CN115175689A - Zscan4核酸和蛋白质向细胞和组织的基于温度的瞬时递送 - Google Patents

Zscan4核酸和蛋白质向细胞和组织的基于温度的瞬时递送 Download PDF

Info

Publication number
CN115175689A
CN115175689A CN202080097320.7A CN202080097320A CN115175689A CN 115175689 A CN115175689 A CN 115175689A CN 202080097320 A CN202080097320 A CN 202080097320A CN 115175689 A CN115175689 A CN 115175689A
Authority
CN
China
Prior art keywords
temperature
cells
sensitive
subject
agent
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202080097320.7A
Other languages
English (en)
Inventor
M·S·H·柯
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Iliksgen Treatment Co
Original Assignee
Iliksgen Treatment Co
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Iliksgen Treatment Co filed Critical Iliksgen Treatment Co
Priority to CN202310278179.6A priority Critical patent/CN116726199A/zh
Publication of CN115175689A publication Critical patent/CN115175689A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/28—Bone marrow; Haematopoietic stem cells; Mesenchymal stem cells of any origin, e.g. adipose-derived stem cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/1703—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • A61K38/1709—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/0008—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/635—Externally inducible repressor mediated regulation of gene expression, e.g. tetR inducible by tetracyline
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0647—Haematopoietic stem cells; Uncommitted or multipotent progenitors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/22—Colony stimulating factors (G-CSF, GM-CSF)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/18011—Paramyxoviridae
    • C12N2760/18811—Sendai virus
    • C12N2760/18841—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2760/18843—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/10—Plasmid DNA
    • C12N2800/106—Plasmid DNA for vertebrates
    • C12N2800/107—Plasmid DNA for vertebrates for mammalian

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Marine Sciences & Fisheries (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

本公开文本涉及用于在一个或多个细胞中瞬时激活温度敏感性药剂的方法，例如通过使一个或多个细胞与温度敏感性药剂接触并在允许温度下瞬时孵育所述细胞以诱导所述细胞中温度敏感性药剂的活性。另外，本公开文本涉及使受试者中的一个或多个细胞与温度敏感性药剂接触，然后将所述受试者的体温降低至允许温度以诱导所述细胞中温度敏感性药剂的活性的方法。本公开文本还涉及用温度敏感性治疗剂治疗受试者的方法。特别地，本公开文本提供了用于将ZSCAN4核酸和蛋白质温度敏感地递送至细胞的工具。

Description

ZSCAN4核酸和蛋白质向细胞和组织的基于温度的瞬时递送
相关申请的交叉引用
本申请要求2020年3月20日提交的美国临时申请号62/992,745和2019年12月31日提交的美国临时申请号62/955,820的权益，将这些申请的公开文本通过引用以其全文特此并入。
以ASCII文本文件提交序列表
将以下提交的ASCII文本文件的内容通过引用以其整体并入本文：序列表的计算机可读形式(CRF)(文件名称：699442001340SEQLIST.TXT，记录日期：2020年12月23日，大小：25KB)。
技术领域
本公开文本涉及用于在一个或多个细胞中瞬时激活温度敏感性药剂(ts药剂)的方法，例如通过使一个或多个细胞与ts药剂接触并在允许温度下瞬时孵育细胞以诱导所述细胞中ts药剂的活性。对于离体治疗策略，将一个或多个细胞在允许温度下用治疗性ts药剂离体处理，随后在非允许温度(例如，受试者的正常核心体温)下将细胞转移到受试者。对于体内治疗策略，将治疗性ts药剂递送至维持在允许温度下的受试者，从而允许所述治疗性ts药剂在有限的时间内在体内起作用，然后当受试者的体温恢复正常时或当受试者的表面体温升高(例如，非允许温度)时，永久关闭ts药剂。可替代地，将治疗性ts药剂递送至受试者，随后通过将受试者的核心体温降低至允许温度以诱导受试者的细胞中治疗性ts药剂的活性来瞬时激活ts药剂。特别地，本公开文本提供了用于将ZSCAN4核酸和蛋白质温度敏感地递送至细胞的工具。
背景技术
将治疗性基因产物递送至人体细胞、组织和器官是巨大的挑战。对于需要持续表达基因以补充患者中基因缺陷的传统基因疗法，这已经通过使用病毒载体如逆转录病毒、慢病毒、腺病毒或腺相关病毒实现。然而，同样重要的策略基因疗法涉及基因的瞬时、短期表达。对于这样的应用，不需要基因的持续表达，并且实际上这可能对细胞有害。
例如，CAS9是切割DNA的细菌酶。它是基于CRISPR/CAS9的基因编辑复合物的重要组分，其已被考虑用于基因疗法。指导RNA和CAS9均可由单个仙台病毒载体上的基因编码(Park等人,2016)。为了在治疗上使用基因编辑系统，必须将含有CRISPR-CAS9的载体引入人体细胞或人体内。然而，CAS9的持续表达可导致DNA断裂和突变的引入。因此，希望CAS9在短时间内表达，例如，约数小时或数天，而不是一周或更长时间。
基因短期表达的另一个应用是用于细胞重编程。最近，已经表明一组转录因子的异位表达可以将细胞转化为治疗上有用的细胞类型。例如，一组三种转录因子可以将胰管细胞转化为分泌胰岛素的胰腺β细胞(Zhou等人,2008)。另一组转录因子可以将成纤维细胞转化为心肌细胞(Ieda等人,2010)。认为将这些转录因子体内递送至人体内可用作一种类型的再生医学。然而，希望使这些有效的改变细胞身份的转录因子仅瞬时表达，因为这些有效转录因子的持续表达可能造成损害。
如上述例子所强调的，使用导致基因持续表达的病毒载体的传统基因疗法可能是不希望的。对于基因产物的限时表达，已经开始使用将合成的或体外转录的mRNA递送至细胞中(Warren等人,2010)。然而，这些方法存在若干问题。例如，递送至细胞、组织和器官的mRNA的量是有限的，因此，蛋白质产物的量可能不足以在体内产生具有生物学意义的效果。
此外，由于RNA的快速更新(turn-over)，其通常仅持续最多12小时(Warren等人,2010；Goparaju等人,2017)，必须多次将合成的RNA转染到细胞中。对于人多能干细胞如胚胎干细胞和诱导多能干细胞(iPS)的强制分化，需要在几天的过程内每天转染两次(Akiyama等人,2016；Goparaju等人2017)。为了从人成纤维细胞生成iPS细胞，必须持续超过两周每天转染合成RNA的混合物(Warren等人,2010)。这不仅麻烦，而且效率低。
对于iPS细胞的生成，这个问题通过使用自我复制RNA来解决，这使得仅在一次递送后能够长期表达(Yoshioka等人,2013)。自我复制RNA是单链RNA，其通常通过去除编码病毒颗粒形成所需的结构蛋白的DNA而从甲病毒(Jose等人,2009)，例如委内瑞拉马脑炎病毒(VEEV)、辛德比斯病毒(SINV)和塞姆利基森林病毒(SFV)产生(Petrakova等人,2005)。自我复制RNA编码非结构蛋白(nsP)，所述非结构蛋白作为RNA依赖性RNA聚合酶来复制自我复制RNA自身并产生用于翻译的转录物。自我复制RNA也可包括编码目的蛋白的目的基因(GOI)和其他遗传元件。由于其RNA的正反馈产生，自我复制RNA可以以高水平表达GOI。可以将自我复制RNA作为裸RNA(即合成RNA)或作为病毒颗粒递送至哺乳动物细胞，所述病毒颗粒可通过包装辅助细胞补充缺失的病毒结构蛋白而产生。
自我复制RNA载体的优点是它们的自我复制特征，这导致GOI表达水平的增强。然而，将RNA/蛋白质递送至哺乳动物细胞的自我复制RNA载体的缺点之一是它们的持续表达。通常，RNA依赖性RNA聚合酶和GOI的正反馈产生会持续，这可导致用裸RNA形式的自我复制RNA转染或用病毒形式的自我复制RNA感染的细胞死亡。
因此，基因疗法领域需要瞬时表达编码目的蛋白质的GOI的工具，例如治疗剂(例如人ZSCAN4)。特别地，期望控制RNA载体和自我复制RNA的转录和翻译。
发明内容
基于目的基因(GOI)限时表达的必要性，需要瞬时基因产物递送系统，其中核酸或蛋白质可以在体外或体内被递送至特定细胞或在特定细胞中表达，其中核酸/蛋白质的量足以具有生物学上有意义的效果，并且其中瞬时表达可以在实现生物学上有意义的效果后永久关闭。为了满足这些和其他需要，本公开文本涉及用于在受试者中(体内)或在培养的细胞中(离体)瞬时诱导温度敏感性药剂(ts药剂)如治疗性ts药剂的活性的工具。在一些实施方案中，所述治疗性ts药剂与温和的治疗性低体温组合使用。在其他实施方案中，所述治疗性ts药剂与温和的治疗性高体温或局部加热组合使用。在一些实施方案中，所述ts药剂是ts-RNA分子或ts-蛋白质分子。在一些实施方案中，所述ts药剂由插入温度敏感性病毒载体中的异源核酸或自我复制RNA编码。在一些实施方案中，所述病毒载体选自但不限于仙台病毒载体、逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体和α病毒载体。在一些实施方案中，所述自我复制RNA包含缺乏病毒结构蛋白编码区的甲病毒复制子。在一些实施方案中，所述甲病毒选自但不限于委内瑞拉马脑炎病毒、辛德比斯病毒和塞姆利基森林病毒。特别感兴趣的基因产物是ZSCAN4，特别是人ZSCAN4。
本公开文本的上述和其他目的和特征将从以下参照附图进行的详细描述中变得更清楚。
附图说明
图1A-图1D描述了委内瑞拉马脑炎病毒(VEEV)基因组的结构和突变区域的位置。图1A显示野生型VEEV基因组(TC-83毒株：完整基因组11,446bp线性RNA：NCBI登录号：L01443.1 GI：323714)的示意图。非结构蛋白(nsP1、nsP2、nsP3、nsP4)的基因编码RNA依赖性RNA聚合酶，并且结构蛋白的基因编码病毒包膜蛋白(C、E1、E2)。5’-UTR(5'-非翻译区)和3’-UTR(3'-非翻译区)。以粗体框表示的nsP2蛋白的基因发生突变以产生温度敏感性。图1B显示了具有突变1的nsP2(温度敏感性突变体1：ts1)的示意图。在氨基酸439与440之间插入五个氨基酸。图1C显示了具有突变2的nsP2(ts2)的示意图。在氨基酸586与587之间插入五个氨基酸。图1D显示了具有突变3的nsP2(ts3)的示意图。在氨基酸594与595之间插入五个氨基酸。
图2A-图2C描述了VEEV nsP2的部分序列，其对应于ts1、ts2和ts3中突变的区域。图2A显示与突变体1(ts1)相比的野生型序列，所述突变体1(ts1)包括导致5个氨基酸插入的15个核苷酸插入。图2B显示与突变体2(ts2)相比的野生型序列，所述突变体2(ts2)包括导致5个氨基酸插入的15个核苷酸插入。图2C显示与突变体3(ts3)相比的野生型序列，所述突变体3(ts3)包括导致5个氨基酸插入的15个核苷酸插入。
图3描述了野生型(TC-83毒株)和突变体4(ts4)的VEEV nsP1的部分核苷酸序列，其分别如SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20所示。5’-UTR和51-nt CSE(保守序列元件)以粗体显示。ts4中的突变核苷酸加下划线。
图4A和图4B描述了测试srRNA1ts2和srRNA1ts3在30℃、32℃和37℃下的温度敏感性。生成了野生型(srRNA1wt-GFP)和突变体(srRNA1ts2-GFP、srRNA1ts3-GFP)自我复制RNA(srRNA)载体。将体外转录产生的RNA转染到人诱导多能干细胞(ADSC-iPSC品系)中。在分别维持在30℃、32℃和37℃下的CO2培养箱中培养细胞。分别在20小时和48小时获得细胞照片。上图显示相对比图像，并且下图显示检测绿色荧光蛋白(GFP)的表达的荧光图像。图4A显示用srRNA1wt-GFP、srRNA1ts2-GFP和srRNA1ts3-GFP RNA转染细胞的结果。图4B显示用编码GFP的合成mRNA(synRNA-GFP)转染细胞的结果。
图5描述了测试srRNA1ts1和srRNA1ts2在32℃下的温度敏感性。生成了野生型(srRNA1wt-GFP)和突变体(srRNA1ts2-GFP和srRNA1ts1-GFP)自我复制RNA(srRNA)载体。将体外转录产生的RNA转染到人诱导多能干细胞(ADSC-iPSC品系)中。在维持在32℃下的CO2培养箱中培养细胞。在24、48、72、96、120、144、168、192、240、288小时获得细胞照片。对于srRNA1ts1-GFP，仅拍摄24小时和168小时的照片。上图显示相对比图像，并且下图显示检测GFP的表达的荧光图像。
图6描述了测试srRNA1ts2和srRNA1ts4在32℃、33℃、37℃下的温度敏感性。生成了突变体(srRNA1ts2-GFP和srRNA1ts4-GFP)自我复制RNA(srRNA)载体。将体外转录产生的RNA转染到人诱导多能干细胞(ADSC-iPSC品系)中。在分别维持在32℃、33℃、37℃下的CO2培养箱中培养细胞。在20、48、96小时获得细胞照片。上图显示相对比图像，并且下图显示检测GFP的表达的荧光图像。
图7描述了测试维持在32℃下的突变体srRNA1ts2-GFP的温度敏感性。将通过突变体载体体外转录产生的RNA(srRNA1ts2-GFP)转染到人诱导多能干细胞(ADSC-iPSC品系)中。在维持在32℃下的CO2培养箱中培养细胞。srRNA1ts2-GFP载体含有在“IRES”序列后插入的嘌呤霉素N-乙酰转移酶(pac)选择基因，因此，可以使用嘌呤霉素选择转染的细胞。在不存在(上图)或存在(下图)1μg/ml嘌呤霉素的情况下进行实验。在24、48、96、144、168、192小时获得细胞照片。上图显示相对比图像，并且下图显示检测GFP的表达的荧光图像。
图8描述了在24小时采用从32℃到37℃的温度转换测试突变体srRNA1ts2-GFP的温度敏感性。将通过突变体载体体外转录产生的RNA(srRNA1ts2-GFP)转染到人诱导多能干细胞(ADSC-iPSC品系)中。在维持在32℃下的CO2培养箱中培养细胞。在24小时，将细胞转移到维持在37℃下的CO2培养箱中。srRNA1ts2-GFP载体含有在“IRES”序列后插入的嘌呤霉素N-乙酰转移酶(pac)选择基因，因此，可以使用嘌呤霉素选择转染的细胞。在不存在(上图)或存在(下图)1μg/ml嘌呤霉素的情况下进行实验。在24、48、96、144、168、192小时获得细胞照片。上图显示相对比图像，并且下图显示检测GFP的表达的荧光图像。
图9描述了在48小时采用从32℃到37℃的温度转换测试突变体srRNA1ts2-GFP的温度敏感性。将通过突变体载体体外转录产生的RNA(srRNA1ts2-GFP)转染到人诱导多能干细胞(ADSC-iPSC品系)中。在维持在32℃下的CO2培养箱中培养细胞。在48小时，将细胞转移到维持在37℃下的CO2培养箱中。srRNA1ts2-GFP载体含有在“IRES”序列后插入的嘌呤霉素N-乙酰转移酶(pac)选择基因，因此，可以使用嘌呤霉素选择转染的细胞。在不存在(上图)或存在(下图)1μg/ml嘌呤霉素的情况下进行实验。在24、48、96、144、168、192小时获得细胞照片。上图显示相对比图像，并且下图显示检测GFP的表达的荧光图像。
图10描述了在72小时采用从32℃到37℃的温度转换测试突变体srRNA1ts2-GFP的温度敏感性。将通过突变体载体体外转录产生的RNA(srRNA1ts2-GFP)转染到人诱导多能干细胞(ADSC-iPSC品系)中。在维持在32℃下的CO2培养箱中培养细胞。在72小时，将细胞转移到维持在37℃下的CO2培养箱中。srRNA1ts2-GFP载体含有在“IRES”序列后插入的嘌呤霉素N-乙酰转移酶(pac)选择基因，因此，可以使用嘌呤霉素选择。在不存在(上图)或存在(下图)1μg/ml嘌呤霉素的情况下进行实验。在24、48、96、144、168、192小时获得细胞照片。上图显示相对比图像，并且下图显示检测GFP的表达的荧光图像。
图11A-图11D描述了在成纤维细胞中测试突变体srRNA1ts2-GFP的温度敏感性。将通过突变体载体体外转录产生的RNA(srRNA1ts2-GFP)转染到人新生真皮成纤维细胞(HDFn品系)中。在维持在32℃下的CO2培养箱中培养细胞。在24、48和96小时获得细胞照片。上图显示相对比图像，并且下图显示检测GFP的表达的荧光图像。图11A和图11B描述了使用JetMessenger(Polyplus)进行的转染。在单独的标准培养基(图11A)或补充有200ng/mlB18R的标准培养基(图11B)中培养细胞。图11C和图11D描述了使用MessengerMax(ThermoFisher)进行的转染。在单独的标准培养基(图11C)或补充有200ng/ml B18R的标准培养基(图11D)中培养细胞。
图12描述了对应于各种甲病毒家族成员的nsP2突变体2(ts2)的氨基酸序列的比对。左图描述了SEQ ID NO:21-28所示的野生型序列的比对(部分复制自Russo等人,2006的图1)，而右图描述了SEQ ID NO:29-36所示的突变体序列的比对，所述突变体序列包括在nsP2的二级结构中的“β5”与“β6”(第5个和第6个“β链)之间插入5个氨基酸。VEEV(委内瑞拉马脑炎病毒)、Aura(奥拉病毒)、WEEV(西部马脑炎病毒)、BFV(巴马森林病毒)、ONNV(奥-奈氏病毒)、RRV(罗斯河病毒)、SFV(塞姆利基森林病毒)、和SINV(辛德比斯病毒)。
图13描述了显示用温度敏感性药剂(ts药剂)对细胞进行的典型离体处理的示意图。ts药剂如srRNA或仙台病毒载体在允许温度(例如33℃)下起作用，但在非允许温度(例如37℃)下不起作用。用ts药剂处理的靶细胞在允许温度下培养特定的持续时间(例如，3天)，然后在非允许温度下继续培养特定的持续时间(例如，10天)。目的基因(GOI)的RNA(或从RNA翻译的蛋白质)的预期水平在允许温度下增加并达到高水平。在转换至非允许温度后，RNA(或蛋白质)的预期水平随着转录和翻译停止而逐渐降低。
图14描述了显示示例性离体治疗程序的示意图。温度敏感性药剂(ts药剂)如srRNA或仙台病毒载体在允许温度(例如33℃)下起作用，但在非允许温度(例如37℃)下不起作用。靶细胞取自患者的身体(自体移植物)，并在允许温度下例如在33℃下与ts药剂离体孵育特定的持续时间，例如24小时。然后，将具有ts药剂的靶细胞移植到患者体内。在37℃的非允许温度下，ts药剂在患者体内不起作用。
图15描述了显示另一示例性离体治疗程序的示意图。温度敏感性药剂(ts药剂)如srRNA或仙台病毒载体在允许温度(例如33℃)下起作用，但在非允许温度(例如37℃)下不起作用。靶细胞取自供体的身体(同种异体移植物)，并在允许温度下例如在33℃下与ts药剂离体孵育特定的持续时间，例如24小时。然后，将具有ts药剂的靶细胞移植到患者体内。在37℃的非允许温度下，ts药剂在患者体内不起作用。
图16描述了显示示例性半体内治疗程序的示意图。温度敏感性药剂(ts药剂)如srRNA或仙台病毒载体在允许温度(例如33℃)下起作用，但在非允许温度(例如37℃)下不起作用。患者经历治疗性低体温的程序，并且患者的核心体温维持在低于正常体温(例如，37℃)的降低的温度(例如，33℃)下。用ts药剂离体处理靶细胞(自体的或同种异体的)并立即输注到患者的循环中或注射到患者的器官中。当患者在降低的温度(例如，33℃)下维持一定时间(例如，24小时)时，ts药剂起作用。随后，患者的核心体温返回到正常温度(37℃)，此时ts药剂不再起作用。
图17描述了显示示例性体内治疗程序的示意图。温度敏感性药剂(ts药剂)如srRNA或仙台病毒载体在允许温度(例如33℃)下起作用，但在非允许温度(例如37℃)下不起作用。患者经历治疗性低体温的程序，并且患者的核心体温维持在低于正常体温(例如，37℃)的降低的温度(例如，33℃)下。将ts药剂直接全身递送或递送至特定器官、组织或细胞类型。当患者在降低的温度(例如，33℃)下维持一定时间(例如，24小时)时，ts药剂起作用。随后，患者的核心体温返回到正常温度(37℃)，此时ts药剂不再起作用。
图18显示了包括人ZSCAN4的编码区(开放阅读框)的示例性温度敏感性仙台病毒载体(SeV18+hZscan4/TS15ΔF；也称为“SeVts-ZSCAN4”)的示意图。已被描述为TS15(Ban等人,2011)的载体骨架缺乏复制感染性子代病毒所需的F(融合)基因。因此，该载体不将病毒从感染细胞传递到未感染细胞。该载体编码两个RNA聚合酶基因(P和L)和三个结构蛋白基因(NP、M和HN)，并且在M、HN、P和L基因中含有点突变，这使载体对温度敏感：在33℃下是允许的；高于37℃是非允许的。为了构建SeVts-ZSCAN4，将人ZSCAN4基因的编码区插入TS15载体骨架中NP基因的上游，其位置在仙台病毒基因组中的基因中提供最高表达。
图19表明与SeVts-ZSCAN4接触并在允许温度(例如，33℃)下孵育16或24小时的大多数人CD34+细胞表达ZSCAN4蛋白。
图20A和图20B表明与SeVts-ZSCAN4接触并在允许温度(例如，33℃)下孵育的人CD34+细胞表达ZSCAN4蛋白，但当随后在非允许温度(例如，37℃)下孵育时开始丧失ZSCAN4蛋白表达。
图21表明与SeVts-ZSCAN4接触并在允许温度(例如，33℃)下孵育少至24小时的人CD34+细胞的端粒被延长。
图22描述了显示实施例14的离体程序的示意图，其中在允许温度(例如，33℃)下使人CD34+细胞与ZSCAN4治疗性ts药剂接触，并且随后输注到具有非允许正常体温(例如，37℃)的免疫受损小鼠中以评估CD34+细胞植入的安全性和功效。
图23表明在允许温度(例如，33℃)下SeVts-ZSCAN4处理24小时在体外延长人CD34+细胞的端粒方面是有效的。
图24表明如果注射到小鼠中的人CD34+细胞首先与SeVts-ZSCAN4接触并在允许温度(例如，33℃)下进行体外孵育，则植入免疫受损小鼠中的人细胞的端粒更长。小鼠492和小鼠493接受SeVts-ZSCAN4接触的CD34+细胞，而小鼠496接受未与SeVts-ZSCAN4接触的CD34+细胞。
图25描述了显示实施例15的离体治疗程序的示意图，其中在允许温度(例如，33℃)下使自体CD34+细胞与ZSCAN4治疗性ts药剂接触，并且随后输注到具有非允许正常体温(例如，37℃)的患者中。
图26显示了实施例15的临床程序的流程图，所述临床程序用于评价在患有端粒生物学障碍和骨髓衰竭的人患者中与SeVts-ZSCAN4接触的自体CD34+细胞。
图27描述了显示实施例15的离体治疗程序的另一示意图，所述离体治疗程序用于评价在患有端粒生物学障碍和骨髓衰竭的人患者中与SeVts-ZSCAN4接触的自体CD34+细胞。
图28描述了显示示例性体内治疗程序的示意图。温度敏感性药剂(ts药剂)如srRNA或仙台病毒载体在允许温度(例如31℃-34℃)下起作用，但在非允许温度(例如，>37℃)下不起作用。等于或略低于患者身体表面的温度(体表温度)即约31℃-34℃低于患者核心体温即约37℃。通过皮内、皮下或肌内施用将ts药剂直接递送至患者，其中其在患者的体表体温下起作用。无需采取进一步措施。可替代地，当不再需要ts药剂的功能时，可通过瞬时增加患者体表体温使ts药剂失去功能。
图29描述了显示示例性体内治疗程序的示意图。温度敏感性药剂(ts药剂)如srRNA或仙台病毒载体在允许温度(例如31℃-35℃)下起作用，但在非允许温度(例如，>37℃)下不起作用。患者身体的气道的温度(气道温度)(鼻腔和上气管为约32℃，且亚段支气管为约35℃(McFadden等人,1985))低于患者的核心体温即约37℃。通过经鼻施用(例如，吹入、吸入或滴注)将ts药剂直接递送至患者，其中其在患者的气道温度下起作用。无需采取进一步措施。当不再需要ts药剂的功能时，可通过瞬时增加患者的气道温度使ts药剂失去功能。
具体实施方式
综述
申请人已经证明可以在允许温度下培养细胞以诱导温度敏感性治疗剂的活性，并且所述活性可以在细胞中产生治疗效果。此外，温度敏感性治疗剂的活性可以通过随后在非允许温度下孵育细胞来降低或抑制。申请人还首次提供了在体内使用温度敏感性药剂(ts药剂)的方法。体外使用的相同类型的ts药剂可以在体内使用。例如，在将ts药剂施用至受试者的核心后，可将受试者的核心体温降低到允许温度以诱导ts药剂的活性。可替代地，在将ts药剂施用至受试者的表面(表皮、真皮、皮下组织或骨骼肌)后，将受试者的表面体温维持在允许温度以诱导ts药剂的活性。受试者的表面体温可以自然或人为地维持。这些方法提供了递送和瞬时激活治疗剂如核酸和多肽的新方法。特别地，本公开文本提供了用于将ZSCAN4核酸和蛋白质温度敏感地递送至细胞的工具。
因此，本公开文本一般涉及在体外瞬时诱导温度敏感性药剂(例如，温度敏感性治疗剂)的活性的方法。在一些实施方案中，将一个或多个包含温度敏感性治疗剂的细胞在允许温度下培养以诱导温度敏感性治疗剂的活性。将细胞在允许温度下培养一定的时间段，所述时间段足以使温度敏感性治疗剂在细胞中诱导治疗效果。然后将细胞返回非允许温度，其中所述非允许温度降低或抑制温度敏感性治疗剂的活性。在另一个实施方案中，所述一个或多个细胞尚未包含温度敏感性治疗剂，并且首先与温度敏感性治疗剂接触。在一些实施方案中，在所述一个或多个细胞中诱导治疗效果后，将所述细胞施用至有需要的受试者。在一些实施方案中，从需要治疗的受试者中分离所述一个或多个细胞，并且在用温度敏感性治疗剂处理后，将细胞返回至所述受试者。
在另一方面，本公开文本涉及在体内瞬时诱导温度敏感性药剂(例如，温度敏感性治疗剂)的活性的方法。在一些实施方案中，受试者中的一个或多个细胞包含温度敏感性治疗剂，并且将受试者的体温降低至允许温度，持续一定的时间段，所述时间段足以使温度敏感性治疗剂在细胞中诱导治疗效果，然后使受试者的体温返回到正常体温。在另一个实施方案中，将温度敏感性治疗剂在受试者体温降低至允许温度之前或之后施用至受试者。
本公开文本的其他方面涉及通过以下方法治疗疾病或病症：从患有所述疾病或病症的受试者(有需要的受试者)的骨髓动员CD34+细胞，从受试者分离所述动员的细胞，在约33℃±0.5℃的温度下孵育所述分离的细胞，将所述细胞与温度敏感性病毒载体(如仙台病毒载体)或温度敏感性自我复制RNA(srRNA)接触，其中所述病毒载体或所述srRNA包含编码目的蛋白质的异源核酸分子，将接触的细胞在约33℃±0.5℃下维持足够的时间段，其中所述病毒载体或所述srRNA能够在33℃±0.5℃下复制，并且所述病毒载体或所述srRNA的复制导致异源核酸分子的表达增加，以及将接触的细胞输注到所述受试者中，从而植入所述接触的细胞并治疗所述疾病或病症。可替代地，在从受试者分离动员的细胞后，将分离的细胞与温度敏感性病毒载体(例如仙台病毒载体)或温度敏感性srRNA接触，然后在约33℃±0.5℃的温度下孵育细胞。在一些实施方案中，所述疾病或病症是端粒生物学障碍，并且所述目的蛋白是ZSCAN4，例如人ZSCAN4。
在另一方面，本公开文本涉及通过向患有疾病或病症的受试者(有需要的受试者)施用温度敏感性病毒载体(如仙台病毒载体)或温度敏感性自我复制RNA(srRNA)来治疗所述疾病或病症，其中所述病毒载体或所述srRNA包含编码目的蛋白的异源核酸，将受试者的核心体温降低至约33℃±0.5℃，将受试者的核心体温在约33℃±0.5℃下维持足够的时间段，其中所述病毒载体或srRNA能够在33℃±0.5℃下复制，并且病毒载体或srRNA的复制导致异源核酸的表达增加，以及使受试者的核心体温返回到正常。可替代地，在施用温度敏感性病毒载体(如仙台病毒载体)或温度敏感性srRNA之前，将受试者的核心体温降低至约33℃±0.5℃。在一些实施方案中，所述疾病或病症是端粒生物学障碍，并且所述目的蛋白是ZSCAN4，例如人ZSCAN4。
关于通过向受试者施用ts药剂或包含ts药剂的细胞来治疗疾病或病症的方法的参考和权利要求，其一般和特定形式同样涉及：
a)ts药剂或包含ts药剂的细胞在制备用于治疗疾病或病症的药物中的用途；和
b)用于治疗疾病或病症的包含ts药剂或含有ts药剂的细胞的药物组合物。
在前述段落的方法的一些实施方案中，异源核酸包含目的基因(GOI)或编码目的蛋白。换言之，异源核酸包含目的蛋白的编码区。在优选的实施方案中，目的蛋白是ZSCAN4，如人ZSCAN4或其变体。
定义
如本文和所附权利要求中所用，单数形式“一个/一种(a)”、“一个/一种(an)”和“所述”包括复数形式，除非另有指示。例如，“一个多核苷酸”包括一个或多个多核苷酸。
如本文所用短语“包含”是开放性的，表明此类实施方案可以包括另外的要素。相反，短语“由……组成”是封闭的，表明这些实施方案不包括另外的要素(痕量杂质除外)。短语“基本上由……组成”是部分封闭的，表明这些实施方案可以进一步包括不在实质上改变这些实施方案的基本特征的要素。应理解，本文描述为“包含”的方面和实施方案包括“由……组成”和“基本上由……组成”实施方案。
如本文所用，关于除温度外的值的术语“约”包括该值的90％至110％(例如，约30分钟是指27分钟至33分钟)，除非另有说明。当用于摄氏温度时，约包括该值的-1℃至+1℃(例如，约37℃是指36℃至38℃)，除非另有说明。相比之下，仅仅使用加或减表示指定的范围(例如，33℃±0.5℃是指32.5℃至33.5℃)。
如本文所用，数字范围包括定义范围的数字(例如，12-18个核苷酸包括12、13、14、15、16、17和18个核苷酸)。
如本文所用，术语“分离的”和“纯化的”是指从其环境(例如，细胞培养物、生物样品等)中移出(例如，分离)的对象(例如，细胞)。“分离的”对象至少50％不含，优选地75％不含，更优选地至少90％不含，最优选地至少95％(例如，95％、96％、97％、98％或99％)不含与它们缔合的其他组分。
术语“个体”和“受试者”是指哺乳动物。“哺乳动物”包括但不限于人、非人灵长类动物(例如，猴子)、农场动物、运动动物、啮齿动物(例如，小鼠和大鼠)和宠物(例如，狗和猫)。
如本文所用，关于药物组合物的术语“剂量”是指在任一时间由受试者服用(施用或接受)的组合物的测量部分。
术语“治疗”疾病或病症是指执行方案，所述方案可包括向个体(人或其他哺乳动物)施用一种或多种药物组合物，以努力减轻疾病的体征或症状。因此，“治疗”(“treating”或“treatment”)不需要完全减轻体征或症状，不需要治愈，并且特别包括对个体仅具有缓和作用的方案。如本文所用，并且如本领域所熟知的，“治疗”是用于获得有益或所需结果(包括临床结果)的方法。有益或所需的临床结果包括但不限于减轻或改善一种或多种症状、降低疾病程度、稳定(即不恶化)疾病状态、预防疾病传播、延迟或减缓疾病进展、改善或缓和疾病状态以及缓解(部分或全部)。
温度敏感性药剂
本公开文本的某些方面涉及在一个或多个细胞中瞬态诱导温度敏感性药剂(例如，温度敏感性治疗剂)的活性。温度敏感性药剂的活性是指所述药剂的任何所需的激活、复制或增加的表达。如文中所用，术语“温度敏感性药剂”是指在不同温度下具有不同功能水平的任何核酸或多肽。示例性温度敏感性药剂包括但不限于温度敏感性病毒载体、温度敏感性自我复制RNA和温度敏感性多肽。
如文中所用，术语“允许温度”是指本公开文本的温度敏感性药剂的活性被诱导的任何温度。通常，允许温度不是受试者的正常体温。人受试者的正常体温为约37℃±0.5℃。取决于温度敏感性药剂，允许温度可以是高于或低于受试者的正常体温的温度。在一些方面，温度敏感性药剂的允许温度范围为30℃至36℃。在一些实施方案中，允许温度为约31℃至约35℃、或32℃至34℃(33℃±1.0℃)。在一些优选实施方案中，允许温度为33℃±0.5℃。由此可见，在一些实施方案中，本公开文本的温度敏感性自我复制RNA的非允许温度高于36℃。在一些优选实施方案中，非允许温度为37℃±0.5℃。
在一些实施方案中，在允许温度下诱导的温度敏感性药剂的活性在非允许温度下被降低或抑制。如文中所用，术语“非允许温度”是指本公开文本的温度敏感性药剂的活性不被诱导的任何温度。当温度敏感性药剂的活性比最佳允许温度下的活性水平低至少95％、低至少90％、低至少85％、低至少80％、低至少75％或低至少50％时，温度敏感性药剂未被诱导。通常，非允许温度是受试者的正常体温。取决于温度敏感性药剂，非允许温度也可能是高于或低于受试者正常体温的温度。
温度敏感性病毒载体
在某些实施方案中，本公开文本的温度敏感性治疗剂可以包括温度敏感性病毒载体。在一些实施方案中，在允许温度下诱导的温度敏感性病毒载体的活性可以包括载体的复制。如文中所用，术语“温度敏感性病毒载体”是指在不同温度下具有不同功能水平的任何病毒载体。示例性温度敏感性病毒载体包括但不限于仙台病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体或甲病毒载体。示例性温度敏感性甲病毒载体包括但不限于委内瑞拉马脑炎病毒载体、辛德毕斯病毒载体和塞姆利基福雷斯特病毒载体。
在本公开文本的一些实施方案中，温度敏感性病毒载体包含异源核酸(例如，与病毒载体相关的外来核酸)，其包含目的蛋白的编码区。异源核酸可以包含一个或多个另外的遗传元件，如与编码区可操作组合的启动子。在优选的实施方案中，目的蛋白是ZSCAN4，如人ZSCAN4或其变体。
本公开文本的温度敏感性病毒载体的允许温度通常在30℃至36℃或38℃至50℃的范围内。在一些实施方案中，允许温度为约31℃至约35℃、或32℃至34℃(33℃±1.0℃)。在一些优选实施方案中，允许温度为33℃±0.5℃。由此可见，在一些实施方案中，本公开文本的温度敏感性病毒载体的非允许温度高于36℃且低于38℃。在一些优选实施方案中，非允许温度为37℃±0.5℃。
如本文所公开的，可将细胞在允许温度下维持一定的时间段，所述时间段足以使温度敏感性药剂诱导效果。在一些实施方案中，温度敏感性病毒载体包括遗传元件，并且效果包括遗传元件的表达增加，其中遗传元件的表达导致产生在细胞中产生生物效果的RNA或多肽。在一些优选的实施方案中，效果是治疗效果。
温度敏感性自我复制RNA
在某些实施方案中，本公开文本的温度敏感性治疗剂可以包括温度敏感性自我复制RNA。如文中所用，术语“温度敏感性自我复制RNA”是指在不同温度下具有不同功能水平的任何自我复制RNA。
在一些实施方案中，温度敏感性自我复制RNA通过工程化自我复制RNA产生，所述自我复制RNA是通常通过去除编码病毒颗粒形成所需的结构蛋白的DNA由甲病毒如委内瑞拉马脑炎病毒(VEEV)、辛德比斯病毒(SINV)和塞姆利基森林病毒(SFV)制成的单链RNA(Petrakova等人,2005)。在一些实施方案中，自我复制RNA编码非结构蛋白(nsP)，所述非结构蛋白作为RNA依赖性RNA聚合酶来复制自我复制RNA本身，并产生用于翻译的转录物。在一些实施方案中，自我复制RNA还包含含有目的蛋白的编码区的目的基因(GOI)。目的基因可以包含一个或多个另外的遗传元件，如与编码区可操作组合的启动子。在优选的实施方案中，目的蛋白是ZSCAN4，如人ZSCAN4或其变体。在一些实施方案中，不希望受到理论的约束，由于其RNA的正反馈产生，因此自我复制RNA可以以高水平表达GOI。在一些实施方案中，温度敏感性自我复制RNA可以通过突变编码nsP的基因来产生。
在一些实施方案中，温度敏感性自我复制RNA可以作为裸RNA(即合成RNA)递送至哺乳动物细胞中。在一些实施方案中，温度敏感性自我复制RNA可以作为纳米颗粒包封的裸RNA(即合成RNA)递送至哺乳动物细胞中。在一些实施方案中，纳米颗粒被工程化以靶向特定的细胞类型、组织、器官、癌症、肿瘤或异常细胞。在一些实施方案中，温度敏感性自我复制RNA可以作为病毒颗粒递送至哺乳动物细胞，所述病毒颗粒可以通过包装辅助细胞来补充缺失的病毒结构蛋白而生成。在一些实施方案中，病毒颗粒被工程化以靶向特定的细胞类型、组织、器官、癌症、肿瘤或异常细胞。
当温度敏感性药剂是温度敏感性自我复制RNA时，在允许温度下诱导的温度敏感性自我复制RNA的活性可包括RNA的复制。
在一些方面，本公开文本的温度敏感性自我复制RNA的允许温度通常在30℃至36℃的范围内。在一些实施方案中，允许温度为约31℃至约35℃、或32℃至34℃(33℃±1.0℃)。在一些优选实施方案中，允许温度为33℃±0.5℃。33℃±0.5℃。由此可见，在一些实施方案中，本公开文本的温度敏感性自我复制RNA的非允许温度高于36℃。在一些优选实施方案中，非允许温度为37℃±0.5℃。
在其他方面，本公开文本的温度敏感性自我复制RNA的允许温度通常在38℃至50℃的范围内。由此可见，在一些实施方案中，本公开文本的温度敏感性自我复制RNA的非允许温度高于36℃且低于38℃。在一些优选实施方案中，非允许温度为37℃±0.5℃。
温度敏感多肽
在某些实施方案中，本公开文本的温度敏感性治疗剂可以包括温度敏感性多肽。如文中所用，术语“温度敏感性多肽”是指在不同温度下具有不同功能水平的任何温度敏感性多肽。在一些实施方案中，温度敏感性多肽可以是温度敏感性ZSCAN4。在其他实施方案中，温度敏感性多肽选自但不限于ZSCAN4基因的转录因子。
当温度敏感性药剂是温度敏感性多肽时，在允许温度下诱导的温度敏感性蛋白质的活性可包括蛋白质的构象变化(例如，结构或形状的变化)。
本公开文本的温度敏感性多肽的允许温度通常在30℃至36℃或38℃至50℃的范围内。在一些实施方案中，允许温度为约31℃至约35℃、或32℃至34℃(33℃±1.0℃)。在一些优选实施方案中，允许温度为33℃±0.5℃。由此可见，在一些实施方案中，本公开文本的温度敏感性自我复制多肽的非允许温度高于36℃且低于38℃。在一些优选实施方案中，非允许温度为37℃±0.5℃。
本公开文本的各个方面涉及基本上纯化的多肽。基本上纯化的多肽可以指基本上不含与其天然缔合的其他多肽、脂质、碳水化合物或其他物质的多肽。在一个实施方案中，多肽至少50％，例如至少80％不含与其天然缔合的其他多肽、脂质、碳水化合物或其他物质。在另一个实施方案中，多肽至少90％不含与其天然缔合的其他多肽、脂质、碳水化合物或其他物质。在又另一个实施方案中，多肽至少95％不含与其天然缔合的其他多肽、脂质、碳水化合物或其他物质。
核酸和多肽
本公开文本的某些方面涉及在一个或多个细胞中瞬时诱导温度敏感性治疗剂的活性，其中所述活性导致核酸分子的表达增加。在一些实施方案中，核酸是多核苷酸。多核苷酸可以指任何长度的核酸序列(例如线性序列)。因此，多核苷酸包括寡核苷酸，以及在染色体中发现的基因序列。寡核苷酸是通过天然磷酸二酯键连接的多个连接核苷酸。寡核苷酸是长度为6至300个核苷酸的多核苷酸。寡核苷酸类似物是指功能类似于寡核苷酸但具有非天然存在部分的部分。例如，寡核苷酸类似物可以含有非天然存在的部分，例如改变的糖部分或糖间连接，例如硫代磷酸酯寡脱氧核苷酸。天然存在的多核苷酸的功能类似物可以结合RNA或DNA，并且包括肽核酸分子。
在某些实施方案中，核酸分子或多核苷酸编码遗传元件。这些多核苷酸包括编码目的基因的DNA、cDNA和RNA序列，如mRNA序列。编码序列可以与异源启动子可操作地连接以指导遗传元件的转录。启动子可以是指指导核酸的转录的核酸控制序列。启动子包括靠近转录起始位点的必需核酸序列。启动子还任选地包括远端增强子或阻遏子元件。组成型启动子是具有连续活性并且不受外部信号或分子调节的启动子。相反，诱导型启动子的活性受外部信号或分子(例如转录因子)调节。在第一核酸序列被置于与第二核酸序列具有功能性关系的位置中时，第一核酸序列与第二核酸序列可操作地连接。例如，如果启动子影响编码序列的转录或表达，则该启动子与该编码序列可操作地连接。通常，可操作地连接的核酸序列是连续的，且在必要时将两个蛋白质编码区结合在同一阅读框内。异源多肽或多核苷酸是指源自不同来源或物种的多肽或多核苷酸。启动子包括转录起始位点附近的必需核酸序列，例如在聚合酶II型启动子的情况下，TATA元件。启动子还任选地包括远端增强子或阻遏子元件，其可以位于距转录起始位点多达数千个碱基对处。在一个例子中，启动子是组成型启动子，例如CAG启动子(Niwa等人,Gene 108(2):193-9,1991)，或磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子。在一些实施方案中，启动子是诱导型启动子，例如四环素诱导型启动子(Masui等人,Nucleic Acids Res.33:e43,2005)。可用于驱动遗传元件表达的其他示例性启动子包括但不限于：lac系统、trp系统、tac系统、trc系统、噬菌体λ的主要操纵子和启动子区域、fd外壳蛋白的控制区、SV40的早期和晚期启动子、源自多瘤病毒、腺病毒、逆转录病毒、杆状病毒和猿猴病毒的启动子、3-磷酸甘油酸激酶的启动子、酵母酸性磷酸酶的启动子和酵母α交配因子的启动子。本公开文本的遗传元件可以处于以下启动子的控制下：组成型启动子、诱导型启动子、或本文所述的任何其他合适的启动子、或本领域技术人员将易于识别的其他合适的启动子。
在一些实施方案中，诱导温度敏感性药剂的活性导致核酸或多肽的表达增加，其可包括例如，相对于未与药剂接触的人细胞中的多核苷酸或多肽表达，表达增加至少1.5倍、至少1.6倍、至少1.7倍、至少1.8倍、至少1.9倍、至少2.0倍、至少2.1倍、至少2.1倍、至少2.2倍、至少2.3倍、至少2.4倍、至少2.5倍、至少2.6倍、至少2.7倍、至少2.8倍、至少2.9倍、至少3.0倍、至少3.5倍、至少4.0倍、至少4.5倍、至少5.0倍、至少5.5倍、至少6.0倍、至少6.5倍、至少7.0倍、至少7.5倍、至少8.0倍、至少8.5倍、至少9.0倍、至少9.5倍、至少10倍、至少50倍、至少100倍、至少200倍、至少300倍、至少400倍、至少500倍、至少600倍、至少700倍、至少800倍、至少900倍、至少1,000倍、至少2,000倍、至少3,000倍、至少4,000倍、至少5,000倍、至少6,000倍、至少7,000倍、至少8,000倍、至少9,000倍、至少10,000倍、至少25,000倍、至少50,000倍、至少75,000倍、至少100,000倍、至少125,000倍、至少150,000倍、至少175,000倍、至少200,000倍、至少225,000倍、至少250,000倍、至少275,000倍、至少300,000倍、至少325,000倍、至少350,000倍、至少375,000倍、至少400,000倍、至少425,000倍、至少450,000倍、至少475,000倍、至少500,000倍、至少750,000倍或至少1,000,000倍。
本公开文本的各个方面涉及分离的实体，例如分离的核酸或合成的mRNA分子。分离的核酸已经基本上从其他核酸序列和其中核酸天然存在的生物体的细胞，即其他染色体和染色体外DNA和RNA中分离或纯化。因此，术语“分离的”包括通过标准核酸纯化方法纯化的核酸。该术语还包括通过在宿主细胞中重组表达制备的核酸以及化学合成的核酸。类似地，分离的多肽已经基本上从蛋白质天然存在的生物体的细胞的其他多肽中分离或纯化，并且包括通过在宿主细胞中重组表达而制备的多肽以及化学合成的多肽。类似地，分离的细胞基本上与其他细胞类型分离。
将温度敏感性药剂引入细胞的方法
在一些实施方案中，将一个或多个细胞与温度敏感性药剂接触。接触可以指以直接物理缔合的方式放置，包括固体和液体形式。“接触”可与“暴露”互换使用。在一些情况下，“接触”包括转染，例如将核酸分子转染到细胞中。在一些情况下，“接触”包括将温度敏感性药剂引入一个或多个细胞中。
在一些实施方案中，温度敏感性药剂是多核苷酸(例如自我复制RNA)，并且将多核苷酸引入细胞中。将核酸分子或蛋白质引入细胞中包括将核酸分子或蛋白质递送至细胞中的任何方式。例如，可以将核酸分子转染、转导或电穿孔到细胞中。在一些实施方案中，温度敏感性药剂是多肽(例如，温度敏感性多肽)，并且将多肽引入细胞中。将多肽递送至细胞中可以例如通过将蛋白质融合至细胞穿透肽，例如具有蛋白质转导结构域(例如，HIV-1Tat)或聚精氨酸肽标签(Fuchs和Raines,Protein Science 14:1538-1544,2005)的肽来实现。蛋白质转导结构域可以指促进较大分子(蛋白质、核酸分子等)通过独立于经典胞吞作用的机制进入细胞的小阳离子肽。聚精氨酸肽标签可以指由精氨酸残基组成的短肽(通常7至11个残基)，其促进将较大分子(例如蛋白质和核酸分子)递送至细胞中(参见例如，Fuchs和Raines,Protein Science 14:1538-1544,2005)。
用温度敏感性药剂将核酸引入细胞可涉及使用温度敏感性病毒载体(例如整合或非整合病毒载体)或温度敏感性质粒载体。这些方法中的每一种已在本领域中描述，因此在本领域技术人员的能力范围内。本文提供了可用于将核酸分子递送至一个或多个宿主细胞(例如，优选哺乳动物宿主细胞，如人宿主细胞)的每种方法的简要概述。载体可以指引入宿主细胞从而产生转化的宿主细胞的核酸分子。载体可包括允许其在宿主细胞中复制的核酸序列，例如复制起点(参与起始DNA合成的DNA序列)。例如，表达载体含有必需的调控序列以允许插入的一个或多个基因的转录和翻译。载体还可以包括一个或多个选择性标记基因以及本领域中已知的其他遗传元件。载体可包括例如病毒载体和质粒载体。
允许温度
在允许温度下孵育一个或多个细胞
本公开文本的某些方面涉及通过在允许温度下孵育细胞以诱导温度敏感性药剂的活性而在一个或多个细胞中瞬时诱导温度敏感性药剂的活性。在一些实施方案中，允许温度可以高于或低于标准细胞培养温度。例如，人和啮齿动物细胞通常在约37℃的温度下培养。因此，在一些实施方案中，允许温度可以低于约36.5℃。例如，在一些实施方案中，细胞在36℃、35.5℃、35℃、34.5℃、34℃、33.5℃、33℃、32.5℃、32℃、31.5℃、31℃、30.5℃或30℃的允许温度下培养。在一些优选实施方案中，允许温度为30℃至36℃、或31℃至35℃、或32℃至34℃、或32.5℃至33.5℃。在一些实施方案中，允许温度高于或等于(下限)30℃、31℃、32℃、33℃、34℃或35℃，并且低于或等于(上限)36℃、35℃、34℃、33℃、32℃或31℃。
在其他实施方案中，允许温度可以高于约37.5℃。例如，在一些实施方案中，细胞在38℃、38.5℃、39℃、39.5℃、40℃、40.5℃、41℃、41.5℃、42℃、42.5℃、43℃、43.5℃、44℃、44.5℃、45℃、45.5℃、46℃、46.5℃、47℃、47.5℃、48℃、48.5℃、49℃、49.5℃或50℃的允许温度下培养。
在一些实施方案中，在允许温度下孵育后，将一个或多个细胞在非允许温度下培养，其中温度敏感性药剂的活性被降低或抑制。例如，可以抑制温度敏感性病毒载体的复制，可以抑制温度敏感性自我复制RNA的复制，并且可以抑制温度敏感性多肽的构象变化。这种温度变化使得温度敏感性药剂的活性被瞬时诱导然后被抑制。在其他实施方案中，在允许温度下培养后，将一个或多个细胞施用至受试者。一个或多个细胞可以从允许温度下的培养物直接施用至受试者，或者可以首先在培养物中从允许温度转移到非允许温度，然后施用至受试者。在某些实施方案中，温度敏感性药剂随后被降解。例如，非整合的温度敏感性病毒载体、RNA和多肽将被降解。
将受试者的核心体温降低到允许温度
本公开文本的某些方面涉及通过将受试者的核心体温降低至允许温度用于诱导温度敏感性药剂的活性来瞬时诱导受试者的细胞中的温度敏感性治疗剂的活性。在一些实施方案中，使用目标温度管理(TTM)程序来降低受试者的核心体温。TTM程序被设计为实现并维持受试者体内的特定体温一段时间。此类程序先前已在治疗上用于减少各种急性健康问题(例如心脏病发作和中风)引起的负面影响。使用它们的设备和一般方法是本领域已知的并且可以用于本文所述的方法中。该程序可以使用多种方法进行，包括冷却导管、冷却毯和在身体周围施加冰块。
在将受试者的核心体温降低至允许温度后，将受试者的核心体温在允许温度下维持足以诱导温度敏感性药剂活性的一段时间。受试者的核心体温随后返回到正常核心体温，这是非允许温度，其中温度敏感性药剂的活性被降低或抑制。在某些实施方案中，温度敏感性药剂随后被降解。例如，非整合的温度敏感性病毒载体、RNA和多肽将在非允许温度下被降解。如本文所用，术语“体温”是指“核心体温”，除非上下文另外明确指出。
将受试者的表面体温维持在允许温度下
本公开文本的某些方面涉及利用受试者身体区域中的自然温差。例如，在人受试者身体的表面处或附近的温度(表面体温)为约31-34℃，这低于人受试者的核心体温，即约37℃。如本文所用，受试者身体的“表面”是指表皮、真皮、皮下组织或肌肉中的一种或多种。受试者身体的“皮肤”是指表皮和真皮中的一者或两者。因此，向受试者身体的表皮、真皮或皮下组织施用的合适途径包括皮内和皮下施用。向受试者身体表面附近肌肉施用的合适途径是肌内施用。
例如，将ts药剂直接递送至受试者皮肤的特定区域(在疫苗接种的情况下)或递送至受试者皮肤的更宽区域(在皮肤病治疗的情况下)。皮肤温度(约31-34℃)是ts药剂的允许温度，其允许ts药剂起作用。GOI的长期表达不需要进一步的动作。如果需要或期望终止ts药剂的功能，则通过局部加热(例如，热贴片或加热毯)或通过温和的治疗性高体温(例如，温浴或热桑拿)来增加所治疗皮肤的温度并暂时维持在非允许温度(>37℃)。该治疗程序是安全的，因为ts药剂仅在身体的预期区域起作用，因为核心体温是非许可温度(约37℃)。在一些实施方案中，如果受试者的表面体温高于正常值，则降低表面体温以匹配ts药剂的允许温度。
将受试者的上呼吸道温度维持在允许温度
类似于人受试者的表面体温，人受试者的上呼吸道和上气管的温度是ts药剂的允许温度，允许ts药剂起作用。即，人受试者的鼻腔和上气管的温度为约32℃，并且人受试者的亚段支气管的温度为约35℃(McFadden等人,1985)。因此，鼻内施用至人患者的上呼吸道(鼻腔、咽部和/或喉部)和/或上气管的细胞的ts药剂在不降低人患者的核心体温的情况下起作用。鼻内施用可以通过吹入、吸入或滴注进行。
非允许温度
在非允许温度下孵育一个或多个细胞
细胞的体外培养通常在细胞来源的受试者的正常体温下进行。例如，哺乳动物细胞如人细胞和小鼠细胞通常在约37℃下培养。本公开文本的某些方面涉及在受试者的正常体温下不起作用(例如，不复制或表达基因)的温度敏感性药剂。因此，受试者的正常体温是温度敏感性药剂的非允许温度。在一些优选实施方案中，非允许温度为37℃±0.5℃。
受试者的正常核心体温
在一些实施方案中，将温度敏感性药剂、与温度敏感性药剂接触的细胞或携带温度敏感性药剂的细胞引入维持在正常核心体温的受试者体内。本公开文本的某些方面涉及在生物体的该正常体温(非允许温度)下不起作用，例如复制或表达基因的温度敏感性药剂。该特征提供了在受试者的生命过程中防止温度敏感性药剂的不期望的作用或再激活的安全机制。
人细胞
本公开文本的某些方面涉及在一个或多个人细胞(包括但不限于成人细胞)中瞬时诱导温度敏感性治疗剂的活性。在某些实施方案中，一个或多个人细胞在需要用治疗剂治疗的受试者中。
各种人细胞可用于本文所述的方法中。如本文所公开的，术语“人细胞”是指在胚胎发育期间和之后在整个人体中发现的任何细胞，例如人胚胎细胞、干细胞、多能细胞、分化细胞、成熟细胞、体细胞和成体细胞。在一些实施方案中，本公开文本的人细胞是人成体细胞。如本文所公开的，术语“人成体细胞”是指胚胎发育后在整个人体中发现的任何细胞(即，非胚胎细胞)。本公开文本的人细胞包括但不限于精细胞、卵母细胞、受精卵母细胞(即受精卵)、胚胎细胞、成熟细胞、分化细胞、体细胞、祖细胞、胚胎干(ES)细胞、诱导多能干(iPS)细胞、成体干细胞、体干细胞和组织干细胞。成体干细胞，也称为体干细胞或组织干细胞，可以指胚胎发育后全身发现的未分化细胞，所述未分化细胞通过细胞分裂增殖以补充死亡细胞并再生受损组织。祖细胞可以指分化成特定类型的细胞或细胞谱系的寡能或单能细胞。祖细胞类似于干细胞，但分化程度更高并表现出有限的自我更新。示例性成体干细胞、组织干细胞和/或祖细胞可包括但不限于造血干细胞、间充质干细胞、脂肪干细胞、神经元干细胞、肠干细胞、皮肤干细胞和生殖细胞(例如精细胞和卵母细胞)。
人细胞还可包括但不限于体细胞、成熟细胞和分化细胞。体细胞可以指身体的任何细胞，包括但不限于生殖细胞、组织干细胞、祖细胞、诱导多能干(iPS)细胞和分化细胞。示例性体细胞、成熟细胞和/或分化的细胞可包括但不限于表皮细胞、成纤维细胞、淋巴细胞、肝细胞、上皮细胞、肌细胞、软骨细胞、骨细胞、脂肪细胞、心肌细胞、胰腺β细胞、角质细胞、红细胞、外周血细胞、骨髓细胞、神经细胞、星形细胞和生殖细胞。生殖细胞可以指产生有性繁殖的生物体的配子(即卵子和精子)的细胞。在某些实施方案中，生殖细胞包括但不限于卵母细胞和精细胞。在一些实施方案中，本公开文本的体细胞、成熟细胞和/或分化细胞还包括但不限于植入前胚胎。
人细胞还可以包括但不限于源自脐带血的细胞、造血干细胞、CD34+细胞、间充质干细胞、血管内皮干细胞、组织干细胞、粒细胞、淋巴细胞、T细胞、B细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突细胞、红细胞、网织红细胞和巨核细胞。人细胞还可以包括但不限于人来源的异常细胞，例如癌细胞、肿瘤细胞、恶性细胞、良性细胞、增生细胞、发育不全细胞和非典型细胞。人细胞还可包括但不限于二倍体细胞、单倍体细胞、四倍体细胞、多倍体细胞、核型异常的细胞、染色体异常的细胞、基因突变的细胞、端粒长度异常的细胞、端粒短的细胞和端粒长的细胞。人细胞还可以包括但不限于具有表观遗传异常的细胞，例如具有低甲基化基因组区域的细胞、具有高甲基化基因组区域的细胞、具有异常组蛋白修饰如乙酰化和甲基化的细胞。
在一些实施方案中，本公开文本的受试者是非人动物。非人动物可以指除人以外的所有动物。非人动物包括但不限于非人灵长类动物、农场动物如猪、牛和家禽、运动动物或宠物如狗、猫、马、仓鼠、啮齿动物如小鼠、或动物园动物如狮子、老虎或熊。在一个实施方案中，非人动物是小鼠。
温度敏感性药剂的治疗用途
本公开文本的温度敏感性药剂可以通过本领域已知的任何合适的方法施用，包括但不限于通过口服施用、舌下施用、经颊施用、局部施用、直肠施用、经由吸入、透皮施用、皮下注射、静脉内注射、动脉内注射、肌内注射、心内注射、骨内注射、皮内注射、腹膜内注射、经粘膜施用、阴道施用、玻璃体内施用、关节内施用、关节周围施用、局部施用、表皮施用或其任何组合。在一些实施方案中，组合物通过皮下注射和/或静脉内注射施用。
在一些方面，本公开文本的方法涉及使用治疗有效量的温度敏感性药剂。药剂的治疗有效量可以指足以实现预期目的的治疗剂的量。例如，在人细胞中治疗疾病或病症的温度敏感性药剂的治疗有效量是足以减轻疾病或病症或疾病或病症的一种或多种症状的量。在一些例子中，治疗有效量可以不100％治疗疾病或病症或疾病或病症的症状。然而，疾病或病症的任何已知特征或症状的减少，例如减少至少25％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％可以是治疗性的。
给定治疗剂的治疗有效量将随诸如药剂的性质、施用途径、接受治疗剂的受试者的体型和/或年龄以及施用目的等因素而变化。在每种个体情况下的治疗有效量可以由熟练技术人员根据本领域确定的方法凭经验确定而无需过度实验。
受试者可以指活的多细胞脊椎动物生物体，包括人和非人哺乳动物的类别。在一些实施方案中，受试者是人。可以使用本文提供的方法治疗的受试者可以包括哺乳动物受试者，例如兽医或人受试者。受试者可包括受精卵、合子、植入前胚胎、胚胎、胎儿、新生儿、婴儿、儿童和/或成人。在一些实施方案中，选择待治疗的受试者，例如选择将受益于疗法，特别是包括施用本公开文本的温度敏感性药剂的疗法的受试者。
本公开文本的药物组合物包含ts药剂，例如治疗性ts药剂，和一种或多种另外的化合物。如本文所用，术语“药学上可接受的载体”和“药学上可接受的媒介物”是指一种或多种另外的化合物(即，除ts药剂以外的化合物)。适用于本公开文本的药学上可接受的载体是常规的。特别地，适合于包含温度敏感性药剂的组合物的药物递送的组合物和配制品如前所述(参见例如，Gennaro,A.R.(编辑)Remington's Pharmaceutical Sciences,MackPublishing Co.,Easton,PA,第18版(1990)；和Felton,L.A.(编辑)Remington Essentialsof Pharmaceutics,Pharmaceutical Press,London,United Kingdom,第一版,(2013))。
通常，所述载体的性质将取决于所采用的特定施用方式。例如，肠胃外配制品通常包含载体，如注射液，所述注射液包括药学上和生理学上可接受的流体，如水、生理盐水、平衡盐溶液、右旋糖水溶液、甘油等。对于固体组合物(例如，粉末、丸剂、片剂或胶囊形式)，常规的无毒固体载体可包括，例如，药用级的甘露醇、乳糖、淀粉或硬脂酸镁。除生物中性载体外，待施用的药物组合物可包含少量的无毒辅助物质，如润湿剂或乳化剂、防腐剂和pH缓冲剂等，例如乙酸钠或脱水山梨糖醇单月桂酸酯。在一些实施方案中，本公开文本的药物组合物包含ts药剂(例如治疗性ts药剂)和一种或多种促进ts药剂掺入细胞中的另外的化合物。在基于RNA的ts药剂的情况下，ts药剂被包封在纳米颗粒中。在一些情况下，纳米颗粒是基于脂质的(例如，lipofectamine)。
最适于患者治疗的治疗剂量和方案将随待治疗的疾病或病症以及根据患者的体重和其他参数而变化。有效剂量和治疗方案可以通过常规方法确定，从实验动物中的低剂量开始，然后在监测效果的同时增加剂量，并系统地改变剂量方案。当确定给定受试者的最佳剂量时，临床医生可以考虑许多因素。因素包括患者的体型、患者的年龄、患者的一般状况、所治疗的特定疾病、疾病的严重程度、患者中其他药物的存在等。在考虑动物研究结果和临床文献后选择试验剂量。
动员骨髓细胞
在一些实施方案中，方法包括将骨髓细胞(包括但不限于CD34+细胞、造血干细胞、间充质干细胞、内皮干细胞)动员到受试者的脾脏和外周血。在一些实施方案中，方法包括在适于温度敏感性药剂将核酸递送至脾脏中的一个或多个骨髓细胞(包括但不限于CD34+细胞、造血干细胞、间充质干细胞、内皮干细胞)的条件下施用治疗有效量的本公开文本的温度敏感性药剂(例如，温度敏感性治疗剂)。
在本文公开的方法的一些实施方案中，将骨髓细胞(包括但不限于CD34+细胞、造血干细胞、间充质干细胞、内皮干细胞)动员至脾脏和外周血包括向受试者施用治疗有效量的细胞因子和/或化疗剂。在一些实施方案中，将骨髓细胞(包括但不限于CD34+细胞、造血干细胞、间充质干细胞、内皮干细胞)动员至脾脏和外周血包括向受试者施用治疗有效量的细胞因子。在一些实施方案中，将骨髓细胞(包括但不限于CD34+细胞、造血干细胞、间充质干细胞、内皮干细胞)动员至脾脏包括向受试者施用治疗有效量的化疗剂。在一些实施方案中，将骨髓细胞(包括但不限于CD34+细胞、造血干细胞、间充质干细胞、内皮干细胞)动员至脾脏包括向受试者施用治疗有效量的细胞因子和化疗剂。细胞因子和/或化疗剂可以本领域已知的任何合适的方法施用，包括但不限于通过口服施用、舌下施用、经颊施用、局部施用、直肠施用、经由吸入、透皮施用、皮下注射、静脉内注射、动脉内注射、肌内注射、心内注射、骨内注射、皮内注射、腹膜内注射、经粘膜施用、阴道施用、玻璃体内施用、关节内施用、关节周围施用、局部施用、表皮施用或其任何组合。在一些实施方案中，细胞因子和/或趋化因子通过皮下注射和/或静脉内注射施用。
在一些实施方案中，受试者的骨髓细胞(包括但不限于CD34+细胞、造血干细胞、间充质干细胞、内皮干细胞)在施用组合物(例如，本文所述的任何纳米颗粒组合物)之前至少4周、至少3周、至少2周、至少1周、至少6天、至少5天、至少4天、至少3天、至少2天、至少1天、少于1天、至少18小时、至少16小时、至少12小时、至少8小时、至少6小时或至少1小时被动员。在一些实施方案中，受试者的骨髓细胞(包括但不限于CD34+细胞、造血干细胞、间充质干细胞、内皮干细胞)在施用组合物之前被动员连续七天、连续五天、连续四天、连续三天、连续两天或一天。在一些实施方案中，受试者的骨髓细胞(包括但不限于CD34+细胞、造血干细胞、间充质干细胞、内皮干细胞)在施用组合物的同时被动员。
可以使用本领域已知的能够动员骨髓细胞(包括但不限于CD34+细胞、造血干细胞、间充质干细胞、内皮干细胞)的任何细胞因子，包括但不限于粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、促红细胞生成素(EPO)、血小板生成素(TPO)、干细胞因子(SCF)、甲状旁腺激素(PTH)及其任何组合。在一些实施方案中，细胞因子是G-CSF。
在一些实施方案中，将G-CSF以约0.1μg/kg至约100μg/kg，或约1.0μg/kg至约10μg/kg的浓度向受试者施用。在一些实施方案中，将G-CSF以约2.5μg/kg的浓度向受试者施用。在一些实施方案中，将G-CSF以约10μg/kg的浓度向受试者施用。
可以使用本领域已知的能够动员骨髓细胞(包括但不限于CD34+细胞、造血干细胞、间充质干细胞、内皮干细胞)的任何化疗剂，包括但不限于普乐沙福、环磷酰胺(CY)、紫杉醇、依托泊苷、POL6326、BKT-140、TG-0054、NOX-A12、SEW2871、BIO 5192、硼替佐米、SB-251353、FG-4497及其任何组合。在一些实施方案中，化疗剂是普乐沙福。
在一些实施方案中，普乐沙福以约1μg/kg至约1000μg/kg，或约75μg/kg至约500μg/kg的浓度向受试者施用。在一些实施方案中，普乐沙福以约150μg/kg的浓度向受试者施用。在一些实施方案中，普乐沙福以约240μg/kg的浓度向受试者施用。
在一些实施方案中，将骨髓细胞(包括但不限于CD34+细胞、造血干细胞、间充质干细胞、内皮干细胞)动员至脾脏和外周血包括施用治疗有效量的G-CSF和治疗有效量的普乐沙福。在一些实施方案中，将G-CSF和普乐沙福共同施用至受试者。在一些实施方案中，将G-CSF和普乐沙福共同施用至受试者，持续一天、两天、三天、四天或更长时间。在一些实施方案中，将G-CSF在普乐沙福之前施用至受试者。在一些实施方案中，将G-CSF在普乐沙福之前一天、两天、三天、四天或更长时间施用至受试者。在一些实施方案中，将G-CSF在普乐沙福之前一天、两天、三天、四天或更长时间施用至受试者，然后将G-CSF和普乐沙福共同施用至受试者，持续一天、两天、三天、四天或更长时间。在一些实施方案中，将普乐沙福在G-CSF之前施用至受试者。在一些实施方案中，将普乐沙福在G-CSF之前一天、两天、三天、四天或更长时间施用至受试者。在一些实施方案中，将普乐沙福在G-CSF之前一天、两天、三天、四天或更长时间施用至受试者，然后将G-CSF和普乐沙福共同施用至受试者，持续一天、两天、三天、四天或更长时间。
在一些实施方案中，使一个或多个人细胞与将核酸递送至一个或多个人细胞的温度敏感性药剂(例如，温度敏感性治疗剂)接触。在一些实施方案中，核酸包含目的基因或编码目的蛋白。
在一些方面，本公开文本的方法涉及使用治疗量的在体外或体内将核酸递送至受试者的细胞的温度敏感性药剂(例如，温度敏感性治疗剂)。药剂的治疗有效量可以指足以实现预期目的的治疗剂的量。例如，将核酸递送至人细胞以治疗疾病或病症的温度敏感性药剂(例如，温度敏感性治疗剂)的治疗有效量是足以减轻疾病或病症或疾病或病症的一种或多种症状的量。在一些例子中，治疗有效量可以不100％治疗疾病或病症或疾病或病症的症状。然而，疾病或病症的任何已知特征或症状的减少，例如减少至少25％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、或至少95％可以是治疗性的。
在另一个例子中，治疗有效量的能够在受试者中动员骨髓细胞(包括但不限于CD34+细胞、造血干细胞、间充质干细胞、内皮干细胞)的细胞因子和/或趋化因子是足以诱导一种或多种骨髓细胞(包括但不限于CD34+细胞、造血干细胞、间充质干细胞、内皮干细胞)从骨髓动员到外周血中的量。
给定的温度敏感性药剂(例如，温度敏感性治疗剂)的治疗有效量将随诸如药剂的性质、施用途径、接受治疗剂的受试者的体型和/或年龄以及施用目的等因素而变化。在每种个体情况下的治疗有效量可以由熟练技术人员根据本领域确定的方法凭经验确定而无需过度实验。
受试者可以指活的多细胞脊椎动物生物体，包括人和非人哺乳动物的类别。在一些实施方案中，受试者是人。可以使用本文提供的方法治疗的受试者可以包括哺乳动物受试者，例如兽医或人受试者。受试者可包括胎儿、新生儿、婴儿、儿童和/或成人。在一些实施方案中，选择待治疗的受试者，例如选择将受益于治疗的受试者。
治疗疾病和障碍
可受益于施用温度敏感性药剂(例如，温度敏感性治疗剂)的疾病或障碍的例子包括与一个或多个基因突变、异常端粒长度和/或一个或多个异常表观遗传修饰相关的那些障碍或疾病。在一些方面，所述疾病或障碍是端粒生物学障碍。可受益于施用温度敏感性药剂(例如，温度敏感性治疗剂)的障碍或疾病的其他例子包括但不限于癌症、自身免疫性疾病和其中细胞再生是有益的疾病，例如神经损伤或神经退行性障碍、以及失明和耳聋。在一些方面，所述疾病或障碍是血液或造血器官的疾病。
癌症包括特征在于异常或不受控制的细胞生长的恶性肿瘤。癌症通常与基因突变和异常端粒调节有关。可受益于用ts药剂治疗的示例性癌症包括但不限于心脏癌(例如肉瘤(血管肉瘤、纤维肉瘤、横纹肌肉瘤、脂肪肉瘤)、粘液瘤、横纹肌瘤、纤维瘤、脂肪瘤和畸胎瘤)、肺癌(例如支气管癌(鳞状细胞、未分化的小细胞、未分化的大细胞、腺癌)、肺泡(细支气管)癌、支气管腺瘤、肉瘤、淋巴瘤、软骨错构瘤、间皮瘤)；胃肠道癌(例如，食管癌(鳞状细胞癌、腺癌、平滑肌肉瘤、淋巴瘤)、胃癌(癌、淋巴瘤、平滑肌肉瘤)、胰腺癌(导管腺癌、胰岛素瘤、胰高血糖素瘤、胃泌素瘤、类癌瘤、舒血管肠肽瘤)、小肠癌(腺癌、淋巴瘤、类癌瘤、卡波西氏肉瘤、平滑肌瘤、血管瘤、脂肪瘤、神经纤维瘤、纤维瘤)、大肠癌(腺癌、管状腺瘤、绒毛状腺瘤、错构瘤、平滑肌瘤)、泌尿生殖道癌(例如，肾癌(腺癌、威尔姆氏肿瘤、肾母细胞瘤、淋巴瘤、白血病)、膀胱和尿道癌(鳞状细胞癌、移行细胞癌、腺癌)、前列腺癌(腺癌、肉瘤)、睾丸癌(精原细胞瘤、畸胎瘤、胚胎癌、畸胎癌、绒毛膜癌、肉瘤、间质细胞癌、纤维瘤、纤维腺瘤、腺瘤样肿瘤、脂肪瘤)、肝癌(例如肝细胞瘤(肝细胞癌)、胆管癌、肝母细胞瘤、血管肉瘤、肝细胞腺瘤、血管瘤)、骨癌(例如骨原性肉瘤(骨肉瘤)、纤维肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤、软骨肉瘤、尤文氏肉瘤、恶性淋巴瘤(网状细胞肉瘤)、多发性骨髓瘤、恶性巨细胞瘤、脊索瘤、骨软骨瘤(骨软骨外生骨疣)、良性软骨瘤、成软骨细胞瘤、软骨粘液纤维瘤、骨样骨瘤和巨细胞瘤)、神经系统癌(例如颅骨癌(骨瘤、血管瘤、肉芽肿、黄瘤、畸形性骨炎)、脑膜癌(脑膜瘤、脑膜肉瘤、神经胶质瘤)、脑癌(星形细胞瘤、髓母细胞瘤、神经胶质瘤、室管膜瘤、生殖细胞瘤、松果体瘤、多形性胶质母细胞瘤、少突胶质细胞瘤、神经鞘瘤、视网膜母细胞瘤、先天性肿瘤)、脊髓癌(神经纤维瘤、脑膜瘤、神经胶质瘤、肉瘤)、妇科癌症(例如子宫癌(子宫内膜癌)、宫颈癌(宫颈癌、瘤前宫颈发育不良)、卵巢癌(卵巢癌、浆液性囊腺癌、粘液性囊腺癌、子宫内膜样肿瘤、布伦纳瘤、透明细胞癌、未分类癌、颗粒细胞瘤、支持间质细胞瘤、无性细胞瘤、恶性畸胎瘤)、外阴癌(鳞状细胞癌、上皮内癌、腺癌、纤维肉瘤、黑色素瘤)、阴道癌(透明细胞癌、鳞状细胞癌、葡萄状肉瘤、胚胎性横纹肌肉瘤、输卵管(癌))、血液癌症(例如血液癌(骨髓性白血病(急性和慢性)、急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、骨髓增生性疾病、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合征)、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤(恶性淋巴瘤))、皮肤癌(例如恶性黑色素瘤、基底细胞癌、鳞状细胞癌、卡波西氏肉瘤、痣、发育不良痣、脂肪瘤、血管瘤、皮肤纤维瘤、瘢痕瘤、牛皮癣)和肾上腺癌(例如成神经细胞瘤)。
自身免疫性疾病由异常免疫应答引起，例如产生对自身抗原或受试者自身细胞或组织具有特异性的抗体或细胞毒性T细胞。在一些情况下，自身免疫性疾病限于某些器官(例如，甲状腺炎)或可涉及不同位置的特定组织(例如，Goodpasture病)。可受益于用ts药剂治疗的示例性自身免疫性疾病包括但不限于类风湿性关节炎、幼年少关节炎、胶原诱导的关节炎、佐剂诱导的关节炎、干燥综合征、多发性硬化、实验性自身免疫性脑脊髓炎、炎性肠病(例如克罗恩病、溃疡性结肠炎)、自身免疫性胃萎缩、寻常型天疱疮、银屑病、白癜风、1型糖尿病、非肥胖糖尿病、重症肌无力、格雷夫氏病、桥本氏甲状腺炎、硬化性胆管炎、硬化性唾液腺炎、系统性红斑狼疮、自身免疫性血小板减少性紫癜、Goodpasture综合征、阿狄森氏病、系统性硬化、多发性肌炎、皮肌炎、自身免疫性溶血性贫血和恶性贫血。
在一些实施方案中，受试者是患有神经损伤或患有神经退行性障碍的受试者。神经损伤可指对神经系统(例如脑或脊髓或特定神经元)的创伤，其不利地影响受伤患者的运动和/或记忆。例如，这些患者可能患有构音障碍(运动言语障碍)、轻偏瘫或偏瘫。神经系统损伤可由对神经系统(例如脑或脊髓或特定神经元)的创伤引起，其不利地影响受伤患者的运动和/或记忆。这样的创伤可以由传染物(例如，细菌或病毒)、毒素、跌倒或其他类型的事故造成的损伤、或遗传障碍或出于其他未知原因引起。因此，在一些实施方案中，通过调节患有神经损伤的患者的神经系统中的组织干细胞，其中调节神经系统中的组织干细胞产生神经元和神经胶质细胞，从而修复神经系统中的缺陷，本公开文本的温度敏感性药剂(例如，温度敏感性治疗剂)可用于治疗受试者中的神经损伤。在一些实施方案中，编码各种神经营养因子例如脑源性神经营养因子(BDNF)、神经生长因子(NGF)、神经营养因子-3、神经营养因子-4、睫状神经营养因子、神经胶质细胞系源性神经营养因子(GDNF)的温度敏感性药剂可用于治疗此类患者。在一些实施方案中，患者可能患有神经损伤，例如由事故或中风引起的脑或脊髓损伤。
神经退行性疾病是其中脑和/或脊髓细胞丢失的病症。神经退行性疾病由神经元或它们的髓鞘退化引起，这随时间导致功能障碍和残疾。产生的病症可引起运动问题(例如共济失调)和记忆问题(例如痴呆)。因此，在一些实施方案中，通过调节患有神经退行性疾病的患者的神经系统中的组织干细胞，其中调节神经系统中的组织干细胞产生神经元和神经胶质细胞，从而修复神经系统中的缺陷，本公开文本的温度敏感性药剂(例如，温度敏感性治疗剂)可用于治疗受试者中的神经退行性疾病。在一些实施方案中，药剂调节受试者的神经系统并恢复疾病的退行性病症。示例性神经退行性疾病包括但不限于：肾上腺脑白质营养不良(ALD)、酒精中毒、亚历山大病、阿尔珀病、阿尔茨海默病、肌萎缩侧索硬化(葛雷克氏病)、共济失调性毛细血管扩张症、贝敦氏病(也称为Spielmeyer-Vogt-Sjogren-Batten病)、牛海绵状脑病(BSE)、卡纳万病、脑瘫、科克因综合征、皮质基底节变性、克雅二氏病、家族性致命性失眠、额颞叶变性、亨廷顿病、HIV相关痴呆、肯尼迪病、克腊伯氏病、路易体痴呆、神经疏螺旋体病、马查多·约瑟夫病(3型脊髓小脑性共济失调)、多系统萎缩、多发性硬化、发作性睡病、尼曼皮克病、帕金森病、佩梅病、皮克病、原发性侧索硬化、朊病毒病、进行性核上性麻痹、雷弗素姆氏病、山德霍夫氏病、谢耳德氏病、继发于恶性贫血的亚急性脊髓联合变性、Spielmeyer-Vogt-Sjogren-Batten病(也称为贝敦氏病)、脊髓小脑性共济失调、脊髓性肌萎缩、Steele-Richardson-Olszewski病、脊髓痨、中毒性脑病。
因此，向受试者施用温度敏感性药剂(例如，温度敏感性治疗剂)以减轻或改善与特定障碍相关的症状。癌症治疗的治疗终点可包括肿瘤大小或体积的减小、肿瘤血管生成的减小或肿瘤转移的减少。如果肿瘤已经被去除，另一个治疗终点可以是去除的组织或器官的再生。可以使用本领域的方法测量癌症治疗的有效性，例如肿瘤的成像或检测肿瘤标记物或癌症存在的其他指标。治疗自身免疫性疾病的治疗终点可包括自身免疫应答的降低。自身免疫疾病治疗的有效性可以使用本领域的方法测量，例如测量自身免疫抗体，其中在所治疗的受试者中此类抗体的减少表明治疗是成功的。治疗神经退行性障碍的治疗终点可包括神经退行性相关缺陷的减少，例如运动、记忆或行为缺陷的增加。治疗神经退行性障碍的有效性可以使用本领域的方法测量，例如通过测量认知损害，其中在所治疗的受试者中这种损害的减少表明治疗是成功的。治疗神经损伤的治疗终点可包括损伤相关缺陷(例如运动、记忆或行为缺陷的增加)的减少。治疗神经损伤的有效性可以使用本领域的方法测量，例如通过测量活动性和灵活性，其中在所治疗的受试者中这样的增加表明治疗是成功的。治疗不需要100％有效性。疾病(或其症状)减少至少约10％、约15％、约25％、约40％、约50％或更多(例如相对于在人细胞中不存在药剂治疗)被认为是有效的。
例如，通过向受试者的血流施用本公开文本的温度敏感性药剂(例如，温度敏感性治疗剂)，使得所述药剂引入/接触血管内皮细胞并提高其质量，从而治疗受试者中的动脉粥样硬化和/或冠心病，本公开文本的温度敏感性药剂(例如，温度敏感性治疗剂)还可用于治疗有需要的受试者中的动脉粥样硬化和/或冠心病。
本公开文本的温度敏感性药剂(例如，温度敏感性治疗剂)还可用于在一个或多个人细胞和/或有需要的受试者中提供对一种或多种基因毒性剂的抗性。
通过增加ZSCAN4表达治疗疾病和障碍
如本文所公开的，ZSCAN4的表达增加端粒长度、增加基因组稳定性、纠正基因组和/或染色体异常、保护细胞免受DNA损伤、和/或增强DNA修复。DNA修复可以指细胞识别和纠正对其基因组DNA分子的损伤的过程集合。因此，本文提供涉及瞬时增加例如人细胞中ZSCAN4的表达以增加端粒长度、增加基因组稳定性、纠正基因组和/或染色体异常、保护细胞免受DNA损伤、和/或增强此类细胞中的DNA修复的方法。在一些方面，本公开文本提供了涉及瞬时增加例如人细胞中ZSCAN4的表达以增加端粒长度从而治疗血液或造血器官的疾病的方法。在一些实施方案中，所述疾病包括骨髓衰竭。
其中引入了增加ZSCAN4表达的ts药剂的哺乳动物细胞(例如，人骨髓细胞)在本文中称为“ZSCAN4*细胞”。“ZSCAN4*细胞”包括但不限于瞬时表达ZSCAN4的细胞。即，ZSCAN4*细胞不一定持续具有可测量的ZSCAN4或持续表达ZSCAN4 mRNA或蛋白质。在一些实施方案中，ZSCAN4的作用是快速的并且仅需要ZSCAN4的瞬时表达(例如，约数小时至数天)。在端粒的情况下，一旦端粒通过ZSCAN4作用延长，由于端粒只是逐渐缩短，因此长时间内不需要进一步的ZSCAN4表达。因此，“ZSCAN4*细胞”包括含有增加ZSCAN4表达的ts药剂的细胞和其中引入ts药剂但不再存在ts药剂的细胞。
提供了用于治疗有需要的受试者，如具有端粒异常的受试者的方法和组合物。端粒异常是指端粒的任何改变(如端粒缩短、端粒DNA重复序列的破坏、或端粒DNA突变)，其破坏一种或多种端粒功能。其中增加ZSCAN4表达可能有益的与端粒异常相关的示例性疾病或障碍包括但不限于端粒缩短疾病、骨髓衰竭综合征、与年龄相关的端粒缩短疾病和过早老化障碍。
可受益于增加人细胞中ZSCAN4表达的温度敏感性药剂的端粒缩短障碍(由术语“端粒生物学障碍”涵盖)包括但不限于先天性角化不良、Hoyeraal-Hreidarsson综合征、Revesz综合征、Coats plus综合征和特发性肺纤维化。在一些实施方案中，端粒缩短障碍是先天性角化不良。
可受益于增加人细胞中ZSCAN4表达的温度敏感性药剂的骨髓衰竭综合征包括但不限于范可尼贫血、无巨核细胞血小板减少症、再生障碍性贫血、Diamond Blackfan贫血、阵发性睡眠性血红蛋白尿症、皮尔逊综合征、Shwachman Diamond综合征和骨髓增生异常综合征。在一些实施方案中，骨髓衰竭综合征是范可尼贫血。在一些实施方案中，需要治疗的受试者患有端粒生物学障碍和骨髓衰竭(例如，先天性角化不良)。
可受益于增加人细胞中ZSCAN4表达的温度敏感性药剂的年龄相关的端粒缩短疾病或过早衰老疾病包括但不限于沃纳综合征、布卢姆氏综合征、Hutchinson-Gilford早衰综合征、科克因综合征、着色性干皮病、共济失调毛细血管扩张症、Rothmund Thomson综合征、毛发硫营养不良症、Juberg-Marsidi综合征和唐氏综合征。
提供了用于治疗有需要的受试者，如患有染色体异常的受试者的方法和组合物。染色体异常是指染色体中导致染色体DNA的缺失、额外或不规则部分的任何异常、畸变或突变。在某些实施方案中，染色体异常导致非典型数目的染色体或导致一条或多条染色体中的结构异常。如本文所用，非整倍性可指异常数目的整个染色体或染色体部分。可受益于增加人细胞中ZSCAN4表达的温度敏感性药剂的非整倍性包括但不限于缺对染色体、染色体单体、染色体三体、染色体四体和染色体五体。人非整倍性的例子包括但不限于三体21、三体16、三体18(艾德华氏综合征)、三体13(帕陶综合征)、单体X(特纳氏综合征)、XXX非整倍性、XXY非整倍性和XYY非整倍性。人节段性非整倍性的例子包括但不限于1p36重复、dup(17)(p11.2p11.2)综合征、佩梅病、dup(22)(q11.2q11.2)综合征和猫眼综合征。在一些实施方案中，非整倍性包括性染色体或常染色体的一个或多个缺失，其可导致诸如猫叫综合征、Wolf-Hirschhorn、Williams-Beuren综合征、腓骨肌萎缩病、具有压力性麻痹倾向的遗传性神经病、史密斯-马吉利综合征、神经纤维瘤病、阿拉吉欧综合征、腭心面综合征、迪乔治综合征、类固醇硫酸酯酶缺乏症、卡尔曼综合征、伴有线性皮肤缺陷的小眼畸形、肾上腺发育不全、甘油激酶缺乏症、佩梅病、Y上的睾丸决定因子、无精子症(因子a)、无精子症(因子b)、无精子症(因子c)或1p36缺失的病症。
ZSCAN4多核苷酸
在一些实施方案中，增加ZSCAN4表达的本公开文本的治疗性温度敏感性药剂是包含编码ZSCAN4蛋白的核酸序列(编码区)的核酸分子。核酸分子包括编码ZSCAN4蛋白的DNA、cDNA和RNA(mRNA)分子。应当理解，编码ZSCAN4蛋白的所有多核苷酸都包括在本文中，只要它们编码具有ZSCAN4活性(如调节基因组稳定性或端粒长度的能力)的ZSCAN4蛋白、其变体或片段即可。基因组稳定性是指细胞如实复制DNA并保持其DNA复制机制完整性的能力。长端粒被认为提供对抗细胞衰老的缓冲，并且通常指示基因组稳定性和整体细胞健康。染色体稳定性(例如，很少突变、没有染色体重排或数目变化)也与基因组稳定性相关。基因组稳定性的丧失与癌症、神经障碍和过早衰老有关。基因组不稳定的迹象包括突变率升高、总染色体重排、染色体数目改变和端粒缩短。
ZSCAN4核酸分子的序列是本领域已知的。ZSCAN4核酸序列包括但不限于编码展现出2细胞胚胎期或ES细胞特异性表达的小鼠Zscan4蛋白(包括Zscan4a、Zscan4b、Zscan4c、Zscan4d、Zscan4e和Zscan4f)或其直系同源物的序列。在一些实施方案中，直系同源物是人ZSCAN4。编码人ZSCAN4及其直系同源物的核酸序列公开于Ko的美国专利号10,335,456B1的序列表中，并通过引用并入本文。
本领域技术人员可以使用标准分子技术制备ZSCAN4多核苷酸的片段和变体。在一些实施方案中，ZSCAN4多核苷酸编码缺少天然存在的ZSCAN4蛋白的一个或多个锌指结构域的截短形式的ZSCAN4蛋白。在一些实施方案中，ZSCAN4多核苷酸编码ZSCAN4蛋白的变体。核苷酸可以是核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸或任一核苷酸的修饰形式。所述术语包括单链和双链形式的DNA。重组核酸是具有非天然存在的序列或具有由两个原本分开的序列区段的人工组合产生的序列的核酸。
ZSCAN4编码区可以与启动子可操作地连接以指导编码区的转录。启动子是指指导可操作连接的编码区转录的核酸控制序列。启动子包括靠近转录起始位点的必需核酸序列。启动子还任选地包括远端增强子或阻遏子元件。组成型启动子是具有连续活性并且不受外部信号或分子调节的启动子。相反，诱导型启动子的活性受外部信号或分子(例如转录因子)调节。在第一核酸序列被置于与第二核酸序列具有功能性关系的位置中时，第一核酸序列与第二核酸序列可操作地连接。例如，如果启动子影响编码序列的转录或表达，则该启动子与该编码序列可操作地连接。通常，可操作地连接的核酸序列是连续的，且在必要时将两个蛋白质编码区结合在同一阅读框内。异源多肽或多核苷酸是指源自不同来源或物种的多肽或多核苷酸。启动子包括转录起始位点附近的必需核酸序列，例如在聚合酶II型启动子的情况下，TATA元件。启动子还任选地包括远端增强子或阻遏子元件，其可以位于距转录起始位点多达数千个碱基对处。在一个例子中，启动子是组成型启动子，如CAG启动子(Niwa等人,Gene 108(2):193-9,1991。在一些实施方案中，启动子是诱导型启动子，如四环素诱导型启动子(Masui等人,Nucleic Acids Res.33:e43,2005)。可用于驱动Zscan4表达的其他示例性启动子包括但不限于：lac系统、trp系统、tac系统、trc系统、噬菌体λ的主要操纵子和启动子区域、fd外壳蛋白的控制区、SV40的早期和晚期启动子、源自多瘤病毒、腺病毒、逆转录病毒、杆状病毒和猿猴病毒的启动子、3-磷酸甘油酸激酶的启动子、酵母酸性磷酸酶的启动子和酵母α交配因子的启动子。在一些实施方案中，使用天然ZSCAN4启动子。
ZSCAN4多肽
应当理解，所有ZSCAN4多肽都包括在本文中，只要它们保留ZSCAN4活性，如调节基因组稳定性或端粒长度的能力即可。术语“多肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，并且包括具有ZSCAN4活性的天然存在的ZSCAN4蛋白质、其变体或片段。
ZSCAN4蛋白的氨基酸序列是本领域已知的。ZSCAN4氨基酸序列包括但不限于展现出2细胞胚胎期或ES细胞特异性表达的小鼠Zscan4蛋白(包括Zscan4a、Zscan4b、Zscan4c、Zscan4d、Zscan4e和Zscan4f)或其直系同源物的序列。在一些实施方案中，直系同源物是人ZSCAN4。编码人ZSCAN4及其直系同源物的氨基酸序列公开于Ko的美国专利号10,335,456B1的序列表中，并通过引用并入本文。
本领域技术人员可以使用标准分子技术制备ZSCAN4蛋白的片段和变体。在一些实施方案中，ZSCAN4蛋白是缺少天然存在的ZSCAN4蛋白的一个或多个锌指结构域的截短形式的ZSCAN4。在一些实施方案中，ZSCAN4蛋白是天然存在的ZSCAN4蛋白的变体。
在一些优选的实施方案中，人ZSCAN4蛋白的氨基酸序列包含SEQ ID NO:38或由SEQ ID NO:39-42组成的组中的一种。
hZSCAN4(aa1-433：)：
MALDLRTIFQCEPSENNLGSENSAFQQSQGPAVQREEGISEFSRMVLNSFQDSNNSYARQELQRLYRIFHSWLQPEKHSKDEIISLLVLEQFMIGGHCNDKASVKEKWKSSGKNLERFIEDLTDDSINPPALVHVHMQGQEALFSEDMPLRDVIVHLTKQVNAQTTREANMGTPSQTSQDTSLETGQGYEDEQDGWNSSSKTTRVNENITNQGNQIVSLIIIQEENGPRPEEGGVSSDNPYNSKRAELVTARSQEGSINGITFQGVPMVMGAGCISQPEQSSPESALTHQSNEGNSTCEVHQKGSHGVQKSYKCEECPKVFKYLCHLLAHQRRHRNERPFVCPECQKGFFQISDLRVHQIIHTGKKPFTCSMCKKSFSHKTNLRSHERIHTGEKPYTCPFCKTSYRQSSTYHRHMRTHEKITLPSVPSTPEAS(SEQ ID NO:38)。
hZSCAN4(aa1-311)：
MALDLRTIFQCEPSENNLGSENSAFQQSQGPAVQREEGISEFSRMVLNSFQDSNNSYARQELQRLYRIFHSWLQPEKHSKDEIISLLVLEQFMIGGHCNDKASVKEKWKSSGKNLERFIEDLTDDSINPPALVHVHMQGQEALFSEDMPLRDVIVHLTKQVNAQTTREANMGTPSQTSQDTSLETGQGYEDEQDGWNSSSKTTRVNENITNQGNQIVSLIIIQEENGPRPEEGGVSSDNPYNSKRAELVTARSQEGSINGITFQGVPMVMGAGCISQPEQSSPESALTHQSNEGNSTCEVHQKGSHGVQKS(SEQ ID NO:39)。
hZSCAN4(aa1-339)：
MALDLRTIFQCEPSENNLGSENSAFQQSQGPAVQREEGISEFSRMVLNSFQDSNNSYARQELQRLYRIFHSWLQPEKHSKDEIISLLVLEQFMIGGHCNDKASVKEKWKSSGKNLERFIEDLTDDSINPPALVHVHMQGQEALFSEDMPLRDVIVHLTKQVNAQTTREANMGTPSQTSQDTSLETGQGYEDEQDGWNSSSKTTRVNENITNQGNQIVSLIIIQEENGPRPEEGGVSSDNPYNSKRAELVTARSQEGSINGITFQGVPMVMGAGCISQPEQSSPESALTHQSNEGNSTCEVHQKGSHGVQKSYKCEECPKVFKYLCHLLAHQRRHRNERP(SEQ ID NO:40)。
hZSCAN4(aa1-367)：
MALDLRTIFQCEPSENNLGSENSAFQQSQGPAVQREEGISEFSRMVLNSFQDSNNSYARQELQRLYRIFHSWLQPEKHSKDEIISLLVLEQFMIGGHCNDKASVKEKWKSSGKNLERFIEDLTDDSINPPALVHVHMQGQEALFSEDMPLRDVIVHLTKQVNAQTTREANMGTPSQTSQDTSLETGQGYEDEQDGWNSSSKTTRVNENITNQGNQIVSLIIIQEENGPRPEEGGVSSDNPYNSKRAELVTARSQEGSINGITFQGVPMVMGAGCISQPEQSSPESALTHQSNEGNSTCEVHQKGSHGVQKSYKCEECPKVFKYLCHLLAHQRRHRNERPFVCPECQKGFFQISDLRVHQIIHTGKKP(SEQID NO:41)。
hZSCAN4(aa1-395)：
MALDLRTIFQCEPSENNLGSENSAFQQSQGPAVQREEGISEFSRMVLNSFQDSNNSYARQELQRLYRIFHSWLQPEKHSKDEIISLLVLEQFMIGGHCNDKASVKEKWKSSGKNLERFIEDLTDDSINPPALVHVHMQGQEALFSEDMPLRDVIVHLTKQVNAQTTREANMGTPSQTSQDTSLETGQGYEDEQDGWNSSSKTTRVNENITNQGNQIVSLIIIQEENGPRPEEGGVSSDNPYNSKRAELVTARSQEGSINGITFQGVPMVMGAGCISQPEQSSPESALTHQSNEGNSTCEVHQKGSHGVQKSYKCEECPKVFKYLCHLLAHQRRHRNERPFVCPECQKGFFQISDLRVHQIIHTGKKPFTCSMCKKSFSHKTNLRSHERIHTGEKP(SEQ ID NO:42)。
在一些实施方案中，人ZSCAN4蛋白的氨基酸序列与由SEQ ID NO:38-42组成的组中的一种至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同。
两个或更多个核酸序列或两个或更多个氨基酸序列之间的同一性/相似性以序列之间的同一性或相似性表示。序列同一性可以用同一性百分比来测量；百分比越高，序列越相同。序列相似性可以用相似性百分比(其考虑保守氨基酸取代)来测量；百分比越高，序列越相似。当使用标准方法比对时，核酸或氨基酸序列的同源物或直系同源物具有相对高度的序列同一性/相似性。当直系同源蛋白或cDNA源自更密切相关的物种(如人和猴子序列)时，与更远亲的物种(如人和小鼠序列)相比，这种同源性更显著。
在两个或更多个序列(例如，核酸序列或氨基酸序列)的上下文中，术语“相同”或“同一性”百分比可指相同的两个或更多个序列或子序列。如果当在比较窗口或指定区域上进行比较和比对以获得最大对应(如使用以下序列比较算法之一或通过手动比对和目视检查测量)时，两个序列具有指定百分比的相同氨基酸残基或核苷酸(即，在指定区域上，或当未指定时在整个序列上95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性)，则两个序列基本上相同。
对于序列比较，通常一个序列用作参考序列，将测试序列与其相比较。在使用序列比较算法时，将测试序列和参考序列输入计算机(如果需要，指定子序列坐标)，并指定序列算法程序参数。可以使用默认程序参数，或者可以指定替代参数。随后序列比较算法基于程序参数来计算测试序列相对于参考序列的序列同一性百分比。当比较两个序列的同一性时，序列不必是连续的，但任何空位都会带来降低整体同一性百分比的罚分。对于blastp，默认参数是空位开放罚分＝11和空位扩展罚分＝1。对于blastn，默认参数是空位开放罚分＝5和空位扩展罚分＝2。
比较窗口可包括对包括但不限于以下的连续位置数目的任何一个的区段的提及：20至600、通常约50至约200或更通常约100至约150个，其中可以在两个序列最佳比对后将序列与具有相同的连续位置数目的参考序列进行比较。用于比较的序列比对方法是熟知的。用于比较的最佳的序列比对可以通过以下方法进行，例如通过Smith和Waterman(1981)的局部同源性算法、通过Needleman和Wunsch(1970)J Mol Biol 48(3):443-453的同源性比对算法、通过Pearson和Lipman(1988)Proc Natl Acad Sci USA 85(8):2444-2448的相似性搜索方法、通过这些算法的计算机实现(在Wisconsin Genetics软件包，GeneticsComputer Group，575Science Dr.，麦迪逊，威斯康星州中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA)或通过手动比对和视觉检查[参见例如Brent等人(2003)Current Protocols inMolecular Biology,John Wiley&Sons,Inc.(Ringbou编辑)]。
适合用于确定序列同一性百分比和序列相似性的算法的两个例子是BLAST和BLAST 2.0算法，其分别描述在Altschul等人(1997)Nucleic Acids Res 25(17):3389-3402和Altschul等人(1990)J.Mol Biol 215(3)-403-410中。用于进行BLAST分析的软件是可通过国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)公开获得的。这种算法涉及首先通过鉴定询问序列中长度W的短字码来鉴定高评分序列对(HSP)，所述短字码在与数据库序列中相同长度的字码比对时，匹配或符合一定的正值阈值得分T。T被称为相邻字码得分阈值(Altschul等人，同上)。这些初始相邻字码命中用作开始搜索的种子，以发现含有所述种子的较长HSP。沿每个序列在两个方向上延长字码命中，只要可以增加累积比对得分即可。对于核苷酸序列，累积得分是使用参数M(一对匹配残基的奖励得分；始终>0)和N(错配残基的罚分；始终<0)来计算的。对于氨基酸序列，使用评分矩阵来计算累积得分。在累积比对得分从其最大达成值下降数量X时；在累积得分由于一个或多个负评分残基比对的积累而变为零或更低时；或在到达任一序列的末端时，停止每一方向上的字码命中延伸。BLAST算法参数W、T和X决定了比对的灵敏度和速度。对于氨基酸序列，BLASTP程序使用以下项作为默认参数：字长为3，期望值(E)为10，BLOSUM62评分矩阵[参见Henikoff和Henikoff,(1992)Proc Natl Acad Sci USA 89(22):10915-10919]比对(B)为50，期望值(E)为10，M＝5，N＝-4，以及两条链的比较。对于核苷酸序列，BLASTN程序使用以下项作为默认参数：字长(W)为11，期望值(E)为10，M＝5，N＝-4，以及两条链的比较。
BLAST算法还对两个序列之间的相似性进行统计分析(参见例如，Karlin和Altschul,(1993)Proc Natl Acad Sci USA 90(12):5873-5877)。BLAST算法提供的一个相似性量度是最小总和概率(P(N))，其提供两个核苷酸或氨基酸序列之间偶然发生匹配的概率的指示。例如，核酸被认为与参考序列相似，如果测试核酸与参考核酸的比较中的最小总和概率小于约0.2、更优选小于约0.01、最优选小于约0.001的话。
在某些实施方案中，编码Zscan4多肽的Zscan4多核苷酸是人ZSCAN4多核苷酸或其同源物。在一些实施方案中，Zscan4多核苷酸编码人ZSCAN4蛋白，其包含与由SEQ ID NO:38-42组成的组中的一种至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列。
除非另外说明，否则在此使用的所有技术和科学术语具有如本公开文本所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。除非上下文另外清楚地说明，否则单数术语“一个/种(a)”、“一个/种(an)”以及“所述(the)”包括复数指示物。类似地，除非上下文另外清楚地说明，否则单词“或”旨在包括“和”。因此，“包含A或B”意指包括A、或B、或A和B。还应当理解，对于核酸或多肽给出的所有碱基大小或氨基酸大小，以及所有分子量或分子质量值是近似的，并且被提供用于描述。尽管与本文所述的方法和材料类似或等同的那些方法和材料可以用于本公开文本的实践或测试，但下面描述了合适的方法和材料。本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献都通过引用以其整体并入。在存在冲突的情况下，以本说明书(包括术语解释)为准。
示例性实施方案
1.一种用于瞬时诱导温度敏感性药剂的温度敏感性活性的方法，所述方法包括：
i)将包含所述温度敏感性药剂的一个或多个细胞在诱导所述温度敏感性活性的允许温度下孵育一定的时间段，所述时间段足以使所述温度敏感性活性在所述一个或多个细胞中产生效果；以及
ii)在非允许温度下孵育所述一个或多个细胞，其中所述非允许温度降低所述温度敏感性药剂的温度敏感性活性，
其中所述温度敏感性药剂包括含有人ZSCAN4蛋白或含有人ZSCAN4的编码区的核酸的治疗剂，并且所述效果包括治疗效果。
2.根据实施方案1所述的方法，所述方法在步骤i)之前进一步包括：使所述一个或多个细胞与所述温度敏感性药剂接触。
3.根据实施方案2所述的方法，其中所述一个或多个细胞在与所述温度敏感性药剂接触时处于所述允许温度下。
4.根据实施方案1-3中任一项所述的方法，所述方法进一步包括向需要所述治疗效果的受试者施用所述一个或多个细胞。
5.根据实施方案1-3中任一项所述的方法，其中在非允许温度下孵育所述一个或多个细胞包括向需要所述治疗效果的受试者施用所述一个或多个细胞，其中所述受试者的体温是所述非允许温度。
6.根据实施方案4或5所述的方法，其中在向所述受试者施用所述一个或多个细胞之前，将所述一个或多个细胞在所述非允许温度下进一步孵育。
7.根据实施方案2-6中任一项所述的方法，其中在使所述一个或多个细胞与所述温度敏感性药剂接触之前将所述一个或多个细胞从所述受试者分离。
8.根据实施方案1-7中任一项所述的方法，其中所述治疗效果包括增加所述一个或多个细胞的端粒长度。
9.根据实施方案1-8中任一项所述的方法，其中所述一个或多个细胞是哺乳动物细胞。
10.根据实施方案3-8中任一项所述的方法，其中所述受试者是人受试者。
11.一种用于在人受试者中瞬时诱导温度敏感性药剂的温度敏感性活性的方法，其中所述受试者的一个或多个细胞包含所述温度敏感性药剂，其中所述温度敏感性药剂的温度敏感性活性在允许温度下被诱导，并且其中所述允许温度低于所述受试者的体温，所述方法包括：
i)将所述受试者的体温降低至所述允许温度；
ii)将所述降低的体温维持一定的时间段，所述时间段足以使所述温度敏感性活性在所述受试者中诱导效果；以及
iii)将所述受试者的体温升高回正常体温，
其中所述温度敏感性药剂包括含有人ZSCAN4蛋白或含有人ZSCAN4的编码区的核酸的治疗剂，并且所述效果是治疗效果。
12.一种用于在人受试者中瞬时诱导温度敏感性药剂的温度敏感性活性的方法，其中所述温度敏感性药剂的温度敏感性活性在允许温度下被诱导，并且其中所述允许温度低于所述受试者的体温，所述方法包括：
i)将所述受试者的体温降低至所述允许温度；
ii)向所述受试者的一个或多个细胞施用所述温度敏感性药剂；
iii)将所述降低的体温维持一定的时间段，所述时间段足以使所述温度敏感性活性在所述受试者中诱导效果；以及
iv)将所述受试者的体温升高回正常体温，
其中步骤(i)在步骤(ii)之前、之后或同时进行，其中所述温度敏感性药剂包括含有人ZSCAN4蛋白或含有人ZSCAN4的编码区的核酸的治疗剂，并且所述效果是治疗效果。
13.根据实施方案12所述的方法，其中将所述温度敏感性药剂全身施用。
14.根据实施方案13所述的方法，其中将所述温度敏感性药剂静脉内施用。
15.根据实施方案12所述的方法，其中将所述温度敏感性药剂施用至所述受试者的特定组织或器官。
16.根据实施方案15所述的方法，其中将所述温度敏感性药剂通过硬膜外注射施用至脑和脊髓。
17.根据实施方案15所述的方法，其中将所述温度敏感性药剂通过经皮注射施用至靶器官中。
18.根据实施方案15所述的方法，其中将所述温度敏感性药剂通过内窥镜检查使用注射针头导管施用至靶器官中。
19.根据实施方案15所述的方法，其中将所述温度敏感性药剂通过血管导管施用至靶器官中。
20.根据实施方案17-19中任一项所述的方法，其中所述靶器官选自肝脏、肾脏、骨骼肌、心肌、胰腺、脾脏、心脏、脑、脊髓、皮肤、眼、肺、肠、胸腺、骨髓、骨和软骨。
21.根据实施方案12所述的方法，其中将所述温度敏感性药剂通过吸入施用。
22.根据实施方案11-21中任一项所述的方法，其中降低受试者的体温包括使用目标温度管理(TTM)程序，其中所述TTM程序包括向所述受试者施加由冷却导管、冷却毯和冰块组成的组中的一种。
23.根据实施方案11-22中任一项所述的方法，其中所述受试者是哺乳动物受试者，任选地其中所述受试者是人。
24.根据实施方案1-23中任一项所述的方法，其中所述温度敏感性药剂包含人ZSCAN4蛋白。
25.根据实施方案1-23中任一项所述的方法，其中所述温度敏感性药剂包含含有人ZSCAN4的编码区的核酸。
26.根据实施方案25所述的方法，其中所述温度敏感性病毒载体包含含有人ZSCAN4的编码区的核酸。
27.根据实施方案26所述的方法，其中所述温度敏感性病毒载体选自仙台病毒、腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒和甲病毒。
28.根据实施方案26所述的方法，其中所述温度敏感性病毒载体是甲病毒。
29.根据实施方案28所述的方法，其中所述甲病毒选自委内瑞拉马脑炎病毒、辛德比斯病毒和塞姆利基森林病毒。
30.根据实施方案26所述的方法，其中所述温度敏感性病毒载体是仙台病毒。
31.根据实施方案30所述的方法，其中所述仙台病毒是SeV18+/TS15ΔF。
32.根据实施方案26-31中任一项所述的方法，其中所述温度敏感性活性包括所述温度敏感性病毒载体的复制和转录。
33.根据实施方案25所述的方法，其中温度敏感性自我复制RNA包含含有人ZSCAN4的编码区的核酸。
34.根据实施方案33所述的方法，其中所述自我复制RNA包含缺乏病毒结构蛋白编码区的甲病毒复制子。
35.根据实施方案34所述的方法，其中所述甲病毒选自委内瑞拉马脑炎病毒、辛德比斯病毒和塞姆利基森林病毒。
36.根据实施方案33-35中任一项所述的方法，其中所述温度敏感性活性包括所述温度敏感性自我复制RNA的复制和转录中之一或二者。
37.根据实施方案25-36中任一项所述的方法，其中所述编码区与启动子可操作地连接。
38.根据实施方案1-10中任一项所述的方法，其中足以使所述温度敏感性活性产生所述治疗效果的所述时间段在约12小时至约12周的范围内，任选地其中所述时间段为1至7天。
39.根据实施方案11-37中任一项所述的方法，其中足以在所述受试者中诱导所述治疗效果的所述时间段是约12小时至约7天，任选地其中所述时间段是约12小时至约72小时。
40.根据实施方案1-39中任一项所述的方法，其中所述允许温度在30℃至36℃或38℃至50℃的范围内。
41.根据实施方案40所述的方法，其中所述允许温度是33℃±0.5℃。
42.根据实施方案40或实施方案41所述的方法，其中所述非允许温度是37℃±0.5℃。
43.根据实施方案1-42中任一项所述的方法，其中所述一个或多个细胞是人细胞。
44.根据实施方案43所述的方法，其中所述一个或多个人细胞是成体干细胞、组织干细胞、祖细胞、胚胎干细胞或诱导多能干细胞。
45.根据实施方案43所述的方法，其中所述一个或多个人细胞选自造血干细胞、间充质干细胞、内皮干细胞、脂肪干细胞、神经元干细胞和生殖干细胞。
46.根据实施方案43所述的方法，其中所述一个或多个人细胞是体细胞、成熟细胞或分化的细胞。
47.根据实施方案46所述的方法，其中所述一个或多个人细胞选自表皮细胞、成纤维细胞、淋巴细胞、肝细胞、上皮细胞、肌细胞、软骨细胞、骨细胞、脂肪细胞、心肌细胞、胰腺细胞、胰腺β细胞、角质细胞、红细胞、外周血单个核细胞(PBMC)、神经元、神经胶质细胞、神经细胞、星形胶质细胞、生殖细胞、精细胞和卵母细胞。
48.根据实施方案43所述的方法，其中所述一个或多个人细胞是人骨髓细胞。
49.根据实施方案48所述的方法，其中所述人骨髓细胞是CD34+造血干细胞。
50.根据实施方案48或实施方案49所述的方法，其中所述人受试者患有端粒生物学障碍，任选地其中所述受试者患有骨髓衰竭。
51.一种治疗血液或造血器官疾病的方法，所述方法包括：
i)将造血干细胞从骨髓动员至患有所述疾病的人受试者的外周血；
ii)从获自所述受试者的外周血单个核细胞样品分离CD34+细胞；
iii)在33℃±0.5℃的温度下孵育所述分离的CD34+细胞；
iv)使所述孵育的CD34+细胞与包含含有人ZSCAN4的编码区的异源核酸的温度敏感性仙台病毒载体接触；
v)将所述接触的CD34+细胞在33℃±0.5℃的允许温度下维持至少约12-72小时，其中所述温度敏感性仙台病毒载体的复制和转录在所述允许温度下发生，导致人ZSCAN4的表达增加；以及
vi)在适于植入所述细胞以治疗所述疾病的条件下将所述接触的CD34+细胞输注到所述受试者中。
52.一种治疗血液或造血器官疾病的方法，所述方法包括：
i)将造血干细胞从骨髓细胞动员至患有所述疾病的人受试者的外周血；
ii)从获自所述受试者的外周血单个核细胞样品分离CD34+细胞；
iii)使所述分离的CD34+细胞与包含含有人ZSCAN4的编码区的异源核酸的温度敏感性仙台病毒载体接触；
iv)将所述接触的CD34+细胞在33℃±0.5℃的允许温度下孵育至少约12-72小时，其中所述温度敏感性仙台病毒载体的复制和转录在所述允许温度下发生，导致人ZSCAN4的表达增加；以及
v)在适于植入所述细胞以治疗所述疾病的条件下将所述接触的CD34+细胞输注到所述受试者中。
53.根据实施方案51所述的方法，所述方法进一步包括在步骤v)之后，在将所述接触的CD34+细胞输注到所述受试者中之前，在37℃±0.5℃的非允许温度下孵育所述接触的CD34+细胞，其中所述温度敏感性仙台病毒载体的复制和转录以及人ZSCAN4的表达在所述非允许温度下停止。
54.根据实施方案52所述的方法，所述方法进一步包括在步骤iv)之后，在将所述接触的CD34+细胞输注到所述受试者中之前，在37℃±0.5℃的非允许温度下孵育所述接触的CD34+细胞，其中所述温度敏感性仙台病毒载体的复制和转录以及人ZSCAN4的表达在所述非允许温度下停止。
55.根据实施方案53或实施方案54所述的方法，其中将所述接触的CD34+细胞在37℃±0.5℃的非允许温度下孵育约30分钟至约10天，任选地约30-180分钟。
56.根据实施方案51-55中任一项所述的方法，其中通过向所述受试者施用粒细胞集落刺激因子和普乐沙福中之一或二者来动员所述造血干细胞。
57.根据实施方案51-56中任一项所述的方法，其中所述外周血单个核细胞通过单采术从所述受试者获得。
58.根据实施方案51-57中任一项所述的方法，其中通过使用抗CD34抗体和磁珠进行阳性选择从所述外周血单个核细胞分离所述CD34+细胞。
59.根据实施方案51-58中任一项所述的方法，其中在输注之前将所述接触的CD34+细胞洗涤并重悬于无菌等渗水溶液中。
60.根据实施方案59所述的方法，其中将所述接触的CD34+细胞以约1.0x10^5个细胞/kg至约1.0x10^7个细胞/kg，任选地约2.0-8.0x10^6个细胞/kg的剂量静脉内输注。
61.一种治疗血液或造血器官疾病的方法，所述方法包括：
i)向患有所述疾病的人受试者施用包含含有人ZSCAN4的编码区的异源核酸的温度敏感性仙台病毒载体；
ii)将所述受试者的核心体温降低至33℃±0.5℃的允许温度；
iii)将所述受试者的核心体温在所述允许温度下维持约12小时至约7天或约12-72小时的时间段，其中所述温度敏感性仙台病毒载体的复制和转录在所述允许温度下发生，导致人ZSCAN4的表达增加；以及
iv)允许所述受试者的核心体温返回到37℃±0.5℃的正常非允许温度，其中所述温度敏感性仙台病毒载体的复制和转录以及人ZSCAN4的表达在所述非允许温度下停止。
62.一种治疗血液或造血器官疾病的方法，所述方法包括：
i)将患有所述疾病的受试者的所述核心体温降低至33℃±0.5℃的允许温度；
ii)向所述受试者施用包含含有人ZSCAN4的编码区的异源核酸的温度敏感性仙台病毒载体；
iii)将所述受试者的核心体温在所述允许温度下维持约12小时至约7天或约12-72小时的时间段，其中所述温度敏感性仙台病毒载体的复制和转录在所述允许温度下发生，导致人ZSCAN4的表达增加；以及
iv)允许所述受试者的核心体温返回到37℃±0.5℃的正常非允许温度，其中所述温度敏感性仙台病毒载体的复制和转录以及人ZSCAN4的表达在所述非允许温度下停止。
63.根据实施方案61或实施方案62所述的方法，其中使用目标温度管理(TTM)程序降低所述受试者的核心体温，其中所述TTM程序包括向所述受试者施加由冷却导管、冷却毯和冰块组成的组中的一种。
64.根据实施方案51-63中任一项所述的方法，其中所述人受试者在治疗前被诊断患有骨髓衰竭，任选地其中所述骨髓衰竭包括中性粒细胞减少症、血小板减少症和贫血中的一种或多种。
65.根据实施方案51-64中任一项所述的方法，其中所述受试者不患有癌症。
66.根据实施方案51-65中任一项所述的方法，其中所述疾病是端粒生物学障碍。
67.根据实施方案66所述的方法，其中所述端粒生物学障碍选自先天性角化不良、Hoyeraal-Hreidarsson综合征、Revesz综合征、Coats plus综合征、特发性肺纤维化和肝硬化。
68.根据实施方案66所述的方法，其中所述端粒生物学障碍由以下中之一或二者定义：
i)外周血淋巴细胞、B细胞和幼稚T细胞中的一种或多种中年龄标化平均端粒长度小于1百分位数；以及
ii)选自DKC1、TERC、TERT、NOP10、NHP2、TINF2、CTC1、PARN、RTEL1、ACD、USB1和WRAP53的基因中的致病突变。
69.根据实施方案51-63中任一项所述的方法，其中所述疾病是骨髓衰竭综合征。
70.根据实施方案69所述的方法，其中所述骨髓衰竭综合征选自范可尼贫血、无巨核细胞血小板减少症、再生障碍性贫血、Diamond Blackfan贫血、阵发性睡眠性血红蛋白尿症、皮尔逊综合征、Shwachman Diamond综合征和骨髓增生异常综合征。
71.根据实施方案64所述的方法，其中所述疾病与核型异常相关。
72.根据实施方案1-71中任一项所述的方法，其中人ZSCAN4的所述氨基酸序列包含SEQ ID NO:38或与SEQ ID NO:38至少95％相同。
73.根据实施方案1-71中任一项所述的方法，其中人ZSCAN4的所述氨基酸序列包含由SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41和SEQ ID NO:42组成的组中的一个，或与由SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41和SEQ ID NO:42组成的组中的一个至少95％相同。
74.根据实施方案26-50中任一项所述的方法，其中所述温度敏感性病毒载体或所述温度敏感性自我复制RNA包含插入12-18个核苷酸的非结构蛋白编码区，其中所述插入导致在所述nsP2的β片层5与β片层6之间包含4至6个另外的氨基酸的非结构蛋白2(nsP2＝解旋酶蛋白酶)的表达，任选地其中所述另外的氨基酸导致所述病毒载体或所述自我复制RNA的温度敏感性。
75.根据实施方案74所述的方法，其中所述另外的氨基酸包含选自SEQ ID NO:43(GCGRT)、SEQ ID NO:44(TGAAA)和SEQ ID NO:45(LRPHP)的一个序列。
76.根据实施方案74所述的方法，其中所述另外的氨基酸包含SEQ ID NO:44(TGAAA)的序列。
77.根据实施方案76所述的方法，其中所述NsP2的氨基酸序列包含选自SEQ IDNO:29-36的一个序列。
78.一种温度敏感性药剂，其中所述药剂是温度敏感性病毒载体或温度敏感性自我复制RNA，其包含含有人ZSCAN4的编码区的异源核酸和插入12-18个核苷酸的非结构蛋白编码区，其中所述插入导致在所述nsP2的β片层5与β片层6之间包含4至6个另外的氨基酸的非结构蛋白2(nsP2＝解旋酶蛋白酶)的表达，任选地其中所述另外的氨基酸导致所述病毒载体或所述自我复制RNA的温度敏感性。
79.根据实施方案78所述的温度敏感性药剂，其中所述另外的氨基酸包含选自SEQID NO:43(GCGRT)、SEQ ID NO:44(TGAAA)和SEQ ID NO:45(LRPHP)的一个序列。
80.根据实施方案78所述的温度敏感性药剂，其中所述另外的氨基酸包含SEQ IDNO:44(TGAAA)的序列。
81.根据实施方案81所述的温度敏感性药剂，其中所述NsP2的氨基酸序列包含选自SEQ ID NO:29-36的一个序列。
82.根据实施方案78-81中任一项所述的温度敏感性药剂，其中所述药剂是温度敏感性甲病毒载体。
83.根据实施方案78-81中任一项所述的温度敏感性药剂，其中所述药剂是包含缺乏病毒结构蛋白编码区的甲病毒复制子的温度敏感性自我复制RNA。
84.根据实施方案82或实施方案83所述的温度敏感性药剂，其中所述甲病毒选自委内瑞拉马脑炎病毒、辛德比斯病毒和塞姆利基森林病毒。
85.根据实施方案82或实施方案83所述的温度敏感性药剂，其中所述甲病毒是委内瑞拉马脑炎病毒。
86.一种用于在受试者中瞬时诱导温度敏感性药剂(ts药剂)的温度敏感性活性的方法，其中所述ts药剂是温度敏感性病毒载体或温度敏感性自我复制RNA，其包含含有人ZSCAN4的编码区的异源核酸，其中所述受试者的身体表面处或附近的一个或多个细胞包含所述ts药剂，其中所述ts药剂的温度敏感性活性包括在允许温度下表达人ZSCAN4，并且其中所述允许温度是所述受试者的表面体温，所述方法包括：
i)将所述受试者的表面体温在所述允许温度下维持一定的时间段，所述时间段足以使所述温度敏感性活性在所述受试者中诱导效果；以及
ii)将所述受试者的表面体温升高至非允许温度，持续一定的时间段，所述时间段足以使所述受试者中的所述温度敏感性活性停止。
87.一种用于在受试者中瞬时诱导温度敏感性药剂(ts药剂)的温度敏感性活性的方法，其中所述ts药剂是温度敏感性病毒载体或温度敏感性自我复制RNA，其包含含有人ZSCAN4的编码区的异源核酸，其中所述ts药剂的温度敏感性活性包括在允许温度下表达人ZSCAN4，并且其中所述允许温度是所述受试者的表面体温，所述方法包括：
i)将所述ts药剂施用至所述受试者的身体表面处或附近的一个或多个细胞；以及
ii)将所述受试者的表面体温在所述允许温度下维持一定的时间段，所述时间段足以使所述温度敏感性活性在所述受试者中诱导效果。
88.根据实施方案87所述的方法，所述方法进一步包括iii)将所述受试者的表面体温升高至非允许温度，持续一定的时间段，所述时间段足以使所述受试者中的所述温度敏感性活性停止。
89.根据实施方案86或实施方案87所述的方法，其中将所述温度敏感性药剂i)皮内或皮下施用；或ii)肌内施用。
90.根据实施方案86或实施方案87所述的方法，其中将所述温度敏感性药剂鼻内施用。
91.根据实施方案86-90中任一项所述的方法，其中所述非允许温度高于36℃，并且所述允许温度低于36℃，任选地其中所述允许温度为约31℃至约34℃或约33℃±0.5℃，并且所述非允许温度为37℃±0.5℃。
92.根据实施方案86-91中任一项所述的方法，其中人ZSCAN4的表达的所述效果是预防效果或治疗效果。
93.根据实施方案86-92中任一项所述的方法，其中所述ts药剂是温度敏感性病毒载体并且所述温度敏感性活性进一步包括所述温度敏感性病毒载体的复制和转录。
94.根据实施方案93所述的方法，其中所述温度敏感性病毒载体选自仙台病毒、腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒和甲病毒。
95.根据实施方案93所述的方法，其中所述温度敏感性病毒载体是甲病毒，任选地其中所述甲病毒选自委内瑞拉马脑炎病毒、辛德比斯病毒和塞姆利基森林病毒。
96.根据实施方案93所述的方法，其中所述温度敏感性病毒载体是仙台病毒。
97.根据实施方案86-92中任一项所述的方法，其中所述ts药剂是温度敏感性自我复制RNA，并且所述温度敏感性活性进一步包括所述温度敏感性自我复制RNA的复制和转录中之一或二者。
98.根据实施方案97所述的方法，其中所述自我复制RNA包含缺乏甲病毒病毒结构蛋白编码区的甲病毒复制子。
99.根据实施方案98所述的方法，其中所述甲病毒选自委内瑞拉马脑炎病毒、辛德比斯病毒和塞姆利基森林病毒。
100.根据实施方案98所述的方法，其中所述甲病毒是委内瑞拉马脑炎病毒。
101.根据实施方案86-100中任一项所述的方法，其中足以使所述温度敏感性活性产生效果的所述时间段在约12小时至约12周的范围内，任选地其中所述时间段为1至7天。
102.根据实施方案86-100中任一项所述的方法，其中足以在所述受试者中诱导效果的所述时间段是约12小时至约7天，任选地其中所述时间段是约12小时至约72小时。
103.根据实施方案86-102中任一项所述的方法，其中所述受试者是哺乳动物受试者，任选地其中所述受试者是人。
实施例
缩写：Aura(奥拉病毒)；BFV(巴马森林病毒)；GFP(绿色荧光蛋白)；GOI(目的基因)；IRES(内部核糖体进入位点)；LUC(萤光素酶)；ONNV(奥-奈氏病毒)；RRV(罗斯河病毒)；SeV(仙台病毒)；SeVts(温度敏感性仙台病毒)；SFV(塞姆利基森林病毒)；shRNA(短发夹RNA)；SINV(辛德比斯病毒)；srRNA(自主复制RNA)；ts(温度敏感)；ts药剂(温度敏感性药剂)；VEEV(委内瑞拉马脑炎病毒)；和WEEV(西部马脑炎病毒)。
提供以下实施例以说明某些特定特征和/或实施方案。实施例不旨在限制所要求保护的公开内容。
实施例1：温度敏感性药剂
本实施例描述了在低于或高于正常体温的温度下起作用，但在正常体温下不起作用或显示出降低的功能的温度敏感性药剂(ts药剂)。ts药剂适用于离体、半体内和体内疗法。将温度敏感性病毒载体和自我复制RNA工程化以表达目的基因(GOI)、短发夹RNA(shRNA)、长非编码RNA和/或其他遗传元件。例如，具有温度敏感性突变的蛋白质在较低温度(例如，30℃)下起作用，但在正常体温(例如，37℃)下不起作用。除非另有规定，否则正常体温为正常人体温度37℃±0.5℃。
特定的GOI是ZSCAN4基因，其在本文中也称为ZSCAN4基因的编码区或编码ZSCAN4蛋白的核酸。人ZSCAN4蛋白的氨基酸序列如(SEQ ID NO:38)所示。
实施例2：温度敏感性仙台病毒载体(SeVts)
本实施例描述了温度敏感性仙台病毒载体(SeVts)，其可用于温度特异性基因表达。仙台病毒载体基于仙台病毒，即一种副粘病毒亚科的单链RNA病毒。SeV18/TS15ΔF是温度敏感性仙台病毒载体，当保持在32℃-35℃下时允许病毒复制和基因表达。然而，在37℃及更高的非允许温度下病毒复制停止(Ban等人.,PNAS 2011)。
实施例3：温度敏感性自我复制RNA(srRNA)
本实施例描述了如下发现，即在委内瑞拉马脑炎病毒(VEEV)载体中编码的nsP2蛋白中的突变展现出温度敏感性。温度敏感性系统允许目的基因(GOI)在30℃-33℃下表达，但在37℃及更高温度下不表达。srRNA载体允许GOI比编码GOI的合成RNA更高的表达。当温度转变至37℃(例如，非允许温度)时，GOI的表达被关闭。本研究中鉴定的特定温度敏感性突变(突变2)是在甲病毒中的高度保守区。与仙台病毒载体(SeVts)相比，srRNAts对于一些应用可能更有吸引力，因为srRNAts可用于非病毒RNA表达系统。
材料和方法
细胞培养
人脂肪干细胞来源的iPS细胞系(ADSC-iPS细胞)购自System Biosciences(加利福尼亚州帕洛阿尔托)。根据标准的hPSC培养方法，细胞常规地被维持为未分化的人多能细胞(hPSC)。简言之，在补充有100ng/ml FGF2的StemFit basic02(Ajinomoto,日本)中培养细胞。此外，在包被有层粘连蛋白-511底物(iMatrix-511,Nippi,日本)的细胞培养皿上培养细胞。
VEEV载体
基于公众可获得的序列信息(T7-VEE-IRES-Puro，下文称为“srRNA1wt”)，使用合成的DNA片段组装VEEV载体质粒。根据Yoshioka等人,2013，最初如Petrakova等人,2005中所述得到VEEV载体骨架。通过插入诱变和大规模平行测序(Beitzel等人,2010)鉴定的7480个候选序列用于得到潜在的温度敏感性突变体。通过转座子介导的在VEEV基因组中插入15bp进行最初的大规模筛选(图1A)。随后，将能够在30℃或40℃下增殖的大量15bp插入VEEV突变体分离。尽管这些数据提供了用于进一步研究的初始突变体，但不知道这些序列是否展现出温度敏感性，例如在32℃或33℃下的允许性和在37℃下的非允许性。从总共7480个候选突变体序列(来自Beitzel等人,2010的数据集S1)中选择三种突变体序列—突变体1(ts1，图1B)、突变体2(ts2，图1C)和突变体3(ts3，图1D)。合成这些突变体DNA片段(图2)并将其克隆到VEEV载体中，并命名为srRNA1ts1(突变体1)、srRNA1ts2(突变体2)、srRNA1ts3(突变体3)。设计突变体4，其包括病毒序列的5'-区域(5’-UTR和已知包括51-nt保守序列元件(CSE)的RNA依赖性RNA聚合酶的N末端蛋白序列的一部分)。在这种情况下，核苷酸被系统地改变为热稳定性较差的变体(例如，G->A)，同时保持氨基酸序列(图3)。将srRNA1ts2中该区域的序列替换以产生srRNA1ts4(即，含有突变体4和突变体2二者)。根据Yoshioka等人,2013，从这些载体产生合成RNA。
结果
评估srRNA1ts2-GFP和srRNA1ts3-GFP在30℃、32℃和37℃下的温度敏感性
将ADSC-iPSC细胞以80,000个细胞/孔的密度铺板在24孔板上。24小时后，用srRNA1wt-GFP、srRNA1ts2-GFP或srRNA1ts3-GFP转染细胞。对于转染，用与1μlJetMessenger(Polyplus)转染试剂混合的0.5μg合成RNA(srRNA)处理24孔板的每个孔，最终体积为50μl。向细胞中添加转染复合物后，添加450μl培养基。将细胞在30℃、32℃或37℃下孵育。转染后6小时，更换培养基以去除转染复合物。在20小时和48小时拍摄相对比和荧光图像。图4A显示野生型(srRNA1wt-GFP)在37℃下强烈表达GFP，但在30℃和32℃下均仅微弱表达GFP。相比之下，突变体2(srRNA1ts2-GFP)在30℃和32℃下表达GFP，但在37℃下不表达GFP。突变体3(srRNA1ts3-GFP)在30℃和32℃下表达GFP，但在37℃下也表达GFP。基于这些结果，选择突变体2用于进一步开发。如所预期的，与通过编码GFP的合成mRNA的单次转染实现的GFP表达水平相比，srRNA显示出高得多的GFP表达(图4B)。
评估srRNA1ts1-GFP和srRNA1ts2-GFP在32℃下的温度敏感性
将ADSC-iPSC细胞以50,000个细胞/孔的密度铺板在24孔板上。24小时后，用srRNA1wt-GFP、srRNA1ts2-GFP或srRNA1ts1-GFP转染细胞。对于转染，用与1μlJetMessenger(Polyplus)转染试剂混合的0.5μg合成RNA(srRNA)处理24孔板的每个孔，最终体积为50μl。向细胞中添加转染复合物后，添加450μl培养基。将细胞在32℃下孵育。转染后6小时，更换培养基以去除转染复合物。在24、48、72、96、120、144、168、192、240和288小时拍摄相对比和荧光图像。
图5示出了结果。野生型(srRNA1wt-GFP)的GFP表达在24小时开始并持续直到观察期结束(在288小时)，但在整个时间过程中非常弱。相比之下，突变体2(srRNA1ts2-GFP)的GFP表达在整个时间过程中非常强烈。突变体1(srRNA1ts1-GFP)完全不表达GFP(基于24小时和168小时的观察)。基于这些结果，选择突变体2用于进一步开发。
评估srRNA1ts2-GFP和srRNA1ts4-GFP在32℃、33℃和37℃下的温度敏感性
将ADSC-iPSC细胞以50,000个细胞/孔的密度铺板在24孔板上。24小时后，用srRNA1ts2-GFP或srRNA1ts4-GFP转染细胞。对于转染，用与1μl JetMessenger(Polyplus)转染试剂混合的0.5μg合成RNA(srRNA)处理24孔板的每个孔，最终体积为50μl。向细胞中添加转染复合物后，添加450μl培养基。将细胞在32℃、33℃或37℃下孵育。转染后6小时，更换培养基以去除转染复合物。在20、48和96小时拍摄相对比和荧光图像。
图6示出了结果。在32℃和33℃下，突变体2(srRNA1ts2-GFP)的GFP表达早在20小时就开始，但在48小时显著增加，并且在96小时进一步增加。GFP的表达在33℃下比在32℃下更强。与上述实验一致，在37℃下GFP完全不表达。srRNA1ts4-GFP(含有突变体2和突变体4二者)显示与srRNA1ts2-GFP相似的温度曲线，但GFP表达总体上弱得多。基于这些结果，选择突变体2用于进一步开发。
评估srRNA1ts2-GFP在32℃下的温度敏感性
将ADSC-iPSC细胞以80,000个细胞/孔的密度铺板在24孔板上。24小时后，用srRNA1ts2-GFP转染细胞。对于转染，用与1μl JetMessenger(Polyplus)转染试剂混合的0.5μg合成RNA(srRNA)处理24孔板的每个孔，最终体积为50μl。向细胞中添加转染复合物后，添加450μl培养基。将细胞在32℃下孵育。转染后6小时，更换培养基以去除转染复合物。每天更换培养基。srRNA1ts2-GFP载体含有在“IRES”序列后插入的嘌呤霉素N-乙酰转移酶(pac)选择基因，因此，可以使用嘌呤霉素进行选择。在不存在(上图)或存在(下图)1μg/ml嘌呤霉素的情况下进行实验。对于使用嘌呤霉素选择的细胞，在48小时和72小时添加嘌呤霉素。在24、48、72、96、144、168、192小时拍摄相对比和荧光图像。
图7示出了结果。在32℃下，srRNA1ts2-GFP的GFP表达早在24小时就开始，但在48小时显著增加，并且在72小时和96小时达到峰值。GFP的表达持续到观察期结束(在192小时)。GFP的表达模式似乎没有因添加嘌呤霉素而改变。
评估24小时后从32℃转换至37℃的srRNA1ts2-GFP的温度敏感性。
将ADSC-iPSC细胞以80,000个细胞/孔的密度铺板在24孔板上。24小时后，用srRNA1ts2-GFP转染细胞。对于转染，用与1μl JetMessenger(Polyplus)转染试剂混合的0.5μg合成RNA(srRNA)处理24孔板的每个孔，最终体积为50μl。向细胞中添加转染复合物后，添加450μl培养基。将细胞在32℃下孵育。转染后6小时，更换培养基以去除转染复合物。每天更换培养基。srRNA1ts2-GFP载体含有在“IRES”序列后插入的嘌呤霉素N-乙酰转移酶(pac)选择基因，因此，可以使用嘌呤霉素进行选择。在不存在(上图)或存在(下图)1μg/ml嘌呤霉素的情况下进行实验。对于使用嘌呤霉素选择的细胞，在48小时和72小时添加嘌呤霉素。为了测试温度变化的影响，在24小时(转染后24小时)将细胞培养物转移到维持在37℃下的CO2培养箱中。在24、48、72、96、144、168、192小时拍摄相对比和荧光图像。
图8显示了结果。在32℃下，srRNA1ts2-GFP的GFP表达早在24小时就开始，但甚至在24小时温度转换至37℃后仍继续增加。GFP的表达在48小时达到峰值，然后开始降低。到96小时，GFP表达变得非常弱，并且到144小时，GFP表达不再被检测到。随后，直到192小时观察期结束都没有GFP表达。因此，当温度从33℃(允许温度)转变至37℃(非允许温度)时，GOI(在此由GFP表示)的表达被快速关闭。GFP的表达模式似乎没有因添加嘌呤霉素而改变。
评估48小时后从32℃转换至37℃的srRNA1ts2-GFP的温度敏感性。
将ADSC-iPSC细胞以80,000个细胞/孔的密度铺板在24孔板上。24小时后，用srRNA1ts2-GFP转染细胞。对于转染，用与1μl JetMessenger(Polyplus)转染试剂混合的0.5μg合成RNA(srRNA)处理24孔板的每个孔，最终体积为50μl。向细胞中添加转染复合物后，添加450μl培养基。将细胞在32℃下孵育。转染后6小时，更换培养基以去除转染复合物。每天更换培养基。srRNA1ts2-GFP载体含有在“IRES”序列后插入的嘌呤霉素N-乙酰转移酶(pac)选择基因，因此，可以使用嘌呤霉素进行选择。在不存在(上图)或存在(下图)1μg/ml嘌呤霉素的情况下进行实验。对于使用嘌呤霉素选择的细胞，在48小时和72小时添加嘌呤霉素。为了测试温度变化的影响，在48小时(转染后48小时)将细胞培养物转移到维持在37℃下的CO2培养箱中。在24、48、72、96、144、168、192小时拍摄相对比和荧光图像。
图9显示了结果。在32℃下，srRNA1ts2-GFP的GFP表达早在24小时就开始并且在48小时进一步增加。即使在48小时将温度转换至37℃后，GFP的表达仍持续到96小时。但GFP表达从72小时开始下降，并且到96小时GFP表达变得非常弱。到144小时，几乎检测不到GFP表达，并且到192小时完全关闭。因此，当温度从33℃(允许温度)转变至37℃(非允许温度)时，GOI(在此由GFP表示)的表达被快速关闭。GFP的表达模式似乎没有因添加嘌呤霉素而改变。
评估72小时后从32℃转换至37℃的srRNA1ts2-GFP的温度敏感性。
将ADSC-iPSC细胞以80,000个细胞/孔的密度铺板在24孔板上。24小时后，用srRNA1ts2-GFP转染细胞。对于转染，用与1μl JetMessenger(Polyplus)转染试剂混合的0.5μg合成RNA(srRNA)处理24孔板的每个孔，最终体积为50μl。向细胞中添加转染复合物后，添加450μl培养基。将细胞在32℃下孵育。转染后6小时，更换培养基以去除转染复合物。每天更换培养基。srRNA1ts2-GFP载体含有在“IRES”序列后插入的嘌呤霉素N-乙酰转移酶(pac)选择基因，因此，可以使用嘌呤霉素进行选择。在不存在(上图)或存在(下图)1μg/ml嘌呤霉素的情况下进行实验。对于使用嘌呤霉素选择的细胞，在48小时和72小时添加嘌呤霉素。为了测试温度变化的影响，在72小时(转染后72小时)将细胞培养物转移到维持在37℃下的CO2培养箱中。在24、48、72、96、144、168、192小时拍摄相对比和荧光图像。
图10显示了结果。在32℃下，srRNA1ts2-GFP的GFP表达在24小时就开始并且在48小时进一步增加。即使在48小时将温度转换至37℃后，GFP的表达仍持续到96小时。但GFP表达从72小时开始下降，并且到144小时GFP表达变得非常弱。到168小时，几乎检测不到GFP表达，并且到192小时完全关闭。因此，当温度从33℃(允许温度)变化到37℃(非允许温度)时，GOI(在此由GFP表示)的表达被快速关闭。GFP的表达模式似乎没有因添加嘌呤霉素而改变。
评估srRNA1ts2-GFP在成纤维细胞中的温度敏感性
将人新生真皮成纤维细胞(第20代的HDFn)以10,000个细胞/孔的密度铺板在24孔板上。24小时后，用srRNA1wt-GFP转染细胞。通过使用JetMessenger(Polyplus)转染试剂或Lipofectamine MessengerMax(Thermo-Fisher)进行srRNA1wt-GFP(0.5μg合成RNA)的转染。将细胞在37℃下孵育。为了观察已知抑制干扰素应答的B18R的作用，在不存在(上图)或存在(下图)200ng/ml B18R的情况下进行转染和细胞培养。每天更换培养基。在0、24、48和96小时拍摄相对比和荧光图像。
图11显示了结果。在不存在B18R的情况下，几乎没有检测到GFP的表达。相比之下，在存在B18R的情况下，srRNA1wt-GFP的GFP表达早在24小时就开始并且持续直到48小时和72小时。GFP在GFP+细胞中强烈表达，但GFP+细胞的频率不高。这很可能是由于srRNA1wt-GFP对人原代成纤维细胞的低转染效率。
比对对应于突变体2(ts2)的甲病毒家族的氨基酸序列
如图12所示，甲病毒的nsP2蛋白的结构，甚至在氨基酸水平上在家族成员中是高度保守的。基于3D结构模型(Russo等人,2006)，其中5个氨基酸SEQ ID NO:44(TGAAA)插入突变体2中的蛋白质区域是两个β片层结构之间的转折点，其在甲病毒家族成员中也是高度保守的。因此，突变体2的温度敏感性极有可能可以转移到其他甲病毒家族成员，包括Aura(奥拉病毒)、WEEV(西部马脑炎病毒)、BFV(巴马森林病毒)、ONNV(奥-奈氏病毒)、RRV(罗斯河病毒)、SFV(塞姆利基森林病毒)、和SINV(辛德比斯病毒)。用于在各种甲病毒的nsP2中插入以赋予温度敏感性的合适位置列于表3-1中。
表3-1.甲病毒nsP2序列和插入位点
Figure BDA0003808661270000331
实施例4：温度敏感性抗体
本实施例描述了温度敏感性抗体。在允许温度(例如，32℃)下起作用并且在非允许温度(例如，37℃)下不起作用或显示降低的功能的抗体通过插入或取代氨基酸序列来工程化。温度敏感性抗体可以通过插入编码温度敏感性螺旋卷曲过渡肽(-Glu-Ala-Ala-Ala-Lys-，如SEQ ID NO:37所示)的接头寡核苷酸来产生，如(Kamihara和Iijima,2000；Merutka和Stellwagen,1990)所述。以这种方式，可以产生工程化抗体，其在允许温度(例如32℃)下起作用，但在非允许温度(例如37℃)下不起作用。可替代地，可以使用在低温环境中自然生活的动物(例如大西洋鲑鱼和虾)的抗体DNA序列，因为这些抗体在允许温度(低温)下最佳地起作用，但在非允许温度(例如37℃)下显示出降低的功能。
实施例5：温度敏感性蛋白
本实施例描述了温度敏感性蛋白。此类蛋白质在允许温度(例如，32℃)下起作用并且在非允许温度(例如，37℃)下不起作用或显示低功能。将温度敏感性蛋白通过取代氨基酸序列进行工程化。可替代地，可以使用从在低温环境中自然生活的动物(例如大西洋鲑鱼和虾)获得的温度敏感性蛋白质，因为这些蛋白质在允许温度(低温)下最佳地起作用，但在非允许温度(例如37℃)下显示出降低的功能。
实施例6：温度敏感性RNA
本实施例描述了温度敏感性RNA分子。RNA分子包括但不限于mRNA、mRNA的前体、非编码RNA、siRNA和shRNA。温度敏感性RNA在允许温度(例如，32℃)下起作用并且在非允许温度(例如，37℃)下不起作用或显示低功能。通过系统地将RNA分子的核苷酸改变为热稳定性较差的变体(例如，G->A)同时确保维持RNA的功能特性，将温度敏感性RNA工程化。此外，由温度转变诱导的核苷酸对的热稳定性差异改变了RNA的二级结构。
实施例7：用温度敏感性药剂离体处理细胞
本实施例说明了一种用于将RNA或蛋白质离体瞬时递送至细胞的方法(图13)。温度敏感性治疗剂可以是本文公开的任何温度敏感性治疗剂。ts药剂如srRNA或仙台病毒载体在允许温度(例如33℃)下起作用，但在非允许温度(例如37℃)下不起作用。将用ts药剂处理的靶细胞在允许温度下离体培养特定的持续时间(例如3天)，然后在非允许温度下培养特定的持续时间(例如10天)。GOI的RNA(或从RNA翻译的蛋白质)的水平在允许温度下增加并达到高水平。在转换至非允许温度后，预期的RNA水平逐渐降低，随后达到非表达水平(图13)。
实施例8：温度敏感性药剂的离体治疗用途
本实施例说明了一种用于将RNA或蛋白质离体瞬时递送至细胞的方法(图14和图15)。ts药剂如srRNA或仙台病毒载体在允许温度(例如33℃)下起作用，但在非允许温度(例如37℃：人体温)下不起作用。通常，靶细胞取自患者(自体细胞移植物；图14)，但也可以使用从供体分离的靶细胞(同种异体细胞移植物；图15)。例如，可通过使用抗体缀合的磁珠来分离靶细胞。将靶细胞与ts药剂在允许温度例如33℃下离体孵育特定的持续时间，例如24小时。GOI的RNA(或从RNA翻译的蛋白质)的水平在允许温度下增加，达到高水平。在诱导治疗效果后，将细胞移植回患者以治疗患者。温度敏感性治疗剂的活性在受试者的正常体温下不被诱导(即正常体温是非允许温度)。温度敏感性治疗剂的降解在诱导治疗效果之后开始，并且最终温度敏感性治疗剂完全降解。在患者的一生中，体温维持在37℃或更高温度，因此，ts药剂不被重新激活，并且除靶细胞之外的细胞将不会被ts药剂处理。
动员的人外周血细胞
将从患者或供体的骨髓或外周血分离的人血细胞在允许温度下用ts药剂离体处理。在注射G-CSF或其他动员剂后，通过单采术机器(例如，COBE Spectra)从外周血收集人白细胞。从骨髓动员后收集的白细胞含有粒细胞、单核细胞、淋巴细胞、树突细胞、间充质干细胞(MSC)、血管内皮细胞(VEC)和CD34+造血细胞/祖细胞。理想地，使用功能封闭系统如Miltenyi的CliniMacs Prodigy，在功能性温度(例如，33℃)下，用ts药剂离体处理这些细胞一段时间(几小时至几周)。随后，在非允许温度(37℃)下将处理的细胞输注到患者中。ts药剂、含有ts药剂的细胞或ts药剂的产物在患者体内不起作用。
人CD34+造血干细胞/祖细胞
通过抗体(抗CD34)缀合的磁珠从动员的人外周血细胞或骨髓细胞分离人CD34+造血干细胞/祖细胞，并将其用作靶细胞，在允许温度下用ts药剂离体处理。在用ts药剂处理后，将人CD34+细胞输注到患者体内并移植到患者的骨髓中。这些细胞将最终在患者体内产生所有血细胞，因此是多种疾病的合适靶标。
包括组织干细胞在内的任何人细胞
将从患者或供体分离并用作靶细胞的任何人细胞在允许温度下用ts药剂离体处理。这些细胞包括但不限于皮肤成纤维细胞、滤泡细胞、骨骼肌细胞、肝细胞和神经组织。这些细胞还包括各种组织干细胞，例如间充质干细胞、神经干细胞、肌肉干细胞、皮肤干细胞和肠干细胞。
实施例9：温度敏感性药剂的半体内治疗用途
本实施例描述了将RNA或蛋白质瞬时递送至细胞的半体内方法(图16)。温度敏感性治疗剂可以是本文公开的任何温度敏感性治疗剂。ts药剂在允许温度(例如33℃)下起作用，但在非允许温度(例如37℃)下不起作用。
患者经历治疗性低体温的程序：患者的核心体温维持在低于正常体温的温度(例如，33℃)下。用ts药剂离体处理靶细胞(任何自体的或同种异体的细胞)并立即输注到患者的循环中或注射到患者的器官中。
当患者在目标温度(例如33℃)下维持特定的持续时间(例如24小时)时，ts药剂展现出其预期功能。GOI的RNA(或从RNA翻译的蛋白质)的水平在允许温度下增加，达到高水平。随后，患者体温返回到37℃的正常温度。ts药剂在患者体内37℃的非允许条件下不再起作用。在患者的一生中，体温维持在37℃或更高温度，因此，ts药剂不被重新激活，并且除靶细胞之外的细胞将不会被ts药剂处理。值得注意的是，该治疗程序可应用于任何细胞类型，包括上述那些。
实施例10：温度敏感性药剂的体内治疗用途
本实施例说明了如何将温度敏感性病毒载体施用至受试者，并且当在受试者中诱导温和低体温时被瞬时激活(图17)。温度敏感性治疗剂可以是本文公开的任何温度敏感性治疗剂。温度敏感性治疗剂在允许温度(例如33℃)下起作用，但在非允许温度(例如37℃：人体温)下不起作用。
使用目标温度管理(TTM)程序降低受试者的体温，该程序已在临床中用于心脑创伤患者(Callaway等人,2015)。TTM程序被设计为实现并维持受试者体内的特定体温一段时间。此类程序先前已在治疗上用于减少各种急性健康问题(例如心脏病发作和中风)引起的负面影响。使用TTM程序的设备和一般方法是本领域已知的并且可以用于本文所述的方法中。TTM程序可以使用多种方法进行，包括冷却导管、冷却毯和在身体周围施加冰块。多种器械已用于此目的。例如，ArcticSunTM是可用于将患者体温降低或升高至32℃-38.5℃的器械(Pittl等人,2013)。所述程序可安全进行，并且据报道，该器械没有造成重大不利影响。
使用TTM程序将患者置于低体温条件下，并且目标体温是足以诱导温度敏感性治疗剂的活性的温度。温度敏感性治疗剂通过全身途径(例如静脉内)或通过直接注射到器官/组织中(例如导管或经皮针头注射)直接递送至患者(图17)。
将患者的温度在允许温度下保持一定的时间，所述时间足以允许诱导温度敏感性治疗剂的期望活性。温度敏感性药剂的期望活性在含有或暴露于温度敏感性治疗剂的细胞中产生治疗效果。
在实现期望的治疗效果之后，患者的体温随后返回到正常体温(即，非允许温度)，导致温度敏感性治疗剂的活性停止。随后是温度敏感性治疗剂的降解。
通过循环的全身递送
将患者置于低体温条件下(例如33℃)。一旦患者的核心体温稳定地维持在目标温度，就将ts药剂直接静脉内递送至患者。通过该全身途径将ts药剂递送至许多器官和组织。患者的核心体温在功能性温度下维持期望的持续时间(例如，24小时)。当患者的体温保持在药剂的允许温度(例如，在33℃)下时，药剂起作用。当患者体温返回到正常的37℃时，即药剂的非允许温度，药剂停止起作用。
ts药剂可以是裸RNA(即合成RNA)。在具有或不具有靶器官特异性的情况下通过循环的全身递送将裸RNA递送至许多器官。可替代地，ts药剂是由纳米颗粒包封的RNA(即合成RNA)，所述纳米颗粒被工程化以靶向特定细胞类型、组织、器官、癌症、肿瘤或异常细胞。因此，通过循环的全身递送将纳米颗粒包封的RNA递送至特定细胞类型、组织、器官、癌症、肿瘤或异常细胞。可替代地，ts药剂是包装在病毒颗粒中的RNA。根据包膜类型和其他特征，病毒颗粒靶向特定细胞类型、组织、器官、癌症、肿瘤或异常细胞。因此，通过循环的全身递送将包装在病毒颗粒中的RNA递送至特定细胞类型、组织、器官、癌症、肿瘤或异常细胞。可替代地，ts药剂是温度敏感性病毒载体。根据包膜类型和其他特征，病毒颗粒靶向特定细胞类型、组织、器官、癌症、肿瘤或异常细胞。因此，通过循环的全身递送将温度敏感性病毒载体递送至特定细胞类型、组织、器官、癌症、肿瘤或异常细胞。
通过脑脊液靶向递送至脑和脊髓
将患者置于低体温条件下(例如33℃)。当患者的核心体温稳定地维持在目标温度下时，通过硬膜外注射将ts药剂直接递送至患者的脑脊液。将ts药剂递送至脑和脊髓。患者的核心体温继续维持在允许温度下一段期望的持续时间(例如，24小时)。当患者的体温保持在药剂的允许温度(例如，在33℃)下时，药剂起作用。当患者体温返回到正常的37℃时，即药剂的非允许温度，药剂停止起作用。
通过经皮注射靶向递送至肝脏、肾脏、骨骼肌、心肌、胰腺、骨髓和其他器官
将患者置于低体温条件下(例如33℃)。当患者的核心体温稳定地维持在目标温度下时，在超声或CT的视觉引导下，使用非常细的针头将ts药剂通过皮肤(经皮)注射到器官例如肝脏、肾脏、骨骼肌、心肌、胰腺或其他器官中。患者的核心体温在允许温度下维持期望的持续时间(例如，24小时)。当患者的体温保持在药剂的允许温度(例如，在33℃)下时，药剂起作用。当患者体温返回到正常的37℃时，即药剂的非允许温度，药剂停止起作用。
使用注射针头导管通过内窥镜检查靶向递送至肝脏、肾脏、骨骼肌、心肌、胰腺、骨髓和其他器官
将患者置于低体温条件下(例如33℃)。一旦患者的核心体温稳定地维持在目标温度下，则通过内窥镜注射针头导管将ts药剂直接递送至特定器官和组织。患者的核心体温在允许温度下维持期望的持续时间(例如，24小时)。当患者的体温保持在药剂的允许温度(例如，在33℃)下时，药剂起作用。当患者体温返回到正常的37℃时，即药剂的非允许温度，药剂停止起作用。
通过血管导管靶向递送至肝脏、肾脏、骨骼肌、心肌、胰腺、和其他器官
将患者置于低体温条件下(例如33℃)。但患者的核心体温稳定地维持在目标温度下时，通过血管导管将ts药剂直接递送至特定器官和组织。患者的核心体温在允许温度下维持期望的持续时间(例如，24小时)。当患者的体温保持在药剂的允许温度(例如，在33℃)下时，药剂起作用。当患者体温返回到正常的37℃时，即药剂的非功能性温度，药剂停止起作用。
通过吸入靶向递送至肺和其他器官
将患者置于低体温条件下(例如33℃)。当患者的核心体温稳定地维持在目标温度下时，通过吸入将ts药剂直接静脉内递送至患者。通过经肺吸入将ts药剂递送至肺和其他器官。患者的核心体温在允许温度下维持期望的持续时间(例如，24小时)。当患者的温度保持在药剂的允许温度(例如，在33℃)下时，药剂起作用。当患者体温返回到正常的37℃时，即药剂的非允许温度，药剂停止起作用。
靶向递送至动员至脾脏的骨髓细胞
患者将接受G-CSF、普乐沙福或其他细胞因子的注射以将骨髓细胞(包括但不限于CD34+细胞、造血干细胞、间充质干细胞和内皮干细胞)动员至受试者的脾脏。将患者置于低体温条件下(例如33℃)。当患者的核心体温稳定地维持在目标温度下时，通过上述方法将ts药剂递送至脾脏。随后，将ts药剂递送至动员至脾脏的骨髓细胞。患者的核心体温在允许温度下维持期望的持续时间(例如，24小时)。当患者的温度保持在药剂的允许温度(例如，在33℃)下时，药剂起作用。当患者体温返回到正常温度37℃时，即药剂的非允许温度，药剂停止起作用。例如，所述方法可包括将治疗有效量的温度敏感性药剂(例如，温度敏感性治疗剂)施用至脾脏中的一个或多个骨髓细胞(包括但不限于CD34+细胞、造血干细胞、间充质干细胞、内皮干细胞)。
实施例11：SeVts-ZSCAN4对人动员的外周血CD34+细胞的最佳离体接触条件
本实施例描述了以下发现，即在33℃下离体孵育16小时足以使温度敏感性仙台病毒载体对人CD34+细胞具有作用。本实施例表明1至25的感染复数(MOI)足以使载体离体感染大多数人CD34+细胞。
材料和方法
细胞培养
将通过CD34+磁珠纯化的人外周血CD34+细胞的冷冻样品解冻，并在补充有含有重组人干细胞因子(SCF)、Flt3配体和血小板生成素(TPO)的组合的StemMACS HSC扩增混合物的培养基中培养。在这些培养条件下，大多数CD34+细胞在最初的几天内不分裂，因为甚至当细胞培养10天时也仅发生两次细胞分裂。
编码人ZSCAN4基因的仙台病毒载体
SeV18+TS15ΔF是由ID Pharma(Tsukuba,日本)定制的具有TS15骨架的温度敏感性形式的仙台病毒载体(Ban等人,PNAS 2011)。该载体骨架缺少复制感染性子代病毒所需的融合基因。因此，该载体不将病毒从感染细胞传递到未感染细胞。该载体编码两个RNA聚合酶基因(P和L)和三个结构蛋白基因(NP、M和HN)，并且在M、HN、P和L基因中含有点突变，这使载体对温度敏感：在33℃(或低于35℃)下复制，但在37℃下停止复制。SeV18+hZSCAN4/TS15ΔF(本文也称为“SeVts-ZSCAN4”)是由ID Pharma(日本筑波)定制的编码人ZSCAN4基因的SeV18+TS15ΔF仙台病毒载体。图18显示了SeV18+hZSCAN4/TS15ΔF(即SeVts-ZSCAN4)的基因组示意图。
感染复数(MOI)
最佳感染复数(MOI)在不同实验条件之间变化。例如，发现不仅MOI影响仙台病毒载体的感染效率而且培养基的总体积影响仙台病毒载体的感染效率。我们的标准MOI＝25是以下列方式确定的。首先，先前已经显示，对于CD34+细胞，MOI＝20导致100％效率，而MOI＝2导致43％(Ban等人,2011)。对于小鼠胚胎干细胞，比较了MOI＝10、MOI＝30、MOI＝100，并且MOI＝30显示出最高的效率(Amano等人,2015)。对于人成纤维细胞，MOI＝25显示出55.6％效率，而MOI＝5显示出14％效率并且MOI＝10显示出25.4％效率(Amano等人,2015)。我们的CD34+数据显示，MOI＝25导致53％效率，而MOI＝10导致33％效率。进一步的研究显示，MOI＝25一致地导致75.6％±14.2％(平均值±SD，n＝16)的CD34+细胞效率。在后面的研究中，MOI＝1.1在人CD34+细胞中显示89.8％效率。因此，根据实验条件，对于SeVts-ZSCAN4感染选择MOI＝1-25。
结果
为了确定CD34+细胞与SeVts-ZSCAN4离体接触的最佳时间和条件，对CD34+细胞使用预期的临床CD34+孵育方案评价在功能性温度(33℃)下的一系列孵育时间。将CD34+细胞铺板在12孔板(1x105或5x104个细胞/孔)上，并与SeVts-ZSCAN4(MOI＝25)在33℃下在5％CO2中孵育0、3、6、16、24、48或72小时。然后将细胞在37℃下在5％CO2中孵育长达10天。在33℃下孵育允许仙台病毒感染、复制和转基因表达，而将温度升高至37℃使病毒失活并关闭转基因表达。在规定的33℃孵育后，用抗hZSCAN4抗体针对ZSCAN4蛋白表达对细胞进行免疫染色。将表达人ZSCAN4的细胞的数量与通过DAPI荧光染色鉴定的细胞的总数进行比较。
3和6小时孵育太短而不能以可检测的水平表达ZSCAN4蛋白。然而，在33℃下孵育16和24小时分别导致82％和95％的CD34+细胞的ZSCAN4蛋白表达(图19)。在33℃下孵育48和72小时后，转染效率和蛋白质表达没有进一步增加。
实施例12：人CD34+细胞中ZSCAN4蛋白的动力学
本实施例描述了以下发现，即从33℃至37℃的温度转变关闭ZSCAN4蛋白的表达，其突然消失。
材料和方法
编码人ZSCAN4基因的仙台病毒载体
SeVts-ZSCAN4(也称为SeV18+hZSCAN4/TS15ΔF)以温度敏感的方式表达人ZSCAN4(图18)。
结果
为了确定暴露于ZSCAN4蛋白的时间，检查CD34+细胞中ZSCAN4蛋白表达的动力学。为了密切模拟所提出的临床试验情况，从Hemacare,Inc获得通过动员外周HSC分离的CD34+细胞。
CD34+细胞未经处理或在33℃下与SeVts-ZSCAN4接触24小时并在37℃下进一步孵育9天。在第1、3、7和10天对细胞取样，并用抗CD34和ZSCAN4的抗体免疫染色。
在10天的孵育期间，几乎100％的细胞保留了它们的CD34标记物，这表明与SeVts-ZSCAN4接触在CD34+细胞的分数和CD34标记物表达方面没有改变CD34+细胞的性质(图20A、图20B)。基于在第1天用ZSCAN4免疫染色，与SeVts-ZSCAN4的接触(MOI＝25)使77％的CD34+细胞暴露于ZSCAN4蛋白(图20A)。如所预期的，一旦温度转变至37℃，具有ZSCAN4蛋白的细胞相当快速地减少：到第7天仅有7％的ZSCAN4阳性细胞，并且到第10天仅有2％。相比之下，对照实验显示，在没有SeVts-ZSCAN4接触的情况下，不存在ZSCAN4阳性细胞，但几乎100％的细胞保留CD34+。在转换至非允许温度37℃后，ZSCAN4蛋白的快速下降不是简单地由细胞分裂引起，因为细胞数量在10天内仅增加3.5倍(平均少于两次细胞分裂)。在相同时间内，对照细胞(没有SeVts-ZSCAN4接触)的数量增加6.1倍。
实施例13：SeVts-ZSCAN4对人CD34+细胞端粒长度的影响
本实施例描述了以下发现，即使用温度敏感性病毒载体瞬时表达人ZSCAN4增加人CD34+细胞中的端粒长度。
材料和方法
编码人ZSCAN4基因的仙台病毒载体
SeVts-ZSCAN4(也称为SeV18+hZSCAN4/TS15ΔF)以温度敏感的方式表达人ZSCAN4(图18)。
结果
已经显示ZSCAN4定位于端粒，上调减数分裂特异性同源重组基因，并且通过在小鼠胚胎干(ES)细胞中的端粒重组(不依赖于端粒酶活性)延长端粒(Zalzman等人,2010；Amano等人,2013)。为了评估在人造血干细胞中的这种潜力，使人外周血CD34+细胞与SeVts-ZSCAN4离体接触并在33℃下孵育。将CD34+细胞用SeVts-ZSCAN4在33℃下处理16、24、48和72小时，然后在37℃下培养10天以用于端粒测定。使用端粒特异性引物(T)和单拷贝基因特异性引物组(S)通过定量实时PCR方法测定端粒长度，如(Cawthon 2002)所述。相对端粒长度计算为T/S比，并通过对照样品(未处理的对照)的T/S比进一步归一化。
与未处理的细胞相比，在33℃下孵育24小时使端粒延长约1.5倍(图21)。孵育≥24小时没有进一步延长端粒；因此，在允许温度(即33℃)下孵育24小时足以延长人CD34+细胞的端粒。
实施例14：SeVts-ZSCAN4对植入到免疫受损小鼠中的人血细胞的端粒长度的影响
本实施例描述了用于评价向受试者施用用表达人ZSCAN4基因的温度敏感性仙台病毒载体处理的CD34+细胞的安全性和细胞植入的功效的程序。
SeVts-ZSCAN4(也称为SeV18+hZSCAN4/TS15ΔF)以温度敏感的方式表达人ZSCAN4(图18)。使人CD34+细胞与培养物中的SeVts-ZSCAN4(MOI＝25)在33℃的允许温度下以适于预期临床使用的方式接触24小时。然后洗涤细胞以去除游离的SeVts-ZSCAN4并重悬于盐水(测试材料)中(图22)。将测试材料的等分试样进一步体外培养10天并通过qPCR进行端粒长度测定(图22)。MNC是用于端粒长度的单个核细胞标准。样品相对于MNC的端粒长度比(T/S比)表示为相对端粒长度。用SeVts-ZSCAN4处理24小时的CD34+的端粒在统计学上显著长于CD34+未处理细胞的端粒(图23)。因此，将SeVts-ZSCAN4在允许温度(即33℃)下处理24小时能够在体外延长人CD34+细胞的端粒。
为了紧密模拟预期的临床试验，用G-CSF和普乐沙福治疗严重免疫缺陷的NOG-EXL小鼠(Taconic)(图22)。所述研究使用没有辐射(即骨髓消融)的NOG-EXL小鼠。此外，与使用更有效的脐带血CD34+细胞的典型植入研究不同，所述研究使用来自健康供体的G-CSF动员的外周血CD34+细胞。向NOG-EXL小鼠在第1天以2×107个细胞/kg的剂量静脉内施用CD34+未处理的细胞或用SeVts-ZSCAN4(测试材料)处理的CD34+(图22)。所述剂量比预期用于人的剂量高大约10倍。在接受用SeVts-ZSCAN4处理的CD34+细胞的NOG-EXL小鼠中没有观察到SeVts-ZSCAN4相关的不良事件。此外，在CD34+细胞注射38周后，将接受用SeVts-ZSCAN4处理的CD34+的两只小鼠(#492和#493)和接受未处理的CD34+细胞的一只小鼠(#496)(对照)处死，以检查源自人CD34+细胞的植入细胞。将从这些小鼠分离的脾细胞通过人CD45+泛造血标记物进行FACS分选，并用于进行基于qPCR的端粒测定。如图24所示，在接受用SeVts-ZSCAN4处理的CD34+细胞的小鼠中植入的人细胞的端粒比仅接受CD34+细胞的小鼠(对照)中的端粒长。这些数据表明，SeVts-ZSCAN4处理的人CD34+细胞可以植入到小鼠骨髓中并参与正常造血。此外，在通过SeVts-ZSCAN4的处理使端粒延长后，这些细胞的端粒甚至在植入和细胞分化之后也更长。所述研究还表明了SeVts-ZSCAN4处理的安全性。
实施例15：在患有端粒生物学障碍和骨髓衰竭的人患者中评价SeVts-ZSCAN4
包括先天性角化不良的伴有骨髓衰竭的端粒生物学障碍具有不良预后和高死亡率。目前，造血干细胞移植是唯一的治愈性治疗，其可以减轻病症的血液学表现。然而，在寻找匹配良好的供体以及与骨髓细胞清除(化疗和放疗)和免疫并发症相关的毒性方面，其使用可能具有困难。本实施例描述了对有需要的人患者施用与编码人ZSCAN4的温度敏感性仙台病毒载体离体接触的CD34+细胞的安全性和耐受性以及细胞植入的效力的评价。
治疗性温度敏感性药剂。SeVts-ZSCAN4(也称为SeV18+hZSCAN4/TS15ΔF)以温度敏感的方式表达人ZSCAN4(图18)。如在本实施例中使用的，研究药物产品是包含无菌、含电解质的等渗水溶液的药物组合物，其中与SeVts-ZSCAN4离体接触的自体CD34+细胞是悬浮的。由Baxter International Inc.(伊利诺伊州德尔菲尔德)销售的PLASMA-LYTE多电解质注射溶液是用于重悬浮病毒接触的CD34+细胞的合适溶液。
基本原理。与SeVts-ZSCAN4离体接触的自体CD34+细胞已显示在体外和体内非临床研究中延长人CD34+细胞中的端粒。当可以使用患者自身的细胞时，这种治疗不需要良好匹配的供体。与SeVts-ZSCAN4接触导致患者自身(自体)CD34+细胞中人ZSCAN4蛋白的瞬时产生，其通过离体延长其异常短的端粒来恢复其功能。给药后，植入接触的CD34+细胞，其随后在患者骨髓中增殖，导致血细胞的产生。这样，有效地治疗了患者的骨髓衰竭(图25)。
患者。研究群体最初包括成年男性和女性，但将扩展到儿科患者。入选标准包括轻度或中度骨髓衰竭和端粒生物学障碍的诊断。轻度或中度骨髓衰竭由以下一项或两项定义：1)外周血中绝对嗜中性粒细胞计数(ANC)为0.5-1.5x 10^9/L；或血小板20-100x 10^9/L；或血红蛋白<10g/dL；和2)年龄相关的低细胞性骨髓。端粒生物学障碍的诊断由以下一项定义：1)外周血淋巴细胞(PBL)、B细胞和幼稚T细胞中的任一种中的年龄标化平均端粒长度<1百分位数；以及2)DKC1、TERC、TERT、NOP10、NHP2、TINF2、CTC1、PARN、RTEL1、ACD、USB1或WRAP53中的致病突变。排除标准包括以下一项或多项：接受癌症化疗；骨髓检查中与骨髓增生异常综合征或急性髓性白血病相关的克隆细胞遗传学异常；不受控制的细菌、病毒或真菌感染；既往同种异体骨髓或干细胞移植；无资格接受G-CSF和普乐沙福的受试者；无资格进行单采术的受试者；受试者目前正在服用或在研究开始前60天内已服用达那唑和雄激素。
程序。简言之，所述研究涉及：1)将造血干细胞动员至血流中并通过单采术收集单个核细胞(MNC)；2)离体细胞加工；和3)输注经加工的细胞。研究设计的流程图如图26所示，并且示意图如图27所示。
动员和单采术。
第1至3天：所有合格的受试者每天接受粒细胞集落刺激因子(G-CSF)注射(10μg/kg SC)。
第4天：G-CSF注射(10μg/kg SC)后，收集血样并确定CD34+细胞计数。具有<5个细胞/μL的CD34+细胞的受试者从研究中退出。将具有≥5个细胞/μL的CD34+细胞的受试者住院，并且在单采术之前约11小时施用普乐沙福(20mg固定剂量或0.24mg/kg SC)。普乐沙福(1,4-双((1,4,8,11四氮杂环十四烷-1-基)甲基)苯，CAS编号155148-31-5)(如由Genzyme公司(马萨诸塞州剑桥市)销售的MOZOBIL)是造血干细胞动员剂。
第5天：施用G-CSF(10μg/kg SC)并开始第一次单采术以收集MNC。在单采术后，评估受试者耐受第二次单采术的能力。在第二次单采术之前约11小时将普乐沙福(20mg固定剂量或0.24mg/kg SC)施用至被认为能够耐受第二次单采术的受试者。不能耐受第二次单采术且具有<2.0x 10^6/kg CD34+细胞的受试者从研究中退出并且将所有收集的细胞输注回受试者中。不能耐受第二次单采术且具有≥2.0x 10^6/kg CD34+细胞的受试者继续进行研究。
第6天：能够耐受第二次单采术的受试者在开始第二次单采术之前接受G-CSF(10μg/kg SC)以收集另外的MNC。在单采术后，获得全血细胞计数(CBC)，并且如果需要的话，向受试者输注红细胞或血小板以保持血红蛋白水平>10.5g/dl和血小板>100K。已进行第二次单采术且具有<2.0x 10^6/kg CD34+细胞(第一次和第二次单采术的总和)的受试者从研究中退出并将所有收集的细胞输注回受试者中。已进行第二次单采术且具有≥2.0x10^6/kgCD34+细胞的受试者继续进行研究。
离体细胞加工。使用Miltenyi Biotec(德国)销售的CLINIMACS PRODIGY自动化细胞加工系统，在良好生产实践下，从通过单采术收集的MNC分离CD34+细胞。将CD34+细胞悬浮于GMP级HSC-Brew GMP培养基和细胞因子(相当于StemMacs培养基)中，以MOI＝1至MOI＝25(取决于收集的CD34+细胞数)与SeVts-ZSCAN4接触，在33℃的允许温度下培养1小时。将另外的HSC-Brew GMP培养基添加至病毒接触的CD34+细胞中，将其在33℃的允许温度下再培养23小时。孵育后，将接触病毒的CD34+细胞用HSC-Brew GMP培养基洗涤三次以去除游离的SeVts-ZSCAN4，并重悬于100mL无菌PLASMA-LYTE中以产生研究药物产品。
输注。受试者接受悬浮于100mL由Baxter Healthcare Corporation(Deerfield,IL)销售的PLASMA-LYTE多种注射用电解质或其他无菌含电解质的等渗水溶液中的剂量为2.0–8.0x 10^6/kg CD34+细胞的研究药物产品的单次静脉输注。在30分钟内以3.3mL/min的输注速率递送细胞。研究药物产品输注在第一次单采术之后约32小时进行。
安全性评估在输注后24、36或48小时进行，并且包括但不限于评估生命体征(体温、脉搏、呼吸率和血压)、体重、心电图、临床实验室检查(血液学、血液化学和尿分析)、不良事件、血浆细胞因子水平和研究药物产品的免疫原性。所测量的一种或多种血浆细胞因子包括GM-CSF、IFN-γ、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8和TNF-α中的一种或多种。通过测量从受试者获得的血样中的仙台病毒载体反应性和人SCAN4反应性抗体来评估研究药物的免疫原性。
探索性终点。以下任一项中的端粒长度的增加：外周血中的淋巴细胞、粒细胞、B细胞、幼稚T细胞、记忆T细胞和NK细胞，以及血细胞计数(嗜中性粒细胞、血小板或血红蛋白)的改善。通过Flow FISH测量端粒长度。
实施例16：人ZSCAN4蛋白的体内表达
温度敏感性药剂(ts药剂)如srRNA或仙台病毒载体在允许温度(例如，约31℃-34℃)下起作用，但在非允许温度(例如，37℃)下不起作用。人受试者的核心体温为约37℃，而人受试者的表面体温为约31℃-34℃。因此，施用至人患者身体表面处或附近的细胞(例如，皮内、皮下或肌内施用)的ts药剂在不降低人患者的核心体温的情况下起作用(图28)。无需采取进一步措施。
类似地，人受试者的鼻腔和上气管的温度为约32℃，并且人受试者的亚段支气管的温度为约35℃(McFadden等人,1985)。因此，鼻内施用至人患者的上呼吸道(鼻腔、咽部和/或喉部)和/或上气管的细胞的ts药剂在不降低人患者的核心体温的情况下起作用(图29)。鼻内施用可以通过吹入、吸入或滴注进行。无需采取进一步措施。
可替代地，随后可通过升高人患者的表面体温，例如通过将热贴片或加热垫施用至患者皮肤的治疗区域，浸泡在温浴中或坐在热桑拿浴中，使施用至人患者身体表面处或附近的细胞(例如，皮内、皮下或肌内施用)的ts药剂不起作用。该治疗程序是非常安全的，因为ts药剂仅在预期区域起作用，而在患者身体的其他区域不起作用。类似地，可通过将人患者置于具有非允许温度(例如，≥37℃)的环境中而使鼻内施用至人患者的上呼吸道(鼻腔、咽部和/或喉部)和/或上气管的细胞的ts药剂不起作用。
例如，将人ZSCAN4的编码区引入srRNA1ts2或SeV18/TS15ΔF中，如上文对于人ZSCAN4在人患者体表或体表附近的表达所述。srRNA1ts2的构建如以上实施例3中所述。简言之，srRNA1ts2包含缺乏VEEV结构蛋白编码区的委内瑞拉马脑炎病毒(VEEV)复制子。VEEV复制子包含VEEV非结构蛋白编码区，其中插入15-18个核苷酸，导致在nsP2的β片层5与β片层6之间包含5或6个另外的氨基酸(SEQ ID NO:44＝TGAAA)的非结构蛋白2(nsP2＝解旋酶蛋白酶)的表达。所述另外的氨基酸导致srRNA的温度敏感性。
srRNA1ts2载体的RNA可以使用T7 RNA聚合酶在体外转录，而无需使用动物或人来源的材料。以这种方式，使用srRNA1ts2载体的ts药剂容易适于使用当前良好生产实践的生产。将RNA转染到受试者皮肤组织的细胞中。转染的合适方法是通过裸RNA的贴片电穿孔。可替代地，使用微针皮内转染RNA。例如，使用由透明质酸或壳聚糖-透明质酸复合物制成的可溶解微针皮内转染RNA。
序列表
<110> 伊利克斯根治疗公司
<120> ZSCAN4核酸和蛋白质向细胞和组织的基于温度的瞬时递送
<130> 69944-20013.40
<140> 尚未分配
<141> 同时随同提交
<150> US 62/992,745
<151> 2020-03-20
<150> US 62/955,820
<151> 2019-12-31
<160> 45
<170> 用于Windows的FastSEQ 4.0版
<210> 1
<211> 16
<212> PRT
<213> 委内瑞拉马脑炎病毒 (VEEV)
<400> 1
Thr Leu Thr Ala Lys Tyr Pro Gly Asn Phe Thr Ala Thr Ile Glu Glu
1 5 10 15
<210> 2
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 2
Thr Leu Thr Ala Lys Tyr Pro Gly Cys Gly Arg Thr Gly Asn Phe Thr
1 5 10 15
Ala Thr Ile Glu Glu
20
<210> 3
<211> 16
<212> PRT
<213> 委内瑞拉马脑炎病毒 (VEEV)
<400> 3
Gly Arg Val Tyr Asp Met Asn Thr Gly Thr Leu Arg Asn Tyr Asp Pro
1 5 10 15
<210> 4
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 4
Gly Arg Val Tyr Asp Met Asn Thr Gly Ala Ala Ala Thr Gly Thr Leu
1 5 10 15
Arg Asn Tyr Asp Pro
20
<210> 5
<211> 16
<212> PRT
<213> 委内瑞拉马脑炎病毒 (VEEV)
<400> 5
Gly Thr Leu Arg Asn Tyr Asp Pro Arg Ile Asn Leu Val Pro Val Asn
1 5 10 15
<210> 6
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 6
Gly Thr Leu Arg Asn Tyr Asp Pro Leu Arg Pro His Pro Arg Ile Asn
1 5 10 15
Leu Val Pro Val Asn
20
<210> 7
<211> 39
<212> DNA
<213> 委内瑞拉马脑炎病毒 (VEEV)
<400> 7
acactgactg ccaagtaccc tgggaatttc actgccacg 39
<210> 8
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 8
acactgactg ccaagtaccc tgggtgcggc cggactggga atttcactgc cacg 54
<210> 9
<211> 39
<212> DNA
<213> 委内瑞拉马脑炎病毒 (VEEV)
<400> 9
ggaagagtct atgacatgaa cactggtaca ctgcgcaat 39
<210> 10
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 10
ggaagagtct atgacatgaa cactggtgcc gccgcaactg gtacactgcg caat 54
<210> 11
<211> 39
<212> DNA
<213> 委内瑞拉马脑炎病毒 (VEEV)
<400> 11
ggtacactgc gcaattatga tccgcgcata aacctagta 39
<210> 12
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 12
ggtacactgc gcaattatga tccgctgcgg ccccatccgc gcataaacct agta 54
<210> 13
<211> 13
<212> PRT
<213> 委内瑞拉马脑炎病毒 (VEEV)
<400> 13
Thr Leu Thr Ala Lys Tyr Pro Gly Asn Phe Thr Ala Thr
1 5 10
<210> 14
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 14
Thr Leu Thr Ala Lys Tyr Pro Gly Cys Gly Arg Thr Gly Asn Phe Thr
1 5 10 15
Ala Thr
<210> 15
<211> 13
<212> PRT
<213> 委内瑞拉马脑炎病毒 (VEEV)
<400> 15
Gly Arg Val Tyr Asp Met Asn Thr Gly Thr Leu Arg Asn
1 5 10
<210> 16
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 16
Gly Arg Val Tyr Asp Met Asn Thr Gly Ala Ala Ala Thr Gly Thr Leu
1 5 10 15
Arg Asn
<210> 17
<211> 13
<212> PRT
<213> 委内瑞拉马脑炎病毒 (VEEV)
<400> 17
Gly Thr Leu Arg Asn Tyr Asp Pro Arg Ile Asn Leu Val
1 5 10
<210> 18
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 18
Gly Thr Leu Arg Asn Tyr Asp Pro Leu Arg Pro His Pro Arg Ile Asn
1 5 10 15
Leu Val
<210> 19
<211> 240
<212> DNA
<213> 委内瑞拉马脑炎病毒 (VEEV)
<400> 19
ataggcggcg catgagagaa gcccagacca attacctacc caaaatggag aaagttcacg 60
ttgacatcga ggaagacagc ccattcctca gagctttgca gcggagcttc ccgcagtttg 120
aggtagaagc caagcaggtc actgataatg accatgctaa tgccagagcg ttttcgcatc 180
tggcttcaaa actgatcgaa acggaggtgg acccatccga cacgatcctt gacattggaa 240
<210> 20
<211> 240
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 20
atgggcggcg catgagagaa gcccagacca attacctact caaaatggaa aaagttcacg 60
ttgacatcga agaagacagc ccattcctca gagctttgca gcggagtttt ccgcagtttg 120
aagtagaagc caagcaggtc actgataatg accatgctaa tgcaagagcg ttttcgcatc 180
ttgcttcaaa actgatcgaa acggaggtgg acccatccga cacgatcctt gacattggaa 240
<210> 21
<211> 13
<212> PRT
<213> 委内瑞拉马脑炎病毒 (VEEV)
<400> 21
Gly Arg Val Tyr Asp Met Asn Thr Gly Thr Leu Arg Asn
1 5 10
<210> 22
<211> 13
<212> PRT
<213> 奥拉病毒 (Aura)
<400> 22
Gly Asp Gln Ile Leu Pro Ile Tyr Gly Arg Val Ser Val
1 5 10
<210> 23
<211> 13
<212> PRT
<213> 西部马脑炎病毒 (WEEV)
<400> 23
Gly Arg Val Ala Asp Ile Arg Asn Asn Thr Ile Lys Asp
1 5 10
<210> 24
<211> 13
<212> PRT
<213> 巴马森林病毒 (BFV)
<400> 24
Gly Met Gln Ile Val Val Thr Glu Met Arg Ile Gln Arg
1 5 10
<210> 25
<211> 13
<212> PRT
<213> 奥-奈氏病毒 (ONNV)
<400> 25
Asn Lys Gln Ile Cys Ile Thr Thr Arg Lys Val Asp Glu
1 5 10
<210> 26
<211> 13
<212> PRT
<213> 罗斯河病毒 (RRV)
<400> 26
Gly Leu Gln Val Asn Val Pro Glu Arg Lys Val Gln Pro
1 5 10
<210> 27
<211> 13
<212> PRT
<213> 塞姆利基森林病毒 (SFV)
<400> 27
Gly Lys Gln Ala Val Ile Ala Glu Arg Lys Ile Gln Pro
1 5 10
<210> 28
<211> 13
<212> PRT
<213> 辛德比斯病毒 (SINV)
<400> 28
Gly Thr Gln Leu Asp Leu Gln Thr Gly Arg Thr Arg Val
1 5 10
<210> 29
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 29
Gly Arg Val Tyr Asp Met Asn Thr Gly Ala Ala Ala Thr Gly Thr Leu
1 5 10 15
Arg Asn
<210> 30
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 30
Gly Asp Gln Ile Leu Pro Ile Thr Gly Ala Ala Ala Tyr Gly Arg Val
1 5 10 15
Ser Val
<210> 31
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 31
Gly Arg Val Ala Asp Ile Arg Thr Gly Ala Ala Ala Asn Asn Thr Ile
1 5 10 15
Lys Asp
<210> 32
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 32
Gly Met Gln Ile Val Val Thr Thr Gly Ala Ala Ala Glu Met Arg Ile
1 5 10 15
Gln Arg
<210> 33
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 33
Asn Lys Gln Ile Cys Ile Thr Thr Gly Ala Ala Ala Thr Arg Lys Val
1 5 10 15
Asp Glu
<210> 34
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 34
Gly Leu Gln Val Asn Val Pro Thr Gly Ala Ala Ala Glu Arg Lys Val
1 5 10 15
Gln Pro
<210> 35
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 35
Gly Lys Gln Ala Val Ile Ala Thr Gly Ala Ala Ala Glu Arg Lys Ile
1 5 10 15
Gln Pro
<210> 36
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 36
Gly Thr Gln Leu Asp Leu Gln Thr Gly Ala Ala Ala Thr Gly Arg Thr
1 5 10 15
Arg Val
<210> 37
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 37
Glu Ala Ala Ala Lys
1 5
<210> 38
<211> 433
<212> PRT
<213> 智人 (Homo sapiens)
<400> 38
Met Ala Leu Asp Leu Arg Thr Ile Phe Gln Cys Glu Pro Ser Glu Asn
1 5 10 15
Asn Leu Gly Ser Glu Asn Ser Ala Phe Gln Gln Ser Gln Gly Pro Ala
20 25 30
Val Gln Arg Glu Glu Gly Ile Ser Glu Phe Ser Arg Met Val Leu Asn
35 40 45
Ser Phe Gln Asp Ser Asn Asn Ser Tyr Ala Arg Gln Glu Leu Gln Arg
50 55 60
Leu Tyr Arg Ile Phe His Ser Trp Leu Gln Pro Glu Lys His Ser Lys
65 70 75 80
Asp Glu Ile Ile Ser Leu Leu Val Leu Glu Gln Phe Met Ile Gly Gly
85 90 95
His Cys Asn Asp Lys Ala Ser Val Lys Glu Lys Trp Lys Ser Ser Gly
100 105 110
Lys Asn Leu Glu Arg Phe Ile Glu Asp Leu Thr Asp Asp Ser Ile Asn
115 120 125
Pro Pro Ala Leu Val His Val His Met Gln Gly Gln Glu Ala Leu Phe
130 135 140
Ser Glu Asp Met Pro Leu Arg Asp Val Ile Val His Leu Thr Lys Gln
145 150 155 160
Val Asn Ala Gln Thr Thr Arg Glu Ala Asn Met Gly Thr Pro Ser Gln
165 170 175
Thr Ser Gln Asp Thr Ser Leu Glu Thr Gly Gln Gly Tyr Glu Asp Glu
180 185 190
Gln Asp Gly Trp Asn Ser Ser Ser Lys Thr Thr Arg Val Asn Glu Asn
195 200 205
Ile Thr Asn Gln Gly Asn Gln Ile Val Ser Leu Ile Ile Ile Gln Glu
210 215 220
Glu Asn Gly Pro Arg Pro Glu Glu Gly Gly Val Ser Ser Asp Asn Pro
225 230 235 240
Tyr Asn Ser Lys Arg Ala Glu Leu Val Thr Ala Arg Ser Gln Glu Gly
245 250 255
Ser Ile Asn Gly Ile Thr Phe Gln Gly Val Pro Met Val Met Gly Ala
260 265 270
Gly Cys Ile Ser Gln Pro Glu Gln Ser Ser Pro Glu Ser Ala Leu Thr
275 280 285
His Gln Ser Asn Glu Gly Asn Ser Thr Cys Glu Val His Gln Lys Gly
290 295 300
Ser His Gly Val Gln Lys Ser Tyr Lys Cys Glu Glu Cys Pro Lys Val
305 310 315 320
Phe Lys Tyr Leu Cys His Leu Leu Ala His Gln Arg Arg His Arg Asn
325 330 335
Glu Arg Pro Phe Val Cys Pro Glu Cys Gln Lys Gly Phe Phe Gln Ile
340 345 350
Ser Asp Leu Arg Val His Gln Ile Ile His Thr Gly Lys Lys Pro Phe
355 360 365
Thr Cys Ser Met Cys Lys Lys Ser Phe Ser His Lys Thr Asn Leu Arg
370 375 380
Ser His Glu Arg Ile His Thr Gly Glu Lys Pro Tyr Thr Cys Pro Phe
385 390 395 400
Cys Lys Thr Ser Tyr Arg Gln Ser Ser Thr Tyr His Arg His Met Arg
405 410 415
Thr His Glu Lys Ile Thr Leu Pro Ser Val Pro Ser Thr Pro Glu Ala
420 425 430
Ser
<210> 39
<211> 311
<212> PRT
<213> 智人 (Homo sapiens)
<400> 39
Met Ala Leu Asp Leu Arg Thr Ile Phe Gln Cys Glu Pro Ser Glu Asn
1 5 10 15
Asn Leu Gly Ser Glu Asn Ser Ala Phe Gln Gln Ser Gln Gly Pro Ala
20 25 30
Val Gln Arg Glu Glu Gly Ile Ser Glu Phe Ser Arg Met Val Leu Asn
35 40 45
Ser Phe Gln Asp Ser Asn Asn Ser Tyr Ala Arg Gln Glu Leu Gln Arg
50 55 60
Leu Tyr Arg Ile Phe His Ser Trp Leu Gln Pro Glu Lys His Ser Lys
65 70 75 80
Asp Glu Ile Ile Ser Leu Leu Val Leu Glu Gln Phe Met Ile Gly Gly
85 90 95
His Cys Asn Asp Lys Ala Ser Val Lys Glu Lys Trp Lys Ser Ser Gly
100 105 110
Lys Asn Leu Glu Arg Phe Ile Glu Asp Leu Thr Asp Asp Ser Ile Asn
115 120 125
Pro Pro Ala Leu Val His Val His Met Gln Gly Gln Glu Ala Leu Phe
130 135 140
Ser Glu Asp Met Pro Leu Arg Asp Val Ile Val His Leu Thr Lys Gln
145 150 155 160
Val Asn Ala Gln Thr Thr Arg Glu Ala Asn Met Gly Thr Pro Ser Gln
165 170 175
Thr Ser Gln Asp Thr Ser Leu Glu Thr Gly Gln Gly Tyr Glu Asp Glu
180 185 190
Gln Asp Gly Trp Asn Ser Ser Ser Lys Thr Thr Arg Val Asn Glu Asn
195 200 205
Ile Thr Asn Gln Gly Asn Gln Ile Val Ser Leu Ile Ile Ile Gln Glu
210 215 220
Glu Asn Gly Pro Arg Pro Glu Glu Gly Gly Val Ser Ser Asp Asn Pro
225 230 235 240
Tyr Asn Ser Lys Arg Ala Glu Leu Val Thr Ala Arg Ser Gln Glu Gly
245 250 255
Ser Ile Asn Gly Ile Thr Phe Gln Gly Val Pro Met Val Met Gly Ala
260 265 270
Gly Cys Ile Ser Gln Pro Glu Gln Ser Ser Pro Glu Ser Ala Leu Thr
275 280 285
His Gln Ser Asn Glu Gly Asn Ser Thr Cys Glu Val His Gln Lys Gly
290 295 300
Ser His Gly Val Gln Lys Ser
305 310
<210> 40
<211> 339
<212> PRT
<213> 智人 (Homo sapiens)
<400> 40
Met Ala Leu Asp Leu Arg Thr Ile Phe Gln Cys Glu Pro Ser Glu Asn
1 5 10 15
Asn Leu Gly Ser Glu Asn Ser Ala Phe Gln Gln Ser Gln Gly Pro Ala
20 25 30
Val Gln Arg Glu Glu Gly Ile Ser Glu Phe Ser Arg Met Val Leu Asn
35 40 45
Ser Phe Gln Asp Ser Asn Asn Ser Tyr Ala Arg Gln Glu Leu Gln Arg
50 55 60
Leu Tyr Arg Ile Phe His Ser Trp Leu Gln Pro Glu Lys His Ser Lys
65 70 75 80
Asp Glu Ile Ile Ser Leu Leu Val Leu Glu Gln Phe Met Ile Gly Gly
85 90 95
His Cys Asn Asp Lys Ala Ser Val Lys Glu Lys Trp Lys Ser Ser Gly
100 105 110
Lys Asn Leu Glu Arg Phe Ile Glu Asp Leu Thr Asp Asp Ser Ile Asn
115 120 125
Pro Pro Ala Leu Val His Val His Met Gln Gly Gln Glu Ala Leu Phe
130 135 140
Ser Glu Asp Met Pro Leu Arg Asp Val Ile Val His Leu Thr Lys Gln
145 150 155 160
Val Asn Ala Gln Thr Thr Arg Glu Ala Asn Met Gly Thr Pro Ser Gln
165 170 175
Thr Ser Gln Asp Thr Ser Leu Glu Thr Gly Gln Gly Tyr Glu Asp Glu
180 185 190
Gln Asp Gly Trp Asn Ser Ser Ser Lys Thr Thr Arg Val Asn Glu Asn
195 200 205
Ile Thr Asn Gln Gly Asn Gln Ile Val Ser Leu Ile Ile Ile Gln Glu
210 215 220
Glu Asn Gly Pro Arg Pro Glu Glu Gly Gly Val Ser Ser Asp Asn Pro
225 230 235 240
Tyr Asn Ser Lys Arg Ala Glu Leu Val Thr Ala Arg Ser Gln Glu Gly
245 250 255
Ser Ile Asn Gly Ile Thr Phe Gln Gly Val Pro Met Val Met Gly Ala
260 265 270
Gly Cys Ile Ser Gln Pro Glu Gln Ser Ser Pro Glu Ser Ala Leu Thr
275 280 285
His Gln Ser Asn Glu Gly Asn Ser Thr Cys Glu Val His Gln Lys Gly
290 295 300
Ser His Gly Val Gln Lys Ser Tyr Lys Cys Glu Glu Cys Pro Lys Val
305 310 315 320
Phe Lys Tyr Leu Cys His Leu Leu Ala His Gln Arg Arg His Arg Asn
325 330 335
Glu Arg Pro
<210> 41
<211> 367
<212> PRT
<213> 智人 (Homo sapiens)
<400> 41
Met Ala Leu Asp Leu Arg Thr Ile Phe Gln Cys Glu Pro Ser Glu Asn
1 5 10 15
Asn Leu Gly Ser Glu Asn Ser Ala Phe Gln Gln Ser Gln Gly Pro Ala
20 25 30
Val Gln Arg Glu Glu Gly Ile Ser Glu Phe Ser Arg Met Val Leu Asn
35 40 45
Ser Phe Gln Asp Ser Asn Asn Ser Tyr Ala Arg Gln Glu Leu Gln Arg
50 55 60
Leu Tyr Arg Ile Phe His Ser Trp Leu Gln Pro Glu Lys His Ser Lys
65 70 75 80
Asp Glu Ile Ile Ser Leu Leu Val Leu Glu Gln Phe Met Ile Gly Gly
85 90 95
His Cys Asn Asp Lys Ala Ser Val Lys Glu Lys Trp Lys Ser Ser Gly
100 105 110
Lys Asn Leu Glu Arg Phe Ile Glu Asp Leu Thr Asp Asp Ser Ile Asn
115 120 125
Pro Pro Ala Leu Val His Val His Met Gln Gly Gln Glu Ala Leu Phe
130 135 140
Ser Glu Asp Met Pro Leu Arg Asp Val Ile Val His Leu Thr Lys Gln
145 150 155 160
Val Asn Ala Gln Thr Thr Arg Glu Ala Asn Met Gly Thr Pro Ser Gln
165 170 175
Thr Ser Gln Asp Thr Ser Leu Glu Thr Gly Gln Gly Tyr Glu Asp Glu
180 185 190
Gln Asp Gly Trp Asn Ser Ser Ser Lys Thr Thr Arg Val Asn Glu Asn
195 200 205
Ile Thr Asn Gln Gly Asn Gln Ile Val Ser Leu Ile Ile Ile Gln Glu
210 215 220
Glu Asn Gly Pro Arg Pro Glu Glu Gly Gly Val Ser Ser Asp Asn Pro
225 230 235 240
Tyr Asn Ser Lys Arg Ala Glu Leu Val Thr Ala Arg Ser Gln Glu Gly
245 250 255
Ser Ile Asn Gly Ile Thr Phe Gln Gly Val Pro Met Val Met Gly Ala
260 265 270
Gly Cys Ile Ser Gln Pro Glu Gln Ser Ser Pro Glu Ser Ala Leu Thr
275 280 285
His Gln Ser Asn Glu Gly Asn Ser Thr Cys Glu Val His Gln Lys Gly
290 295 300
Ser His Gly Val Gln Lys Ser Tyr Lys Cys Glu Glu Cys Pro Lys Val
305 310 315 320
Phe Lys Tyr Leu Cys His Leu Leu Ala His Gln Arg Arg His Arg Asn
325 330 335
Glu Arg Pro Phe Val Cys Pro Glu Cys Gln Lys Gly Phe Phe Gln Ile
340 345 350
Ser Asp Leu Arg Val His Gln Ile Ile His Thr Gly Lys Lys Pro
355 360 365
<210> 42
<211> 395
<212> PRT
<213> 智人 (Homo sapiens)
<400> 42
Met Ala Leu Asp Leu Arg Thr Ile Phe Gln Cys Glu Pro Ser Glu Asn
1 5 10 15
Asn Leu Gly Ser Glu Asn Ser Ala Phe Gln Gln Ser Gln Gly Pro Ala
20 25 30
Val Gln Arg Glu Glu Gly Ile Ser Glu Phe Ser Arg Met Val Leu Asn
35 40 45
Ser Phe Gln Asp Ser Asn Asn Ser Tyr Ala Arg Gln Glu Leu Gln Arg
50 55 60
Leu Tyr Arg Ile Phe His Ser Trp Leu Gln Pro Glu Lys His Ser Lys
65 70 75 80
Asp Glu Ile Ile Ser Leu Leu Val Leu Glu Gln Phe Met Ile Gly Gly
85 90 95
His Cys Asn Asp Lys Ala Ser Val Lys Glu Lys Trp Lys Ser Ser Gly
100 105 110
Lys Asn Leu Glu Arg Phe Ile Glu Asp Leu Thr Asp Asp Ser Ile Asn
115 120 125
Pro Pro Ala Leu Val His Val His Met Gln Gly Gln Glu Ala Leu Phe
130 135 140
Ser Glu Asp Met Pro Leu Arg Asp Val Ile Val His Leu Thr Lys Gln
145 150 155 160
Val Asn Ala Gln Thr Thr Arg Glu Ala Asn Met Gly Thr Pro Ser Gln
165 170 175
Thr Ser Gln Asp Thr Ser Leu Glu Thr Gly Gln Gly Tyr Glu Asp Glu
180 185 190
Gln Asp Gly Trp Asn Ser Ser Ser Lys Thr Thr Arg Val Asn Glu Asn
195 200 205
Ile Thr Asn Gln Gly Asn Gln Ile Val Ser Leu Ile Ile Ile Gln Glu
210 215 220
Glu Asn Gly Pro Arg Pro Glu Glu Gly Gly Val Ser Ser Asp Asn Pro
225 230 235 240
Tyr Asn Ser Lys Arg Ala Glu Leu Val Thr Ala Arg Ser Gln Glu Gly
245 250 255
Ser Ile Asn Gly Ile Thr Phe Gln Gly Val Pro Met Val Met Gly Ala
260 265 270
Gly Cys Ile Ser Gln Pro Glu Gln Ser Ser Pro Glu Ser Ala Leu Thr
275 280 285
His Gln Ser Asn Glu Gly Asn Ser Thr Cys Glu Val His Gln Lys Gly
290 295 300
Ser His Gly Val Gln Lys Ser Tyr Lys Cys Glu Glu Cys Pro Lys Val
305 310 315 320
Phe Lys Tyr Leu Cys His Leu Leu Ala His Gln Arg Arg His Arg Asn
325 330 335
Glu Arg Pro Phe Val Cys Pro Glu Cys Gln Lys Gly Phe Phe Gln Ile
340 345 350
Ser Asp Leu Arg Val His Gln Ile Ile His Thr Gly Lys Lys Pro Phe
355 360 365
Thr Cys Ser Met Cys Lys Lys Ser Phe Ser His Lys Thr Asn Leu Arg
370 375 380
Ser His Glu Arg Ile His Thr Gly Glu Lys Pro
385 390 395
<210> 43
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 43
Gly Cys Gly Arg Thr
1 5
<210> 44
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 44
Thr Gly Ala Ala Ala
1 5
<210> 45
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 45
Leu Arg Pro His Pro
1 5

Claims (105)

1.一种治疗血液或造血器官疾病的方法，所述方法包括：
i)将造血干细胞从骨髓动员至患有所述疾病的人受试者的外周血；
ii)从获自所述受试者的外周血单个核细胞样品分离CD34+细胞；
iii)在33℃±0.5℃的温度下孵育所述分离的CD34+细胞；
iv)使所述孵育的CD34+细胞与包含含有人ZSCAN4的编码区的异源核酸的温度敏感性仙台病毒载体接触；
v)将所述接触的CD34+细胞在33℃±0.5℃的允许温度下维持至少约12-72小时，其中所述温度敏感性仙台病毒载体的复制和转录在所述允许温度下发生，导致人ZSCAN4的表达增加；以及
vi)在适于植入所述细胞以治疗所述疾病的条件下将所述接触的CD34+细胞输注到所述受试者中。
2.一种治疗血液或造血器官疾病的方法，所述方法包括：
i)将造血干细胞从骨髓细胞动员至患有所述疾病的人受试者的外周血；
ii)从获自所述受试者的外周血单个核细胞样品分离CD34+细胞；
iii)使所述分离的CD34+细胞与包含含有人ZSCAN4的编码区的异源核酸的温度敏感性仙台病毒载体接触；
iv)将所述接触的CD34+细胞在33℃±0.5℃的允许温度下孵育至少约12-72小时，其中所述温度敏感性仙台病毒载体的复制和转录在所述允许温度下发生，导致人ZSCAN4的表达增加；以及
v)在适于植入所述细胞以治疗所述疾病的条件下将所述接触的CD34+细胞输注到所述受试者中。
3.根据权利要求1所述的方法，所述方法进一步包括在步骤v)之后，在将所述接触的CD34+细胞输注到所述受试者中之前，在37℃±0.5℃的非允许温度下孵育所述接触的CD34+细胞，其中所述温度敏感性仙台病毒载体的复制和转录以及人ZSCAN4的表达在所述非允许温度下停止。
4.根据权利要求2所述的方法，所述方法进一步包括在步骤iv)之后，在将所述接触的CD34+细胞输注到所述受试者中之前，在37℃±0.5℃的非允许温度下孵育所述接触的CD34+细胞，其中所述温度敏感性仙台病毒载体的复制和转录以及人ZSCAN4的表达在所述非允许温度下停止。
5.根据权利要求3或权利要求4所述的方法，其中将所述接触的CD34+细胞在37℃±0.5℃的非允许温度下孵育约30分钟至约10天，任选地约30-180分钟。
6.根据权利要求5所述的方法，其中通过向所述受试者施用粒细胞集落刺激因子和普乐沙福中之一或二者来动员所述造血干细胞。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述外周血单个核细胞通过单采术从所述受试者获得。
8.根据权利要求7所述的方法，其中通过使用抗CD34抗体和磁珠进行阳性选择从所述外周血单个核细胞分离所述CD34+细胞。
9.根据权利要求8所述的方法，其中在输注之前将所述接触的CD34+细胞洗涤并重悬于无菌等渗水溶液中。
10.根据权利要求9所述的方法，其中将所述接触的CD34+细胞以约1.0x 10^5个细胞/kg至约1.0x 10^7个细胞/kg，任选地约2.0-8.0x 10^6个细胞/kg的剂量静脉内输注。
11.一种治疗血液或造血器官疾病的方法，所述方法包括：
i)向患有所述疾病的人受试者施用包含含有人ZSCAN4的编码区的异源核酸的温度敏感性仙台病毒载体；
ii)将所述受试者的核心体温降低至33℃±0.5℃的允许温度；
iii)将所述受试者的核心体温在所述允许温度下维持约12小时至约7天或约12-72小时的时间段，其中所述温度敏感性仙台病毒载体的复制和转录在所述允许温度下发生，导致人ZSCAN4的表达增加；以及
iv)允许所述受试者的核心体温返回到37℃±0.5℃的正常非允许温度，其中所述温度敏感性仙台病毒载体的复制和转录以及人ZSCAN4的表达在所述非允许温度下停止。
12.一种治疗血液或造血器官疾病的方法，所述方法包括：
i)将患有所述疾病的受试者的所述核心体温降低至33℃±0.5℃的允许温度；
ii)向所述受试者施用包含含有人ZSCAN4的编码区的异源核酸的温度敏感性仙台病毒载体；
iii)将所述受试者的核心体温在所述允许温度下维持约12小时至约7天或约12-72小时的时间段，其中所述温度敏感性仙台病毒载体的复制和转录在所述允许温度下发生，导致人ZSCAN4的表达增加；以及
iv)允许所述受试者的核心体温返回到37℃±0.5℃的正常非允许温度，其中所述温度敏感性仙台病毒载体的复制和转录以及人ZSCAN4的表达在所述非允许温度下停止。
13.根据权利要求11或权利要求12所述的方法，其中使用目标温度管理(TTM)程序降低所述受试者的核心体温，其中所述TTM程序包括向所述受试者施加由冷却导管、冷却毯和冰块组成的组中的一种。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述人受试者在治疗前被诊断患有骨髓衰竭，任选地其中所述骨髓衰竭包括中性粒细胞减少症、血小板减少症和贫血中的一种或多种。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述受试者不患有癌症。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述疾病是端粒生物学障碍。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述端粒生物学障碍选自先天性角化不良、Hoyeraal-Hreidarsson综合征、Revesz综合征、Coats plus综合征、特发性肺纤维化和肝硬化。
18.根据权利要求16所述的方法，其中所述端粒生物学障碍由以下中之一或二者定义：
i)外周血淋巴细胞、B细胞和幼稚T细胞中的一种或多种中年龄标化平均端粒长度小于1百分位数；以及
ii)选自DKC1、TERC、TERT、NOP10、NHP2、TINF2、CTC1、PARN、RTEL1、ACD、USB1和WRAP53的基因中的致病突变。
19.根据权利要求13所述的方法，其中所述疾病是骨髓衰竭综合征。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述骨髓衰竭综合征选自范可尼贫血、无巨核细胞血小板减少症、再生障碍性贫血、Diamond Blackfan贫血、阵发性睡眠性血红蛋白尿症、皮尔逊综合征、Shwachman Diamond综合征和骨髓增生异常综合征。
21.根据权利要求14所述的方法，其中所述疾病与核型异常相关。
22.一种温度敏感性药剂，其中所述药剂是温度敏感性病毒载体或温度敏感性自我复制RNA，其包含含有人ZSCAN4的编码区的异源核酸和插入12-18个核苷酸的非结构蛋白编码区，其中所述插入导致在所述nsP2的β片层5与β片层6之间包含4至6个另外的氨基酸的非结构蛋白2(nsP2＝解旋酶蛋白酶)的表达，任选地其中所述另外的氨基酸导致所述病毒载体或所述自我复制RNA的温度敏感性。
23.根据权利要求22所述的温度敏感性药剂，其中所述另外的氨基酸包含选自SEQ IDNO:43(GCGRT)、SEQ ID NO:44(TGAAA)和SEQ ID NO:45(LRPHP)的一个序列。
24.根据权利要求22所述的温度敏感性药剂，其中所述另外的氨基酸包含SEQ ID NO:44(TGAAA)的序列。
25.根据权利要求24所述的温度敏感性药剂，其中所述NsP2的氨基酸序列包含选自SEQID NO:29-36的一个序列。
26.根据权利要求22所述的温度敏感性药剂，其中所述药剂是温度敏感性甲病毒载体。
27.根据权利要求22所述的温度敏感性药剂，其中所述药剂是包含缺乏病毒结构蛋白编码区的甲病毒复制子的温度敏感性自我复制RNA。
28.根据权利要求26或权利要求27所述的温度敏感性药剂，其中所述甲病毒选自委内瑞拉马脑炎病毒、辛德比斯病毒和塞姆利基森林病毒。
29.根据权利要求26或权利要求27所述的温度敏感性药剂，其中所述甲病毒是委内瑞拉马脑炎病毒。
30.一种用于在受试者中瞬时诱导温度敏感性药剂(ts药剂)的温度敏感性活性的方法，其中所述ts药剂是温度敏感性病毒载体或温度敏感性自我复制RNA，其包含含有人ZSCAN4的编码区的异源核酸，其中所述受试者的身体表面处或附近的一个或多个细胞包含所述ts药剂，其中所述ts药剂的温度敏感性活性包括在允许温度下表达人ZSCAN4，并且其中所述允许温度是所述受试者的表面体温，所述方法包括：
i)将所述受试者的表面体温在所述允许温度下维持一定的时间段，所述时间段足以使所述温度敏感性活性在所述受试者中诱导效果；以及
ii)将所述受试者的表面体温升高至非允许温度，持续一定的时间段，所述时间段足以使所述受试者中的所述温度敏感性活性停止。
31.一种用于在受试者中瞬时诱导温度敏感性药剂(ts药剂)的温度敏感性活性的方法，其中所述ts药剂是温度敏感性病毒载体或温度敏感性自我复制RNA，其包含含有人ZSCAN4的编码区的异源核酸，其中所述ts药剂的温度敏感性活性包括在允许温度下表达人ZSCAN4，并且其中所述允许温度是所述受试者的表面体温，所述方法包括：
i)将所述ts药剂施用至所述受试者的身体表面处或附近的一个或多个细胞；以及
ii)将所述受试者的表面体温在所述允许温度下维持一定的时间段，所述时间段足以使所述温度敏感性活性在所述受试者中诱导效果。
32.根据权利要求31所述的方法，所述方法进一步包括iii)将所述受试者的表面体温升高至非允许温度，持续一定的时间段，所述时间段足以使所述受试者中的所述温度敏感性活性停止。
33.根据权利要求31所述的方法，其中将所述温度敏感性药剂皮内或皮下施用。
34.根据权利要求31所述的方法，其中将所述温度敏感性药剂肌内施用。
35.根据权利要求30-34中任一项所述的方法，其中所述允许温度是30℃至36℃、或31℃至35℃、或32℃至34℃、或33℃±0.5℃，所述非允许温度是37℃±0.5℃。
36.根据权利要求35所述的方法，其中人ZSCAN4的表达的所述效果是预防效果或治疗效果。
37.根据权利要求35所述的方法，其中所述ts药剂是温度敏感性病毒载体并且所述温度敏感性活性进一步包括所述温度敏感性病毒载体的复制和转录。
38.根据权利要求37所述的方法，其中所述温度敏感性病毒载体选自仙台病毒、腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒和甲病毒。
39.根据权利要求37所述的方法，其中所述温度敏感性病毒载体是甲病毒，任选地其中所述甲病毒选自委内瑞拉马脑炎病毒、辛德比斯病毒和塞姆利基森林病毒。
40.根据权利要求37所述的方法，其中所述温度敏感性病毒载体是仙台病毒。
41.根据权利要求35所述的方法，其中所述ts药剂是温度敏感性自我复制RNA，并且所述温度敏感性活性进一步包括所述温度敏感性自我复制RNA的复制和转录中之一或二者。
42.根据权利要求41所述的方法，其中所述自我复制RNA包含缺乏甲病毒病毒结构蛋白编码区的甲病毒复制子。
43.根据权利要求42所述的方法，其中所述甲病毒选自委内瑞拉马脑炎病毒、辛德比斯病毒和塞姆利基森林病毒。
44.根据权利要求42所述的方法，其中所述甲病毒是委内瑞拉马脑炎病毒。
45.根据权利要求36所述的方法，其中足以使所述温度敏感性活性产生效果的所述时间段在约12小时至约12周的范围内，任选地其中所述时间段为1至7天。
46.根据权利要求36所述的方法，其中足以在所述受试者中诱导效果的所述时间段是约12小时至约7天，任选地其中所述时间段是约12小时至约72小时。
47.根据权利要求36所述的方法，其中所述受试者是哺乳动物受试者，任选地其中所述受试者是人。
48.根据权利要求1-47中任一项所述的方法，其中人ZSCAN4的所述氨基酸序列包含SEQID NO:38或与SEQ ID NO:38至少95％相同。
49.根据权利要求1-47中任一项所述的方法，其中人ZSCAN4的所述氨基酸序列包含由SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41和SEQ ID NO:42组成的组中的一个，或与由SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41和SEQ ID NO:42组成的组中的一个至少95％相同。
50.一种用于瞬时诱导温度敏感性药剂的温度敏感性活性的方法，所述方法包括：
i)将包含所述温度敏感性药剂的一个或多个细胞在诱导所述温度敏感性活性的允许温度下孵育一定的时间段，所述时间段足以使所述温度敏感性活性在所述一个或多个细胞中产生效果；以及
ii)在非允许温度下孵育所述一个或多个细胞，其中所述非允许温度降低所述温度敏感性药剂的温度敏感性活性，
其中所述温度敏感性药剂包括含有人ZSCAN4蛋白或含有人ZSCAN4的编码区的核酸的治疗剂，并且所述效果包括治疗效果。
51.根据权利要求50所述的方法，所述方法进一步包括在步骤i)之前：使所述一个或多个细胞与所述温度敏感性药剂接触。
52.根据权利要求51所述的方法，其中所述一个或多个细胞在与所述温度敏感性药剂接触时处于所述允许温度下。
53.根据权利要求50所述的方法，所述方法进一步包括向需要所述治疗效果的受试者施用所述一个或多个细胞。
54.根据权利要求50所述的方法，其中在非允许温度下孵育所述一个或多个细胞包括向需要所述治疗效果的受试者施用所述一个或多个细胞，其中所述受试者的体温是所述非允许温度。
55.根据权利要求54所述的方法，其中在向所述受试者施用所述一个或多个细胞之前，将所述一个或多个细胞在所述非允许温度下进一步孵育。
56.根据权利要求50所述的方法，其中在使所述一个或多个细胞与所述温度敏感性药剂接触之前将所述一个或多个细胞从所述受试者分离。
57.根据权利要求50所述的方法，其中所述治疗效果包括增加所述一个或多个细胞的端粒长度。
58.根据权利要求50所述的方法，其中所述一个或多个细胞是哺乳动物细胞。
59.根据权利要求54所述的方法，其中所述受试者是人受试者。
60.一种用于在人受试者中瞬时诱导温度敏感性药剂的温度敏感性活性的方法，其中所述受试者的一个或多个细胞包含所述温度敏感性药剂，其中所述温度敏感性药剂的温度敏感性活性在允许温度下被诱导，并且其中所述允许温度低于所述受试者的体温，所述方法包括：
i)将所述受试者的体温降低至所述允许温度；
ii)将所述降低的体温维持一定的时间段，所述时间段足以使所述温度敏感性活性在所述受试者中诱导效果；以及
iii)将所述受试者的体温升高回正常体温，
其中所述温度敏感性药剂包括含有人ZSCAN4蛋白或含有人ZSCAN4的编码区的核酸的治疗剂，并且所述效果是治疗效果。
61.一种用于在人受试者中瞬时诱导温度敏感性药剂的温度敏感性活性的方法，其中所述温度敏感性药剂的温度敏感性活性在允许温度下被诱导，并且其中所述允许温度低于所述受试者的体温，所述方法包括：
i)将所述受试者的体温降低至所述允许温度；
ii)向所述受试者的一个或多个细胞施用所述温度敏感性药剂；
iii)将所述降低的体温维持一定的时间段，所述时间段足以使所述温度敏感性活性在所述受试者中诱导效果；以及
iv)将所述受试者的体温升高回正常体温，
其中步骤(i)在步骤(ii)之前、之后或同时进行，其中所述温度敏感性药剂包括含有人ZSCAN4蛋白或含有人ZSCAN4的编码区的核酸的治疗剂，并且所述效果是治疗效果。
62.根据权利要求61所述的方法，其中将所述温度敏感性药剂全身施用。
63.根据权利要求62所述的方法，其中将所述温度敏感性药剂静脉内施用。
64.根据权利要求61所述的方法，其中将所述温度敏感性药剂施用至所述受试者的特定组织或器官。
65.根据权利要求64所述的方法，其中将所述温度敏感性药剂通过硬膜外注射施用至脑和脊髓。
66.根据权利要求64所述的方法，其中将所述温度敏感性药剂通过经皮注射施用至靶器官中。
67.根据权利要求64所述的方法，其中将所述温度敏感性药剂通过内窥镜检查使用注射针头导管施用至靶器官中。
68.根据权利要求64所述的方法，其中将所述温度敏感性药剂通过血管导管施用至靶器官中。
69.根据权利要求66所述的方法，其中所述靶器官选自肝脏、肾脏、骨骼肌、心肌、胰腺、脾脏、心脏、脑、脊髓、皮肤、眼、肺、肠、胸腺、骨髓、骨和软骨。
70.根据权利要求61所述的方法，其中将所述温度敏感性药剂通过吸入施用。
71.根据权利要求61所述的方法，其中降低受试者的体温包括使用目标温度管理(TTM)程序，其中所述TTM程序包括向所述受试者施加由冷却导管、冷却毯和冰块组成的组中的一种。
72.根据权利要求61所述的方法，其中所述受试者的正常体温是温度敏感性药剂的非允许温度。
73.根据权利要求61所述的方法，其中所述温度敏感性药剂包含人ZSCAN4蛋白。
74.根据权利要求61所述的方法，其中所述温度敏感性药剂包含含有人ZSCAN4的编码区的核酸。
75.根据权利要求74所述的方法，其中温度敏感性病毒载体包含含有人ZSCAN4的编码区的核酸。
76.根据权利要求75所述的方法，其中所述温度敏感性病毒载体选自仙台病毒、腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒和甲病毒。
77.根据权利要求75所述的方法，其中所述温度敏感性病毒载体是甲病毒。
78.根据权利要求77所述的方法，其中所述甲病毒选自委内瑞拉马脑炎病毒、辛德比斯病毒和塞姆利基森林病毒。
79.根据权利要求75所述的方法，其中所述温度敏感性病毒载体是仙台病毒。
80.根据权利要求79所述的方法，其中所述仙台病毒是SeV18+/TS15ΔF。
81.根据权利要求75所述的方法，其中所述温度敏感性活性包括所述温度敏感性病毒载体的复制和转录。
82.根据权利要求74所述的方法，其中温度敏感性自我复制RNA包含含有人ZSCAN4的编码区的核酸。
83.根据权利要求82所述的方法，其中所述自我复制RNA包含缺乏病毒结构蛋白编码区的甲病毒复制子。
84.根据权利要求83所述的方法，其中所述甲病毒选自委内瑞拉马脑炎病毒、辛德比斯病毒和塞姆利基森林病毒。
85.根据权利要求82所述的方法，其中所述温度敏感性活性包括所述温度敏感性自我复制RNA的复制和转录中之一或二者。
86.根据权利要求74所述的方法，其中所述编码区与启动子可操作地连接。
87.根据权利要求50所述的方法，其中足以使所述温度敏感性活性产生所述治疗效果的所述时间段在约12小时至约12周的范围内，任选地其中所述时间段为1至7天。
88.根据权利要求61所述的方法，其中足以在所述受试者中诱导所述治疗效果的所述时间段是约12小时至约7天，任选地其中所述时间段是约12小时至约72小时。
89.根据权利要求50-88中任一项所述的方法，其中所述允许温度在30℃至36℃、或31℃至35℃或32℃至34℃的范围内。
90.根据权利要求89所述的方法，其中所述允许温度是33℃±0.5℃。
91.根据权利要求90所述的方法，其中所述非允许温度是37℃±0.5℃。
92.根据权利要求50所述的方法，其中所述一个或多个细胞是人细胞。
93.根据权利要求92所述的方法，其中所述一个或多个人细胞是成体干细胞、组织干细胞、祖细胞、胚胎干细胞或诱导多能干细胞。
94.根据权利要求92所述的方法，其中所述一个或多个人细胞选自造血干细胞、间充质干细胞、内皮干细胞、脂肪干细胞、神经元干细胞和生殖干细胞。
95.根据权利要求92所述的方法，其中所述一个或多个人细胞是体细胞、成熟细胞或分化的细胞。
96.根据权利要求95所述的方法，其中所述一个或多个人细胞选自表皮细胞、成纤维细胞、淋巴细胞、肝细胞、上皮细胞、肌细胞、软骨细胞、骨细胞、脂肪细胞、心肌细胞、胰腺细胞、胰腺β细胞、角质细胞、红细胞、外周血单个核细胞(PBMC)、神经元、神经胶质细胞、神经细胞、星形胶质细胞、生殖细胞、精细胞和卵母细胞。
97.根据权利要求92所述的方法，其中所述一个或多个人细胞是人骨髓细胞。
98.根据权利要求97所述的方法，其中所述人骨髓细胞是CD34+造血干细胞。
99.根据权利要求98所述的方法，其中所述人受试者患有端粒生物学障碍，任选地其中所述受试者患有骨髓衰竭。
100.根据权利要求89所述的方法，其中所述温度敏感性病毒载体或所述温度敏感性自我复制RNA包含插入12-18个核苷酸的非结构蛋白编码区，其中所述插入导致在所述nsP2的β片层5与β片层6之间包含4至6个另外的氨基酸的非结构蛋白2(nsP2＝解旋酶蛋白酶)的表达，任选地其中所述另外的氨基酸导致所述病毒载体或所述自我复制RNA的温度敏感性。
101.根据权利要求100所述的方法，其中所述另外的氨基酸包含选自SEQ ID NO:43(GCGRT)、SEQ ID NO:44(TGAAA)和SEQ ID NO:45(LRPHP)的一个序列。
102.根据权利要求100所述的方法，其中所述另外的氨基酸包含SEQ ID NO:44(TGAAA)的序列。
103.根据权利要求102所述的方法，其中所述NsP2的氨基酸序列包含选自SEQ ID NO:29-36的一个序列。
104.根据权利要求50-103中任一项所述的方法，其中人ZSCAN4的所述氨基酸序列包含SEQ ID NO:38或与SEQ ID NO:38至少95％相同。
105.根据权利要求50-103中任一项所述的方法，其中人ZSCAN4的所述氨基酸序列包含由SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41和SEQ ID NO:42组成的组中的一个，或与由SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41和SEQ ID NO:42组成的组中的一个至少95％相同。
CN202080097320.7A 2019-12-31 2020-12-30 Zscan4核酸和蛋白质向细胞和组织的基于温度的瞬时递送 Pending CN115175689A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202310278179.6A CN116726199A (zh) 2019-12-31 2020-12-30 Zscan4核酸和蛋白质向细胞和组织的基于温度的瞬时递送

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201962955820P 2019-12-31 2019-12-31
US62/955,820 2019-12-31
US202062992745P 2020-03-20 2020-03-20
US62/992,745 2020-03-20
PCT/US2020/067507 WO2021138448A1 (en) 2019-12-31 2020-12-30 Temperature-based transient delivery of zscan4 nucleic acids and proteins to cells and tissues

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202310278179.6A Division CN116726199A (zh) 2019-12-31 2020-12-30 Zscan4核酸和蛋白质向细胞和组织的基于温度的瞬时递送

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN115175689A true CN115175689A (zh) 2022-10-11

Family

ID=76687412

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202310278179.6A Pending CN116726199A (zh) 2019-12-31 2020-12-30 Zscan4核酸和蛋白质向细胞和组织的基于温度的瞬时递送
CN202080097320.7A Pending CN115175689A (zh) 2019-12-31 2020-12-30 Zscan4核酸和蛋白质向细胞和组织的基于温度的瞬时递送

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202310278179.6A Pending CN116726199A (zh) 2019-12-31 2020-12-30 Zscan4核酸和蛋白质向细胞和组织的基于温度的瞬时递送

Country Status (10)

Country Link
US (1) US20230059649A1 (zh)
EP (1) EP4084809A4 (zh)
JP (1) JP2023508725A (zh)
KR (1) KR20220128367A (zh)
CN (2) CN116726199A (zh)
AU (1) AU2020419183A1 (zh)
CA (1) CA3162825A1 (zh)
IL (1) IL294289A (zh)
MX (1) MX2022007910A (zh)
WO (1) WO2021138448A1 (zh)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20220129567A (ko) 2019-12-31 2022-09-23 엘릭서젠 쎄라퓨틱스, 인크. 핵산 및 단백질의 세포 및 조직으로의 온도-기반 일시적 전달
EP4395817A1 (en) * 2021-09-02 2024-07-10 Elixirgen Therapeutics, Inc. Temperature-controllable, rna immunotherapeutic for cancer

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ATE340254T1 (de) * 1995-04-06 2006-10-15 Miltenyi Biotec Inc Verfahren zur freisetzung von magnetischen teilchen, die an zelloberflächen gebunden sind
US7998733B2 (en) * 2004-10-05 2011-08-16 Merial Limited Chimeric vectors
EP2961828A4 (en) * 2013-02-28 2016-08-03 Harvard College COMPOSITIONS AND METHOD FOR MOBILIZING STEM CELLS
SG11201507334VA (en) * 2013-03-15 2015-10-29 Elixirgen Llc Methods of using zscan4 for rejuvenating human cells
WO2014200910A2 (en) * 2013-06-10 2014-12-18 Iogenetics, Llc Bioinformatic processes for determination of peptide binding
GB201603374D0 (en) * 2016-02-26 2016-04-13 Ucl Business Plc Packaging cell

Also Published As

Publication number Publication date
EP4084809A4 (en) 2024-04-03
MX2022007910A (es) 2022-08-25
JP2023508725A (ja) 2023-03-03
EP4084809A1 (en) 2022-11-09
KR20220128367A (ko) 2022-09-20
AU2020419183A1 (en) 2022-07-14
US20230059649A1 (en) 2023-02-23
CN116726199A (zh) 2023-09-12
CA3162825A1 (en) 2021-07-08
WO2021138448A1 (en) 2021-07-08
IL294289A (en) 2022-08-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20200308545A1 (en) Conditionally immortalized long-term stem cells and methods of making and using such cells
JP7263327B2 (ja) 細胞の遺伝子修飾のための非組込みｄｎａベクター
JP6889747B2 (ja) ヒト細胞を若返らせるためのｚｓｃａｎ４の使用方法
CN116134131A (zh) 核酸和蛋白质向细胞和组织的基于温度的瞬时递送
US20220401518A1 (en) Mesenchymal stem cell expressing hepatocyte growth factor, and use thereof
CN115175689A (zh) Zscan4核酸和蛋白质向细胞和组织的基于温度的瞬时递送
KR101760618B1 (ko) Sox 유전자가 이입된 비바이러스성 미니써클 벡터 및 이의 제조방법
WO2006066247A2 (en) Methods and compositions for extending telomere length and increasing cell lifespan
JP2022501044A (ja) ヒトアンジェルマン症候群において父方ｕｂｅ３ａ遺伝子発現を復活させるための組成物および方法
CN114729320A (zh) 用于将细胞重新程序化为能够呈递抗原的树突细胞2型的组合物、方法及其用途
Yu et al. In vitro non-viral lipofectamine delivery of the gene for glial cell line-derived neurotrophic factor to human umbilical cord blood CD34+ cells
Zhu et al. Growth and expression of rat bone marrow mesenchymal stem cells modified by nerve growth factor in diabetic rat bladders
KR20180079033A (ko) Igf-1 및 il-10을 분비하는 세포, 및 이의 용도
RU2801207C2 (ru) Способы применения zscan4 для омоложения человеческих клеток
CN116473999A (zh) 人脐带间充质干细胞在制备预防和/或治疗纤维化疾病的药物中的应用
WO2016072105A1 (ja) 重層上皮組織形成能を有する細胞、及びその製造方法
Growth Stem Cell Engineering and Therapy

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination