CN115141845A - 一种用于治疗肺癌的rna质粒递送系统 - Google Patents

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Abstract

本申请提供一种用于治疗肺癌的RNA质粒递送系统。该系统包括质粒，所述质粒携带有能够治疗肺癌的RNA片段，所述质粒能够在宿主的器官组织中富集，并在所述宿主器官组织中内源性地自发形成含有所述RNA片段的复合结构，所述复合结构能够将所述RNA片段送入肺部，对肺癌进行治疗。本申请提供的用于治疗肺癌的RNA递送系统安全性和可靠性已被充分验证，成药性非常好、通用性强，具有极好的经济效益和应用前景。

Description

一种用于治疗肺癌的RNA质粒递送系统
技术领域
本申请涉及生物医学技术领域，特别涉及一种用于治疗肺癌的RNA质粒递送系统。
背景技术
肺癌是发病率和死亡率增长最快，对人群健康和生命威胁最大的恶性肿瘤之一。肺癌目前主要采用以下手段进行治疗：1、化学治疗：化疗是肺癌的主要治疗方法，90％以上的肺癌需要接受化疗治疗，化疗对小细胞肺癌的疗效无论早期或晚期均较肯定，甚至有约1％的早期小细胞肺癌通过化疗治愈。但化疗会抑制骨髓造血系统，主要是白细胞和血小板的下降。2、放射治疗：肺癌放疗照射野应包括原发灶、淋巴结转移的纵隔区，同时要辅以药物治疗。但放疗并发症较多，比如放射性肺炎、放射性食管炎、放射性肺纤维化和放射性脊髓炎等。3、外科治疗：其可以完全切除肺癌原发病灶及转移淋巴结，达到临床治愈；或切除肿瘤的绝大部分，为其他治疗创造有利条件，即减瘤手术；但外科治疗限制条件较多，无法大规模应用。
RNA干扰(RNAi)疗法自从被发明以来，一直被认为是治疗人类疾病的一种很有前途的策略，但在临床实践过程中遇到了许多问题，该疗法的发展进度远远落后于预期。
一般认为RNA无法在细胞外长期稳定存在，因为RNA会被细胞外富含的RNase降解成碎片，因此必须找到能够使RNA稳定存在于细胞外，并且能够靶向性地进入特定组织的方法，才能将RNAi疗法的效果凸显出来。
目前与siRNA相关的专利很多，主要聚焦在以下几个方面：1、设计具有医学效果的siRNA。2、对siRNA进行化学修饰，提高siRNA在生物体内的稳定性，提高产率。3、提高设计各种人工载体(如脂质纳米粒子、阳离子聚合物和病毒)，以提高siRNA在体内传递的效率。其中第3方面的专利很多，其根本原因是研究人员们已经意识到目前缺乏合适的siRNA传递系统，将siRNA安全地、精确地、高效地输送到目标组织，该问题已经成为制约RNAi疗法的核心问题。
公开号为CN108624590A的中国专利公开了一种能够抑制DDR2基因表达的siRNA；公开号为CN108624591A的中国专利公开了一种能够沉默ARPC4基因的siRNA，并且对该siRNA进行了α-磷-硒修饰；公开号为CN108546702A的中国专利公开了一种靶向长链非编码RNA DDX11-AS1的siRNA。公开号为CN106177990A的中国专利公开了一种可以用于多种肿瘤治疗的siRNA前体。这些专利均设计了特定的siRNA并且来针对某些由基因变化引起的疾病。
公开号为CN108250267A的中国专利公开了一种多肽、多肽-siRNA诱导共组装体，使用多肽作为siRNA的载体。公开号为CN108117585A的中国专利公开了一种靶向导入siRNA促进乳腺癌细胞凋亡的多肽，同样使用多肽作为siRNA的载体。公开号为CN108096583A的中国专利公开了一种纳米粒子载体，该载体在包含化疗药物的同时还可以装载具有乳腺癌疗效的siRNA。这些专利均为在siRNA载体方面的发明创造，但是其技术方案具有一个共同特征，那就是载体和siRNA均在体外预先组装，然后再引入宿主体内。事实上，目前绝大部分设计的传递技术均是如此。然而这类传递体系具有共同的问题，那就是这些人工合成的外源性传递体系很容易被宿主的循环系统清除，也有可能引起免疫原性反应，甚至可能对特定的细胞类型和组织有毒。
本发明的研究团队发现内源性细胞可以选择性地将miRNAs封装到外泌体(exosome)中，外泌体可以将miRNA传递到受体细胞中，其分泌的miRNA在相对较低的浓度下，即可有力阻断靶基因的表达。外泌体与宿主免疫系统生物相容，并具有在体内保护和运输miRNA跨越生物屏障的先天能力，因此成为克服与siRNA传递相关的问题的潜在解决方案。例如，公开号为CN110699382A的中国专利就公开了一种递送siRNA的外泌体的制备方法，公开了从血浆中分离外泌体，并将siRNA通过电穿孔的方式封装到外泌体中的技术。
但是这类在体外分离或制备外泌体的技术，往往需要通过细胞培养获取大量的外泌体，再加上siRNA封装的步骤，这使得大规模应用该产品的临床费用变得非常高，一般患者无法负担；更重要的是，外泌体复杂的生产/纯化过程，使其几乎不可能符合GMP标准。
到目前为止，以外泌体为有效成分的药物从未获得CFDA批准，其核心问题就是无法保证外泌体产品的一致性，而这一问题直接导致此类产品无法获得药品生产许可证。如果能解决这一问题，则对推动RNAi疗法治疗肺癌意义非凡。
因此，开发一个安全、精确和高效的siRNA传递系统是对提高RNAi治疗效果，推进RNAi疗法至关重要的一环。
发明内容
有鉴于此，本申请实施例提供了一种用于治疗肺癌的RNA质粒递送系统及其应用，以解决现有技术中存在的技术缺陷。
本申请的一个发明点为提供一种用于治疗肺癌的RNA质粒递送系统，该系统包括质粒，所述质粒携带有能够治疗肺癌的RNA片段，所述质粒能够在宿主的器官组织中富集，并在所述宿主器官组织中内源性地自发形成含有所述RNA片段的复合结构，所述复合结构能够将所述RNA片段送入肺部，对肺癌进行治疗。RNA片段送入肺部后，能够抑制与其相匹配的基因的表达，进而抑制肺癌的发展，实现肺癌的治疗。
可选地，所述RNA片段包含1个、两个或多个具有医疗意义的具体RNA序列，所述RNA序列是具有医学意义的、能够抑制或阻碍肺癌发展的siRNA、shRNA或miRNA。
可选地，所述质粒还包括启动子和靶向标签，所述靶向标签能够在宿主的器官组织中形成所述复合结构的靶向结构，所述靶向结构位于复合结构的表面，所述复合结构能够通过所述靶向结构寻找并结合目标组织，将所述RNA片段递送进入目标组织。
可选地，所述质粒包括以下任意一种线路或几种线路的组合：启动子-RNA片段、启动子-靶向标签、启动子-RNA片段-靶向标签；每一个所述质粒中至少包括一个RNA片段和一个靶向标签，所述RNA片段和靶向标签位于相同的线路中或位于不同的线路中。
可选地，所述质粒还包括能够使所述线路折叠成正确结构并表达的侧翼序列、补偿序列和loop序列，所述侧翼序列包括5’侧翼序列和3’侧翼序列；
所述质粒包括以下任意一种线路或几种线路的组合：5’-启动子-5’侧翼序列-RNA序列-loop序列-补偿序列-3’侧翼序列、5’-启动子-靶向标签或者5’-启动子-靶向标签-5’侧翼序列-RNA序列-loop序列-补偿序列-3’侧翼序列。
可选地，所述5’侧翼序列为ggatcctggaggcttgctgaaggctgtatgctgaattc或与其同源性大于80％的序列；
所述loop序列为gttttggccactgactgac或与其同源性大于80％的序列；
所述3’侧翼序列为accggtcaggacacaaggcctgttactagcactcacatggaacaaatggcccagatctggccgcactcgag或与其同源性大于80％的序列；
所述补偿序列为所述RNA片段的反向互补序列，并删除其中任意1-5位碱基。删除RNA反向互补序列的1-5位碱基的目的是使该序列不表达。
优选地，所述补偿序列为所述RNA片段的反向互补序列，并删除其中任意1-3位碱基。
更为优选地，所述补偿序列为所述RNA片段的反向互补序列，并删除其中任意1-3位连续排列的碱基。
最为优选地，所述补偿序列为所述RNA片段的反向互补序列，并删除其中的第9位和/或第10位碱基。
可选地，在质粒中存在至少两种线路的情况下，相邻的线路之间通过序列1-3(序列1-序列2-序列3)组成的序列相连；
其中，序列1为CAGATC，序列2是由5-80个碱基组成的序列，序列3为TGGATC。
可选地，在质粒中存在至少两种线路的情况下，相邻的线路之间通过序列4或与序列4同源性大于80％的序列相连；
其中，序列4为CAGATCTGGCCGCACTCGAGGTAGTGAGTCGACCAGTGGATC。
可选地，所述器官组织为肝脏，所述复合结构为外泌体。
可选地，所述靶向标签选自具有靶向功能的靶向肽或靶向蛋白。
可选地，所述靶向肽包括RVG靶向肽、GE11靶向肽、PTP靶向肽、TCP-1靶向肽、MSP靶向肽；
所述靶向蛋白包括RVG-LAMP2B融合蛋白、GE11-LAMP2B融合蛋白、PTP-LAMP2B融合蛋白、TCP-1-LAMP2B融合蛋白、MSP-LAMP2B融合蛋白。
可选地，所述RNA序列的长度为15-25个核苷酸。比如，所述RNA序列的长度可以为16、17、18、19、20、21、22、23、24、25个核苷酸。优选地，所述RNA序列的长度为18-22个核苷酸。
可选地，所述能够治疗肺癌的RNA选自以下RNA中的任意一种或几种：EGFR基因的siRNA、KRAS基因的siRNA，或与上述序列同源性大于80％的RNA序列，或编码上述RNA的核酸分子。需要说明的是，此处“编码上述RNA序列的核酸分子”中的RNA序列也同时包括每种RNA的同源性大于80％的RNA序列。
可选地，EGFR基因的siRNA包括UGUUGCUUCUCUUAAUUCCU、AAAUGAUCUUCAAAAGUGCCC、UCUUUAAGAAGGAAAGAUCAU、AAUAUUCGUAGCAUUUAUGGA、UAAAAAUCCUCACAUAUACUU、其他具有抑制EGFR基因表达的序列以及与上述序列同源性大于80％的序列。
KRAS基因的siRNA包括UGAUUUAGUAUUAUUUAUGGC、AAUUUGUUCUCUAUAAUGGUG、UAAUUUGUUCUCUAUAAUGGU、UUAUGUUUUCGAAUUUCUCGA、UGUAUUUACAUAAUUACACAC、其他具有抑制KRAS基因表达的序列以及与上述序列同源性大于80％的序列。
需要说明的是，以上所述的“同源性大于80％的序列”可以为同源性为85％、88％、90％、95％、98％等。
可选地，所述RNA片段包括RNA序列本体和对RNA序列本体进行核糖修饰得到的修饰RNA序列。即RNA片段既可以仅由至少一个RNA序列本体组成，也可以仅由至少一个修饰RNA序列组成，还可以由RNA序列本体与修饰RNA序列组成。
在本发明中，所述分离的核酸还包括其变体和衍生物。本领域的普通技术人员可以使用通用的方法对所述核酸进行修饰。修饰方式包括(但不限于)：甲基化修饰、烃基修饰、糖基化修饰(如2-甲氧基-糖基修饰、烃基-糖基修饰、糖环修饰等)、核酸化修饰、肽段修饰、脂类修饰、卤素修饰、核酸修饰(如“TT”修饰)等。在本发明的其中一种实施方式中，所述修饰为核苷酸间键合，例如选自：硫代磷酸酯、2'-O甲氧基乙基(MOE)、2'-氟、膦酸烷基酯、二硫代磷酸酯、烷基硫代膦酸酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯、碳酸酯、磷酸三酯、乙酰胺酯、羧甲基酯及其组合。在本发明的其中一种实施方式中，所述修饰为对核苷酸的修饰，例如选自：肽核酸(PNA)、锁核酸(LNA)、阿拉伯糖-核酸(FANA)、类似物、衍生物及其组合。优选的，所述修饰为2’氟嘧啶修饰。2’氟嘧啶修饰是将RNA上嘧啶核苷酸的2’-OH用2’-F替代，2’-F能够使RNA不易被体内的RNA酶识别，由此增加RNA片段在体内传输的稳定性。
可选地，所述递送系统为用于包括人在内的哺乳动物中的递送系统。
本申请还提供一种用于治疗肺癌的RNA递送系统在药物中的应用。
可选地，所述药物为治疗肺癌及其相关疾病的药物，这里的相关疾病指的是上述肺癌的形成或发展过程中出现的关联疾病或并发症、后遗症等，或与肺癌具有一定相关性的其他疾病。
可选地，所述药物为治疗肺癌及其相关疾病的药物，所述药物的给药方式包括口服、吸入、皮下注射、肌肉注射、静脉注射。
所述药物的剂型可以为片剂、胶囊剂、粉剂、颗粒剂、丸剂、栓剂、软膏剂、溶液剂、混悬剂、洗剂、凝胶剂、糊剂等。
可选地，所述药物的给药方式包括口服、吸入、皮下注射、肌肉注射、静脉注射。优选静脉注射。
本申请的技术效果为：
本申请提供的用于治疗肺癌的RNA递送系统以质粒作为载体，质粒作为成熟的注入物，其安全性和可靠性已被充分验证，成药性非常好。最终发挥效果的RNA序列由内源性外泌体包裹输送，不存在任何免疫反应，无需验证该外泌体的安全性。该递送系统可以递送各类小分子RNA，通用性强。并且质粒的制备要比外泌体或是蛋白质、多肽等物质的制备便宜地多，经济性好。本申请提供的用于治疗肺癌的RNA递送系统在体内自组装后能够与AGO2紧密结合并富集为复合结构(外泌体)，不仅能防止其过早降解，维持其在循环中的稳定性，而且有利于受体细胞吸收、胞浆内释放和溶酶体逃逸，所需剂量低。
本申请提供的用于治疗肺癌的RNA递送系统应用于药物中，即提供了一个药物递送平台，可以大大提高肺癌治疗效果，还可以通过该平台形成更多RNA类药物的研发基础，对RNA类药物研发和使用具有极大的推动作用。
附图说明
图1是本申请一实施例提供的小鼠体内质粒分布与代谢情况对比图；
图2是本申请一实施例提供的小鼠体内蛋白表达水平对比图；
图3是本申请一实施例提供的小鼠体内相关siRNA水平对比图；
图4是本申请一实施例提供的小鼠各组织中绝对siRNA水平对比图；
图5是本申请一实施例提供的质粒剂量对小鼠siRNA水平的影响对比图；
图6是本申请一实施例提供的注射质粒后的小鼠肝脏内前体及成熟体的代谢情况对比图；
图7是本申请一实施例提供的小鼠不同组织中siRNA动力学和分布情况对比图；
图8是本申请一实施例提供的不同启动子对siRNA的影响对比图；
图9是本申请一实施例提供的小鼠不同组织中eGFP荧光强度对比图；
图10是本申请一实施例提供的小鼠谷丙转氨酶、谷草转氨酶、总胆红素、血尿素氮、血清碱性磷酸酶、肌酐含量以及胸腺重量、脾脏重量、外周血细胞百分比对比图；
图11是本申请一实施例提供的小鼠EGFR突变肺癌肿瘤治疗效果对比图；
图12是本申请一实施例提供的小鼠HE染色图、免疫组织染色图以及着色情况统计图；
图13是本申请一实施例提供的小鼠KRAS突变肺癌肿瘤治疗效果对比图；
图14是本申请一实施例提供的小鼠HE染色图、免疫组织染色图以及着色情况统计图。
图15是本申请一实施例提供的6种不同RNA的质粒治疗肺癌后的荧光信号统计，图中A为CMV-siRE和Albumin-siRE的荧光检测结果，B为CMV-siRT和Albumin-siRT的荧光检测结果，C为CMV-miR7和Albumin-miR7的荧光检测结果，D为CMV-shRE和Albumin-shRE的荧光检测结果，E为CMV-shRT和Albumin-shRT的荧光检测结果，F为CMV-miR133b和Albumin-miR133b的荧光检测结果。
图16是本申请一实施例提供的6种RNA中任意2种RNA序列组成的4组质粒治疗肺癌后的荧光信号统计，均是以CMV或Albumin连接RNA，图中A为siRE+shRT的荧光检测结果，B为shRE+miR133b的荧光检测结果，C为siRT+miR7的荧光检测结果，D为shRT+miR133b的荧光检测结果。
图17是本申请一实施例提供的6种RNA中任意3种RNA序列组成的3组质粒治疗肺癌后的荧光信号统计，均是以CMV或Albumin连接RNA，图中A为siRE+shRT+miR7的荧光检测结果，B为siRT+shRE+miR7的荧光检测结果，C为shRE+siRT+miR133b的荧光检测结果。
图18是本申请一实施例提供的分别静脉注射质粒CMV-siRE和质粒CMV-GE11-siRE后siRNA在肝、肺、血浆、外泌体中的富集结果，图中A为有/无靶向肽GE11的情况下在肝、肺中的EGFR siRNA含量，B为有/无靶向肽GE11的情况下在血浆、外泌体中的EGFR siRNA含量。
图19是本申请一实施例提供的分别静脉注射质粒CMV-siRE和质粒CMV-GE11-siRE后EGFR蛋白及mRNA的表达量检测结果，图中A为有/无靶向肽GE11的情况下检测EGFR的蛋白含量，B为有/无靶向肽GE11的情况下检测EGFR的mRNA含量。
图20是本申请一实施例提供的含有5’侧翼序列同源性大于80％的序列的质粒在肺部富集效果以及治疗效果，图中A为有/无靶向标签RVG的情况下2条5’侧翼同源序列的EGFR siRNA含量，B为有/无靶向标签RVG的情况下1条5’侧翼同源序列的荧光信号检测结果，C为有/无靶向标签RVG的情况下另1条5’侧翼同源序列的荧光信号检测结果。
图21是本申请一实施例提供的含有loop序列同源性大于80％的序列的质粒在肺部富集效果以及治疗效果，图中A为有/无靶向标签RVG的情况下2条loop同源序列的EGFRsiRNA含量，B为有/无靶向标签RVG的情况下1条loop同源序列的荧光信号检测结果，C为有/无靶向标签RVG的情况下另1条loop同源序列的荧光信号检测结果。
图22是本申请一实施例提供的含有3’侧翼序列同源性大于80％的序列的质粒在肺部富集效果以及治疗效果，图中A为有/无靶向标签RVG的情况下2条3’侧翼同源序列的EGFR siRNA含量，B为有/无靶向标签RVG的情况下1条3’侧翼同源序列的荧光信号检测结果，C为有/无靶向标签RVG的情况下另1条3’侧翼同源序列的荧光信号检测结果。
图23是本申请一实施例提供的分别含有序列4以及2条与序列4同源性大于80％的序列4-1、4-2的质粒静脉注射9小时后肺部组织的EGFR siRNA含量检测结果，RNA为siRE/siRT，图中A为序列4的EGFR siRNA含量检测结果，B为序列4-1的EGFR siRNA含量检测结果，C为序列4-2的EGFR siRNA含量检测结果。
图24是本申请一实施例提供的分别含有长度为18、20、22的RNA序列的3种质粒静脉注射后EGFR表达量检测，图中A为EGFR的蛋白含量检测结果，B为EGFR的mRNA含量检测结果。
具体实施方式
下面结合附图对本申请的具体实施方式进行描述。
首先，对本发明涉及到的专业名词、试验方法等进行解释说明。
苏木精-伊红染色法(hematoxylin-eosin staining)，简称HE染色。HE染色是组织学、病理学教学与科研中最基础、使用最广泛的技术方法之一。
苏木精染液为碱性，可以将组织的嗜碱性结构(如核糖体、细胞核及细胞质中的核糖核酸等)染成蓝紫色；伊红为酸性染料，可以将组织的嗜酸性结构(如细胞内及细胞间的蛋白质，包括路易体、酒精小体以及细胞质的大部分)染成粉红色，使整个细胞组织的形态清晰可见。
HE染色的具体步骤包括：样本组织固定与切片；组织样本脱蜡；组织样本水化；组织切片苏木素染色、分化与反蓝；组织切片伊红染色与脱水；组织样本切片风干封片；最后在显微镜下观察并拍照。
Masson染色使胶原纤维呈蓝色(被苯胺蓝所染)或绿色(被亮绿所染)，肌纤维呈红色(被酸性品红和丽春红所染)，这与阴离子染料分子的大小和组织的渗透性有关。已固定的组织用一系列阴离子水溶性染料先后或混合染色，则可发现红细胞被最小分子的阴离子染料着染，肌纤维与胞质被中等大小的阴离子染料着染，而胶原纤维则被大分子的阴离子染料着染。由此说明了红细胞对阴离子染料的渗透性最小，肌纤维与胞质次之，而胶原纤维具有最大的渗透性。I型、III型胶原呈绿色(GBM、TBM、系膜基质及肾间质呈绿色)，嗜复红蛋白、肾小管胞质、红细胞呈红色。
Masson染色的具体步骤包括：
组织固定于Bouin氏液，流水冲洗一晚，常规脱水包埋；切片脱蜡至水(二甲苯中脱蜡10min×3次，用吸水纸吸干液体；100％乙醇5min×2次，用吸水纸吸干液体；95％乙醇5min×2次，用吸水纸吸干液体；流水2min，用吸水纸吸干水分)；Weiger氏铁苏木素染5-10min；流水稍洗；0.5％盐酸酒精分化15s；流水冲洗3min；丽春红酸性品红液染8min；蒸馏水稍冲洗；1％磷钼酸水溶液处理约5min；不用水洗，直接用苯胺蓝液或亮绿液复染5min；1％冰醋酸处理1min；95％乙醇脱水5min×2次，用吸水纸吸干液体；100％乙醇5min×2次，用吸水纸吸干液体；二甲苯中透明5min×2次，用吸水纸吸干液体；中性树胶封片。
Western免疫印迹(Western Blot)是将蛋白质转移到膜上,然后利用抗体进行检测.对已知表达蛋白,可用相应抗体作为一抗进行检测,对新基因的表达产物,可通过融合部分的抗体检测。
Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体(例如硝酸纤维素薄膜)上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质,且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变，以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。其步骤主要包括：提取蛋白、蛋白定量、制胶和电泳、转膜、免疫标记及显影。
免疫组化，应用抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂(荧光素、酶、金属离子、同位素)显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及相对定量的研究，称为免疫组织化学技术(immunohistochemistry)或免疫细胞化学技术(immunocytochemistry)。
免疫组化的主要步骤包括：切片浸泡、过夜晾干、二甲苯脱蜡、梯度酒精脱蜡(100％、95％、90％、80％、75％、70％、50％，每次3min)、双蒸水、滴加3％过氧化氢溶液去除过氧化氢酶、水洗、抗原修复、滴加5％BSA、封闭1h、稀释一抗、PBS缓冲液清洗、孵二抗、PBS缓冲液清洗、显色液显色、水洗、苏木精染色、梯度乙醇脱水、中性树胶封片。
本发明中涉及到的siRNA水平、蛋白含量和mRNA含量的检测，均是通过向小鼠体内注射RNA递送系统，建立了小鼠干细胞体外模型。利用qRT-PCR检测细胞、组织中mRNA和siRNA表达水平。对于siRNA的绝对定量利用标准品绘制标准曲线的方式进行确定。每个siRNA或mRNA相对于内参的表达量可以用2-ΔCT表示，其中ΔCT＝C样品-C内参。扩增siRNA时内参基因为U6 snRNA(组织中)或miR-16(血清、外泌体中)分子，扩增mRNA时基因为GAPDH或18s RNA。利用Western blotting实验检测细胞、组织中蛋白质的表达水平，用ImageJ软件进行蛋白定量分析。
在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的试剂、材料和操作步骤均为相应领域内广泛使用的试剂、材料和常规步骤。
实施例1
本实施例提供一种用于治疗肺癌的RNA质粒递送系统，该系统包括质粒，所述质粒携带有能够治疗肺癌的RNA片段，所述质粒能够在宿主的器官组织中富集，并在所述宿主器官组织中内源性地自发形成含有所述RNA片段的复合结构，所述复合结构能够将所述RNA片段送入肺部，对肺癌进行治疗。
在本实施例中，质粒还包括启动子和靶向标签。所述质粒包括以下任意一种线路或几种线路的组合：启动子-RNA序列、启动子-靶向标签、启动子-RNA序列-靶向标签，每一个所述质粒中至少包括一个RNA片段和一个靶向标签，所述RNA片段和靶向标签位于相同的线路中或位于不同的线路中。换而言之，质粒中可以仅包括启动子-RNA序列-靶向标签，也可以包括启动子-RNA序列、启动子-靶向标签的组合，或是启动子-靶向标签、启动子-RNA序列-靶向标签的组合。
进一步地，所述质粒还可以包括能够使所述线路折叠成正确结构并表达的侧翼序列、补偿序列和loop序列，所述侧翼序列包括5’侧翼序列和3’侧翼序列；所述质粒包括以下任意一种线路或几种线路的组合：5’-启动子-5’侧翼序列-RNA序列-loop序列-补偿序列-3’侧翼序列、5’-启动子-靶向标签、5’-启动子-靶向标签-5’侧翼序列-RNA序列-loop序列-补偿序列-3’侧翼序列。
见图18-19，5’-启动子-5’侧翼序列-RNA序列-loop序列-补偿序列-3’侧翼序列对应质粒名称为CMV-siRE，5’-启动子-靶向标签-5’侧翼序列-RNA序列-loop序列-补偿序列-3’侧翼对应质粒名称为CMV-GE11-siRE，图18为静脉注射后siRNA在肝、肺、血浆、外泌体中的富集结果，图19为静脉注射上述质粒后EGFR蛋白及mRNA的表达量检测结果。
其中，所述5’侧翼序列优选为ggatcctggaggcttgctgaaggctgtatgctgaattc或与其同源性大于80％的序列，包括与ggatcctggaggcttgctgaaggctgtatgctgaattc同源性为85％、90％、92％、95％、98％、99％的序列等。
所述loop序列优选为gttttggccactgactgac或与其同源性大于80％的序列，包括与gttttggccactgactgac同源性为85％、90％、92％、95％、98％、99％的序列等。
所述3’侧翼序列优选为accggtcaggacacaaggcctgttactagcactcacatggaacaaatggcccagatctggccgcactcgag或与其同源性大于80％的序列，包括与accggtcaggacacaaggcctgttactagcactcacatggaacaaatggcccagatctggccgcactcgag同源性为85％、90％、92％、95％、98％、99％的序列等。
所述补偿序列为所述RNA片段的反向互补序列，并删除其中任意1-5位碱基。在RNA片段中仅包含一个RNA序列时，所述补偿序列可以为该RNA序列的删除其中任意1-5位碱基的反向互补序列。
优选地，所述补偿序列为所述RNA片段的反向互补序列，并删除其中任意1-3位碱基。在RNA片段中仅包含一个RNA序列时，所述补偿序列可以为该RNA序列的删除其中任意1-3位碱基的反向互补序列。
更为优选地，所述补偿序列为所述RNA片段的反向互补序列，并删除其中任意1-3位连续排列的碱基。在RNA片段中仅包含一个RNA序列时，所述补偿序列可以为该RNA序列的删除其中任意1-3位连续排列的碱基的反向互补序列。
最为优选地，所述补偿序列为所述RNA片段的反向互补序列，并删除其中的第9位和/或第10位碱基。在RNA片段中仅包含一个RNA序列时，所述补偿序列可以为该RNA序列的删除其中第9位和/或第10位的反向互补序列。删除第9位和第10位碱基效果最优。
需要说明的是，上述侧翼序列、补偿序列、loop序列均不是随意选择的，而是基于大量的理论研究和试验确定的，在上述特定侧翼序列、补偿序列、loop序列的配合下，能够最大程度的提高RNA片段的表达率。
见图20-22，图20为含有5’侧翼序列同源性大于80％的序列的质粒在肺部富集效果以及治疗效果，图21为含有loop序列同源性大于80％的序列的质粒在肺部富集效果以及治疗效果，图22为含有3’侧翼序列同源性大于80％的序列的质粒在肺部富集效果以及治疗效果。
图20-22中所给出的任选的2条5’侧翼同源序列、2条loop同源序列和2条3’侧翼同源序列具体如下
表1所示。
名称 序列
5flank1 ggataatggaggcttgctgcaggctgtatgctgaattc
5flank2 ggatactggacgcttgcttaaggctgtatggtgaattc
Loop1 gacttggccactgactgac
Loop2 gttttggccactggctgtc
3flank1 agccgtcaggacatgaggcctgttactagcactcacgtggctcaaatggcagagatctggctacactccag
3flank2 actggtcacgacacaaggcctattactagcagtcacattgaacaaatggccaagatctcgccgcactgtag
在质粒携带两个或多个线路的情况下，相邻的线路之间可以通过序列1-序列2-序列3相连；其中，序列1优选为CAGATC，序列2可以为由5-80个碱基组成的序列，比如10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、55个、60个、65个、70个、75个碱基组成的序列均可，优选为10-50个碱基组成的序列，更优选为20-40个碱基组成的序列，序列3优选为TGGATC。
序列2具体如下表2所示。
Figure BDA0003572355350000081
Figure BDA0003572355350000091
更为优选地，在质粒携带两个或多个线路的情况下，相邻的线路之间通过序列4或与序列4同源性大于80％的序列相连；其中，序列4为CAGATCTGGCCGCACTCGAGGTAGTGAGTCGACCAGTGGATC。
见图23，图为序列4以及2条与序列4同源性大于80％的序列4-1、4-2静脉注射9小时后肺部组织的EGFR siRNA含量检测结果。
序列4具体如下表3所示。
名称 序列
序列4 CAGATCTGGCCGCACTCGAGGTAGTGAGTCGACCAGTGGATC
序列4-1 CAGAAGATGCCGCACTCGAGGTAGTCCTTCGACCAGTGGATC
序列4-2 CAGATCCCGCCGCACTCAATGAAGTGAGTCGACCAGTGGATC
以上所述的RNA片段包含1个、两个或多个具有医疗意义的具体RNA序列，所述RNA序列能够在目标受体中被表达，所述补偿序列在目标受体中不能被表达。RNA序列可以为siRNA序列、shRNA序列或miRNA序列，优选为siRNA序列。
一个RNA序列的长度为15-25个核苷酸(nt)，优选为18-22nt，比如18nt、19nt、20nt、21nt、22nt均可。此序列长度的范围并不是随意选择的，而是经过反复的试验后确定的。大量试验证明，在RNA序列的长度小于18nt，特别是小于15nt的情况下，该RNA序列大多无效，不会发挥作用，而在RNA序列的长度大于22nt，特别是大于25nt的情况下，则不仅线路的成本大大提高，而且效果也并未优于长度为18-22nt的RNA序列，经济效益差。因此，在RNA序列的长度为15-25nt，特别是18-22nt时，能够兼顾成本与作用的发挥，效果最好。
见图24，RNA序列长度分别为18、20、22的质粒分别对应CMV-siRE(18)、CMV-siRE(20)、CMV-siRE(22)，图24为上述3种质粒静脉注射后EGFR表达量检测。
不同长度序列具体如下表4所示。
名称 序列
siRE(18) ACCTATTCCGTTACACACT
siRE(20) ATACCTATTCCGTTACACAC
siRE(22) ATACCTATTCCGTTACACACTT
所述能够治疗肺癌的RNA选自以下RNA中的任意一种或几种：EGFR基因的siRNA、KRAS基因的siRNA或编码上述RNA的核酸分子。
能够治疗肺癌的RNA有效序列的数量为1条、2条或多条。比如可以在同一个质粒载体上联合使用EGFR基因的siRNA和KRAS基因的siRNA，也可以单独使用EGFR基因的siRNA或KRAS基因的siRNA。
以在同一个质粒载体上联合使用“siRNA1”和“siRNA2”为例，该质粒载体的功能结构区可以表示为：(启动子-siRNA1)-连接序列-(启动子-siRNA2)-连接序列-(启动子-靶向标签)，或(启动子-靶向标签-siRNA1)-连接序列-(启动子-靶向标签-siRNA2)，或(启动子-siRNA1)-连接序列-(启动子-靶向标签-siRNA2)等。
更加具体地，该质粒载体的功能结构区可以表示为：(5’-启动子-5’侧翼序列-siRNA1-loop序列-补偿序列-3’侧翼序列)-连接序列-(5’-启动子-5’侧翼序列-siRNA2-loop序列-补偿序列-3’侧翼序列)-连接序列-(5’-启动子-靶向标签)，或(5’-启动子-靶向标签-5’侧翼序列-siRNA1-loop序列-补偿序列-3’侧翼序列)-连接序列-(5’-启动子-靶向标签-5’侧翼序列-siRNA2-loop序列-补偿序列-3’侧翼序列)，或(5’-启动子-5’侧翼序列-siRNA1-loop序列-补偿序列-3’侧翼序列)-连接序列-(5’-启动子-靶向标签-5’侧翼序列-siRNA2-loop序列-补偿序列-3’侧翼序列)、(5’-启动子-靶向标签-5’侧翼序列-siRNA1-siRNA2-loop序列-补偿序列-3’侧翼序列)等。其他情况均可以此类推，在此不再赘述。以上连接序列可以为“序列1-序列2-序列3”或“序列4”，一个括号表示一个完整的线路(circuit)。
优选地，上述RNA还可以通过对其中的RNA序列(siRNA、shRNA或miRNA)进行核糖修饰得到，优选2’氟嘧啶修饰。2’氟嘧啶修饰是将siRNA、shRNA或miRNA上嘧啶核苷酸的2’-OH用2’-F替代，2’-F能够使人体内的RNA酶不易识别siRNA、shRNA或miRNA，如此能够增加RNA在体内传输的稳定性。
具体地，肝脏会吞噬外源性的质粒，高达99％的外源性质粒会进入肝脏，因此当以质粒作为载体时并不需要做特异性设计即可在肝脏组织中富集，随后外源性质粒被打开，释放出RNA分子(siRNA、shRNA或miRNA)，肝脏组织自发地将上述RNA分子包裹进外泌体内部，这些外泌体就变成了RNA输送机构。
优选地，为了使该RNA输送机构(外泌体)具有“精确制导”的能力，在注入体内的质粒中我们设计了靶向标签，该靶向标签也会被肝脏组织组装到外泌体中，尤其是当选择某些特定的靶向标签时，靶向标签能够被插入外泌体表面，从而成为能够引导外泌体的靶向结构，这就大大提高了本发明所述的RNA输送机构的精准性，一方面可以使所需引入的外源性质粒的用量大大减少，另一方面还大大提高了潜在药物递送的效率。
靶向标签选自具有靶向功能的肽、蛋白质或抗体中的一种，靶向标签的选择是需要创造性劳动的过程，一方面需要根据目标组织选取可用的靶向标签，另一方面还需要保证该靶向标签能够在稳定地出现在外泌体的表面，从而达到靶向功能。目前已经筛选出的靶向肽包括但不限于RVG靶向肽(核苷酸序列如SEQ ID No：1所示)、GE11靶向肽(核苷酸序列如SEQ ID No：2所示)、PTP靶向肽(核苷酸序列如SEQ ID No：3所示)、TCP-1靶向肽(核苷酸序列如SEQ ID No：4所示)、MSP靶向肽(核苷酸序列如SEQ ID No：5所示)；靶向蛋白包括但不限于RVG-LAMP2B融合蛋白(核苷酸序列如SEQ ID No：6所示)、GE11-LAMP2B融合蛋白(核苷酸序列如SEQ ID No：7所示)、PTP-LAMP2B融合蛋白(核苷酸序列如SEQ ID No：8所示)、TCP-1-LAMP2B融合蛋白(核苷酸序列如SEQ ID No：9所示)、MSP-LAMP2B融合蛋白(核苷酸序列如SEQ ID No：10所示)。优选采用GE11靶向肽、GE11-LAMP2B融合蛋白。
此外，为了达到精准递送的目的，我们实验了多种质粒载体搭载的方案，得出另一优化的方案：所述质粒载体还可以由具有不同结构的多种质粒构成，其中一种质粒包含启动子和靶向标签，其他质粒包含启动子和RNA片段。即将靶向标签与RNA片段装载到不同的质粒载体中，将两种质粒载体注入体内，其靶向效果不差于将相同的靶向标签与RNA片段装载在一个质粒载体中产生的靶向效果。
更优选地，两种不同的质粒载体注入宿主体内时，可以先将装有RNA序列的质粒载体注入，在1-2小时后再注入含有靶向标签的质粒载体，如此能够达到更优的靶向效果。
以上所述的递送系统均可用于包括人在内的哺乳动物。
如图1A所示，为了了解质粒在体内的分布情况，我们对小鼠进行了平板试验，对小鼠注射质粒后按时间点(1h、3h、6h、9h、12h、24h、72h、168h、720h)取样，采用大观霉素提取的质粒进行转化，观测肝脏、血浆、肺、大脑、肾脏、脾脏中克隆体的数量，结果如图1B、图1C、图1D所示，可以看出，质粒在小鼠肝脏中分布最多，并且在注射后3h左右达到峰值，注射后12h已基本代谢。
向C57BL/6J小鼠静脉注射共表达eGFP蛋白和EGFR siRNA的CMV eGFP siREcircuit，结果如图2所示，随着时间的推移，小鼠肝脏内eGFP荧光逐渐增强，约12小时达到峰值，48小时降至背景水平，其他组织未见明显的eGFP信号。
分别向小鼠注射对照质粒(CMV-scrR)、表达EGFR siRNA的质粒(CMV-siRE)，并建立小鼠肝细胞体外模型，分别检测注射CMV-scrR和CMV-siRE的小鼠肝细胞外泌体中相关siRNA水平，结果如图3A所示，可见在注射CMV-siRE的小鼠肝细胞外泌体中存在siRNA的表达。
我们通常认为与Ago2蛋白结合是siRNA发挥功能的必要条件，即外泌体中的siRNA可以与Ago2蛋白结合，因此我们进行Ago2免疫沉淀实验，结果如图3B、图3C所示。其中，Input代表不经过免疫沉淀，直接将外泌体裂解并进行检测的样品，代表阳性对照。
对小鼠静脉注射质粒后，成熟siRNA在不同组织中的分布如图4所示。从图4A可以看出，血浆、外泌体、无外泌体的血浆中EGFR-siRNA水平呈时间依赖性变化；从图4B可以看出，小鼠EGFR-siRNA在肝、肺、胰腺、脾脏、肾脏中的积累具有时间依赖性。
分别对小鼠注射对照质粒(CMV-scrR)、0.05mg/kg的CMV-siRE质粒、0.5mg/kg的CMV-siRE质粒、5mg/kg的CMV-siRE质粒，检测小鼠肝脏、脾脏、心脏、肺、肾脏、胰腺、脑、骨骼肌、CD4+细胞中绝对siRNA(EGFR siRNA)水平，结果如图5A所示，可以看出，注射对照质粒的小鼠组织中无siRNA的表达，注射CMV-siRE质粒的小鼠各组织中，siRNA表达的水平与CMV-siRE质粒浓度呈正相关。如图5B所示，荧光原位杂交试验(FISH)同样证实了siRNA表达的水平与CMV-siRE质粒浓度呈正相关，即EGFR siRNA的组织分布具有剂量依赖性。
由于质粒进入体内后，会表达前体(Precursor)，再加工成成熟体(siRNA)，故我们对小鼠注射质粒之后肝脏中前体(Precursor)和成熟体(siRNA)的代谢情况进行了检测，结果如图6所示。可以看出，在注射质粒后6个小时的时间节点，小鼠肝脏中前体(Precursor)和成熟体(siRNA)的表达水平达到峰值，在注射质粒后36个小时，小鼠肝脏中的成熟体(siRNA)代谢完成，在注射质粒后48个小时，小鼠肝脏中前体(Precursor)代谢完成。
对小鼠进行胆总管注射外源性siRNA后分别检测小鼠无外泌体血浆(exosome-free)、外泌体(exosome)、血浆中绝对siRNA水平，结果如图7A所示。对小鼠进行胆总管注射外源性siRNA后分别检测小鼠脾脏、心脏、肺、肾脏、胰腺、脑、骨骼肌、CD4+细胞中siRNA的水平，结果如图7B所示。这两张图反映出siRNA在不同组织中动力学几乎相同，在不同组织中siRNA的分布有显著差别。
分别向小鼠体内静脉注射以白蛋白ALB为启动子的siRNA、以CMV为启动子的siRNA、不含任何启动子的siRNA，在注射后0h、3h、6h、9h、12h、24h、36h、48h分别检测小鼠体内的绝对siRNA水平，结果如图8所示。可见，小鼠体内以CMV为启动子的siRNA的水平最高，即以CMV作为启动子效果最优。
我们通过荧光试验观察自组装的eGFP siRNA对小鼠体内eGFP水平的抑制，过程如下：对eGFP转基因小鼠静脉注射PBS或5mg/kg CMV-siRG或CMV-RVG-siRG质粒，治疗24小时后处死小鼠，在冷冻切片中检测其eGFP荧光水平，图9A所示为具有代表性的荧光显微镜图像，其中绿色表示阳性eGFP信号，蓝色显表示DAPI染色的细胞核，比例尺：100μm，可见CMV-RVG-siRG质粒对小鼠eGFP的抑制效果更为明显；对eGFP转基因小鼠静脉注射PBS或CMV-scrR或CMV-siRE质粒，治疗24小时后处死小鼠，在冷冻切片中检测其eGFP荧光水平，图9B为注射PBS、CMV-siRE、CMV-RVG-siRE的小鼠心脏、肺、肾脏、胰腺、脑、骨骼肌的荧光强度(Fluorescence intensity)柱形对比图，可见，在肝脏、脾脏、肺、肾脏部位小鼠荧光强度对比更为明显。
分别对于注射PBS、CMV-scrR、CMV-siRE的小鼠其谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、总胆红素(TBIL)、血尿素氮(BUN)、血清碱性磷酸酶(ALP)、肌酐(CREA)含量以及胸腺重量、脾脏重量、外周血细胞百分比(percentage peripheral blood cells)进行检测，结果如图10所示，图10A-F为分别注射PBS、小鼠CMV-scrR、CMV-siRE的谷丙转氨酶、谷草转氨酶、总胆红素、血尿素氮、血清碱性磷酸酶、肌酐含量对比图，图10G为小鼠肝脏、肺、脾脏、肾脏组织对比图，图10H-I为小鼠胸腺、脾脏组织对比图，图10J为小鼠外周血细胞百分比(percentage in peripheral blood cells)对比图。
结果显示注射PBS、CMV-scrR、CMV-siRE的小鼠ALT、AST等含量以及胸腺重量、脾脏重量、外周血细胞百分比均相差无几，注射CMV-siRE的小鼠与注射PBS的小鼠相比，其肝脏、肺、脾脏、肾脏也无组织损伤。
以上试验足以说明，本实施例提供的用于治疗肺癌的RNA递送系统以质粒作为载体，质粒作为成熟的注入物，其安全性和可靠性已被充分验证，成药性非常好。最终发挥效果的RNA序列由内源性外泌体包裹输送，不存在任何免疫反应，无需验证该外泌体的安全性。该递送系统可以递送各类小分子RNA，通用性强。并且质粒的制备要比外泌体或是蛋白质、多肽等物质的制备便宜地多，经济性好。本实施例提供的用于治疗肺癌的RNA递送系统在体内自组装后能够与AGO2紧密结合并富集为复合结构(外泌体)，不仅能防止其过早降解，维持其在循环中的稳定性，而且有利于受体细胞吸收、胞浆内释放和溶酶体逃逸，所需剂量低。
实施例2
在实施例1的基础上，本实施例提供一种药物。该药物包括质粒，所述质粒携带能够治疗肺癌的RNA，所述质粒能够在宿主的器官组织中富集，并在所述宿主器官组织中内源性地自发形成含有能够治疗肺癌的RNA的并具有靶向结构的复合结构，所述复合结构通过靶向结构将能够治疗肺癌的RNA送入肺部，对肺癌进行治疗。
进一步地，所述能够治疗肺癌的RNA是具有医学意义的、能够抑制或阻碍肺癌发展的siRNA、shRNA和miRNA中的一种或多种。
见图15-17，图15是提供的6种不同RNA的质粒治疗肺癌后的荧光信号统计，6种RNA分别为：siRE(靶基因为EGFR)、siRT(靶基因为TNC)、shRE(靶基因为EGFR)、shRT(靶基因为TNC)、miR-7(靶基因为EGFR)、miR-133b(靶基因为EGFR)；图16是以上提供的6种RNA中任意2种RNA序列组成的4组质粒治疗肺癌后的荧光信号统计；图17是以上提供的6种RNA中任意3种RNA序列组成的3组质粒治疗肺癌后的荧光信号统计。
具体序列(前体)如下表5所示。
Figure BDA0003572355350000121
Figure BDA0003572355350000131
进一步地，所述质粒包括启动子序列和所需递送的RNA序列。
进一步地，所述质粒还包括靶向标签，所述靶向标签在宿主的器官组织中形成所述复合结构的靶向结构。
进一步地，所述质粒的功能结构区按以下顺序中的任一种排列：5’-启动子-5’侧翼序列-RNA序列-loop序列-补偿序列-3’侧翼序列、5’-启动子-靶向标签或者5’-启动子-靶向标签-5’侧翼序列-RNA序列-loop序列-补偿序列-3’侧翼序列；
其中RNA序列包括1个、两个或多个具有医疗意义的具体RNA序列，所述RNA序列能够在目标受体中被表达，所述补偿序列在目标受体中不能被表达。
进一步地，所述质粒由具有不同结构的多种质粒构成，其中一种质粒包含启动子和靶向标签，其他质粒包含启动子和RNA序列。
进一步地，所述器官组织为肝脏。
进一步地，所述复合结构为外泌体。
进一步地，所述靶向标签选自具有靶向功能的肽、蛋白质或抗体中的一种，所述靶向结构位于复合结构的表面。
进一步地，所述靶向标签为RVG-LAMP2B融合蛋白，或者GE11-LAMP2B融合蛋白。
进一步地，所述能够治疗肺癌的RNA有效序列的数量为1条、2条或多条。
进一步地，该递送系统可用于包括人在内的哺乳动物。
进一步地，所述能够治疗肺癌的RNA选自以下RNA中的任意一种或几种：EGFR基因的siRNA、KRAS基因的siRNA或编码上述RNA的核酸分子。
该药物可以通过口服、吸入、皮下注射、肌肉注射或静脉注射的方式进入人体后，通过实施例1所述的RNA递送系统递送至目标组织，发挥治疗作用。
该药物还可以与其他治疗肺癌的药物联合使用，以增强治疗效果。比如吉非替尼、厄洛替尼、埃克替尼、阿法替尼等。
本实施例的药物还可以包括药学上可以接受的载体，该载体包括但不限于稀释剂、缓冲剂、乳剂、包囊剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、喷雾剂、透皮吸收剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、着色剂、矫味剂、佐剂、干燥剂、吸附载体等。
本实施例提供的药物的剂型可以为片剂、胶囊剂、粉剂、颗粒剂、丸剂、栓剂、软膏剂、溶液剂、混悬剂、洗剂、凝胶剂、糊剂等。
本实施例提供的药物以质粒作为载体，质粒作为成熟的注入物，其安全性和可靠性已被充分验证，成药性非常好。最终发挥效果的RNA序列由内源性外泌体包裹输送，不存在任何免疫反应，无需验证该外泌体的安全性。该药物可以递送各类小分子RNA，通用性强。并且质粒的制备要比外泌体或是蛋白质、多肽等物质的制备便宜地多，经济性好。本申请提供的药物在体内自组装后能够与AGO2紧密结合并富集为复合结构(外泌体)，不仅能防止其过早降解，维持其在循环中的稳定性，而且有利于受体细胞吸收、胞浆内释放和溶酶体逃逸，所需剂量低。
实施例3
在实施例1或2的基础上，本实施例提供一种用于治疗肺癌的RNA递送系统在药物中的应用。在此通过以下试验进行具体说明。
如图11A所示，选取小鼠，向小鼠体内注射小鼠肺癌细胞(LLC细胞)，而后每两日向小鼠注射一次PBS缓冲液/CMV-scrR/吉非替尼/CMV-siRE进行治疗，分别对小鼠进行生存分析和肿瘤评估，第30天治疗开始，第44天治疗结束。
如图11B所示，横轴表示时间，纵轴表示生存率，从该图中可以看出，注射CMV-siRE的小鼠生存率最高。
如图11C所示，该图为注射PBS缓冲液/CMV-scrR/吉非替尼/CMV-siRE的小鼠在治疗之前和治疗之后根据CT影像图对小鼠肺组织进行3D建模，可以看出，注射CMV-siRE的小鼠肿瘤显著减小。
如图11D所示，该图为注射PBS缓冲液/CMV-scrR/吉非替尼/CMV-siRE的小鼠在治疗之前和治疗之后的肿瘤体积(mm3)对比图，可以看出，注射CMV-siRE的小鼠肿瘤体积显著减小。而注射PBS缓冲液/CMV-scrR/吉非替尼的小鼠肿瘤体积不仅没有减小，还呈现不同程度的增加。
如图11E所示，该图为正常小鼠、注射PBS缓冲液/CMV-scrR/吉非替尼/CMV-siRE的小鼠的western blot对比图，可见注射PBS缓冲液/CMV-scrR/吉非替尼的小鼠其EGFR基因含量明显较高。
如图11F所示，该图为正常小鼠、注射PBS缓冲液/CMV-scrR/吉非替尼/CMV-siRE的小鼠相关EGFRmiRNA水平对比图，可见注射PBS缓冲液/CMV-scrR/吉非替尼的小鼠其相关EGFRmiRNA水平相对较高。
综上，CMV-siRE对EGFR突变的肺癌肿瘤具有显著的治疗效果。
分别对注射PBS缓冲液/CMV-scrR/吉非替尼/CMV-siRE的小鼠进行HE染色和免疫组织染色，结果如图12A-图12B所示，EGFR在注射PBS缓冲液/CMV-scrR/吉非替尼的小鼠中具有更多的表达。统计小鼠中EGFR和PCNA的着色面积，结果如图12C-图12D所示，可见注射CMV-siRE的小鼠EGFR和PCNA的着色面积均最少，证明其对EGFR突变的肺癌肿瘤的治疗效果最好。
如图13A所示，选取KRASG12D p53-/-小鼠，使小鼠吸入Adv-Cre后的第50天至第64天，每两日向小鼠注射一次PBS缓冲液/CMV-scrR/吉非替尼/CMV-siRE进行治疗，分别对小鼠进行生存分析和肿瘤评估。
如图13B所示，横轴表示感染后的时间，纵轴表示生存率，从该图中可以看出，注射CMV-siRK的小鼠生存率更高。
如图13C所示，该图为注射CMV-scrR/CMV-siRK的小鼠在治疗之前和治疗之后根据CT影像图对小鼠肺组织进行3D建模，可以看出，注射CMV-siRK能够显著抑制肺癌肿瘤的增长。
如图13D所示，该图为注射CMV-scrR/CMV-siRK的小鼠在治疗之前和治疗之后的肿瘤数量对比图，可以看出，注射CMV-siRK的小鼠肿瘤数量增长显著更少。
如图13E所示，该图为注射CMV-scrR/CMV-siRK的小鼠在治疗之前和治疗之后的肿瘤数量(mm3)对比图，可以看出，注射CMV-siRK的小鼠肿瘤体积增长缓慢。而注射CMV-scrR的小鼠肿瘤体积增长显著。
如图13F所示，该图为注射CMV-scrR/CMV-siRK的小鼠的western blot对比图，可见注射CMV-scrR的小鼠其KRAS基因含量明显较高。
如图13G所示，该图为注射CMV-scrR/CMV-siRK的小鼠相关KRAS mRNA水平对比图，可见注射CMV-scrR的小鼠其相关KRAS mRNA水平相对较高。
综上，CMV-siRK对KRAS突变的肺癌肿瘤具有显著的治疗效果。
分别对注射CMV-scrR/CMV-siRK的小鼠进行HE染色和免疫组织染色，结果如图14A、图14D、图14E所示，可见在注射CMV-scrR的小鼠中KRAS、p-AKT、p-ERK具有更多的表达，着色百分比更高。采用western blot免疫印迹法检测小鼠体内相关蛋白的表达水平，结果如图14B、图14C所示，在注射CMV-scrR的小鼠中相关蛋白具有更多的表达。这也说明CMV-siRK对KRAS突变的肺癌肿瘤具有显著的抑制作用。
在本文中，“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”等仅用于表示相关部分之间的相对位置关系，而非限定这些相关部分的绝对位置。
在本文中，“第一”、“第二”等仅用于彼此的区分，而非表示重要程度及顺序、以及互为存在的前提等。
在本文中，“相等”、“相同”等并非严格的数学和/或几何学意义上的限制，还包含本领域技术人员可以理解的且制造或使用等允许的误差。
除非另有说明，本文中的数值范围不仅包括其两个端点内的整个范围，也包括含于其中的若干子范围。
上面结合附图对本申请优选的具体实施方式和实施例作了详细说明，但是本申请并不限于上述实施方式和实施例，在本领域技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本申请构思的前提下做出各种变化。

Claims (17)

1.一种用于治疗肺癌的RNA质粒递送系统，其特征在于，该系统包括质粒，所述质粒携带有能够治疗肺癌的RNA片段，所述质粒能够在宿主的器官组织中富集，并在所述宿主器官组织中内源性地自发形成含有所述RNA片段的复合结构，所述复合结构能够将所述RNA片段送入肺部，对肺癌进行治疗。
2.如权利要求1所述的用于治疗肺癌的RNA质粒递送系统，其特征在于，所述RNA片段包含1个、两个或多个具有医疗意义的具体RNA序列，所述RNA序列是具有医学意义的、能够抑制或阻碍肺癌发展的siRNA、shRNA或miRNA。
3.如权利要求2所述的用于治疗肺癌的RNA质粒递送系统，其特征在于，所述质粒还包括启动子和靶向标签，所述靶向标签能够在宿主的器官组织中形成所述复合结构的靶向结构，所述靶向结构位于复合结构的表面，所述复合结构能够通过所述靶向结构寻找并结合目标组织，将所述RNA片段递送进入目标组织。
4.如权利要求3所述的用于治疗肺癌的RNA质粒递送系统，其特征在于，所述质粒包括以下任意一种线路或几种线路的组合：启动子-RNA片段、启动子-靶向标签、启动子-RNA片段-靶向标签；每一个所述质粒中至少包括一个RNA片段和一个靶向标签，所述RNA片段和靶向标签位于相同的线路中或位于不同的线路中。
5.如权利要求4所述的用于治疗肺癌的RNA质粒递送系统，其特征在于，所述质粒还包括能够使所述线路折叠成正确结构并表达的侧翼序列、补偿序列和loop序列，所述侧翼序列包括5’侧翼序列和3’侧翼序列；
所述质粒包括以下任意一种线路或几种线路的组合：5’-启动子-5’侧翼序列-RNA序列-loop序列-补偿序列-3’侧翼序列、5’-启动子-靶向标签或者5’-启动子-靶向标签-5’侧翼序列-RNA序列-loop序列-补偿序列-3’侧翼序列。
6.如权利要求5所述的用于治疗肺癌的RNA质粒递送系统，其特征在于，所述5’侧翼序列为ggatcctggaggcttgctgaaggctgtatgctgaattc或与其同源性大于80％的序列；
所述loop序列为gttttggccactgactgac或与其同源性大于80％的序列；
所述3’侧翼序列为accggtcaggacacaaggcctgttactagcactcacatggaacaaatggcccagatctggccgcactcgag或与其同源性大于80％的序列；
所述补偿序列为所述RNA片段的反向互补序列，并删除其中任意1-5位碱基。
7.如权利要求4所述的用于治疗肺癌的RNA质粒递送系统，其特征在于，在质粒中存在至少两种线路的情况下，相邻的线路之间通过序列1-3组成的序列相连；
其中，序列1为CAGATC，序列2是由5-80个碱基组成的序列，序列3为TGGATC。
8.如权利要求7所述的用于治疗肺癌的RNA质粒递送系统，其特征在于，在质粒中存在至少两种线路的情况下，相邻的线路之间通过序列4或与序列4同源性大于80％的序列相连；
其中，序列4为CAGATCTGGCCGCACTCGAGGTAGTGAGTCGACCAGTGGATC。
9.如权利要求1所述的用于治疗肺癌的RNA质粒递送系统，其特征在于，所述器官组织为肝脏，所述复合结构为外泌体。
10.如权利要求3所述的用于治疗肺癌的RNA质粒递送系统，其特征在于，所述靶向标签选自具有靶向功能的靶向肽或靶向蛋白。
11.如权利要求10所述的用于治疗肺癌的RNA质粒递送系统，其特征在于，所述靶向肽包括RVG靶向肽、GE11靶向肽、PTP靶向肽、TCP-1靶向肽、MSP靶向肽；
所述靶向蛋白包括RVG-LAMP2B融合蛋白、GE11-LAMP2B融合蛋白、PTP-LAMP2B融合蛋白、TCP-1-LAMP2B融合蛋白、MSP-LAMP2B融合蛋白。
12.如权利要求2所述的用于治疗肺癌的RNA质粒递送系统，其特征在于，所述RNA序列的长度为15-25个核苷酸。
13.如权利要求12所述的用于治疗肺癌的RNA质粒递送系统，其特征在于，所述能够治疗肺癌的RNA选自以下RNA中的任意一种或几种：EGFR基因的siRNA、KRAS基因的siRNA，或与上述序列同源性大于80％的RNA序列，或编码上述RNA的核酸分子。
14.如权利要求13所述的用于治疗肺癌的RNA质粒递送系统，其特征在于，
EGFR基因的siRNA包括UGUUGCUUCUCUUAAUUCCU、AAAUGAUCUUCAAAAGUGCCC、UCUUUAAGAAGGAAAGAUCAU、AAUAUUCGUAGCAUUUAUGGA、UAAAAAUCCUCACAUAUACUU、其他具有抑制EGFR基因表达的序列以及与上述序列同源性大于80％的序列。
KRAS基因的siRNA包括UGAUUUAGUAUUAUUUAUGGC、AAUUUGUUCUCUAUAAUGGUG、UAAUUUGUUCUCUAUAAUGGU、UUAUGUUUUCGAAUUUCUCGA、UGUAUUUACAUAAUUACACAC、其他具有抑制KRAS基因表达的序列以及与上述序列同源性大于80％的序列。
15.如权利要求14所述的用于治疗肺癌的RNA质粒递送系统，其特征在于，所述递送系统为用于包括人在内的哺乳动物中的递送系统。
16.一种权利要求1-15任意一项所述的用于治疗肺癌的RNA递送系统在药物中的应用。
17.如权利要求16所述的应用，其特征在于，所述药物为治疗肺癌及其相关疾病的药物，所述药物的给药方式包括口服、吸入、皮下注射、肌肉注射、静脉注射。
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