CN115175984A - 具有丁酸产生能力的菌株 - Google Patents

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Abstract

本发明的目的在于提供一种高效地产生丁酸的菌株及使用该菌株的丁酸的制造方法。本发明提供一种拜氏梭菌SIID27451‑B11株(保藏编号NITE BP‑02951)，其相较于拜氏梭菌基准株Clostridium beijerinckii NBRC 109359T，于37℃厌氧培养72小时后的培养液中所包含的丁酸的产生量更多，乳酸及乙酸的产生量更少。此外，本发明提供一种丁酸的制造方法，其使用SIID27451‑B11株。

Description

具有丁酸产生能力的菌株
技术领域
本发明涉及具有丁酸产生能力的菌株及使用该菌株的丁酸制造方法。
背景技术
近年来，丁酸的有用性正受到瞩目。已得知丁酸在大肠中被利用而作为能量源，有使肠内细菌丛保持健康的状态，改善免疫系统的失调的可能性。丁酸菌(丁酸产生菌)是通过代谢来产生丁酸的细菌的总称。丁酸菌为肠内细菌的一种，其在肠内分解食物纤维而产生丁酸。以往，作为在整肠剂等用途中所使用的代表性丁酸菌，已知丁酸梭菌(Clostridiumbutyricum)，但现正需要能够更高效地产生丁酸的丁酸菌。
此外，不仅是如上所述的对生物体的用途，丁酸也可以用作例如香料的合成之类的工业用途的原料。在这种用途中，也需要更高效地产生丁酸的丁酸菌。
发明内容
本发明所要解决的技术问题
本发明的目的在于提供一种高效地产生丁酸的菌株及使用该菌株的丁酸的制造方法。
解决技术问题的技术手段
本发明者等人在使大豆及草药之类的各式各样的天然原料进行发酵而制造包含丁酸、丙酸、乳酸等短链脂肪酸的发酵液的过程中，发现了一种能够高效地产生丁酸的SIID27451-B11株(保藏编号NITE BP-02951)，并加以分离。SIID27451-B11株经鉴定为拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)种的菌株SIID27451-B11株。
即，本发明提供一种拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)SIID27451-B11株(保藏编号NITE BP-02951)。
此外，本发明提供一种拜氏梭菌SIID27451-B11株，其具有序列编号1～序列编号5所示的基因组碱基序列。
此外，本发明提供一种拜氏梭菌SIID27451-B11株，其具有序列编号6所示的16SrDNA的碱基序列。
此外，本发明提供一种拜氏梭菌SIID27451-B11株，其相较于拜氏梭菌基准株Clostridium beijerinckii NBRC 109359T，于37℃厌氧培养72小时后的培养液中所包含的丁酸的产生量更多，乳酸及乙酸的产生量更少。
此外，本发明提供一种丁酸的制造方法，其使用SIID27451-B11株。
发明效果
根据本发明，提供一种丁酸产生菌，其相比于属于以往的代表性丁酸产生菌的丁酸梭菌而言能够更高效地产生丁酸，同时在与拜氏梭菌的基准株的比较中，也更高效地产生丁酸。
附图说明
[图1]表示SIID27451-B11株的菌落影像的照片。
[图2]表示SIID27451-B11株的革兰氏染色影像的照片。
[图3]表示基于SIID27451-B11株的16S rDNA部分碱基序列的简易分子系统树的图。
具体实施方式
对SIID27451-B11株的分类学性状进行了探讨。以下，在本说明书中，也将SIID27451-B11株称为B11株。另外，在没有特别说明的前提下，以下试验都在TechnoSurugaLaboratory株式会社实施。
(1)形态观察
使用GAM Broth“Nissui”(Nissui Pharmaceutical，Japan)+琼脂作为培养基，于30℃实施B11株的厌氧培养48小时。实施基于实体显微镜的菌落观察及革兰氏染色，观察检体的菌落及细胞形态。将菌落影像示于图1，将革兰氏染色影像示于图2。细胞形态为杆菌～椭圆杆菌(1.0-1.5×3.0-5.0μm)，革兰氏染色性为阳性，观察到芽孢形成。菌落的色调为米色。
(2)生理/生物化学性状
使用GAM Broth(Nissui Pharmaceutical，Japan)+琼脂作为培养基，于30℃实施B11株的厌氧培养48小时。使用厌氧性菌生物化学鉴定试剂盒API20A(bioMerieux，FRA)实施试验。将试验项目及结果示于表1。
表1：试验项目及结果
测试项目 反应/酶 结果
IND 吲哚产生<sup>*</sup> -
URE 脲酶<sup>*</sup> -
GLU 葡萄糖<sup>**</sup> +
MAN D-甘露糖醇<sup>**</sup> +
LAC 乳糖<sup>**</sup> +
SAC 白糖<sup>**</sup> +
MAL 麦芽糖<sup>**</sup> +
SAL 水杨苷<sup>**</sup> +
XYL D-木糖<sup>**</sup> +
ARA L-阿拉伯糖<sup>**</sup> +
GEL 明胶水解<sup>*</sup> -
ESC 七叶苷水解<sup>*</sup> +
GLY 甘油<sup>**</sup> +
CEL D-纤维二糖<sup>**</sup> +
MNE D-甘露糖<sup>**</sup> +
MLZ D-松三糖<sup>**</sup> -
RAF D-棉子糖<sup>**</sup> -
SOR D-山梨糖醇<sup>**</sup> +
RHA L-鼠李糖<sup>**</sup> -
TRE D-海藻糖<sup>**</sup> +
CAT 过氧化氢酶<sup>*</sup> +
SPOR 芽孢 +
GRAM 革兰氏染色性 +
COCC 球菌 -
*生物化学试验，**氧化试验
+：阳性，-：阴性
此外，实施下述项目的追加试验。将结果示于下述表2。
表2：追加试验
试验项目 试验结果
淀粉的水解 +
在5％NaCl存在下的生长 +
在6.5％NaCl存在下的生长 +
在7％NaCl存在下的生长 +
牛奶凝固试验 凝固
+：阳性，-：阴性
(3)16SrDNA部分碱基序列解析
由16SrDNA(16SrRNA基因)的部分碱基序列(约1500bp)(序列编号6)的解析结果，推定检体的归属。使用Broth“Nissui”(NissuiPharmaceutical，Japan)+琼脂作为培养基，于30℃实施B11株的厌氧培养7天。使用下述条件实施16S rDNA部分碱基序列解析。
·DNA提取：无色肽酶(achromopeptidase)(FUJIFILM Wako Pure Chemi cal，Japan)
·PCR扩增：TKs Gflex DNA聚合酶(Takara Bio，Japan)
·循环测序：BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit(Applied Biosystems，USA)
·使用引物：
PCR扩增：9F、1510R
测序：9F、515F、1099F、536R、926R、1510R
·测序：ABI PRISM3130 xl Genetic Analyzer System (Applied Biosyste ms)
·碱基序列确定：ChromasPro 2.1(Technelysium，AUS)
·BLAST相同性检索：
解析软件：ENKI(TechnoSuruga Laboratory，Japan)
数据库：
DB-BA 14.1(TechnoSuruga Laboratory)
国际碱基序列数据库(DDBJ/ENA(EMBL)/GenBank)
检索日：2019年2月22日
·简易分子系统树解析：
系统树的推定：近邻结合法
碱基置换模型：Kimura-2-parameter
树形的可靠性评估：拔靴法(bootstrap method)(重复1000次)
将结果示于表3及表4。
表3：B11株相对于DB-BA的BLAST检索结果：与上位30个碱基序列的相同率
Figure BDA0003808719330000051
注1)BSL(生物安全等级)标记出等级1(机会性病原体)以上，空白栏是指等级1.
注2)阴影部分表示供至简易分子系统解析的序列数据.
表4：B11株针对国际碱基序列数据库的BLAST检索结果：
与上位30个碱基序列的相同率
Figure BDA0003808719330000061
将基于B11株的16S rDNA部分碱基序列的简易分子系统树示于图3。图中，左上的线表示比例尺，比例尺的0.01是指尺的长度为1％的相异碱基。位于系统枝的分枝的数字表示拔靴值(bootstrap value)，其是表示树形的可靠性的值，株名的末尾的T表示该种的基准株(Type strain)，BSL表示生物安全等级(标记出BSL1*(机会性病原体)以上)。由图3可知，B11株经推定，与拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)及二醇梭菌(Clostridiumdiolis)属于近缘。
(4)菌株的保藏
由上述结果，已判明SIID27451-B11株为梭菌属的菌株。SIID27451-B11株为于2019年5月16日以保藏编号NITE P-02951的形式国内保藏于属于布达佩斯条约上的国际保藏机构(IDA)之一的独立行政法人制品评价技术基盘机构专利微生物保藏中心(NPMD)(日本国千叶县木更津市上总镰足2-5-8122号室)，并于2020年4月22日在该机构以国际保藏编号NITE BP-02951的形式移管至国际保藏。
微生物的种类：细菌细胞形状：杆菌特征：芽孢形成阳性(芽孢性)
分类学上的位置Clostridium sp.(梭菌属)
培养条件GAM Broth“Nissui”+琼脂
培养温度：30℃培养期：48小时
培养方法：厌氧性
(5)平均核苷酸一致性(Average Nucleotide Identity，ANI)解析
此外，为了探讨B11株是否为新种，对于与B11株的相同率较高的上位3种的拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)(相同率99.7％)、二醇梭菌(Clostridiu m diolis)(相同率99.7％)、糖乙酸多丁醇梭菌(Clostridium saccharoperbutylacet onicum)(相同率99.0％)，算出了平均核苷酸一致性(ANI)值，由此确定种的异同。ANI解析是在计算机上计算对照株(检体)与比较株的全长基因组序列或基因组序列草图的类似度(ANI：相同值)，判断种的异同。ANI值的运算使用公开程序ANI Calculator(http://enve-omics.ce.gatech.edu/ani/index)，若ANI值为95％以上则判定为同种，若未满95％则判定为不同种(新种)。
将ANI解析所使用的比较对象种示于下述表5。
表5：ANI解析所使用的种
Figure BDA0003808719330000071
※株3的末尾的T:基准株(Type strain)
将ANI解析的结果示于下述表6。
表6-1检体间的ANI值(％)
Figure BDA0003808719330000081
表6-2检体间的ANI值(％)
Figure BDA0003808719330000082
由于SIID27451-B11相对于糖乙酸多丁醇梭菌(Clostridium saccharoperbutylacetonicum)的ANI值为95％以下，因而判断SIID27451-B11株与糖乙酸多丁醇梭菌(Clostridium saccharoperbutylacetonicum)为不同种。SIID27451-B11相对于拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)及二醇梭菌(Clostridium diolis)而言分别显示95％以上的ANI值。拜氏梭菌与二醇梭菌的组合的ANI值也显示为95％以上。因此，判断上述3种检体为同种。另外，依据2020年的Kobayas hi等人的报告(Kobayashi H,et al.,Int J SystEvol Microbiol 2020,70:2463-2466)，显示二醇梭菌(Clostridium diolis)与拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)为同种，学名被统合成拜氏梭菌(Clostridiumbeijerinckii)。根据以上结果，将SIID27451-B11鉴定为拜氏梭菌(Clostridiumbeijerinckii)。
(6)基因组解析
提取出SIID27451-B11株的DNA，实施次世代测序解析及其数据解析。
＜DNA的提取及纯化＞
使用Nucleobond AXG20管柱(MACHEREY-NAGEL，DE)实施B11株的DNA的提取及纯化，使用超微量分光光度计NanoDrop One(Thermo Fisher Scientific，USA)实施所提取出的DNA的纯度测定。质量检查合格基准设为纯度：A260(在波长260nm处的吸亮度，以下相同)/A280≥1.8，A260/A230≥1.6，20μg(浓度150ng/μL)以上。接着，通过琼脂糖电泳实施所提取出的DNA的片段化的确认。设定条件为设为0.5％琼脂糖，30V，1小时。电泳的结果，所提取出的DNA相较于λDNA分子量标记(λ-Hind III digest)而言，在23130bp附近观察到条带，片段化较少，因而判断为属于可用于次世代测序的质量。
<次世代测序>
次世代测序解析及其数据解析委托北海道System Science株式会社实施。
对所提取及纯化而得的SIID27451-B11株的DNA试样，使用次世代测序仪PacBioRS II实施次世代测序解析，获得基因组序列信息。
由NCBI(National Center for Biotechnology Information，美国国立生物技术信息中心)的WEB网站(https：//ftp.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/all/GCA/002/006/445/GCA_002006445.1_ASM200644v1)取得拜氏梭菌(C.beijerinckii)基准株(GCA_002006445.1)的基因组序列信息。
对SIID27451-B11及拜氏梭菌基准株的基因组序列信息，实施经由日本国立遗传学研究所提供的原核生物用自动注解程序“DFAST”的自动注解，实施基因区域预测及注解信息的赋予。
以解析完毕的SIID27451-B11及拜氏梭菌基准株的注解信息为基础，实施利用COG(Clusters of Orthologous Groups of protein，同源蛋白簇)机能分类信息的2菌株间的基因组序列草图比较。COG为以NCBI提供的微生物为中心的基因机能分类数据库。
将所使用的拜氏梭菌基准株的基因组信息概要示于表7，将SIID27451-B11的基因组信息概要示于表8。
[表7]
样品名：C.beijerinckii strain DSM 791(基准株)
样品ID：GCA_002006445.1
种名：Clostridium beijerinckii
数据取得处：NCBI(※1)
Figure BDA0003808719330000091
将表7所示的拜氏梭菌基准株的264个重叠群(contig)序列分别定为序列编号7～序列编号270。
[表8]
样品名：27451-B11
样品ID：Ig18351
种名：Clostridium beijerinckii
Figure BDA0003808719330000101
将表8中所示的SIID27451-B11的5个重叠群序列序列1～序列5分别定为序列编号1、序列编号2、序列编号3、序列编号4及序列编号5。
将通过利用DFAST的注解处理所检测出的各菌株的预测基因数(ORF/rR NA/tRNA)示于表9。
表9：各菌株的预测基因数
Figure BDA0003808719330000102
其次，在通过DFAST所检测出的所有ORF信息中，着眼于已附加COG注解的ORF信息，将基准株及B11株各自所保有的已得知COG机能分类的基因的信息进行比较，摘取出仅在任一方的菌株中特异性地检测出的COG注解信息。将在拜氏梭菌基准株及SIID27451-B11株中特异性地检测出的COG注解信息总结示于表10。
表10：在基准株及B11株中特异性地检测出的注解信息的比较
Figure BDA0003808719330000111
由上述结果可知，在拜氏梭菌基准株与SIID27451-B11株中，具有注解不同的序列。由此，SIID27451-B11株经推定为具有与拜氏梭菌种的基准株不同的性质的菌株。
如上所述，对B11株的分类学性状进行了探讨的结果，B11株经鉴定为拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)种，而基因组解析的结果，可知其具有与基准株注解不同的序列。于是，为了进一步确认B11株为具有与拜氏梭菌的基准株不同的性质的菌株，使用B11株、属于代表性丁酸产生菌的丁酸梭菌(Cl ostridium butyricum)的基准株及拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)的基准株，对有机酸产生能力进行了比较。将详情示于下述实施例1。
实施例
实施例1：有机酸产生能力试验
使用GAM Broth(Nissui Pharmaceutical,Japan)作为培养基，将各菌株于37℃厌氧培养72小时。将培养液以孔径0.20μm的膜过滤器进行过滤，制成试样溶液。通过高效液相层析测定试样溶液中所包含的有机酸的浓度。本试验于2020年2月13日在TechnoSurugaLaboratory株式会社实施。测定条件如下所述。
·系统：岛津有机酸分析系统(Shimadzu，Japan)
·管柱：Shim-pack SCR-102(H)，300mm×8mm ID，以2根串联使用
·保护管柱：Shim-pack SCR-102(H)，50mm×6mm ID
·溶离液：5mmol/L对甲苯磺酸
·反应液：5mmol/L对甲苯磺酸，100μmol/L EDTA，20mmol/L Bis-Tris
·流速：0.8mL/min
·烘箱温度：45℃
·检测器：导电度检测器CDD-10A
作为测定对象的有机酸为琥珀酸、乳酸、甲酸、乙酸、丙酸、异丁酸、正丁酸、异戊酸、正戊酸共9种。将结果示于下述表11。
表11：有机酸产生能力试验(μg/mL)
Figure BDA0003808719330000121
表中，空白栏小于定量下限。关于定量下限，对于琥珀酸、乳酸、乙酸、丙酸而言为5μg/mL，对于甲酸、异丁酸、正丁酸、异戊酸、正戊酸而言为10μg/mL。另外，对于丙酸而言为包含杂质的值。
可知相较于作为丁酸菌所周知的丁酸梭菌而言，B11株产生多达2.74倍的正丁酸。此外，可知若B11扣除培养基(对照组)中所包含的有机酸量，则大致上仅产生丁酸。与之相对，丁酸梭菌除了丁酸以外，也产生乳酸、甲酸、乙酸。由此，B11株称得上是极有效率且选择性地产生丁酸的丁酸产生菌。特别是B11几乎不产生甲酸。甲酸被认为对人体有不良影响。由于B11几乎不产生该甲酸，因而可期待在生物体用途中的应用。
此外，可知若将B11株与拜氏梭菌的基准株Clostridium beijerinckii NB RC109359T进行比较，则所产生的有机酸的种类及量不同。B11株相较于基准株Clostridiumbeijerinckii NBRC 109359T而言，乳酸的产生为定量极限以下，乙酸的产生量更少，丁酸的产生量更多。从而，B11株经判定为具备与拜氏梭菌种的基准株不同的性质的菌株。
[保藏生物材料的叙述]
(1)保藏机构名称：独立行政法人制品评价技术基盘机构专利微生物保藏中心
(2)联络处：〒292-0818日本国千叶县木更津市上总镰足2-5-8 122号室电话号码0438-20-5580
(3)保藏编号：NITE BP-02951
(4)用于识别的标示：SIID27451-B11
(5)原保藏日：2019年5月16日
PCT/RO/134表
Figure 000001

Claims (5)

1.一种拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)SIID27451-B11株(保藏编号N ITE BP-02951)。
2.根据权利要求1所述的拜氏梭菌SIID27451-B11株，其具有序列编号1～序列编号5所示的基因组碱基序列。
3.根据权利要求1所述的拜氏梭菌SIID27451-B11株，其具有序列编号6所示的16SrDNA的碱基序列。
4.根据权利要求1所述的拜氏梭菌SIID27451-B11株，其相较于拜氏梭菌基准株Clostridium beijerinckii NBRC 109359T，于37℃厌氧培养72小时后的培养液中所包含的丁酸的产生量更多，乳酸及乙酸的产生量更少。
5.一种丁酸的制造方法，其使用权利要求1至4中任一项所述的SIID27451-B11株。
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