜色素变性疾病模型的方法、应用及繁育方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN115176760B (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116738352A (zh) * 2023-08-14 2023-09-12 武汉大学人民医院（湖北省人民医院） 视网膜血管阻塞疾病的视杆细胞异常分类方法及装置
CN117230077A (zh) * 2023-11-13 2023-12-15 四川省医学科学院·四川省人民医院 Hakai基因在RP疾病模型构建中的应用及构建方法

Citations (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040180048A1 (en) * 2002-07-12 2004-09-16 The Johns Hopkins University Neuronal and retinal gene expression patterns
EP2639305A1 (en) * 2010-11-11 2013-09-18 Sysmex Corporation Markers for detecting human follicular helper t cells and method for detecting human follicular helper t cells
US20160264934A1 (en) * 2015-03-11 2016-09-15 The General Hospital Corporation METHODS FOR MODULATING AND ASSAYING m6A IN STEM CELL POPULATIONS
US20190262399A1 (en) * 2016-09-07 2019-08-29 The Broad Institute, Inc. Compositions and methods for evaluating and modulating immune responses
CN112715484A (zh) * 2020-12-29 2021-04-30 四川省人民医院 构建视网膜色素变性疾病模型的方法、应用以及繁育方法
CN112941102A (zh) * 2021-01-26 2021-06-11 南方医科大学 一种子痫前期小鼠动物模型的构建方法及其应用
CN113621649A (zh) * 2021-09-14 2021-11-09 商丘市第一人民医院 一种视网膜色素变性疾病模型的构建方法及其应用
US20220010272A1 (en) * 2018-07-05 2022-01-13 Zhejiang University Cell line with METTL3 gene knocked out, its construction method and interference vector
WO2022013420A1 (en) * 2020-07-17 2022-01-20 European Molecular Biology Laboratory Prognostic biomarkers for cancer
CN113957074A (zh) * 2021-10-25 2022-01-21 电子科技大学 一种小脑共济失调疾病模型的构建方法及应用
CN114561408A (zh) * 2022-01-24 2022-05-31 四川省医学科学院·四川省人民医院 一种视网膜色素变性疾病模型的构建方法及其应用

Patent Citations (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040180048A1 (en) * 2002-07-12 2004-09-16 The Johns Hopkins University Neuronal and retinal gene expression patterns
EP2639305A1 (en) * 2010-11-11 2013-09-18 Sysmex Corporation Markers for detecting human follicular helper t cells and method for detecting human follicular helper t cells
US20160264934A1 (en) * 2015-03-11 2016-09-15 The General Hospital Corporation METHODS FOR MODULATING AND ASSAYING m6A IN STEM CELL POPULATIONS
US20190262399A1 (en) * 2016-09-07 2019-08-29 The Broad Institute, Inc. Compositions and methods for evaluating and modulating immune responses
US20220010272A1 (en) * 2018-07-05 2022-01-13 Zhejiang University Cell line with METTL3 gene knocked out, its construction method and interference vector
WO2022013420A1 (en) * 2020-07-17 2022-01-20 European Molecular Biology Laboratory Prognostic biomarkers for cancer
CN112715484A (zh) * 2020-12-29 2021-04-30 四川省人民医院 构建视网膜色素变性疾病模型的方法、应用以及繁育方法
CN112941102A (zh) * 2021-01-26 2021-06-11 南方医科大学 一种子痫前期小鼠动物模型的构建方法及其应用
CN113621649A (zh) * 2021-09-14 2021-11-09 商丘市第一人民医院 一种视网膜色素变性疾病模型的构建方法及其应用
CN113957074A (zh) * 2021-10-25 2022-01-21 电子科技大学 一种小脑共济失调疾病模型的构建方法及应用
CN114561408A (zh) * 2022-01-24 2022-05-31 四川省医学科学院·四川省人民医院 一种视网膜色素变性疾病模型的构建方法及其应用

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
L. HUANG 等,: ""m(6)A writer complex promotes timely differentiation and survival of retinal progenitor cells in zebrafish"", BIOCHEM. BIOPHYS. RES. COMMUN, vol. 567, pages 171, XP086694403, DOI: 10.1016/j.bbrc.2021.06.043 *
刘玉庆等: "家族性渗出性玻璃体视网膜病变患者LRP5基因突变研究", 遗传, pages 241 - 249 *
刘雪;张涛;周笑琦;管伦;陈鹏;: "真核生物mRNA上的修饰核苷及在发育调控中的作用", 生物工程学报, no. 09, pages 84 - 89 *
李游;庞东渤;陈晓隆;: "P16在氧诱导视网膜病变大鼠视网膜中的表达及作用机制", 国际眼科杂志, no. 02, pages 35 - 39 *
杨相颖: "6-甲基腺嘌呤RNA甲基化与眼科疾病的研究进展", 实用临床医药杂志, pages 139 - 144 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116738352A (zh) * 2023-08-14 2023-09-12 武汉大学人民医院（湖北省人民医院） 视网膜血管阻塞疾病的视杆细胞异常分类方法及装置
CN116738352B (zh) * 2023-08-14 2023-12-22 武汉大学人民医院（湖北省人民医院） 视网膜血管阻塞疾病的视杆细胞异常分类方法及装置
CN117230077A (zh) * 2023-11-13 2023-12-15 四川省医学科学院·四川省人民医院 Hakai基因在RP疾病模型构建中的应用及构建方法
CN117230077B (zh) * 2023-11-13 2024-02-23 四川省医学科学院·四川省人民医院 Hakai基因在RP疾病模型构建中的应用及构建方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN115176760B (zh) 2023-11-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN113621649B (zh) 一种视网膜色素变性疾病模型的构建方法及其应用
CN112715484B (zh) 构建视网膜色素变性疾病模型的方法、应用以及繁育方法
CN111269945B (zh) 利用Gm20541基因构建视网膜色素变性疾病模型的方法和应用
CN108029638B (zh) 一种视网膜色素变性疾病动物模型的构建方法及应用
CN114561408B (zh) 一种视网膜色素变性疾病模型的构建方法及其应用
CN115176760A (zh) 一种构建视网膜色素变性疾病模型的方法、应用及繁育方法
CN109182355B (zh) 视网膜新生血管疾病模型的构建方法和应用
CN114916502B (zh) 一种视网膜色素变性疾病模型的构建方法和应用
CN111500640B (zh) Rp疾病模型的构建方法以及培育方法
JP2020508073A (ja) 網膜分離症の非ヒト動物モデル
WO2020240876A1 (ja) エクソンヒト化マウス
WO2019080667A1 (zh) 一种共济失调动物模型的构建方法以及应用
JP2004267001A (ja) トランスジェニック哺乳動物及びその作製方法並びにこれを用いた遺伝子機能の解明方法
CN111778281B (zh) 一种视网膜双极细胞病变模型的构建方法及其应用
KR20230173124A (ko) 암컷 부화 새끼를 생산하기 위한 새 및 이를 생산하는 방법
US11653636B2 (en) Method of making a rat model of retinal degeneration and rat model made thereby
CN114255823B (zh) 一种视网膜退行性病变疾病模型的构建方法及其应用
CN117230077B (zh) Hakai基因在RP疾病模型构建中的应用及构建方法
CN117296799B (zh) 一种视网膜色素变性疾病模型的构建方法及其应用
CN114350659B (zh) elovl4b基因突变视网膜感光神经元病变斑马鱼模型的构建方法
Pandey et al. Advances in Genetic Diagnosis and Treatment of Hearing Loss—A Thirst for Revolution
CN117305364A (zh) 利用基因操作技术构建视网膜变性疾病模型的方法及应用
KR102612878B1 (ko) eif2b3 유전자를 녹아웃시킨 동물모델 및 이의 용도
CN115777626A (zh) Ift140基因视杆细胞条件敲除小鼠模型的构建方法及应用
CN117025673A (zh) 一种视网膜变性疾病模型的构建方法及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant