CN115151869A - 细胞代谢状态观测的计算机实现方法、程序和混合系统 - Google Patents

细胞代谢状态观测的计算机实现方法、程序和混合系统 Download PDF

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CN115151869A CN202180016139.3A CN202180016139A CN115151869A CN 115151869 A CN115151869 A CN 115151869A CN 202180016139 A CN202180016139 A CN 202180016139A CN 115151869 A CN115151869 A CN 115151869A
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Abstract

本申请提供用于预测生物反应器中的生物系统产生或消耗的至少一种生物材料的量的技术。生物系统的工艺条件和代谢物浓度测量为时间的函数。生物系统的代谢率包括代谢物的特定消耗率和代谢物的特定生产率被确定。工艺条件和代谢率被提供给混合系统模型，其配置为预测所述生物材料的生产。混合系统模型包括配置为预测时间函数形式的细胞生长的动力学生长模型以及代谢条件模型，其基于代谢物的特定消耗率或者分泌率以及选择工艺条件。其中代谢条件模型配置为将生物系统分类为代谢状态。基于混合系统模型预测生物材料的量。

Description

细胞代谢状态观测的计算机实现方法、程序和混合系统
技术领域
本申请涉及一种细胞代谢状态观测的计算机实现方法、程序和混合系统，包括混合模型。具体地，该混合模型可用于提供生物反应器的代谢和/或优化生物过程反应条件的可观察性。
背景技术
在生物制造中，生物系统被编排以生产特定的生物材料。该过程通常涉及将细胞和/或微生物放入生物反应器中，该反应器具有在受控大气条件下含有必需营养素的培养基。培养基被细胞消耗并用于生长和其他代谢功能，包括特定生物材料的生产和副产品的生产。
生物反应器包含连续(例如，每秒或每分钟一次)测量工艺条件的仪器，例如温度、pH和溶解氧，以及营养物和气体的添加，以及离开生物反应器的流的流动和含量。通常，定期(例如，每天一次或两次)采集生物过程的样品，以测量大量流体的含量，包括代谢物(例如，葡萄糖、谷氨酰胺、乳酸、NH4等)，还有细胞浓度、生物材料产品的浓度(也称为滴度)和质量属性的浓度(例如，副产品等)。然而，这些方法依赖于对平均细胞代谢行为的间接测量。
用于建模和分析细胞行为的技术包括通量平衡分析(flux balance analysis，FBA)，其可用于根据测量的代谢物的特定消耗和特定产生来建模和分析细胞代谢行为。FBA计算通过代谢网络的给定代谢物的流量，从而可以预测生物体的生长速度或代谢物的产生速率。为了防止模型过度拟合，这种类型的分析需要在生物反应器过程中细胞系的特定遗传知识，以及在通常的工艺开发和制造活动中所测量的基因表达和代谢物水平的测量结果。一般来说，在工艺开发和制造中对细胞代谢的观察极为有限，这限制了这种方法的使用。
在其他情况下，统计方法在建立回归模型以关联测量的工艺条件和代谢物从而预测滴度和副产物方面具有价值。这些方法虽然有利于预测目的，但在了解哪些工艺变量(例如，与代谢功能相关)对良好性能负责方面的能力有限。
在其它方面，诸如单体动力学模型的模型已用于预测细胞生长。这种类型的模型根据基质浓度和抑制性代谢物有效地预测细胞的生长速度。然而，这种方法也没有考虑细胞的当前状态。
因此，在工艺开发中缺乏对代谢活动的直接测量会产生一种情况，其中使用试错法来设计工艺操作。使用这种方法，以混合的方式进行实验，以确定以相对较高的产量生产高质量产品的条件。
工艺开发具有挑战性，并且诊断奇怪行为或优化工艺的能力是困难的。通常，代谢状态可能导致观察到的代谢物概况的生物学相关假设留给主题专家(subject matterexperts，SME)。
生物制造过程的监测也是具有挑战性的。通常，为重要的工艺参数和代谢物生成控制图。这确保该过程相对于正常操作处于受控状态，但不监测生物细胞代谢。异常代谢操作的诊断或预测再次留给SME。
传统的分批jin4料工艺在营养丰富的相对安全条件下运行，导致滴度通常约为2到6克/升。为了优化产量(例如产品形成)以达到更高的产量(例如20克/升及以上)，可能需要更长的运行时间，但这也可能导致副产品。然而，缺乏关于细胞代谢的知识，优化生产率是困难的并且是以混合的方式进行。
发明内容
根据本申请的一个方面，提供了计算机实现方法，计算机程序产品以及系统，用于细胞代谢状态观测，其中包括用于优化生物过程反应条件的混合模型。从工艺控制角度来看，细胞代谢的可观察性使得大量流体可以保持在正确的条件下，例如控制大量流体里的营养素，以便最大化代谢活动来朝着产品生产同时最小化不期望的活动(例如，产生副产品，过量的细胞生长等)。可观察性是高级工艺控制的一个术语，是指对系统(例如，生物反应器)的已测量或在这种情况下未测量的潜在驱动来生成可见性的能力。
根据一方面，提供了一种计算机实现方法，其使用细胞代谢状态观测用于预测生物反应器中的生物系统产生或消耗的至少一种生物材料的量。该方法包括：测量生物系统的工艺条件和代谢物浓度随时间的变化；确定所述生物系统的代谢率，包括代谢物的特定消耗率和代谢物的特定生产率；提供所述工艺条件和所述代谢率给混合系统模型，所述混合系统模型配置为预测所述生物材料的生产，其中所述混合系统模型包括：动力学生长模型，配置为预测时间函数形式的细胞生长，和代谢条件模型，配置为基于代谢物的特定消耗率或者分泌率选择工艺条件，其中所述代谢条件模型还配置为将所述生物系统分类为代谢状态；以及基于所述混合系统模型预测生物材料的量。
该代谢条件模型，当在实时环境中使用时，是状态观测器的一种。
进一步地，根据上述上面的方法，所述动力学模型可以配置为预测活细胞密度。
进一步地，根据上述上面的方法，所述动力学模型可以配置为参考裂解细胞。
进一步地，根据上述上面的方法，用于代谢物的代谢状态观测器可以被构建用于提供所述生物系统的内部代谢状态的预测结果。
进一步地，根据上述上面的方法，该方法还包括：获得所述代谢物的当前测量结果；使用所述代谢状态观测器来确定所述代谢物的消耗率；和使用所述代谢状态观测器和所述当前测量结果来预测所述代谢物的未来浓度。
进一步地，根据上述上面的方法，细胞状态分类可以被执行，使用所述代谢状态观测器来以预测所述代谢物的特定消耗率或者特定生产率。
进一步地，根据上述上面的方法，所述预测的特定消耗率或者所述预测的特定生产率是使用训练数据确定。
进一步地，根据上述上面的方法，该方法还包括：分类所述内部代谢状态为用于生物材料生产的最优或者次优类别；和当所述内部代谢状态被分类为次优类别时，发送通知给用户。
进一步地，根据上述上面的方法，所述动力学生长模型包括单体动力学模型或者饱和动力学模型。
进一步地，根据上述上面的方法，用于所述生物系统的时间函数形式的细胞密度或者细胞活力可以被测量。
进一步地，根据上述上面的方法，所述动力学生长模型还配置为预测时间函数形式的微生物细胞生长。
进一步地，根据上述上面的方法，所述代谢条件模型包括以下一项或者多项：机器学习模型、深度学习模型、主成分分析(principal component analysis，PCA)模型、偏最小二乘(partial least squares，PLS)模型、偏最小二乘判别分析(partial least squaresdiscriminant analysis，PLS-DA)模型和正交偏最小二乘判别分析(orthogonal partialleast squares discriminant analysis，OPLS-DA)模型。
进一步地，根据上述上面的方法，所述方法还包括：从所述生物反应器获得测试样品；和确定所述测试样品中的生物材料的量是否位于所述混合模型所预测的范围内。
进一步地，根据上述上面的方法，当所述混合系统模型运行时更新所述混合系统模型的参数，其中所述参数包括与所述混合系统模型相关联的代谢率和系数。
进一步地，根据上述上面的方法，所述工艺条件包括以下一项或者多项：pH、温度、溶解氧、渗透压、离开生物反应器的工艺流程、生长培养基、副产品、氨基酸、代谢物、氧气流量、氮气流量、二氧化碳流量、空气流量和搅拌速度。
进一步地，根据上述上面的方法，所述生长培养基包括具有氨基酸、糖类或有机酸的营养素。
进一步地，根据上述上面的方法，所述副产品包括氨基酸、糖类、有机酸或氨。
进一步地，根据上述上面的方法，所述方法还包括：基于所述混合系统模型确定用于所述生物反应器的最优工艺条件；使用一个或者个传感器测量所述生物反应器的时间函数形式的实验性工艺条件；监测所述测量的实验性工艺条件以检测与所述最优工艺条件的偏离；和当检测到偏离，发送通知给用户。
进一步地，根据上述上面的方法，所述方法还包括：基于所述混合系统模型确定用于所述生物反应器的最优工艺条件；使用一个或者个传感器测量所述生物反应器的时间函数形式的实验性工艺条件；监测所述测量的实验性工艺条件以检测与所述最优工艺条件的偏离；和提供反馈给控制所述生物反应器的控制器从而自动化调整所述实验性工艺条件以最小化与所述最优工艺条件的偏离。
在一些方面，该方法还包括：基于所述混合系统模型确定用于所述生物反应器的最优工艺条件；使用一个或者个传感器测量所述生物反应器的时间函数形式的实验性工艺条件；监测所述测量的实验性工艺条件以检测与所述最优工艺条件的偏离；当检测到偏离，发送通知给用户；和提供反馈给控制所述生物反应器的控制器从而自动化调整所述实验性工艺条件以最小化与所述最优工艺条件的偏离。
进一步地，根据上述上面的方法，该方法还包括：模拟，使用所述混合系统模型，至少一种生物材料的预测量，其中所述混合系统模型使用所述工艺条件初始化；和基于所述模拟确定所述生物系统的一个或者多个状态。
进一步地，根据上述上面的方法，该方法还包括：基于优化方法来调整所述工艺条件以确定优化预测轨迹、产品数量(滴度)和/或产品质量的工艺条件的配置。
根据一方面，该方法包括校准混合系统模型，所述混合系统模型用于预测生物反应器中的生物系统生产的生物材料。所述方法包括：获得实验数据，包括一个或者多个工艺条件、一个或者多个代谢物浓度和多个生物反应器批次的细胞数量的测量结果，其中每个批次与工艺条件的给定配置相关联；使用所述混合系统模型的动力学模型，基于所述实验数据，确定最优条件下生长速率；使用所述动力学模型，基于所述最优条件下生长速率以及来自所述实验数据的生长速率，确定细胞裂解参数；确定代谢物特定生产率或者特定消耗率；确定抑制生长因子的动力学参数以便最小化所述最优条件下生长速率和来自所述实验数据的生长速率之间的差距；和提供所述确定的动力学参数、所述细胞裂解参数、所述生长速率和所述代谢物特定生产率或者特定消耗率给所述混合系统模型的代谢条件模型用于分类所述生物系统为与所述生物系统生产的生物材料的给定生产率相关联的代谢状态，基于所述代谢物的所测量的特定消耗率或者所测量的分泌率。
进一步地，根据上述上面的方法，参数配置可以被提供给优化模块，其中所述参数配置包括所述最优条件下生长速率、代谢物特定消耗率和特定生产率以及新工艺条件，以确定优化所述生物材料的生产的工艺条件。
进一步地，根据上述上面的方法，该方法还包括使用主成分分析PCA监测所述生物反应器的批量属性。
进一步地，根据上述上面的方法，所述生物反应器的输出使用偏最小二乘PLS预测。
进一步地，根据上述上面的方法，所述输出是所述生物材料的量。
本申请中，生物材料可以包括使用生物反应器制造的代谢物、细胞、所需蛋白质、抗体、免疫球蛋白、毒素、一种或多种副产物、靶分子或任何其他类型的分子。可能有不止一种感兴趣的生物材料，包括产品、目标生物制品。
本申请中，抑制生长因子可能包括抑制生长的基质限制、温度或pH值变化或代谢物。
本申请中，给定生产率指的是以每个细胞为基础生产的产品量。
本申请中，工艺优化指的是确定工艺的最优调整或设置。这在下面的详细说明中更详细地描述。
代谢物可以包括任何合适的分析物，包括但不限于：氨基酸(例如，丙氨酸、精氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、半胱氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、羟脯氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸等)、糖类(例如，岩藻糖、半乳糖、葡萄糖、1-磷酸葡萄糖、乳糖、甘露糖、棉子糖、蔗糖、木糖等)、有机酸(例如，乙酸、丁酸和2-羟基丁酸、3-羟基丁酸、柠檬酸、甲酸、富马酸、异戊酸、乳酸、马来酸、丙酸、丙酮酸、琥珀酸等)，其他有机化合物(例如，丙酮、乙醇、焦谷氨酸等)。
本申请实施例可以实现为方法或者系统，和/或一个或者多个计算机程序产品。本申请实施例可以实现为机器可读介质，其中该介质包含在一个或多个信息载体中，例如CD-ROM、DVD-ROM、半导体存储器或硬盘。这样的计算机程序产品可以使数据处理设备执行应用程序中描述的一个或多个操作。
此外，本申请实施例也可以实现为包括处理器和耦合到处理器的存储器的系统。存储器可以对一个或多个程序进行编码以使处理器执行在申请中描述的一种或多种方法。在一些示例中，该系统可以是包括嵌入式系统的专用计算机系统。
附图说明
在下面的示例性附图和说明书中阐述了一种或多种实施方式的细节。从说明书、附图和权利要求中，其他特征将是显而易见的。然而，应当理解的是，即使实施例被单独描述，不同实施例的单个特征也可以组合到进一步的实施例中。
图1示出了本申请实施例提供的配置为细胞代谢状态观测的混合模型的计算环境的示例。
图2示出了本申请实施例提供的带有状态纠正的状态观测器的示例。
图3A示出了本申请实施例提供的简易代谢状态观测器的一种流程图。
图3B示出了本申请实施例提供的简易代谢状态观测器的另一种流程图。
图4A示出了本申请实施例提供的完整代谢状态观测器的一种流程图。
图4B示出了本申请实施例提供的完整代谢状态观测器的输入和输出的流程图。
图5示出了本申请实施例提供的使用混合模型的数字孪生模拟的操作的流程图。
图6示出了本申请实施例提供的校准动力学生长模型的流程图。
图7示出了本申请实施例提供的校准代谢调节模型的流程图。
图8示出了本申请实施例提供的校准混合模型的流程图。
图9A示出了本申请实施例提供的通过混合模型的数据流通路。
图9B示出了本申请实施例提供的用于代谢条件模型的PCA/PLS的数据流通路。
图10示出了本申请实施例提供的各种工艺运行以确定最优参数。
图11示出了本申请实施例提供的用于葡萄糖浓度的测量轨迹(例如中心点)和用于典型实验数据的或细胞密度。
图12A示出了本申请实施例提供的从实验数据计算代谢物(例如，葡萄糖)的特定消耗率的示例。图12B示出了本申请实施例提供的将预测的代谢物状态与所测量值比较的用于代谢物(如葡萄糖)的状态观测器的输出。在此示例中，代谢状态观测器的预测状态(估计)与实验测量值相关。
图13A至图13C示出了本申请实施例提供的混合模型的细胞状态分类的示例输出。图13A示出了提供由葡萄糖消耗引起的代谢紊乱的可观察性的PCA分数散点图(如使用PCA的状态观测器的预测)。以原点为中心的圆圈内的葡萄糖浓度代表正常操作。但是，超出此范围的葡萄糖值表明滴度降低或产品质量问题的风险增加。图13B示出了PCA分数散点图，提供了由指数增长到稳定期的转变导致的代谢功能的可变性的可观察性。此图表展示了一个示例，可在整个进料过程的轨迹中提供代谢活动变化的可观察性。图13C示出了PCA负载图的示例，以帮助开发对PCA分数散点图的过程理解(如使用PCA的状态观测器的预测)。
图14A至图14C示出了本申请实施例提供的混合模型预测的生产率和产品质量的示例。图14A示出了来自实验数据的所测量的给定生产率和来自状态观测器(使用PLS)的PLS代谢条件模型的所预测的给定生产率(如生产率、特定消耗、代谢物)。图14B示出了PLS分数散点图，提供了与来自状态观测器(使用PLS)的给定生产率(如生产率、特定消耗、代谢物)的变化相关的代谢物可变性的可观察性。图14C示出了相关的PLS负载图，提供了对与来自状态观测器(使用PLS)的给定生产率(如生产率、特定消耗、代谢物)的可变性相关的变量的过程理解。
图15A和15B示出了本申请实施例提供的生产率和产品质量的其他示例。图15A示出了对于给定的起始条件和自变量轨迹来模拟生长和滴度(由给定生产率产生的目标产物的浓度)的示例。还包括测量的生长和滴度数据，以比较预测结果与测量结果。图15B示出了来自状态观测器(使用PLS)的给定生产率(如生产率、特定消耗、代谢物)。
图16示出了本申请实施例提供的从单体动力学模型来确定重要的未测量代谢度量的示例。在此示例中，根据本申请实施例，特定生长速率，特定死亡率以及裂解细胞浓度(全部未测量)从单体动力学模型来预计。
图17A至图17C示出了本申请实施例提供的自变量调整对增长概况的影响的示例。对于每个图，生长状态的预测曲线以实线显示，测量状态的相关数据包括在内以进行比较。图17A示出了具有温度变化(抑制生长)的批次的测量和预测轨迹的示例。图17B示出了具有pH变化和低进料速率(葡萄糖消耗)的批次的测量和预测轨迹。图17C示出了具有pH和温度变化的批次的测量和预测轨迹。
图18示出了本申请实施例提供的如方程(6)所示的基质对生长速率的影响。该图显示了当基质浓度低于阈值时生长速率如何降低。在示例中，显示了阈值为1(θs，i＝1)的各种葡萄糖水平的增长率乘数。
图19示出了本申请实施例提供的二次参数对方程(7)中描述的有效生长速率的影响。当二次参数高于或低于给定的最优值(θi，opt＝36.8℃)时，生长速率会降低。生长速率的下降率由参数θq，i调整。
图20示出了本申请实施例提供的利用混合模型的生物过程反应器的系统框图的示意图。该图描绘了具有四个流的连续搅拌釜式反应器3410(具有反应搅拌器3465)。Ff指进料流3420，包含新鲜培养基，Fb是排放流3430，包含与反应器相同的内容物，Fh，包含反应器中的散装用过的培养基3440(大量流体通过分隔器3460与细胞分离)和Fr，循环流3450，包含细胞和完整循环流中剩余的散装流体。
图21示出了本申请实施例提供的混合模型的操作的高级流程图。
图22示出了本申请实施例提供的配置混合模型的操作的高级流程图。
具体实施方式
在下文中，将参照附图给出示例的详细描述。应当理解，可以对示例进行各种修改。特别地，一个示例的一个或多个元素可以组合并用于其他示例以形成新示例。
图1示出了本申请实施例提供的配置为细胞代谢状态观测的混合模型的计算环境的示例。所述动力学及代谢状态观测系统5可以包括多个特定处理模块，其中包括动力学生长模型50、代谢条件模型60、状态纠正模型75、过程监控引擎80、标记及警报引擎85和消耗率和分泌率模块90。所述代谢条件模型60可以包括额外的模块，包括PCA及PLS统计建模引擎65和数据驱动机器学习引擎70。这些部件的每一个将在下面详细描述。
特别地，混合模型包括动力学生长模型50和代谢条件模型60。该动力学模型确定存活的细胞、裂解细胞、活细胞和细胞密度等的量。该代谢条件模型60提供关于与生物过程有关的滴度和属性(如副产品等)的产品滴度和质量控制信息。在一些实施例中，代谢条件模型60的输出被推送到动力学生长模型50。
混合模型将细胞代谢与代谢物物质平衡结合起来。通常，代谢物是细胞消耗或分泌/产生的任何分析物。可以构建现有的生物过程模型来预测生物材料生产的轨迹，但是，这些生物过程模型存在不确定性。因此，实验测量的代谢物的所述特定消耗率和特定分泌率可能与生物过程模型的输出不匹配。为了解决这种不确定性并减少误差，可以使用状态纠正模型75，其仅更新对动力学生长模型50的状态的预计。可以基于测量的实验输出和预计的混合模型输出之间的差异导出误差，并且可以基于误差信号调整混合模型的参数(也参见图2)以使得误差信号为零作为时间函数形式。
动力学生长模型50是基于单体生长方程(见方程1至11)和代谢物物质平衡方程(见方程12、13)的状态观测器。单体生长方程和代谢物物质平衡方程是一系列微分方程，可用于描述细胞生长(例如微生物细胞生长)、细胞密度和活细胞密度、总细胞(例如活细胞、死细胞和裂解细胞)等。动力学生长模型的输入包括温度、进料条件、pH等，输出包括状态估计。在某些方面，动力学生长模型是经典的状态观测器。在这种情况下，内部建模的参数称为状态。例如，这些参数可能包括xv，xd，xl，mi。
从微分方程构造状态观测器是已知的。因此，在此处，此类技术已扩展到单体动力学方程和代谢物物质平衡方程，它们是一组微分方程，描述了生物细胞培养物中的细胞生长和生命周期以及代谢物的量。因此，动力学生长模型可用于监测生物反应器中活细胞的数量(和其他参数)并预测未来时间点上的生物反应器中的细胞数量。具有介质交换的生物反应器系统的单体生长方程包括以下方程：
(1)xt＝xv+xd+xl，其中xt是总细胞密度，xv是活细胞密度，xd是死细胞密度，以及xl是裂解细胞密度；
(2)
Figure BDA0003809400310000061
其中dxv/dt对应活细胞密度随时间的变化，和ueff对应有效生长速率，ud是细胞死亡率，Fb是细胞流失流速且含有与生物反应器相同的材料，以及V是生物反应器中的材料的体积；
(3)ud＝kd+ktxl，其中kt是裂解细胞浓度引起的死亡率增值，代表了大量流体的毒性；
(4)
Figure BDA0003809400310000062
其中kl是死细胞向裂解细胞的转化率，Fh是收获流速且包含大量流体(活细胞和死细胞从液体中分离出来并循环回生物反应器)；
(5)
Figure BDA0003809400310000063
(6)ueff＝umaxθsubθquadθinh，其中有效细胞密度可以基于umax确定，其对应最大生长速率也就是最优条件下生长速率，其中θsub对应基质耗尽引起的生长速率减值，θquad对应因为二次项(如温度、pH等)偏离生长最大化的目标值而导致的生长速率减值，以及θinh对应生物材料过量引起的生长抑制(例如、代谢物，细胞密度或者自变量)；
(7)
Figure BDA0003809400310000071
其中si是基质值，其可以是代谢物或者子白能量，θs，i是代表在其以下生长被抑制的基质浓度的系数；
(8)
Figure BDA0003809400310000072
其中qi是二次变量的值，其可以是代谢物或者自变量，θi，opt是表示生长最大化的二次变量的值的系数，以及θq，i是代表生长抑制敏感度的系数。
(9)
Figure BDA0003809400310000073
其中Ii是抑制变量的数值，其可以是代谢物或者自变量，θi，i是表示在其以上生长被抑制的抑制变量值的系数。
(10)
Figure BDA0003809400310000074
其中
Figure BDA0003809400310000075
是时间函数形式的生物材料变化率，Qp是输入包含代谢物浓度m的函数，δm，i(t)是当前时刻代谢物的特定生产率或者特定消耗率，u是自变量，以及xv是活细胞密度；
(11)
Figure BDA0003809400310000076
其中
Figure BDA0003809400310000077
是代谢物的变化率，δm，i(t)是当前时刻代谢物的特定消耗率或分泌率，mr，i是生物反应器中代谢物的浓度，mf，i是进料中代谢物的浓度，以及Ff是含新鲜培养基的进料流速。
动力学生长模型的输出包括产品滴度，给定生产率/特定消耗，代谢物浓度，活细胞密度，和活力。
给定时间或细胞状态的特定消耗(或分泌)速率可以从训练集(例如，使用方程14和15的测量数据)并使用以下方程计算：
(12)
Figure BDA0003809400310000078
(13)iVCD＝(0.6xv，k+0.4xv，k+1)(tk+1-tk)
这些方程在下面定义。
代谢条件模型60将系统的内部代谢状态分类，例如，分类为用于生物材料生产的最优或次优状态或类别。任选地，代谢条件模型的输入可以包括温度、进料条件等。通常，代谢条件模型独立于动力学生长模型，并且代谢条件监测可以独立于动力学生长进行。
在一些方面，代谢条件模型可用于通过提供滴度和/或质量的估计以改进滴度预测来增强动力学生长模型。
代谢条件模型至少包含代谢物和VCD以计算代谢物的特定消耗/特定生产。代谢条件模型任选地包含额外的测量的参数和/或未测量状态以改进对产品滴度和/或质量的预测。在一些实施例中，代谢条件模型包括统计建模引擎65，用于特定消耗/生产率(和可选地，从过程或状态测量的附加参数)的主成分分析(PCA)或偏最小二乘(PLS)或正交偏最小二乘(OPLS)。该模型从图9A中的代谢物特定消耗/分泌率(组件720)开始并将其转换为多变量分数(T细胞状态，组件730)。
统计建模引擎可以包括任何合适的引擎，包括(PCA)模型、偏最小二乘(PLS)模型、偏最小二乘判别分析(PLS-DA)模型和/或正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)模型。
PCA可用于分析生物反应器的批量特性(例如，系统作为一个整体滴度)，而PLS可用于分析给定代谢物(例如，葡萄糖)，例如，预测生物反应器的输出。PCA用于在没有潜在环境的情况下表征代谢变异。PLS用于将代谢变异与生产率(滴度)或重要质量度量(产品质量)的生产相关联。可在如Wold等作者的“PLS回归：化学计量学基本工具，化学计量学和智能实验室系统”，版本号58(2001)109-130，中找到用于执行PLS的技术。可以在如Wold等作者的“主成分分析，化学计量学和智能实验室系统第二版”，版本号(1987)37-52，中找到用于执行PCA的技术。PCA和PLS都可用于降低数据集的维数。PCA是一种无监督的降维技术，允许通过变量的线性组合来汇总数据，而不会丢失大量信息。PLS是一种有监督的降维技术，基于因变量和自变量之间的相关性而应用。这些技术被认为在本领域技术人员的范围内。
在一些方面，代谢条件模型60的输出馈送到动力学生长模型50中。代谢条件模型60还可以允许细胞代谢的代谢条件(状态)的可视化。因此，代谢条件模型60的输出既用作动力学生长模型50的输入，也有助于细胞代谢的代谢条件的监测和可视化。
代谢条件模型可以包含或链接到数据驱动机器学习引擎70和/或主成分分析(PCA)和偏最小二乘法(PLS)统计建模引擎65。在其他方面，代谢条件模型可以包含统计建模引擎65和数据驱动机器学习引擎70。机器学习引擎70可以包括神经网络、深度学习模型或其他机器学习模型。机器学习引擎70可以使用已知技术进行训练，以将生物系统/生物反应器的状态分类为最优或次优状态。此外，机器学习引擎70可以使用已知技术进行训练，以将代谢物的状态分类为最优或次优状态。在一些方面，机器学习引擎70执行与统计建模引擎65相当的分类，并且在某些情况下，具有比统计建模引擎65更高的准确度和精确度。
状态纠正模型75根据图2中描绘的状态观测器减轻系统中的误差。可以确定混合模型的输出和测量数据之间的差异，并将其作为误差信号提供给状态纠正模型75。状态纠正模型的作用是使误差最小化，并将使得误差信号为零作为时间函数形式。在一些方面，状态纠正对应于与扩展卡尔曼滤波器相关联的技术。在一些方面，状态纠正模型75可以是单独的模块，或者可选地，可以集成到动力学生长模型中。
继续参见图1，过程监控引擎80可以与多个传感器连接，这些传感器测量与生物反应器相关的一个或多个参数。这些参数可以包括温度、氧气水平、进料条件、pH或生物过程的其他方面，这些方面可以实时或近乎实时地监测。这些测量可以提供给混合模型以模拟生物反应。这些测量也可以提供给代谢条件模块60以监测细胞代谢并产生状态估计。
标记及警报引擎85监视系统的过程偏离。如果生物反应器的输出偏离其预期/预测输出，则向用户提供警报。在一些方面，生物过程可以被系统暂停，直到过程被纠正。在其他方面，系统可以补偿偏离(例如，调整进料或工艺条件以达到所需状态(例如，最优状态))。标记及警报引擎85还可以向用户发送关于生物反应器状态的通知。在其他方面，当内部代谢状态被分类为次优类别时，可以向用户发送通知
消耗率和分泌率模块90确定生物过程反应器中代谢物/分析物的特定消耗率和特定生产率。代谢条件模型60使用特定消耗数据。代谢条件模型60的输出(例如，给定生产力/特定消耗的估计)可以被提供到动力学生长模型中以预测产品滴度。
控制器95可以接收反馈(例如，生物反应器的输出)以控制生物反应器自动调整实验性工艺条件以最小化与最优工艺条件的偏离。
数据库30包含用于动力学及代谢状态观测系统5的各种类型的数据。训练数据32对应数据，其用于识别动力学模型系数、计算代谢物特定消耗/生产率和/或训练代谢条件模型60以将细胞的状态分类为最优或次优状态或者确定对生物材料的生产量如给定生产率的预计。
工艺条件34对应于当前生物过程反应的工艺条件。工艺条件34还可以包含已经通过实验确定的最优工艺条件。这些条件可以提供给混合模型(50、60)以促进当前生物过程操作的过程监控或生物反应器的模拟/预测。输出36是动力学及代谢状态观测系统5的输出，该输出可以从实验系统的输出中减去，以产生误差信号，该误差信号被反馈到混合模型的输入中。
特定消耗率和特定生产率可以从生物过程期间测量的实验数据计算。在一些方面，特定消耗和生产率可以使用以下方程确定：
(12)
Figure BDA0003809400310000091
(13)iVCD＝(0.6xv，k+0.4xv，k+1)(tk+1-tk)
其中δm，i(tk)在时间(tk)表示从时间(tk)到下一个在时间tk+1的采样点的特定消耗或者生产率VCD对应活细胞密度，而iVCD对应跨时间步长的集成VCD。为了确定给定时间步长的iVCD，时间步长(tk+1-tk)乘以在时间k的活细胞密度xv和时间k+1的活细胞密度xv的加权组合。为了确定特定消耗或者特定生产率δm，i(tk)，iVCD的倒数乘以在时间步长(mi，k–mi，k+1)上的代谢物浓度差异，其中mi对应于特定类型的代谢物。该差异被添加到mAdd(i，k)，其对应在时间间隔t＝k和t＝k+1之间的代谢物i的快速或连续的进料增量，其被除以Vk。在这个示例中，k和i都是非负整数。进一步地，假设代谢物i的在t＝k的测量发生在添加推注之前。
代谢物和细胞密度的测量值可以利用过程监控引擎80获得，并提供给特定消耗和分泌速率模型90以确定代谢物的特定消耗率或特定分泌率。特定消耗率和所述特定分泌率可以作为输入提供给代谢调节模型。所述特定消耗率和所述特定分泌率允许将测量的实验数据转化为每个细胞消耗或产生每种代谢物的量。在一些方面，可以将所述特定消耗率和所述特定分泌率提供给代谢条件模型60，其中PCA和PLS统计模型引擎65和/或数据驱动机器学习引擎70对细胞的状态进行分类以确定，相对于工艺参数(例如温度、进料浓度、pH等)而言，系统是否处于最优或次优条件。
图2示出了状态观测器240的上下文中的混合模型。在该示例中，进料和工艺条件显示为生物反应器210的输入。生物反应器的内部状态表示为M(int)。然而，生物反应器的内部状态，对应于生物反应器中单个细胞的代谢，不能直接测量。相对于这些内部状态可执行的最接近的测量是生物反应器210的输出的测量。输出包括代谢物浓度、活细胞密度(VCD)、产品滴度、产品质量、细胞活力、产品品质、温度、pH、溶解氧(DO)等。因此，由混合模型确定的内部估计是基于与生物反应器的输入和输出相关的间接测量值(例如，工艺条件)。
混合模型的输出(例如，状态估计、代谢状态等)与生物反应器的输出相结合，测量参数和估计参数之间的差异通过状态纠正模型75反馈到混合模型220的输入。状态纠正模型75试图修改参数以最小化测量的生物反应器输出和混合模型输出之间的差异，以使得误差信号为零作为时间函数形式。
通常，当系统的状态不可直接测量时，状态估计器可用于估计系统的内部状态。特别地，卡尔曼滤波器可用于基于噪声环境中的间接测量来确定内部系统状态的最优估计。也就是说，基于工艺条件和动力学模型，卡尔曼滤波器可用于优化估计系统的内部状态。卡尔曼滤波器特别适用于在噪声系统中产生系统状态的最优估计。在该示例中，状态纠正模型75可以包括卡尔曼滤波器或扩展卡尔曼滤波器。卡尔曼滤波器或扩展卡尔曼滤波器(extended Kalman Filter，EKF)可用于确定最优状态值，其中误差与模型状态估计中的不确定性、状态测量中的不确定性以及误差的协方差相结合。在某些方面，卡尔曼滤波器适用于动力学增长模型。
在该示例中，状态观测器包括混合模型，其包括动力学生长模型50和代谢条件模型60。动力学模型跟踪存在多少细胞，包括不可见的裂解细胞(裂解细胞通常具有不完整的细胞膜)和不同代谢物的量。代谢调节模型评估生物反应的功能方面(例如，细胞是否会产生更多的靶蛋白或细胞是否处于最优条件之外，这将导致产品(滴度)/靶标生产中的质量控制问题)。混合模型允许执行材料平衡分析(基于细胞、进料、工艺条件、代谢物和滴度等)，并监测/预测细胞将产生的产品量。
图3A示出了简易代谢状态观测器的操作流程图。在这个例子中，简易代谢状态观测器是针对特定的感兴趣的代谢物，而不是一组多种代谢物。简易代谢状态观测器包括用于跟踪消耗或产生代谢物的活细胞的单体生长模型。简易代谢状态观测器可以使用查找表来定义当前时间点的每个细胞消耗或产生的代谢物的量。在此示例中，代谢物是生长模型中的状态。可以针对没有相应测量的时间点估计状态，以在状态测量之间提供状态观测器。与图4A至图4B所示的完整状态观测器不同，简易代谢状态观测器不包括代谢条件模型60。
在这个例子中，简易代谢状态观测器被配置成监测生物反应器过程，如关于图1和图2所描述的，并估计代谢物的未来轨迹。在此示例中，可以使用扩展卡尔曼滤波器(EKF)来解释生物过程中的噪声。然而，可以使用任何合适的估计器。
在操作305，测量过程数据，包括温度、pH、进料条件、时间、代谢物浓度等。这些变量(例如，pH、温度、氧气等)被视为独立值。在一些方面，测量这些值并且使用零阶保持来估计采样间隔上的值。
通常，过程数据可以作为时间的函数来测量。测量的过程数据被提供给动力学生长模型50。
在操作310，动力学生长模型从初始测量值来初始化状态值(例如，代谢物值)，包括xv，xd，xl，mi。状态观测器(包括单体方程)在启动时被初始化。
在操作315，动力学生长模型50基于单体方程确定参数，其中参数包括活细胞密度(VCD)、细胞活力(Viab)和裂解细胞的总数等。在操作期间，根据估计值与测量值更新状态。
在操作320，确定代谢物的特定消耗/生产率。在一些方面，可以使用具有来自先前实验的数据的查找表，其基于当前时间关联特定消耗/生产率。在其他方面，当前时间的特定消耗/生产率是从生物过程的实验测量值估计的。因此，可以针对没有相应状态测量的时间点估计代谢状态，以在测量之间提供状态观测器。
在操作325，来自动力学生长模型的参数用于估计当前状态，包括当前代谢物值。在某些方面，在给定过程参数的测量值的情况下，通过对从反应开始时间到当前时间的一组动力学方程(例如方程1至方程11)进行积分来估计当前状态。
在操作330，将来自状态观测器的预测/估计状态与测量的实验条件进行比较。在操作340，确定最优状态估计(代谢物)。在一些方面，操作340的实施例是扩展卡尔曼滤波器。这些值被反馈到操作325。因此，状态估计可以作为来自反馈回路的时间的函数来更新。
动力学生长模型50的输出345可以包括产品滴度、代谢物浓度、活细胞密度和活力。基于此，在操作335，简易代谢状态观测器可以估计感兴趣的代谢物(mest)的未来值(例如，轨迹)。
动力学生长模型不反映生物反应器中细胞的内部状态。如果细胞在工艺条件下经历波动或偏离(例如，温度变化、代谢物增加或减少、进料条件改变等)，细胞可能会进入次优状态，并且输出(例如，生产中的生物材料的滴度)可能是次优的。因此，操作325至335提供了一种估计细胞内部状态的方法，并将输出生产与环境变量相关联以优化生产。此外，如果系统偏离最优范围，用户可能会收到通知，提示用户纠正生物过程以使反应恢复到最优条件。在一些实施例中，系统可以自动纠正进料或环境条件以使系统恢复到最优条件。例如，通过向控制生物反应器的控制器提供反馈，可以自动调整实验性工艺条件以最小化与所述最优工艺条件的偏离。
在这个例子中，注意到动力学参数不随时间改变。然而，在其他实施例中，特定消耗和生产可以随着时间而改变，因此可以被更新。
图3B示出了简易代谢状态观测器的高级流程图，其中输入350由简易代谢状态感测器355(见图3A)处理，以产生输出(最优估计)365。
图4示出了完整代谢状态观测器的操作的流程图。在这个例子中，完整代谢状态观测器被引导到一组多种代谢物。
在该示例中，完整代谢状态观测器被配置为监测生物反应器过程，如关于图1和图2所描述的，并且估计一种或多种代谢物的未来轨迹。与图3A类似，动力学生长模型和/或完整代谢状态观测器的输出可用于估计未来状态。在此示例中，可以使用扩展卡尔曼滤波器(EKF)来解释生物过程中的噪声。然而，可以使用任何合适的估计器。与简易代谢状态观测器相比，在该示例中，存在代谢条件模型60，并且状态扩展到多于单个代谢物。
在操作405，测量过程数据，包括温度、pH、进料条件、时间、代谢物浓度等。通常，过程数据可以作为时间的函数来测量。将测量的过程数据提供给动力学生长模型50和代谢物条件模型。在其他方面，测量的过程数据可以可选地提供给代谢物条件模型。在操作410，动力学生长模型初始化状态值(例如，代谢物值)，包括xv，xd，xl，mi。状态观测器在启动时被初始化。在操作期间，状态会根据估计值与测量值进行更新，如下所述。在操作415，用于单体方程的动力学生长模型50的系数被初始化，其中系数包括umax，kd，kt，θs，θiopt，θq和θi。
动力学生长模型50(图4B中完整代谢状态观测器470的一部分)的输出可以包括产品滴度、代谢物浓度、活细胞密度、裂解细胞和活力。基于此，完整代谢物状态观测器可以估计(例如，轨迹)滴度、生物材料、活细胞密度、活力、裂解细胞、代谢物和感兴趣的细胞状态(mest)的未来值(参见图4B)。
动力学生长模型不反映生物反应器中细胞的内部状态。如果细胞在工艺条件下经历波动或偏离(例如，温度变化、代谢物增加或减少、进料条件改变等)，细胞可能会进入次优状态，并且输出(例如，生产中的生物材料的滴度)可能是次优的。在具有大量状态的多维系统中，包括一些相互关联的状态，确定要调整哪些工艺条件具有挑战性。因此，代谢条件模型60的状态以及操作425至440提供了一种估计细胞内部状态的方法，并将输出产量与环境条件(变量)相关联以优化滴度产量。此外，如果系统偏离最优范围，用户可能会收到通知，提示用户纠正生物过程以使生物反应恢复到最优条件。在其他实施例中，系统可自动纠正进料或环境条件以自动返回，系统至最优条件。这种能力在下面和整个说明书中更详细地描述。例如，优化例程可用于确定过程调整，如下所述。
在操作420，确定给定时间的代谢物的特定消耗/生产率。在一些方面，可以使用从实验数据校准的查找表，其基于当前时间关联特定消耗/生产率。因此，可以针对没有相应状态测量的时间点估计代谢状态，以在测量之间提供状态观测器。在其他方面，方程12和13可用于提供消耗和生产率。
在操作425，来自动力学生长模型的单体方程用于估计包括当前代谢物值的当前状态。在一些方面，在给定过程参数的测量值的情况下，通过对从反应开始时间到当前时间的动力学方程(例如，单体方程)进行积分来估计当前状态。在其他方面，可以使用饱和动力学方程。
在操作430，将来自状态观测器的预测/估计状态与测量的实验条件进行比较。在操作440，确定最优状态估计(代谢物)。这可以使用扩展卡尔曼滤波器来执行。在操作425，这些值被反馈到系统中。因此，状态估计可以作为来自反馈回路的时间的函数来更新。操作425至440对应于图2所示的反馈路径，从混合模型的输出经过状态纠正模型再到混合模型。
与简易状观测器不同，完整代谢状态观测器包括附加操作，包括操作445至460，其监测多变量系统的代谢状态。在操作445，计算当前测量数据δm，i(tk)的代谢物的特定消耗/生产率。这可以基于测量的过程数据来执行。在操作450，代谢状态是根据代谢条件模型并基于特定消耗和生产率来确定。在操作455，可以可选地计算质量属性的特定生产率或特定生产。给定生产率(目标蛋白的产量)可用于动力学生长模型来估计产品滴度。在操作460，用于过程监测的当前代谢状态根据数据驱动方法(例如，数据驱动分类、PLS、深度学习等)进行分类。由于具有大量状态，包括相关状态，的多元系统的复杂性，很难确定调整哪些工艺条件。本申请提供的数据驱动方法(例如，PCA及PLS统计建模引擎65和数据驱动机器学习引擎70)可用于降低系统的维数，并允许识别影响滴度的条件。换言之，可以识别和调整次优条件以使系统恢复到最优生产率。本申请提供了对现有技术的改进，因为这些改进提供了对生物反应器的细粒度和特异性控制，通过识别超出最优确定范围的过程变量。在这种情况下，最优是指与优化的滴度生产相对应的工艺或进料条件的范围。
对于这个例子，注意到动力学参数不随时间改变。然而，特定消耗和生产可能会随着时间的推移而变化，因此可能会更新。
图4B示出了完整代谢状态观测器的高水平，显示了完整代谢状态观测器的各种输出和输入。具体地，在操作405收集过程数据并将其提供给完整代谢状态观测器470。完整代谢状态观测器使用如本申请所述的混合模型在操作460监测细胞代谢、滴度和质量，并预测在操作455的生物材料的给定生产率和产品质量。可以在操作535预测生物材料的滴度和质量。
如图5所示，混合模型可用于其他应用。例如，混合模型可以用作数字孪生模拟的一部分，以数字方式复制生命系统的行为。
优化涉及搜索各种输入变量以找到使用优化包最大化滴度、质量或其他期望结果的集合。输入变量通常包括营养添加物和独立的过程参数，例如温度和pH值。优化的参数可以作为输入变量提供给操作610。
在操作610，为输入变量(ui))和营养添加物指定轨迹。在操作615，状态值从初始测量数据(xv，xd，xl，mi)中初始化。在操作620，接收操作610的指定轨迹和操作615的初始化状态值作为输入。用于确定生长和代谢物轨迹的单体生长方程在合适的参数范围内进行了整合。
在操作625，使用数据驱动分类(例如，PLS、深度学习等)对细胞代谢进行分类。在操作630，使用混合模型预测给定生产率和产品质量，包括动力学生长模块50和代谢条件模块60。在操作635，预测生物材料的滴度和质量。在此示例中，混合模型被配置为镜像或复制生物反应器产生的输出。
图6示出了动力学生长模型50的校准的示例。在操作705，生成历史测量过程数据的训练集。
在操作715，针对来自历史测量过程数据的训练集的每个观察结果计算代谢物的特定消耗/生产率。在操作720，计算代表训练集的代表性的特定消耗/生产函数(δm，i(tk))。在此示例中，使用查找表来执行此功能。在某些方面，每种代谢物都有一个单独的函数(查找表)。一般来说，可以使用任何合适的方法来估计给定时间的特定消耗/生产。
图7示出了代谢条件模型60的校准方法的示例。在操作810，生成历史测量过程数据的训练集。可选地，测量的过程变量811可以被添加到代谢条件模型中。在操作815，针对来自历史测量过程数据的训练集的每个观察结果计算代谢物的特定消耗/生产率。
在操作820，针对选择的响应变量计算代谢物的特定消耗/生产率。响应变量包括滴度(产出)和质量度量。此操作是可选的。
在操作825，PCA(或PLS，如果存在响应变量)被用于特定消耗/生产率数据。除了特定消耗/生产率数据之外，代谢调节模型还可以包含测量的过程参数。
图8是混合模型校准(解耦系统识别)的操作流程图，包括动力学模型和代谢调节模型。操作910、915和920对应动力学生长模型。操作925对应代谢条件模型。
在操作905，获得训练数据集。在操作910，在最优条件下识别特定生长速率。在操作915，识别抑制动力学系数。在操作920，识别死亡动力学系数。在操作925，计算代谢物特定消耗轨迹。在操作930，这些值可以被提供给动力学生长模型以确定各种参数(例如，VCD、活细胞、总细胞、裂解细胞等)。在操作935，使用数据驱动技术对细胞代谢进行分类，使用代谢物条件模型60。在操作940，可以使用细胞代谢条件模型来预测给定生产率和产品质量。
图9A是通过混合模型的数据流的示例。数据部分705对应生物反应器(m，u)的过程测量值。将实验数据提供给动力学生长模型，以生成估计的生长状态715(xt，xd，xl，
Figure BDA0003809400310000131
)，其中
Figure BDA0003809400310000132
是状态估计，并提供给代谢调节模型60以生成计算的参数720(δmeas)和代谢细胞状态730。该图的上半部分对应动力学生长模型，而该图的下半部分对应代谢调节模型。尽管处于简洁未在该图中示出，但可以将来自下层路径的数据提供给上层路径，如本申请所述。
基于计算的参数720生成细胞状态730。从这些数据集(715和730)，确定产品滴度740Qp和生物材料750的计算参数。
这些示例不旨在限制通过混合模型的数据流，因为可以在应用程序中描述附加的数据流路径。数据流的其他路径可能适用于混合模型。
图9B示出了代谢条件模型的PCA/PLS的数据流路径。可选地，变量760用于确定给定生产率或质量度量765。变量760和生产率/度量765用于PCA或PLS分析以生成主成分分数(T)和/或生成预测的给定生产率或质量度量775。
图10是显示各种生物反应器运行和每次运行所用条件的表格。从该图表中可以看出，工艺条件(例如，pH、温度、进料等)是变化的，以找到产生优化滴度的优化条件。可基于优化方法调整工艺条件以确定优化预测轨迹、产品数量(滴度)和/或产品质量的工艺条件的配置。
找到过程的最优调整或设置可以定义为找到最小化数学目标函数j的一组操纵变量(u或自变量，在这种情况下为工艺条件和进料)。
(14)
Figure BDA0003809400310000141
例如，在未来时间点t|[t+k]最大化滴度的目标函数可以采用以下形式：
(15)
Figure BDA0003809400310000142
其中
Figure BDA0003809400310000143
其中
Figure BDA0003809400310000144
是未来时间点的预测滴度；
x|[t]是状态的当前值，并且
u|[t]是在现在[t]和未来时间点[t+k]之间实施的一组操作变量。
可能存在要同时优化的多个目标。这可以通过基于目标的重要性对目标进行加权来执行。例如，为了最大化滴度并保持目标质量度量，目标函数可以采用以下形式：
(16)
Figure BDA0003809400310000145
其中
θ是要优化的每个参数的相对权重，并且
qsp是质量参数q的目标或设定点。
与IgG的函数类似的函数(fq)可以预测未来时间点的未来质量变量。
通常，有添加到函数的约束。例如，在将质量保持在操作规范内的情况下最大化滴度的优化目标可以由以下方程控制：
(17)
Figure BDA0003809400310000146
受约束于：
(18)
Figure BDA0003809400310000147
为了防止优化算法选择不可行的新输入集合，还对u施加了限制。通过对配方或当前设置的u的变化施加惩罚来调整控制动作的积极性。这可以防止控制器对工艺条件进行不稳定或大的改变，从而对目标参数提供最小的改进。然后完整的目标函数被描述为找到使滴度(IgG)最大化并在目标和指定范围内保持质量的最优可行u的集合。这可以由以下公式控制：
(19)
Figure BDA0003809400310000151
受约束于：
(20)
Figure BDA0003809400310000152
(21)umin≤u|[t]≤umax，其中
θu是u的惩罚权重(注意可能多于一个u)，和
usp是u的目标值，其通常是设定值或当前值。
示例
图11示出了VDC和葡萄糖的示例轨迹。该数据可用于确定这些相应参数的中心点。
图12A至12B示出了代谢物状态估计的例子，例如，对于葡萄糖。
可以使用以下流程构建代谢物的状态观测器。
1.根据收集到的数据计算特定消耗/分泌率。
请注意，在时间(t)的δm，i(t)代表从(t)到下一个BEM采样点的消耗率。可以使用以下等式：
(12)
Figure BDA0003809400310000153
(13)
Figure BDA0003809400310000154
其中mAddi，k是t＝k的代谢物的推注添加量。假定在t＝k的代谢物的测量是在添加推注之前进行的。
2.从训练集中计算平均轨迹。
使用SIMCA平均BEM轨迹是一种简单的方法来确定δm，i(t)。
3.对于模拟和状态观察，使用BEM值的零阶保持计算参数δm，i(t)。
图13A至13C示出了使用数据驱动方法的细胞状态分类的示例。在该方法中，基于测量的数据计算特定消耗率，例如，使用本申请所述的方法来计算δm，i(tk)。该组δm，i(tk)值可用于构建数据驱动模型以对细胞状态(例如代谢物)进行分类。
在一些方面，使用代谢条件模型进行细胞状态分类以估计代谢物的特定消耗速率或特定生产率。在一些方面，机器学习过程可用于对细胞状态进行分类。在其他方面，可以使用统计模型对细胞状态进行分类。例如，PCA可用于对系统进行高级别分类，例如，以确定细胞培养物生长是否在最优范围内运行(参见图13B)。PLS可用于对单个代谢物进行分类，例如，预测滴度和/或产品质量并确定单个参数是否在最优范围内运行(参见图13A，对于葡萄糖)。图13C示出了对各种参数(例如，生长、活力、副产物如氨、氨基酸、饲料等)的状态观察预测。
图14A至14B示出了与生产率相关的参数的识别。相关(不一定是因果关系)的关系可以为管理生物过程反应提供有价值的参考。图14C示出了氨降低生产率，而所有其他代谢物提高生产率。营养素(例如葡萄糖、谷氨酰胺等)的消耗与高生产率有关。其他代谢物，如乳酸和氨，的较低的消耗(或生产)与低生产率有关。还可以研究pH值和温度变化。一般来说，降低pH值会提高生产率，而降低温度会降低生产率。
图15A至15B示出了细胞密度抑制生长速率。例如，大约12乘以10的5次方的细胞密度开始抑制生长速率。混合模型允许分别分析细胞密度和裂解细胞的影响。生长抑制可以用氨来解释，氨随着细胞密度的增加而增加。然而，被裂解的死细胞会将毒素释放到大量流体中并进一步增加细胞死亡率。灌注数据分析可用于区分这些影响，因为灌注可以去除有毒代谢物，而去除毒素可防止细胞死亡率增加。因此，这些结果表明细胞死亡率在很大程度上受到裂解细胞的影响。
图16示出了预测的VCD、生长速率和死亡率的图表。该图显示了生长抑制(例如，随着细胞密度的增加、代谢物的积累、营养素的消耗、温度的变化)。随着裂解细胞密度的增加、氨的形成以及pH值的变化(影响较小)，死亡率会增加。推注进料添加与非常短暂的营养消耗相关。生长抑制与细胞密度相关。
图17A至17C显示了各种参数变化的影响。将混合生长模型的预测行为与测量的实验行为进行比较。如这些图所示，温度的变化被证实会抑制生长。pH值的变化似乎会略微增加细胞死亡率，但似乎不会抑制生长速率。这些细胞似乎能够很好地适应葡萄糖和谷氨酰胺的消耗并从中恢复。因此，在生长中没有观察到显著变化，因为细胞可能代谢其他碳源。
可以使用以下流程获得在各种实验条件下的生长曲线：
1.初始化模型(观测器)。
获取起始条件(例如，VCD、活力、代谢物(葡萄糖、谷氨酰胺、谷氨酸、乳酸、氨等)、输入参数(温度、pH等))。
2.对时间间隔内的动力学模型进行积分。
(22)
Figure BDA0003809400310000161
3.更新代谢物和输入参数。
根据测量值和估计值之间的不匹配更新代谢物的状态估计。将输入参数更新为当前测量值，并在采样间隔上使用零阶保持。
4.继续步骤2。
生长曲线受输入变量和代谢物轨迹的影响。除非另有说明，否则对生长曲线(例如VCD、Viab等)的估计不会因测量数据而调整。这些结果表明测量和预测的生长曲线(例如，VCD、Viab)之间有很好的一致性，表明混合模型准确地反映了生物反应器中细胞的行为。值得注意的是，混合模型考虑了预测的死亡和裂解细胞，这使得混合模型能够在比其他模型更长的时间尺度上准确地跟踪生物反应器。混合模型允许探索生物反应器系统上的各种参数，以确定单个参数变化如何影响生物过程。
图18示出了参数变化的另一示例。在此示例中，当葡萄糖等基质受到限制时，生长受到限制。这种效应可以通过将以下方程结合到动力学生长模型中来建模。
(25)ueff＝umaxθsubθquadθinh
(26)
Figure BDA0003809400310000171
其中sglu:1
图19示出了证明二次项对生长速率的影响的实验数据。当二次项偏离其最优值时，生长速率受到抑制。二次项包括温度、pH或其他因素。这种效应可以通过将以下方程结合到动力学生长模型中来建模。
(27)ueff＝umaxθsubθquadθcorr
(28)
Figure BDA0003809400310000172
其中θq，temp:20，和
θetemp，opt:36.8
图21是混合系统模型的操作流程图。在操作2110，测量生物系统的工艺条件和代谢物浓度作为时间的函数。在操作2120，确定生物系统的代谢率，包括代谢物的特定消耗率和代谢物的特定生产率。在操作2130，工艺条件和代谢率被提供给配置为预测生物材料的生产的混合系统模型，该混合系统模型包括配置为估计时间函数形式的细胞生长的动力学生长模型，以及代谢条件模型，其基于代谢物的特定消耗率或分泌速率选择工艺条件。其中代谢条件模型被配置为将生物系统分类为代谢状态。在操作2140，基于混合系统模型预测生物材料的量。
图22是配置混合系统模型的操作的流程图。在操作2210，获得实验数据，包括一个或者多个工艺条件，一个或者多个代谢物浓度，以及多个生物反应器批次的细胞数量。每个批次与特定的工艺条件的配置相关联。在操作2220，基于实验数据，使用混合系统模型的动力学模型，在最优条件下确定生长速率。在操作2230，基于所述最优条件下生长速率和来自实验数据的生长速率，使用动力学模型确定细胞裂解参数。在操作2240，确定代谢物的特定生产率或特定消耗率。在操作2250，确定抑制生长因子的动力学参数，以最小化所述最优条件下生长速率和来自实验数据的生长速率之间的差异。在操作2260，所确定的动力学参数、细胞裂解参数、生长速率和所述代谢物特定生产率或者特定消耗率被提供给混合系统模型的代谢条件模型，用于将生物系统分类为与所述生物系统生产的生物材料的给定生产率相关联的代谢状态，基于代谢物的所测量的特定消耗率或者所测量的分泌率。
基于混合模型，可以调整生物反应器的参数以优化滴度。这些技术与模拟、优化、过程监控(状态观察)兼容。
本申请提供的技术提供了准确模拟生物反应器中细胞行为的模型。如实验数据所示，预测的VCD和活力曲线与各种进料、pH和温度曲线的测量实验值相匹配。
此外，混合模型有效地充当细胞代谢和代谢物的软传感器，允许监测和表征代谢物的特定消耗和生产，以及监测和表征细胞状态和代谢活性的变化。
与不估计或以其他方式考虑裂解细胞的其他模型不同，混合模型考虑了影响大量流体毒性的裂解细胞的数量。这种方法允许混合模型比不考虑此特征的其他模型更准确，并且比其他模型在更长的时间尺度上。
混合模型的其他优点包括增加了对细胞代谢和驱动细胞生长、细胞死亡、活力、滴度和产品质量的因素的了解。混合模型还提供了模拟新工艺条件(例如，进料、温度、pH曲线等)性能的能力，以最大限度地提高生产率并观察细胞状态(例如，代谢活动等)或其变化。在其他方面，灌注性能可以从分批补料操作中预测。
这些技术提供改进的预测，改进的滴度预测，以及产品质量，基于监测和预测。本技术适用于广泛的应用领域，包括简易单变量代谢物状态预测器、综合性多变量代谢物状态预测器、实时系统(例如，数字孪生模拟)等。因此，本技术在生物反应器控制和生物制剂制造领域提供了改进。
继续参见图1，提供了可用于实现如本文所述的系统100的至少一部分的计算系统的示例性硬件配置。服务器系统10包括中央处理单元(central processing unit，CPU)16、系统存储器17、网络接口18和用户接口19。计算机的这些组件例如通过系统总线(未示出)彼此耦合。CPU16可以通过访问系统存储器17来执行算术、逻辑和/或控制操作。CPU 16可以包括可以执行并行处理的多个处理器(例如，核)，这可以导致计算系统100的更高性能。CPU16可以实现图1和图2以及其它附图中描述的示例性设备和/或系统的处理器、引擎和模块。系统存储器17可以存储与CPU 16结合使用的信息和/或指令。系统存储器17可以包括易失性和非易失性存储器，例如随机存取存储器(random access memory，RAM)和只读存储器(read only memory，ROM)。包含诸如在启动期间在服务器系统10内的元件之间传送信息的基本例程的基本输入/输出系统(basic input/output system，BIOS)，可以存储在存储器17(例如ROM)中。系统总线可以是多种类型的总线结构中的任何一种，包括存储器总线或存储器控制器、外围总线和使用多种总线架构中的任何一种的本地总线。该计算机可以包括用于通过网络(例如，网络45)与其他计算机(例如，客户端系统20)和/或设备通信的网络接口18。
此外，计算机可以包括用于读取和写入硬盘(未示出)的硬盘驱动器(hard diskdrive，HDD)，以及用于读取或写入可移动磁盘(未示出)的外部磁盘驱动器(未示出)。可移动盘可以是用于磁盘驱动器的磁盘或用于光盘驱动器的诸如CD ROM的光盘。HDD和外部磁盘驱动器分别通过HDD接口和外部磁盘驱动器接口连接到系统总线。驱动器及其相关的计算机可读介质为通用或专用计算机提供计算机可读指令、数据结构、程序模块和其他数据的非易失性存储。数据结构可以包括用于实施如本文所述的示例性方法及其变体的相关数据。相关数据可以组织在数据库中，例如关系数据库或对象数据库。
尽管本文描述的示例性环境采用硬盘(未示出)和外部磁盘(未示出)，但是本领域技术人员应当理解，可以存储计算机可访问的数据的其他类型的计算机可读介质在示例性操作环境中也可以使用诸如磁带盒、闪存卡、数字视频磁盘、随机存取存储器、只读存储器等。
许多程序模块可以存储在硬盘、外部磁盘、ROM或RAM上，包括操作系统(未示出)、一个或多个应用程序、其他程序模块(未示出)和定制软件(例如动力学生长模型50、代谢条件模型60、状态纠正模块75、过程监控引擎80、标记及警报引擎85、消耗率和分泌率模块90等)。应用程序可以包括上述功能的至少一部分。
作为使用如图1所示的服务器系统10的实施方案的补充或替代方案，这里描述的示例性实施例的部分或全部功能可以实现为一个或多个硬件电路。这种硬件电路的示例可以包括但不限于：大规模集成(Large Scale Integration，LSI)、精简指令集电路(ReducedInstruction Set Circuits，RISC)、专用集成电路(Application Specific IntegratedCircuit，ASIC)和现场可编程门阵列(Field Programmable Gate Array，FPGA)。
数据库30可以存储用于本文提供的技术的各种信息，例如训练数据32、工艺条件34和输出数据36，或由动力学及代谢状态观测系统在测试或真实环境中生成的任何其他数据。数据库系统30可以在服务器系统10和客户端系统20是本地或远程，并且可以通过任何合适的通信介质进行通信，例如局域网(local area network，LAN)、广域网(wide areanetwork，WAN)、因特网、内联网、硬线、无线链接等。
客户端系统20可以由任何合适的计算机系统实现，该计算机系统优选地配备有显示器或监视器、至少一个硬件处理器(例如，微处理器、控制器、中央处理单元(CPU)、GPU等)、一个或多个存储器和/或内部或外部网络接口或通信设备，例如调制解调器、网卡等)。该系统还可以包括可选的输入设备，例如键盘、鼠标或其他输入设备，以及任何商业可用的和定制的软件。例如，如图1所示，客户端包括至少一个CPU/处理器22、一个或多个存储器24、和/或内部或外部网络接口或通信设备26，例如调制解调器或网卡，以及用户接口28等。可选输入设备可能包括键盘、鼠标或其他输入设备。客户端系统20可以从用户请求信息以提供给服务器系统10。客户端系统可以呈现图形用户界面，例如GUI等，或其他界面，例如命令行提示、菜单屏幕等，以便从用户处获取信息以操作生物过程反应，并使用动力学及代谢状态观测系统监控生物过程反应。
本申请实施例可普遍适用于在任何上下文中提供支持，并且不限于任何特定应用领域，例如生物反应器制造、健康等。
本申请提供的描述是为了说明和描述的目的而呈现的，并不旨在穷举或受限于本文所公开的示例。在不脱离本文提供的技术的范围和精神的情况下，许多修改和变化对于本领域的普通技术人员将是显而易见的。选择所选择的示例是为了最好地解释设备的工作原理和组件，以使本领域的普通技术人员能够理解本文所设想的各种实施例。
动力学及代谢状态观测系统的各个方面在此描述中参考了方法、装置(系统)和计算机程序产品的流程图和/或框图。流程图和/或框图的每个块，以及流程图和/或框图中的块的组合，可以由计算机可读程序指令来实现。框图和/或流程图说明的每个块或其组合可以由基于专用软件的系统实现，该系统执行特定功能以执行本文公开的专用计算机指令的组合。
词汇表
Fb:细胞流失流速
Ff:含新鲜培养基的进料流速
Fh:收获流速
kd:无裂解细胞的死亡率
kl:死细胞向裂解细胞的转化率
kt:裂解细胞浓度引起的死亡率增值
IgG:生物材料，在此为一种免疫球蛋白
Figure BDA0003809400310000191
时间函数形式的生物材料变化率
Ii:抑制变量的数值，可以是代谢物或自变量
Figure BDA0003809400310000192
代谢物i的在时间间隔t＝k和t＝k+1之间快速或连续的进料增量
Figure BDA0003809400310000193
代谢物的变化率
mr，i:生物反应器中代谢物的浓度
mf，i:进料中代谢物的浓度
mi:给定代谢物
Qp:输入包含代谢物浓度m的函数
qi:二次变量的值，可能是代谢物或自变量
si:基质值，可能是代谢物或自变量
ud:细胞死亡率
u:自变量
umax:最大生长速率(最优条件下)
VCD:活细胞密度
iVCD:跨时间步长的集成VCD
V:生物反应器中材料的体积
Figure BDA0003809400310000201
活细胞密度随时间的变化
Figure BDA0003809400310000202
裂解细胞密度随时间的变化
Figure BDA0003809400310000203
死细胞密度随时间的变化
xt:总细胞密度
xv:活细胞密度
xd:死细胞密度
xl:裂解细胞密度
θi:与最优条件下的生长速率抑制相关的系数
θi，i:表示在其以上生长被抑制的抑制变量值的系数
θi，opt:表示生长最大化的二次变量的值的系数
θinh:生物材料过量引起的生长抑制
θq，i:代表生长抑制敏感度的系数
θquad:由于二次项(如温度、pH等)引起的生长速率减值
θs，i:代表在其以下生长被抑制的基质浓度的系数
θsub:基质耗尽引起的生长速率减值
θinh:人口密度
μeff:有效生长速率
δm，i(t):当前时刻代谢物的特定消耗率或分泌率

Claims (26)

1.一种方法，用于预测生物反应器中的生物系统产生或消耗的至少一种生物材料的量，其特征在于，所述方法包括：
测量生物系统的工艺条件和代谢物浓度随时间的变化；
确定所述生物系统的代谢率，包括代谢物的特定消耗率和代谢物的特定生产率；
提供所述工艺条件和所述代谢率给混合系统模型，所述混合系统模型配置为预测所述生物材料的生产，其中所述混合系统模型包括：动力学生长模型，配置为预测时间函数形式的细胞生长，和代谢条件模型，配置为基于代谢物的特定消耗率或者分泌率选择工艺条件，其中所述代谢条件模型还配置为将所述生物系统分类为代谢状态；以及
基于所述混合系统模型预测生物材料的量。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述动力学模型还配置为预测细胞活力。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述动力学模型还配置为参考裂解细胞。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：构建用于代谢物的代谢状态观测器用于提供所述生物系统的内部代谢状态的预测结果。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：
获得所述代谢物的当前测量结果；
使用所述代谢状态观测器来确定所述代谢物的消耗率；和
使用所述代谢状态观测器和所述当前测量结果来预测所述代谢物的未来浓度。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：使用所述代谢状态观测器来执行细胞状态分类以预测所述代谢物的特定消耗率或者特定生产率。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述预测的特定消耗率或者所述预测的特定生产率是使用训练数据确定。
8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：
分类所述内部代谢状态为用于生物材料生产的最优或者次优类别；和
当所述内部代谢状态被分类为次优类别时，发送通知给用户。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述动力学生长模型包括单体动力学模型或者饱和动力学模型。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：测量用于所述生物系统的时间函数形式的细胞密度或者细胞活力。
11.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述动力学生长模型还配置为预测时间函数形式的微生物细胞生长。
12.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述代谢条件模型包括以下一项或者多项：机器学习模型、深度学习模型、主成分分析PCA模型、偏最小二乘PLS模型、偏最小二乘判别分析PLS-DA模型和正交偏最小二乘判别分析OPLS-DA模型。
13.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：
从所述生物反应器获得测试样品；和
确定所述测试样品中的生物材料的量是否位于所述混合模型所预测的范围内。
14.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：当所述混合系统模型运行时更新所述混合系统模型的参数，其中所述参数包括与所述混合系统模型相关联的代谢率和系数。
15.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述工艺条件包括以下一项或者多项：pH、温度、溶解氧、渗透压、离开生物反应器的工艺流程、生长培养基、副产品、氨基酸、代谢物、氧气流量、氮气流量、二氧化碳流量、空气流量和搅拌速度。
16.根据权利要求15所述的方法，其特征在于，所述生长培养基包括具有氨基酸、糖类或有机酸的营养素。
17.权利要求15所述的方法，其特征在于，所述副产品包括氨基酸、糖类、有机酸或氨。
18.权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括以下至少之一：
基于所述混合系统模型确定用于所述生物反应器的最优工艺条件；
使用一个或者个传感器测量所述生物反应器的时间函数形式的实验性工艺条件；
监测所述测量的实验性工艺条件以检测与所述最优工艺条件的偏离；和
当检测到偏离，发送通知给用户。
19.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括以下至少之一：
基于所述混合系统模型确定用于所述生物反应器的最优工艺条件；
使用一个或者个传感器测量所述生物反应器的时间函数形式的实验性工艺条件；
监测所述测量的实验性工艺条件以检测与所述最优工艺条件的偏离；和
提供反馈给控制所述生物反应器的控制器从而自动化调整所述实验性工艺条件以最小化与所述最优工艺条件的偏离。
20.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：
模拟，使用所述混合系统模型，至少一种生物材料的预测量，其中所述混合系统模型使用所述工艺条件初始化；和
基于所述模拟确定所述生物系统的一个或者多个状态。
21.根据权利要求20所述的方法，其特征在于，所述模拟还包括：基于优化方法来调整所述工艺条件以确定优化预测轨迹、产品数量(滴度)和/或产品质量的工艺条件的配置。
22.一种方法，用于校准混合系统模型，所述混合系统模型用于预测生物反应器中的生物系统生产的生物材料，其特征在于，所述方法包括：
获得实验数据，包括一个或者多个工艺条件、一个或者多个代谢物浓度和多个生物反应器批次的细胞数量的测量结果，其中每个批次与工艺条件的给定配置相关联；
使用所述混合系统模型的动力学模型，基于所述实验数据，确定最优条件下生长速率；
使用所述动力学模型，基于所述最优条件下生长速率以及来自所述实验数据的生长速率，确定细胞裂解参数；
确定代谢物特定生产率或者特定消耗率；
确定抑制生长因子的动力学参数以便最小化所述最优条件下生长速率和来自所述实验数据的生长速率之间的差距；和
提供所述确定的动力学参数、所述细胞裂解参数、所述生长速率和所述代谢物特定生产率或者特定消耗率给所述混合系统模型的代谢条件模型用于分类所述生物系统为与所述生物系统生产的生物材料的给定生产率相关联的代谢状态，基于所述代谢物的所测量的特定消耗率或者所测量的分泌率。
23.根据权利要求22所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：
提供参数配置给优化模块，其中所述参数配置包括所述最优条件下生长速率、代谢物特定消耗率和特定生产率以及新工艺条件，以确定优化所述生物材料的生产的工艺条件。
24.根据权利要求22所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：使用主成分分析PCA监测所述生物反应器的批量属性。
25.根据权利要求22所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：使用偏最小二乘PLS预测所述生物反应器的输出。
26.根据权利要求25所述的方法，其特征在于，所述输出是所述生物材料的量。
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