CN115141213A - 一类能产生拉曼光谱信号的有机化合物及其制剂 - Google Patents

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CN115141213A CN202210315953.1A CN202210315953A CN115141213A CN 115141213 A CN115141213 A CN 115141213A CN 202210315953 A CN202210315953 A CN 202210315953A CN 115141213 A CN115141213 A CN 115141213A
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Abstract

本发明属于分子影像学和药物制剂技术领域，涉及一类能产生拉曼光谱信号的有机化合物及其制剂及制备方法。本发明所述该类有机化合物分子结构特征是以噻吩偶联苯并双噻二唑为母核结构，具有特定的拉曼位移，在聚集状态下，经近红外光(700‑900nm)照射后，可产生特征拉曼光谱信号。以磷脂类分子或二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺‑聚乙二醇及其衍生物或白蛋白或聚乙二醇类嵌段共聚物与该类有机化合物分子制备成纳米制剂，制备的纳米制剂在近红外光(700‑900nm)的照射下，产生强拉曼光谱信号峰，实现体内拉曼成像。

Description

一类能产生拉曼光谱信号的有机化合物及其制剂
技术领域
本发明属于分子影像学和药物制剂技术领域，涉及一类用于体内拉曼成像的小分子拉曼探针及其纳米制剂。尤其涉及用于体内拉曼成像的小分子化合物(以下简称拉曼分子)及其制剂及其制备方法。
背景技术
拉曼光谱是一种散射光谱。有文献记载，当光子与待测物分子之间发生相互作用时会产生两种碰撞：一种是弹性碰撞，这个过程中光子与分子没有能量交换，只是改变了其运动轨迹，称作瑞利散射；另一种是非弹性碰撞，这个过程中光子与分子间既存在部分能量交换，运动轨迹也发生了变化，这个过程被称作拉曼散射；发生弹性碰撞的几率要比非弹性碰撞的几率大的多；所以拉曼散射信号很弱，受瑞利散射以及荧光的影响很大，普通拉曼光谱的灵敏度比其他光谱检测方法的低。因此，通常拉曼分子不能直接应用，需要通过拉曼信号增强技术增加拉曼光谱的灵敏性，例如表面增强拉曼光谱(SERS)。SERS技术是通过向分析物中加入贵金属(金、银、铜等)使拉曼信号实现几个数量级的增强，从而达到成像要求。
拉曼成像技术是一种新型的成像技术，在生物样本检测方面具有独特优势，其不需要对样品进行前处理，也没有样品的制备过程，在分析过程中操作简便，测定时间短，灵敏度高，因此拉曼光谱检测作为临床即时诊断的方法，有巨大的应用潜力。同时，拉曼光谱谱峰清晰尖锐，包含的信息量丰富，适合深度数据挖掘以及运用差异分析进行定性研究。但是，普通的拉曼成像技术无法直接应用于体内/活体拉曼成像。采用SERS原理，通过制备贵金属(金、银、铜等)纳米颗粒，以贵金属为基底，在纳米颗粒表面或者缝隙中装载拉曼报告分子，可显著增强报告分子的拉曼光谱信号，实现体内病变诊断是目前生命医学领域研究的热点。SERS成像技术可通过光谱中显示的指纹信息反应局域病变状态，拥有更高的灵敏度和分辨率，成像迅速且无损性检测等优点，在动物体内研究中已被广泛用于鉴别恶性病变以及恶变前病变，包括脑肿瘤、乳腺癌、消化道肿瘤、皮肤癌以及口腔癌等。但是，目前应用于SERS体内成像技术的拉曼显像剂是以金属作为基底材料制备而成，生物相容性差，存在生物安全性和难以体内代谢的问题，不利于临床转化。
基于现有技术的不足，本申请的发明人拟提供一类可用于体内拉曼成像的小分子拉曼探针及其纳米制剂的制备方法；所述的小分子拉曼探针及其制剂无需金属基底即可产生强拉曼信号，用于体内拉曼成像具有良好的临床应用前景。
发明内容
本发明的目的是，基于现有SERS体内显像剂需要以金属作为基底材料制备，存在生物安全性和难以体内代谢的问题，提供一类可用于体内拉曼成像的有机小分子拉曼探针及其纳米制剂的制备方法。尤其是一类不依赖于金属基底表面增强即可用于体内拉曼成像的小分子化合物及其制剂及其制备方法。
本发明中的小分子化合物为一类能够产生拉曼光谱信号的有机化合物(以下简称拉曼分子)，具有894和1264cm-1拉曼位移的特征峰，其在聚集状态下，无需金属基底表面增强，经近红外光(700-900nm)照射产生强拉曼光谱信号，实现体内拉曼成像。
本发明中，所述该类拉曼分子其特征在于以噻吩偶联苯并双噻二唑为母核，具有聚集诱导拉曼散射增强特性，在聚集状态下，经近红外光(700-900nm)照射后，无需金属基底表面增强即可产生强拉曼信号用于体内拉曼成像。本发明中通过采用常见纳米药物制剂载体材料，包括磷脂分子、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇及其衍生物或白蛋白或聚乙二醇类嵌段共聚物等，包载该类拉曼分子，制备载该类拉曼分子的纳米制剂，使该类拉曼分子在纳米制剂中聚集，在894和1264cm-1拉曼位移可产生强拉曼信号用于体内拉曼成像。所制得的制剂不依赖于金属基底表面增强，即可用于体内拉曼成像的拉曼分子。
本发明所述的此类拉曼分子，其结构通式如下：
Figure BDA0003569012740000021
R1、R2、R3、R4是氢、羟基、羧基、醛基、氨基、卤素、C1-C20直链或支链烷基、含氧的C1-C20直链或支链杂烷基、环丙烷基、芳基(取代或非取代苯基和萘基)、杂芳基(取代或非取代噻吩基、吡啶基、吲哚基、呋喃基、吡咯基等)、取代或非取代三苯胺基、取代或非取代四苯乙烯基。
其按下述方法合成制备：
合成路线1：以4,7-二溴苯并双噻二唑和α或β位取代的三丁基(噻吩-2-基)锡烷为原料，经过stille反应得到目标产物，合成路线1反应式如下：
Figure BDA0003569012740000031
其中R1、R2、R3、R4是氢、羟基、羧基、醛基、氨基、C1-C20直链或支链烷基、含氧的C1-C20直链或支链杂烷基、环丙烷基、芳基(取代或非取代苯基和萘基)、杂芳基(取代或非取代噻吩基、吡啶基、吲哚基、呋喃基、吡咯基等)、取代或非取代三苯胺基、取代或非取代四苯乙烯基。
上述反应路线1反应式中的试剂：(a)四三苯基膦钯、1,4-二氧六环，105℃。合成路线2：以2中按照合成路线1得到的β位取代的4,7-二噻吩基苯并双噻二唑为原料，经过溴化和Suzuki反应得到目标产物，合成路线2反应式如下：
Figure BDA0003569012740000032
其中R1、R2是是氢、羟基、羧基、醛基、氨基、C1-C20直链或支链烷基、含氧的C1-C20直链或支链杂烷基、环丙烷基、芳基(取代或非取代苯基和萘基)、杂芳基(取代或非取代噻吩基、吡啶基、吲哚基、呋喃基、吡咯基等)、取代或非取代三苯胺基、取代或非取代四苯乙烯基。
上述反应路线2反应式中的试剂：(a)N-溴代琥珀酰亚胺(NBS)、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、氯仿，冰浴；(b)2M K2CO3、四三苯基膦钯、芳基、杂芳基硼酸或芳基、杂芳基频哪醇硼酸酯、1,4-二氧六环，105℃。
本发明采用上述的拉曼分子，更具体地，以上述化合物中的任一种制备脂质体制剂。
所述脂质体制剂按下述技术方案制备：
采用所述的拉曼分子、磷脂分子、胆固醇和二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇或衍生物制备脂质体制剂；
所述的拉曼分子与磷脂分子的摩尔比为1:0.2-1:50；优选地，摩尔比为1:0.2-1:10；
所述的磷脂分子是二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、磷脂酰胆碱(PC)中的一种或几种的混合物；优选地，所述的磷脂分子是二硬脂酰磷脂酰胆碱。
所述的二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇及其衍生物是二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇5000、二硬脂酰磷脂酰乙酰胺-聚乙二醇-氨基、二硬脂酰磷脂酰乙酰胺-聚乙二醇-马来酰亚胺、二硬脂酰磷脂酰乙酰胺-聚乙二醇-巯基中的一种或几种的混合物；优选的，所述的二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇或衍生物分子是二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000。
以磷脂、胆固醇、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000为辅料，上述含有所述拉曼分子的脂质体制剂按下述的制备方法，其包括步骤：
(1)将磷脂、胆固醇、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000和所述拉曼分子溶解于氯仿、二氯甲烷、四氢呋喃或它们的混合溶剂中；
(2)将(1)所述的混合溶液混合均匀后旋转蒸发除去有机溶剂形成脂质膜；
(3)向(2)中形成的脂质膜中加入一定量的缓冲溶液，充分震荡使脂质膜水化脱落；
(4)将步骤(3)得到的水溶液通过聚碳酸脂膜得到粒径均一的脂质体。
优选的，步骤(1)中的溶剂为氯仿。
优选的，步骤(2)的旋蒸温度在30-60℃之间。
优选地，步骤(3)中的缓冲溶液pH在5-8之间，体积在1-10mL之间。
本发明采用上述的拉曼分子，具体地，以上述化合物中的任一种制备胶束。
所述胶束制剂的制备技术方案如下：
所述制剂中含有所述的拉曼分子和二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(DSPE-PEG)及其衍生物；
所述的拉曼分子与二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇及其衍生物的摩尔比为1:0.2-1:50；优选地，摩尔比为1:0.2-1:10；
所述的二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇及其衍生物是二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇5000、二硬脂酰磷脂酰乙酰胺-聚乙二醇-氨基、二硬脂酰磷脂酰乙酰胺-聚乙二醇-马来酰亚胺、二硬脂酰磷脂酰乙酰胺-聚乙二醇-巯基中的一种或几种的混合物。优选地，所述的二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇及其衍生物是二硬脂酰磷脂酰乙酰胺-聚乙二醇2000；
以二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000为辅料，上述含有所述拉曼分子的胶束制剂的制备方法，其包括步骤：
(1)将二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000和所述拉曼分子溶解于氯仿、二氯甲烷、四氢呋喃或它们的混合溶剂中；
(2)将(1)中所述混合溶液逐滴加入水中并稀释十倍；
(3)将(2)中所述混合溶液超声一定时间；
(4)将(3)中所述混合溶液于通风橱搅拌一定时间；
(5)将(4)中所述混合溶液通过0.22μm滤膜过滤，制备得到胶束。
优选地，步骤(1)中所述的溶剂为氯仿。
优选地，步骤(3)中所述的超声时间为2-10分钟。
优选地，步骤(4)中搅拌时间为8-12小时。
本发明采用以上所述的拉曼分子，具体地，以上述化合物中的任一种制备白蛋白纳米制剂。
该白蛋白纳米制剂的制备技术方案如下：
所述制剂中含有所述的拉曼分子和白蛋白；
所述的拉曼分子与白蛋白的摩尔比为1:0.2-1:50；优选地，摩尔比为1:0.2-1:10。
所述的白蛋白是人血清白蛋白、重组人血清白蛋白和牛血清白蛋白中的一种或几种的混合物。
以牛血清白蛋白为辅料，上述含有所述拉曼分子的白蛋白纳米制剂的制备方法，包括步骤：
(1)将白蛋白溶解于水中；
(2)将所述拉曼分子溶解于甲醇、乙醇、丙二醇、氯仿、二氯甲烷、四氢呋喃或它们的混合溶剂中；
(3)将步骤(2)的有机溶液加入到步骤(1)的水溶液中并混合均匀；
(4)将步骤(3)得到的混合液室温搅拌1-8小时。
优选地，步骤(1)中所述的白蛋白水溶液浓度为0.1％-5％(w/v)，优选为0.5％-2％(w/v)。
优选地，步骤(2)中的有机溶剂与步骤(1)中的水的比例为1:40-1:60。
优选地，步骤(4)中搅拌时间为2-6小时。
本发明采用以上所述的拉曼分子，具体地，以上述化合物中的任一种，制备聚乙二醇类嵌段共聚物包载的纳米制剂。
该纳米制剂的制备技术方案如下：
所述制剂中含有所述的拉曼分子和聚乙二醇类嵌段共聚物。
所述的拉曼分子与聚乙二醇类嵌段共聚物的摩尔比为1:0.2-1:50；优选地，摩尔比为1:0.2-1:10。
所述的聚乙二醇类嵌段共聚物是聚乙二醇-聚乳酸羟基乙酸嵌段共聚物、聚乙二醇-聚己内酯嵌段共聚物、聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物、聚乙二醇-聚碳酸酯嵌段共聚物的一种或者几种的混合物。所述的聚乙二醇类嵌段聚合物的分子量范围2000-60000之间，聚乙二醇的分子量在1000-5000之间。优选地，所述的聚乙二醇类嵌段共聚物是聚乙二醇-聚乳酸羟基乙酸嵌段共聚物(PEG-PLGA)，PLGA的分子量为50000，羟基乙酸：乳酸(LA:GA)＝50:50，聚乙二醇的分子量为2000。
以PEG-PLGA为辅料，上述含有所述拉曼分子的PEG-PLGA纳米制剂的制备方法，步骤如下：
(1)将所述拉曼分子和PEG-PLGA以一定比例溶解于甲醇、乙醇、丙二醇、氯仿、二氯甲烷、四氢呋喃或它们的混合溶剂中；
(2)在超声、冰水浴条件下，将步骤(1)的有机溶液加入到纯水中混合均匀；
(3)将步骤(2)得到的混合液室温搅拌1-8小时用以挥干有机溶剂；
(4)将步骤(3)中所得纳米粒溶液冷冻干燥即得所需纳米粒子。
优选地，步骤(1)中所述的拉曼分子与PEG-PLGA的摩尔比为1:0.2-1:10。
优选地，步骤(2)中的有机溶剂与纯水的比例为1:10-1:20。
优选地，步骤(3)中搅拌时间为2-6小时。
本发明采用以上所述的任意一种载拉曼分子的纳米制剂，经近红外光(700-900nm)照射，在无需金属基底表面增强的条件下进行体内拉曼成像；优选地，激发光源波长为785nm和830nm激光。
具体成像步骤如下：
(1)载拉曼分子的纳米制剂的水溶液经近红外激光激发，检测其在894和1264cm-1拉曼位移的特征峰。
(2)裸鼠皮下注射载拉曼分子的纳米制剂(0.1-100mg/kg)，在5-100分钟后，在不打开小鼠皮肤的情况下，透过皮肤检测拉曼位移894cm-1的特征峰，并对小鼠皮下分布的载拉曼分子的纳米制剂进行拉曼成像。
(3)裸鼠皮下注射载拉曼分子的纳米制剂(1-400mg/kg)，在5-100分钟后，在不打开小鼠皮肤的情况下，对小鼠的引流淋巴结和淋巴管进行拉曼成像。
(4)裸鼠静脉注射载拉曼分子的纳米制剂(1-400mg/kg)后，对小鼠腹部进行非侵入性拉曼成像。
(5)建立小鼠原位结肠癌模型，静脉注射载拉曼分子的纳米制剂(1-400mg/kg)，在0.5-72小时后，切开盲肠部位的皮肤及腹膜，暴露肠段，对原位灶和转移灶分别进行拉曼成像。
优选地，步骤(2)中的注射剂量为1mg/kg，成像时间窗口为注射后15分钟。
优选地，步骤(3)中的注射剂量为40mg/kg，成像时间窗口为注射后15分钟。
优选地，步骤(4)中的注射剂量为40mg/kg。
优选地，步骤(5)中的注射剂量为40mg/kg，成像时间窗口为注射后24小时。
本发明所制备的纳米制剂与游离的拉曼分子相比，水溶性得到极大提高，达到了体内拉曼成像所需注射剂量对溶解度的要求。小鼠实验结果显示，该类拉曼探针的纳米制剂注射到体内后，在830nm近红外激光照射下，能够在皮下检测到拉曼位移894和1264cm-1处的特征峰；并能够对淋巴管、淋巴结和血管等脏器进行清晰的拉曼成像。在荷瘤小鼠体内，该纳米制剂能够实现肿瘤部位累积，可以实现肿瘤原位灶和转移灶的清晰成像。
附图说明
图1.化合物3在830nm激发下的拉曼光谱。
图2.化合物5(BBT)在830nm激发下的拉曼光谱。
图3.化合物BBT胶束制剂的粒径分布图。
图4.在830nm激发下化合物BBT NPs(10μM)的拉曼光谱。
图5.(a)，裸鼠皮下注射BBT NPs(1mg/kg)，在830nm激发下的皮下拉曼成像信号图像(894cm-1)；(b)，对应于图(a)中的星号处BBT NPs的拉曼光谱图，其中的阴影标记为拉曼特征峰(894cm-1)。
图6.(a)，裸鼠皮下注射BBT NPs(40mg/kg)后进行淋巴引流拉曼成像；(b)，图(a)中不同部位的拉曼信号强度：1、2、3分别表示皮肤、淋巴管和淋巴结；(c)，图(a)中左下图箭头和虚线指示的淋巴管用于FWHM分析。
图7.裸鼠静脉注射BBT NPs(40mg/kg)用于皮下血管的非侵入性拉曼成像，(a)，小鼠腹部皮下血管的拉曼成像(左)，局部放大图(右)，右图箭头(下)表示微血管成像；(b)，对应于图(a)位置的皮肤，手术取下后，皮下血管面朝上拍照，再经180°翻转，以确认皮下血管，虚线和箭头对应于图(a)中右图；(c)，图(a)中不同部位的拉曼光谱：标签1代表皮肤，标签2和3代表静脉；(d)，图(a)中右图箭头(上)和虚线指示的微血管用于FWHM分析。
图8.荷CT26-Luc原位瘤模型小鼠给药(40mg/kg)后24小时，原位瘤(上)和转移瘤(下)的可见光照片和相应的拉曼成像，箭头指示转移瘤位置。
图9.化合物6在830nm激发下的拉曼光谱。
图10.在830nm激发下化合物6纳米粒(10μM)的拉曼光谱。
图11.(a)，小鼠皮下注射化合物6纳米粒(1mg/kg)，在830nm激发下的皮下拉曼成像信号图像(894cm-1)；(b)，对应于图(a)中的星号处化合物6纳米粒的拉曼光谱图，其中的阴影标记为拉曼特征峰(894cm-1)。
图12.(a)，化合物7在830nm激发下的拉曼光谱；(b)，化合物7纳米粒(10μM)的拉曼光谱(激发波长为785nm)。
图13.化合物8在830nm激发下的拉曼光谱。
图14.在830nm激发下化合物8脂质体(10μM)的拉曼光谱。
图15.(a)小鼠皮下注射化合物8脂质体(1mg/kg)，在830nm激发下的皮下拉曼成像信号图像(894cm-1)；(b)，对应于图(a)中的星号处化合物8脂质体的拉曼光谱图，其中的阴影标记为拉曼特征峰(894cm-1)。
图16.化合物10在830nm激发下的拉曼光谱。
图17.在830nm激发下化合物10白蛋白纳米粒(10μM)的拉曼光谱。
图18.(a)小鼠静脉注射化合物10纳米粒(1mg/kg)，在830nm激发下的皮下拉曼成像信号图像(894cm-1)；(b)，对应于图(a)中的星号处化合物10白蛋白纳米粒的拉曼光谱图，其中的阴影标记为拉曼特征峰(894cm-1)。
图19.化合物12在785nm激发下的拉曼光谱。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步说明，但不仅限于此。
实施例1：拉曼分子4,7-二(噻吩-2-基)苯并[1,2-c：4,5-c']双([1,2,5]噻二唑)(化合物3)的合成
Figure BDA0003569012740000101
反应试剂和条件：
(a)四三苯基膦钯、1,4-二氧六环，105℃
将4,7-二溴-苯并[1,2-c：4,5-c']双([1,2,5]噻二唑(化合物1，0.2g，0.57mmol)和四三苯基膦钯(57mg，0.05mmol)置于含有1,4-二氧六环(10mL)的50mL双颈瓶中，氮气保护下加入三丁基(噻吩-2-基)锡烷(化合物2，0.57g，1.52mmol)，氮气置换(×3)。将混合物在105℃下搅拌12小时后，冷却至室温。将混合物倒入水中并用二氯甲烷萃取，有机层用饱和氟化钾水溶液和盐水洗涤，然后用无水硫酸钠干燥，旋除溶剂，残余物通过柱色谱法纯化，以二氯甲烷：石油醚＝1∶1(v/v)作为洗脱剂，得到目标产物(83mg，41％)，为蓝色固体。1H NMR(600MHz,THF)δ7.58–7.53(m,2H),7.50–7.48(m,2H),7.43–7.38(m,2H).13C NMR(151MHz,THF)δ150.49,134.47,134.16,133.54,131.80,131.25,131.18,130.75,130.15,129.35,127.58,127.50,126.86,126.69.MALDI-TOF MS Calcd for:C14H7N4S4 +([M+H]+):359.9571.Found:359.9571。
化合物3经830nm激发，可检测到894和1264cm-1拉曼位移的特征峰(图1)。
实施例2：拉曼分子4,7-双(4-(2-乙基己基)噻吩-2-基)苯并[1,2-c：4,5-c']双[1,2,5]噻二唑(化合物5，BBT)的合成
Figure BDA0003569012740000111
反应试剂和条件：
(a)四三苯基膦钯、1,4-二氧六环，105℃。
将化合物1(0.78g,2.23mmol)和四三苯基膦钯(0.23g，0.20mmol)置于含有1,4-二氧六环(20mL)的50mL双颈瓶中，氮气保护下加入三丁基(4-(2-乙基己基)噻吩-2-基)锡烷(化合物4，2.47g,5.10mmol)，氮气置换(×3)。将混合物在105℃下搅拌12小时后，冷却至室温。将混合物倒入水中并用二氯甲烷萃取，有机层用饱和氟化钾水溶液和盐水洗涤，然后用无水硫酸钠干燥，旋除溶剂，残余物通过柱色谱法纯化，以乙酸乙酯：石油醚＝1∶20(v/v)作为洗脱剂，得到蓝色固体产物BBT(0.73g，56％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.67(s,2H),7.28(s,2H),2.66(d,J＝6.8Hz,4H),1.84–1.71(m,2H),1.45–1.31(m,16H),1.05–0.87(m,12H).13C NMR(151MHz,CDCl3)δ150.55,142.29,136.50,133.95,126.50,113.00,39.79,33.97,31.90,28.30,25.07,22.51,13.60,10.30.MALDI-TOF MS Calcd for:C30H37N4S4 -([M-H]-):582.1924.Found:582.2315。
BBT经830nm激发，可检测到894和1264cm-1拉曼位移的特征峰(图2)。
实施例3：载BBT胶束制剂的制备与评价
将1mg二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000和1mg BBT溶解于四氢呋喃溶剂中，然后加入水中并稀释十倍最终体积为5mL。将所述混合溶液超声分散2分钟后置于50mL茄形瓶中，于通风橱搅拌8小时，最后将混合溶液通过0.22μm滤膜过滤，制备得到胶束。所制备得到的纳米制剂的相关参数，如表1所示。
表1
Figure BDA0003569012740000121
将化合物BBT制备成胶束(BBT NPs)，粒径约为100nm(图3)。BBT NPs(10μM)的水溶液，经830nm激发，可检测到拉曼位移894和1264cm-1处的特征峰(图4)。
裸鼠皮下注射BBT NPs(1mg/kg)15分钟后，在不打开小鼠皮肤的情况下，可透过皮肤检测到拉曼位移894cm-1的特征峰，并可对小鼠皮下分布的BBT NPs进行拉曼成像(图5)。结果证明了该制剂用于体内拉曼成像的可行性。
裸鼠皮下注射BBT NPs(40mg/kg)15分钟后，在不打开小鼠皮肤的情况下，对小鼠的引流淋巴结和淋巴管进行拉曼成像。拉曼成像高信噪比使它们与周围组织产生显著区别。横截面强度分布图显示所选淋巴管的最大半峰全宽(FWHM)约为246μm(图6)。
裸鼠静脉注射BBT NPs(40mg/kg)后，对小鼠腹部进行非侵入性拉曼成像，可以清晰地成像小鼠腹部皮下的血管脉络。横截面强度分布图可以显示FWHM为177μm的微血管(图7)。
采用CT26-Luc细胞株建立小鼠原位结肠癌模型，静脉注射BBT NPs(40mg/kg)24小时后，切开盲肠部位的皮肤及腹膜，暴露肠段，对原位灶和转移灶分别进行拉曼成像，可以检测到原位灶以及大小约为0.6mm×0.5mm的转移灶(图8)。
实施例4：拉曼分子4,7-双(5-溴-(4-(2-乙基己基)噻吩-2-基)苯并[1,2-c：4,5-c']双[1,2,5]噻二唑(化合物6)的合成
Figure BDA0003569012740000122
反应试剂和条件：
(a)NBS、氯仿、DMF，冰浴。
室温下将NBS(0.07g,0.39mmol)滴加到BBT(0.11g，0.19mmol)的氯仿/DMF(10mL，1:1，v/v)混合溶液中。将混合物在氮气保护下于冰浴中搅拌10分钟，然后用冰水淬灭，水相用二氯甲烷萃取。用水和饱和盐水洗涤，有机相经无水硫酸钠干燥。减压除去二氯甲烷后，将残余物通过硅胶色谱法纯化，用乙酸乙酯/石油醚(1:120，v/v)洗脱，得到所需的产物化合物6(53mg，产率38％)，为蓝色固体。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.57(s,2H),2.63(d,J＝6.8Hz,4H),1.84–1.70(m,2H),1.46–1.33(m,16H),0.98-0.92(m,12H).13C NMR(151MHz,CDCl3)δ149.89,141.62,136.38,133.35,117.31,111.74,39.39,33.21,31.91,28.18,25.16,22.54,13.60,10.32.MALDI-TOF MS Calcd for:C30H37Br2N4S4 +([M+H]+):742.0269.Found:742.0602。
化合物6经830nm激发，可检测到拉曼位移894和1264cm-1处的特征峰(图9)。
实施例5：载化合物6的PEG-PLGA纳米制剂的制备与评价
将所述拉曼分子和PEG-PLGA(PLGA的分子量为50000，LA:GA＝50:50，PEG的分子量为2000。)以1:5的比例溶解于二氯甲烷中，在超声、冰水浴条件下，将上述有机溶液1mL逐滴加入到6mL纯水中并混合均匀，将得到的混合液室温搅拌6小时以挥干有机溶剂，最后将所得纳米粒溶液低温冻干即得所需纳米粒子。所制备得到的纳米制剂的相关参数，如表2。
表2
Figure BDA0003569012740000131
将化合物6制备成PEG-PLGA纳米制剂，粒径约为106nm。该化合物6纳米粒(10μM)的水溶液，经830nm激发，可检测到拉曼位移894和1264cm-1处的特征峰(图10)。
裸鼠皮下注射化合物6纳米粒(1mg/kg)15分钟后，在不打开小鼠皮肤的情况下，可透过皮肤检测到拉曼位移894cm-1的特征峰，并可对小鼠皮下分布的化合物6纳米粒进行拉曼成像(图11)。结果证明了该制剂用于体内拉曼成像的可行性。
裸鼠静脉注射化合物6纳米粒(40mg/kg)后，对小鼠腹部进行非侵入性拉曼成像，可以清晰地成像小鼠腹部皮下的血管脉络。
采用CT26-Luc小鼠原位结肠癌模型，静脉注射化合物6纳米粒(40mg/kg)24小时后，切开盲肠部位的皮肤及腹膜，暴露肠段，对原位灶和转移灶分别进行拉曼成像，可以检测到原位灶以及大小约为0.9mm×0.6mm的转移灶。
实施例6：拉曼分子4,7-双(5-溴-(4-(2-乙基己基)噻吩-2-基)苯并[1,2-c：4,5-c']双[1,2,5]噻二唑(化合物7)的合成
Figure BDA0003569012740000141
反应试剂和条件：
(a)苯硼酸、四三苯基膦钯、2M K2CO3、1,4-二氧六环，105℃。
将化合物6(56mg,0.076mmol)、苯硼酸(24mg,0.19mmol)和四三苯基膦钯(8mg,0.0076mmol)置于50mL双颈烧瓶中。在氮气下用注射器加入脱气的1，4-二氧六环(10mL)，将所得溶液通过真空脱气。在氮气下加入2M K2CO3溶液(0.12mL)。将该混合物进一步真空脱气，然后在105℃下搅拌4小时。减压除去溶剂后，将所得残余物用二氯甲烷萃取。有机相用水和饱和食盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥。通过硅胶色谱法用乙酸乙酯/石油醚(1:150，v/v)作为流动相纯化产物，得到绿色固体化合物7(42mg，产率75％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.88(s,2H),7.63(d,J＝6.9Hz,4H),7.49(t,J＝7.8Hz,4H),7.41(t,J＝6.0Hz,2H),2.80(d,J＝5.9Hz,4H),1.80–1.70(m,2H),1.41–1.27(m,8H),1.23(m,8H),0.89–0.79(m,12H).13C NMR(151MHz,CDCl3)δ151.31,144.77,139.15,136.03,135.79,134.82,129.48,128.53,127.75,113.26,40.56,32.80,32.61,28.69,25.85,23.09,14.14,10.83,1.03.MALDI-TOF MS Calcd for:C42H47N4S4 +([M+H]+):736.2708.Found:736.1809。
化合物7经830nm激发，可检测到拉曼位移894和1264cm-1处的特征峰(图12a)。
实施例7：含有化合物7的白蛋白纳米制剂的制备与评价。
将牛血清白蛋白溶解在水中并混合均匀，使蛋白浓度为0.5％(w/v)。取2mL 0.5％白蛋白水溶液于10mL试剂瓶中。准确称量2.0mg化合物7并溶解于0.4mL有机溶剂中。药物与蛋白质量之比为1:5。将溶有化合物7的有机溶剂加入白蛋白水溶液中，室温搅拌4小时，即可得到含有化合物7的白蛋白纳米制剂。所制备得到的纳米制剂的相关参数，如表3所示。
表3
Figure BDA0003569012740000151
将化合物7制备成白蛋白纳米制剂，粒径约为112nm。该化合物7纳米粒(10μM)的水溶液，经785nm激发，可检测到拉曼位移894和1264cm-1处的特征峰(图12b)。
裸鼠皮下注射化合物7纳米粒(1mg/kg)15分钟后，在不打开小鼠皮肤的情况下，可透过皮肤检测到拉曼位移894cm-1的特征峰，并可对小鼠皮下分布的化合物7纳米粒进行拉曼成像。结果证明了该制剂用于体内拉曼成像的可行性。
采用CT26-Luc细胞株建立小鼠原位结肠癌模型，静脉注射化合物7纳米粒(40mg/kg)24小时后，切开盲肠部位的皮肤及腹膜，暴露肠段，对原位灶和转移灶分别进行拉曼成像，可以检测到原位灶以及大小约为1.1mm×0.8mm的转移灶。
实施例8：拉曼分子4,7-双(4-(2-乙基己基)-5-(4-(1,2,2-三苯基乙烯基)苯基)噻吩-2-基)苯并[1,2-c：4,5-c']双[1,2,5]噻二唑(化合物8)的合成
Figure BDA0003569012740000161
反应试剂和条件：
(a)四苯基乙烯频哪醇硼酸酯、四三苯基膦钯、2M K2CO3、1,4-二氧六环，105℃，
将化合物6(0.1g,0.14mmol)、四苯基乙烯频哪醇硼酸酯(0.12g,0.27mmol)和四三苯基膦钯(11.5mg,0.01mmol)置于50mL双颈烧瓶中。在氮气下用注射器加入脱气的1，4-二氧六环(10mL)，将所得溶液通过真空脱气。在氮气下加入2M K2CO3溶液(0.28mL)。将该混合物进一步真空脱气，然后在105℃下搅拌4小时。减压除去溶剂后，将所得残余物用二氯甲烷萃取。有机相用水和饱和食盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥。通过硅胶色谱法用乙酸乙酯/石油醚(1:50，v/v)作为流动相纯化产物，得到绿色固体化合物8(83mg，产率50％)。1H NMR(600MHz,CDCl3)δ8.83(s,2H),7.36–7.33(m,4H),7.15–7.08(m,30H),7.08–7.05(m,4H),2.72(dd,J＝7.2,3.4Hz,4H),1.67(dd,J＝12.2,6.1Hz,2H),1.26(d,J＝11.3Hz,12H),0.86(t,J＝7.0Hz,6H),0.79(t,J＝7.4Hz,6H).13C NMR(151MHz,CDCl3)δ150.63,144.02,143.03,142.98,142.93,142.66,140.78,138.61,135.58,135.00,132.12,130.90,130.83,130.78,130.74,127.97,127.15,127.10,127.05,125.98,125.93,125.88,39.72,32.16,31.91,27.98,25.01,22.41,13.55,10.09.MALDI-TOF MS Calcd for:C42H47N4S4 +([M+H]+):1243.3112.Found:1243.3226。
化合物8经830nm激发，可检测到拉曼位移894和1264cm-1处的特征峰(图13)。
实施例9：含有化合物8的脂质体制剂的制备与评价
将二硬脂酰磷脂酰胆碱、胆固醇、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000和所述拉曼分子溶解于氯仿试剂中，摩尔比为56：1.8：0.2：42。将所述的混合溶液混合均匀后置入10mL茄形瓶中，在水浴中旋转蒸发30分钟用以除去有机溶剂从而形成脂质膜，水浴温度为40℃。向中形成的脂质膜中加入5mL的PBS缓冲溶液，超声使脂质膜水化脱落。将得到的水溶液通过聚碳酸脂膜得到粒径均一的脂质体。所制备得到的纳米制剂的相关参数，如表4所示。
表4
Figure BDA0003569012740000171
将化合物8制备成脂质体，粒径约为85nm。该化合物8脂质体(10μM)的水溶液，经830nm激发，可检测到拉曼位移894和1264cm-1处的特征峰(图14)。
裸鼠皮下注射化合物8脂质体(1mg/kg)15分钟后，在不打开小鼠皮肤的情况下，可透过皮肤检测到拉曼位移894cm-1的特征峰，并可对小鼠皮下分布的化合物8纳米粒进行拉曼成像(图15)。结果证明了该制剂用于体内拉曼成像的可行性。
裸鼠静脉注射化合物8脂质体(40mg/kg)后，对小鼠腹部进行非侵入性拉曼成像，可以清晰地成像小鼠腹部皮下的血管脉络。
采用CT26-Luc小鼠原位结肠癌模型，静脉注射化合物8脂质体(40mg/kg)24小时后，切开盲肠部位的皮肤及腹膜，暴露肠段，对原位灶和转移灶分别进行拉曼成像，可以检测到原位灶以及大小约为0.9mm×0.6mm的转移灶。
实施例10：拉曼分子4,4'-(((苯并[1,2-c：4,5-c']双[1,2,5]噻二唑-4,7-二基)双(3-(2-乙基己基)噻吩-5,2-二基))二苯甲酸(化合物9)的合成
Figure BDA0003569012740000172
反应试剂和条件：
(a)4-硼酸苯甲酸、四三苯基膦钯、2M K2CO3、1,4-二氧六环，105℃。
将化合物6(74mg,0.1mmol)、4-硼酸苯甲酸(33mg,0.2mmol)和四三苯基膦钯(12mg,0.01mmol)置于50mL双颈烧瓶中。在氮气下用注射器加入脱气的1，4-二氧六环(10mL)，将所得溶液通过真空脱气。在氮气下加入2M K2CO3溶液(0.2mL)。将该混合物进一步真空脱气，然后在105℃下搅拌4小时。减压除去溶剂后，将所得残余物用二氯甲烷萃取。有机相用水和饱和食盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥。通过硅胶色谱法用二氯甲烷/甲醇(80:1,v/v)作为流动相纯化产物，得到绿色固体化合物7(35mg，产率43％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ12.56(s,2H),8.18(s,2H),7.83(d,J＝7.9Hz,4H),7.55(t,J＝7.5Hz,4H),2.80(m,4H),1.80–1.70(m,2H),1.42–1.25(m,8H),1.22(m,8H),0.89–0.75(m,12H).
化合物9经830nm激发，可检测到拉曼位移894和1264cm-1处的特征峰。
实施例11：含有化合物9的胶束制剂的制备与评价
将2mg二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000和1mg所述拉曼分子溶解于四氢呋喃溶剂中,然后加入水中并稀释十倍最终体积为5mL。将所述混合溶液超声2分钟后至于50mL茄形瓶中，于通风橱搅拌8小时，最后将混合溶液通过0.22μm滤膜过滤，制备得到胶束。所制备得到的纳米制剂的相关参数，如表5所示。
表5
Figure BDA0003569012740000181
将化合物9制备成胶束，粒径约为105nm。该化合物9胶束(10μM)的水溶液，经830nm激发，可检测到拉曼位移894和1264cm-1处的特征峰。
裸鼠皮下注射化合物9胶束(1mg/kg)15分钟后，在不打开小鼠皮肤的情况下，可透过皮肤检测到拉曼位移894cm-1的特征峰，并可对小鼠皮下分布的化合物9纳米粒进行拉曼成像。结果证明了该制剂用于体内拉曼成像的可行性。
裸鼠静脉注射化合物9胶束(40mg/kg)后，对小鼠腹部进行非侵入性拉曼成像，可以清晰地成像小鼠腹部皮下的血管脉络。
实施例12：拉曼分子4,7-双(4-(2-己基癸基)-5-苯基噻吩-2-基)苯并[1,2-c：4,5-c']双[1,2,5]噻二唑(化合物10)的合成
Figure BDA0003569012740000191
反应试剂和条件：
(a)四三苯基膦钯、1,4-二氧六环，105℃。
将化合物1(0.6g,1.70mmol)和四三苯基膦钯(0.3g，0.28mmol)置于含有1,4-二氧六环(20mL)的50mL双颈瓶中，氮气保护下加入三丁基(4-(2-己基癸基)噻吩-2-基)锡烷(化合物9，4.11g,5.68mmol)，氮气置换(×3)。将混合物在105℃下搅拌12小时后，冷却至室温。将混合物倒入水中并用二氯甲烷萃取，有机层用饱和氟化钾水溶液和盐水洗涤，然后用无水硫酸钠干燥，旋除溶剂，残余物通过柱色谱法纯化，以乙酸乙酯：石油醚＝1∶20(v/v)作为洗脱剂，得到蓝色固体产物(0.95g，69％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.88(s,2H),7.27(s,2H),2.78(d,J＝6.9Hz,4H),1.83–1.72(m,2H),1.23(m,48H),0.85(t,J＝6.4Hz,12H).
化合物10经830nm激发，可检测到拉曼位移894和1264cm-1处的特征峰(图16)。
实施例13：含有化合物10的白蛋白纳米制剂的制备与评价
将牛血清白蛋白溶解在水中并混合均匀，使蛋白浓度为0.5％(w/v)。取2mL0.5％白蛋白水溶液于10mL试剂瓶中。准确称量2.0mg化合物10并溶解于0.4mL有机溶剂中。药物用量与蛋白用量之比为1:5。将溶有化合物10的有机溶剂加入白蛋白水溶液中，室温搅拌4小时，即可得到含有化合物10的白蛋白纳米制剂。所制备得到的纳米制剂的相关参数，如表6。
表6
Figure BDA0003569012740000201
将化合物10制备成白蛋白纳米制剂，粒径约为115nm。该化合物10纳米粒(10μM)的水溶液，经830nm激发，可检测到拉曼位移894和1264cm-1处的特征峰(图17)。
裸鼠皮下注射化合物10白蛋白纳米粒(1mg/kg)15分钟后，在不打开小鼠皮肤的情况下，可透过皮肤检测到拉曼位移894cm-1的特征峰，并可对小鼠皮下分布的化合物10白蛋白纳米粒进行拉曼成像(图18)。结果证明了该制剂用于体内拉曼成像的可行性。
裸鼠静脉注射化合物10白蛋白纳米粒(40mg/kg)后，对小鼠腹部进行非侵入性拉曼成像，可以清晰地成像小鼠腹部皮下的血管脉络。
采用CT26-Luc小鼠原位结肠癌模型，静脉注射化合物10白蛋白纳米粒(40mg/kg)24小时后，切开盲肠部位的皮肤及腹膜，暴露肠段，对原位灶和转移灶分别进行拉曼成像，可以检测到原位灶以及大小约为1.1mm×0.8mm的转移灶。实施例14：拉曼分子4,7-双(5-(4-(双(4-(辛氧基氧基)苯基)氨基)苯基)噻吩-2-基)苯并[1,2-c：4,5-c']双[1,2,5]噻二唑(化合物12)的合成
Figure BDA0003569012740000202
反应试剂和条件：
a)4-(辛氧基)-N-(4-(辛氧基氧基)苯基)-N-(4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼烷-2-基)苯基)苯胺、四三苯基膦钯、2M K2CO3、1,4-二氧六环，105℃。
将化合物11(0.1g,0.19mmol)、4-(辛氧基)-N-(4-(辛氧基氧基)苯基)-N-(4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼烷-2-基)苯基)苯胺(0.25g,0.40mmol)和四三苯基膦钯(23mg,0.02mmol)置于50mL双颈烧瓶中。在氮气下用注射器加入脱气的1，4-二氧六环(15mL)，将所得溶液通过真空脱气。在氮气下加入2M K2CO3溶液(0.4mL)。将该混合物进一步真空脱气，然后在105℃下搅拌4小时。减压除去溶剂后，将所得残余物用二氯甲烷萃取。有机相用水和饱和食盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥。通过硅胶色谱法用乙酸乙酯/石油醚(1:20,v/v)作为流动相纯化产物，得到绿色固体化合物12(0.19g，产率73％)。1H NMR(600MHz,CDCl3)δ8.23(s,2H),7.36–7.33(m,12H),7.15–7.09(m,12H),7.08–7.05(m,4H),4.11(t,J＝6.1Hz,8H),1.69(m,8H),1.56–1.09(m,40H),0.82(t,J＝7.5Hz,12H).
化合物12经785nm激发，可检测到拉曼位移894和1264cm-1处的特征峰(图19)。
实施例14：含有化合物12的脂质体制剂的制备与评价
将二硬脂酰磷脂酰胆碱、胆固醇、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000和所述拉曼分子溶解于氯仿试剂中，摩尔比为56：1.8：0.2：42。将所述的混合溶液混合均匀后置入10mL茄形瓶中，在水浴中旋转蒸发30分钟用以除去有机溶剂从而形成脂质膜，水浴温度为40℃。向中形成的脂质膜中加入5mL的PBS缓冲溶液，超声使脂质膜水化脱落。将得到的水溶液通过聚碳酸脂膜得到粒径均一的脂质体。所制备得到的纳米制剂的相关参数，如表7。
表7
Figure BDA0003569012740000211
将化合物12制备成脂质体，粒径约为75nm。该化合物12脂质体(10μM)的水溶液，分别经785nm激发，均可检测到拉曼位移894和1264cm-1处的特征峰。
裸鼠皮下注射化合物12脂质体(1mg/kg)15分钟后，在不打开小鼠皮肤的情况下，可透过皮肤检测到拉曼位移894cm-1的特征峰，并可对小鼠皮下分布的化合物12纳米粒进行拉曼成像。结果证明了该制剂用于体内拉曼成像的可行性。
裸鼠皮下注射化合物12脂质体(40mg/kg)15分钟后，在不打开小鼠皮肤的情况下，对小鼠的引流淋巴结和淋巴管进行非侵入性拉曼成像。拉曼成像高信噪比使它们与周围组织产生显著区别。
裸鼠静脉注射化合物12脂质体(40mg/kg)后，对小鼠腹部进行非侵入性拉曼成像，可以清晰地成像小鼠腹部皮下的血管脉络。
实施例15：拉曼分子5,5'-(苯并[1,2-c：4,5-c']双([1,2,5]噻二唑)-4,7-二基)双(噻吩-2-醇)(化合物14)的合成
Figure BDA0003569012740000221
反应试剂和条件：
(a)四三苯基膦钯、1,4-二氧六环，105℃。
将4,7-二溴-苯并[1,2-c：4,5-c']双([1,2,5]噻二唑(化合物1，0.2g，0.57mmol)和四三苯基膦钯(57mg，0.05mmol)置于含有1,4-二氧六环(10mL)的50mL双颈瓶中，氮气保护下加入5-(三丁基锡烷基)噻吩-2-醇(化合物13，0.59g，1.52mmol)，氮气置换(×3)。将混合物在105℃下搅拌12小时后，冷却至室温。将混合物倒入水中并用二氯甲烷萃取，有机层用饱和氟化钾水溶液和盐水洗涤，然后用无水硫酸钠干燥，旋除溶剂，残余物通过柱色谱法纯化，以二氯甲烷：甲醇＝100∶1(v/v)作为洗脱剂，得到目标产物(0.1g，46％)，为蓝色固体。1H NMR(600MHz,THF)δ9.88(s,2H),7.78–7.73(m,2H),7.13–7.18(m,2H).13C NMR(151MHz,THF)δ152.39,135.67,134.45,133.84,131.81,131.47,130.48,129.61,127.59,127.35,125.86,125.64。
化合物14分别经700nm激发，均可检测到拉曼位移894和1264cm-1处的特征峰。
实施例16：含有化合物14的PEG-PLGA纳米粒子的制备与评价
将所述拉曼分子和PEG-PLGA(PLGA的分子量为50000，LA:GA＝50:50，PEG的分子量为2000。)以1:5的比例溶解于二氯甲烷中，在超声、冰水浴条件下，将上述有机溶液1mL逐滴加入到6mL纯水中并混合均匀，将得到的混合液室温搅拌6小时以挥干有机溶剂，最后将所得纳米粒溶液低温冻干即得所需纳米粒子。所制备得到的纳米制剂的相关参数，如表8。
表8
Figure BDA0003569012740000231
将化合物14制备成PEG-PLGA纳米制剂，粒径在99nm左右。该化合物14纳米粒(10μM)的水溶液，分别经700nm激发，均可检测到拉曼位移894和1264cm-1处的特征峰。
裸鼠皮下注射化合物14纳米粒(1mg/kg)15分钟后，在不打开小鼠皮肤的情况下，可透过皮肤检测到拉曼位移894cm-1的特征峰，并可对小鼠皮下分布的化合物14纳米粒进行拉曼成像。结果证明了该制剂用于体内拉曼成像的可行性。
实施例17：拉曼分子5,5'-(苯并[1,2-c：4,5-c']双([1,2,5]噻二唑)-4,7-二基)双(3-甲基噻吩-2-醛基)(化合物16)的合成
Figure BDA0003569012740000232
反应试剂和条件：
(a)四三苯基膦钯、1,4-二氧六环，105℃。
将4,7-二溴-苯并[1,2-c：4,5-c']双([1,2,5]噻二唑(化合物1，0.2g，0.57mmol)和四三苯基膦钯(57mg，0.05mmol)置于含有1,4-二氧六环(10mL)的50mL双颈瓶中，氮气保护下加入5-(三丁基锡烷基)3-甲基噻吩-2-醛(化合物15，0.64g，1.52mmol)，氮气置换(×3)。将混合物在105℃下搅拌12小时后，冷却至室温。将混合物倒入水中并用二氯甲烷萃取，有机层用饱和氟化钾水溶液和盐水洗涤，然后用无水硫酸钠干燥，旋除溶剂，残余物通过柱色谱法纯化，以二氯甲烷：甲醇＝120∶1(v/v)作为洗脱剂，得到目标产物(0.1g，46％)，为蓝色固体。1H NMR(600MHz,THF)δ9.84(s,2H),7.8–7.7(m,2H),2.40(S,6H).13C NMR(151MHz,THF)δ180.21，148.35,146.34，136.89,135.15,130.43,128.55,127.41,123.49,121.32,120.64，14.21。
化合物16分别经900nm激发，均可检测到拉曼位移894和1264cm-1处的特征峰。
实施例18：含有化合物16的PEG-PLGA纳米粒子的制备与评价
将所述拉曼分子和PEG-PLGA(PLGA的分子量为50000，LA:GA＝50:50，PEG的分子量为2000。)以1:5的比例溶解于二氯甲烷中，在超声、冰水浴条件下，将上述有机溶液1mL逐滴加入到6mL纯水中并混合均匀，将得到的混合液室温搅拌6小时以挥干有机溶剂，最后将所得纳米粒溶液低温冻干即得所需纳米粒子。所制备得到的纳米制剂的相关参数，如表9。
表9
Figure BDA0003569012740000241
将化合物16制备成PEG-PLGA纳米制剂，粒径在103nm左右。该化合物16纳米粒(10μM)的水溶液，分别经900nm激发，均可检测到拉曼位移894和1264cm-1处的特征峰。
裸鼠皮下注射化合物16纳米粒(1mg/kg)15分钟后，在不打开小鼠皮肤的情况下，可透过皮肤检测到拉曼位移894cm-1的特征峰，并可对小鼠皮下分布的化合物16纳米粒进行拉曼成像。结果证明了该制剂用于体内拉曼成像的可行性。
实施例19：拉曼分子5,5'-(苯并[1,2-c：4,5-c']双([1,2,5]噻二唑)-4,7-二基)双(3-甲氧基噻吩-2-羧酸)(化合物18)的合成
Figure BDA0003569012740000251
反应试剂和条件：
(a)四三苯基膦钯、1,4-二氧六环，105℃。
将4,7-二溴-苯并[1,2-c：4,5-c']双([1,2,5]噻二唑(化合物1，0.2g，0.57mmol)和四三苯基膦钯(57mg，0.05mmol)置于含有1,4-二氧六环(10mL)的50mL双颈瓶中，氮气保护下加入3-甲氧基-5-(三丁基甲锡烷基)噻吩-2-羧酸(化合物17，0.69g，1.55mmol)，氮气置换(×3)。将混合物在105℃下搅拌12小时后，冷却至室温。将混合物倒入水中并用二氯甲烷萃取，有机层用饱和氟化钾水溶液和盐水洗涤，然后用无水硫酸钠干燥，旋除溶剂，残余物通过柱色谱法纯化，以二氯甲烷：甲醇＝40∶1(v/v)作为洗脱剂，得到目标产物(0.12g，42％)，为蓝色固体。1H NMR(600MHz,CDCl3)δ13.4(s,2H)7.08(s,2H),3.83(s,6H).
化合物18分别经785nm激发，均可检测到拉曼位移894和1264cm-1处的特征峰。
实施例20：载化合物18胶束制剂的制备与评价
将2mg二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000和1mg化合物18溶解于四氢呋喃溶剂中，然后加入水中并稀释十倍最终体积为5mL。将所述混合溶液超声分散2分钟后置于50mL茄形瓶中，于通风橱搅拌8小时，最后将混合溶液通过0.22μm滤膜过滤，制备得到胶束。所制备得到的纳米制剂的相关参数，如表10所示。
表10
Figure BDA0003569012740000252
将化合物18制备成胶束，粒径约为121nm，经785nm激发。该化合物18胶束(10μM)的水溶液，可检测到拉曼位移894和1264cm-1处的特征峰。
实施例21：拉曼分子5,5'-(苯并[1,2-c：4,5-c']双([1,2,5]噻二唑)-4,7-二基)双(3-甲氧基噻吩-2-羧酸)(化合物20)的合成
Figure BDA0003569012740000261
反应试剂和条件：
(a)四三苯基膦钯、1,4-二氧六环，105℃。
将4,7-二溴-苯并[1,2-c：4,5-c']双([1,2,5]噻二唑(化合物1，0.2g，0.57mmol)和四三苯基膦钯(57mg，0.05mmol)置于含有1,4-二氧六环(10mL)的50mL双颈瓶中，氮气保护下加入3-(二十烷氧基)-5-(三丁基甲锡烷基)噻吩-2-胺(化合物17，0.69g，1.55mmol)，氮气置换(×3)。将混合物在105℃下搅拌12小时后，冷却至室温。将混合物倒入水中并用二氯甲烷萃取，有机层用饱和氟化钾水溶液和盐水洗涤，然后用无水硫酸钠干燥，旋除溶剂，残余物通过柱色谱法纯化，以二氯甲烷：甲醇＝100∶1(v/v)作为洗脱剂，得到目标产物(0.22g，38％)，为蓝色固体。1H NMR(600MHz,CDCl3)δ7.36(s,4H)6.45(s,2H),4.06-4.02(t,4H)，1.78-1.75(t,4H)，1.50-1.16(m,72H),0.91-0.83(m,6H).
化合物20分别经830nm激发，均可检测到拉曼位移894和1264cm-1处的特征峰。
实施例22：载化合物20胶束制剂的制备与评价
将2mg二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000和1mg化合物20溶解于四氢呋喃溶剂中，然后加入水中并稀释十倍最终体积为5mL。将所述混合溶液超声分散2分钟后置于50mL茄形瓶中，于通风橱搅拌8小时，最后将混合溶液通过0.22μm滤膜过滤，制备得到胶束。所制备得到的纳米制剂的相关参数，如表11所示。
表11
Figure BDA0003569012740000271
将化合物20制备成胶束，粒径约为113nm。该化合物20胶束(10μM)的水溶液，经830nm激发，可检测到拉曼位移894和1264cm-1处的特征峰。
实施例23：拉曼分子5,5'-(苯并[1,2-c：4,5-c']双([1,2,5]噻二唑)-4,7-二基)双(2-环丙基噻吩)(化合物22)的合成
Figure BDA0003569012740000272
反应试剂和条件：
(a)四三苯基膦钯、1,4-二氧六环，105℃。
将4,7-二溴-苯并[1,2-c：4,5-c']双([1,2,5]噻二唑(化合物1，0.2g，0.57mmol)和四三苯基膦钯(57mg，0.05mmol)置于含有1,4-二氧六环(10mL)的50mL双颈瓶中，氮气保护下加入三丁基(5-环丙基噻吩-2-基)锡烷(化合物21，0.66g，1.60mmol)，氮气置换(×3)。将混合物在105℃下搅拌12小时后，冷却至室温。将混合物倒入水中并用二氯甲烷萃取，有机层用饱和氟化钾水溶液和盐水洗涤，然后用无水硫酸钠干燥，旋除溶剂，残余物通过柱色谱法纯化，以二氯甲烷：甲醇＝120∶1(v/v)作为洗脱剂，得到目标产物(0.15g，60％)，为蓝色固体。1H NMR(600MHz,CDCl3)δ7.32(s,4H)6.89(s,2H),2.23-2.20(m,2H)，1.28-1.00(m,8H).
化合物22分别经830nm激发，均可检测到拉曼位移894和1264cm-1处的特征峰。
实施例24：载化合物22胶束制剂的制备与评价
将2mg二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000和1mg化合物22溶解于四氢呋喃溶剂中，然后加入水中并稀释十倍最终体积为5mL。将所述混合溶液超声分散2分钟后置于50mL茄形瓶中，于通风橱搅拌8小时，最后将混合溶液通过0.22μm滤膜过滤，制备得到胶束。所制备得到的纳米制剂的相关参数，如表12所示。
表12
Figure BDA0003569012740000281
将化合物22制备成胶束，粒径约为123nm。该化合物22胶束(10μM)的水溶液，经830nm激发，可检测到拉曼位移894和1264cm-1处的特征峰。
实施例25：拉曼分子5,5'-(苯并[1,2-c：4,5-c']双([1,2,5]噻二唑)-4,7-二基)双((3-戊基-[2,2'-联噻吩]-5-基))(化合物24)的合成
Figure BDA0003569012740000282
反应试剂和条件：
(a)四三苯基膦钯、1,4-二氧六环，105℃。
将4,7-二溴-苯并[1,2-c：4,5-c']双([1,2,5]噻二唑(化合物1，0.2g，0.57mmol)和四三苯基膦钯(57mg，0.05mmol)置于含有1,4-二氧六环(10mL)的50mL双颈瓶中，氮气保护下加入三丁基(3-戊基-[2,2'-联噻吩]-5-基)锡烷(化合物23，0.84g，1.60mmol)，氮气置换(×3)。将混合物在105℃下搅拌12小时后，冷却至室温。将混合物倒入水中并用二氯甲烷萃取，有机层用饱和氟化钾水溶液和盐水洗涤，然后用无水硫酸钠干燥，旋除溶剂，残余物通过柱色谱法纯化，以二氯甲烷：甲醇＝120∶1(v/v)作为洗脱剂，得到目标产物(0.21g，58％)，为蓝色固体。1H NMR(600MHz,CDCl3)δ7.61-7.51(m,4H)，7.10(s,2H),6.88-6,86(t,2H)，2.70-2.66(t,4H)，1.58-1.31(m,12H),1.01-0.91(m,6H).
化合物24分别经830nm激发，均可检测到拉曼位移894和1264cm-1处的特征峰。
实施例26：载化合物24胶束制剂的制备与评价
将2mg二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000和1mg化合物24溶解于四氢呋喃溶剂中，然后加入水中并稀释十倍最终体积为5mL。将所述混合溶液超声分散2分钟后置于50mL茄形瓶中，于通风橱搅拌8小时，最后将混合溶液通过0.22μm滤膜过滤，制备得到胶束。所制备得到的纳米制剂的相关参数，如表13所示。
表13
Figure BDA0003569012740000291
将化合物24制备成胶束，粒径约为103nm。该化合物24胶束(10μM)的水溶液，经830nm激发，可检测到拉曼位移894和1264cm-1处的特征峰。
实施例27：拉曼分子5,5'-(苯并[1,2-c：4,5-c']双([1,2,5]噻二唑)-4,7-二基)双((3-戊基-[2,2'-联噻吩]-5-基))(化合物24)的合成
Figure BDA0003569012740000292
反应试剂和条件：
(a)四三苯基膦钯、1,4-二氧六环，105℃。
将4,7-二溴-苯并[1,2-c：4,5-c']双([1,2,5]噻二唑(化合物1，0.2g，0.57mmol)和四三苯基膦钯(57mg，0.05mmol)置于含有1,4-二氧六环(10mL)的50mL双颈瓶中，氮气保护下加入4-((庚二烷-2-甲氧基)-5(三丁基甲锡烷基)噻吩-3-基)吡啶(化合物25，1.22g，1.60mmol)，氮气置换(×3)。将混合物在105℃下搅拌12小时后，冷却至室温。将混合物倒入水中并用二氯甲烷萃取，有机层用饱和氟化钾水溶液和盐水洗涤，然后用无水硫酸钠干燥，旋除溶剂，残余物通过柱色谱法纯化，以二氯甲烷：甲醇＝120∶1(v/v)作为洗脱剂，得到目标产物(0.21g，58％)，为蓝色固体。1H NMR(600MHz,CDCl3)δ8.71-8.58(m,4H)，8.10(s,4H),7.10-7.08(s,2H),3.73-3.70(m,2H)，1.70-1.66(t,4H)，1.48-1.21(m,74H),1.13-0.92(m,6H).
化合物26分别经830nm激发，均可检测到拉曼位移894和1264cm-1处的特征峰。
实施例28：载化合物26胶束制剂的制备与评价
将2mg二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000和1mg化合物26溶解于四氢呋喃溶剂中，然后加入水中并稀释十倍最终体积为5mL。将所述混合溶液超声分散2分钟后置于50mL茄形瓶中，于通风橱搅拌8小时，最后将混合溶液通过0.22μm滤膜过滤，制备得到胶束。所制备得到的纳米制剂的相关参数，如表14所示。
表14
Figure BDA0003569012740000301
将化合物26制备成胶束，粒径约为108nm。该化合物26胶束(10μM)的水溶液，经700nm激发，可检测到拉曼位移894和1264cm-1处的特征峰。
实施例29：拉曼分子苯并[1,2-c：4,5-c']双([1,2,5]噻二唑)-4,7-双(4-氟噻吩-2-基)(化合物28)的合成
Figure BDA0003569012740000302
反应试剂和条件：
(a)四三苯基膦钯、1,4-二氧六环，105℃。
将4,7-二溴-苯并[1,2-c：4,5-c']双([1,2,5]噻二唑(化合物1，0.2g，0.57mmol)和四三苯基膦钯(57mg，0.05mmol)置于含有1,4-二氧六环(10mL)的50mL双颈瓶中，氮气保护下加入三丁基(4-氟-2-基)锡烷(化合物23，0.67g，1.60mmol)，氮气置换(×3)。将混合物在105℃下搅拌12小时后，冷却至室温。将混合物倒入水中并用二氯甲烷萃取，有机层用饱和氟化钾水溶液和盐水洗涤，然后用无水硫酸钠干燥，旋除溶剂，残余物通过柱色谱法纯化，以二氯甲烷：甲醇＝100∶1(v/v)作为洗脱剂，得到目标产物(0.17g，77％)，为蓝色固体。1H NMR(600MHz,THF-d8)δ6.88-6,86(d,2H)，6.74-6.69(d,2H).
化合物28分别经830nm激发，均可检测到拉曼位移894和1264cm-1处的特征峰。
实施例30：载化合物28胶束制剂的制备与评价
将2mg二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000和1mg化合物28溶解于四氢呋喃溶剂中，然后加入水中并稀释十倍最终体积为5mL。将所述混合溶液超声分散2分钟后置于50mL茄形瓶中，于通风橱搅拌8小时，最后将混合溶液通过0.22μm滤膜过滤，制备得到胶束。所制备得到的纳米制剂的相关参数，如表15所示。
表15
Figure BDA0003569012740000311
将化合物28制备成胶束，粒径约为109nm。该化合物28胶束(10μM)的水溶液，经830nm激发，可检测到拉曼位移894和1264cm-1处的特征峰。

Claims (7)

1.一类能产生拉曼光谱信号的有机化合物，其简称为：拉曼分子，具有894和1264cm-1拉曼位移的特征峰，其在聚集状态下，无需金属基底表面增强，经近红外光(700-900nm)照射产生强拉曼光谱信号；其结构通式如下：
Figure FDA0003569012730000011
其中，R1、R2、R3、R4是氢、羟基、醛基、氨基、卤素、C1-C20直链或支链烷基、含氧的C1-C20直链或支链杂烷基、环丙烷基、芳基(取代或非取代苯基和萘基)、杂芳基(取代或非取代噻吩基、吡啶基、吲哚基、呋喃基、吡咯基)、取代或非取代三苯胺基、取代或非取代四苯乙烯基。
2.按权利要求1所述的拉曼分子的制备方法，其特征在于，合成路线如下：
合成路线1：以4,7-二溴苯并双噻二唑和α或β位取代的三丁基(噻吩-2-基)锡烷为原料，经Stille反应得到目标产物，合成路线1反应式如下：
Figure FDA0003569012730000012
其中R1、R2、R3、R4是氢、羟基、醛基、氨基、C1-C20直链或支链烷基、含氧的C1-C20直链或支链杂烷基、环丙烷基、芳基(取代或非取代苯基和萘基)、杂芳基(取代或非取代噻吩基、吡啶基、吲哚基、呋喃基、吡咯基)、取代或非取代三苯胺基、取代或非取代四苯乙烯基；
上述反应路线1反应式中采用试剂：(a)四三苯基膦钯、1,4-二氧六环，反应温度为105℃。
3.按权利要求1所述的拉曼分子的制备方法，其特征在于，合成路线2如下：
合成路线2：采用合成路线1得到的β位取代的4,7-二噻吩基苯并双噻二唑为原料，经溴化和Suzuki反应得到目标产物，合成路线2反应式如下：
Figure FDA0003569012730000021
其中，R1、R2是氢、羟基、羧基、醛基、氨基、C1-C20直链或支链烷基、含氧的C1-C20直链或支链杂烷基、环丙烷基、芳基、杂芳基；R3、R4是芳基(取代或非取代苯基和萘基)、杂芳基(取代或非取代噻吩基、吡啶基、吲哚基、呋喃基、吡咯基)、取代或非取代三苯胺基、取代或非取代四苯乙烯基；
上述反应路线2反应式中采用试剂：(a)N-溴代琥珀酰亚胺、N,N-二甲基甲酰胺、氯仿，反应条件为冰浴；(b)2M K2CO3、四三苯基膦钯、芳基、杂芳基硼酸或芳基、杂芳基频哪醇硼酸酯、1,4-二氧六环，反应温度为105℃。
4.按权利要求1所述的拉曼分子，其特征在于，将所述的拉曼分子包载于脂质体材料制成脂质体制剂，使拉曼分子在制剂中聚集，经近红外光(700-900nm)照射，在894和1264cm-1拉曼位移产生强拉曼信号，实现体内拉曼成像；所述脂质体制剂的组成包括拉曼分子、磷脂类分子和二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇或衍生物，其中，磷脂类分子选自二棕榈酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、二硬脂酰磷脂酰胆碱、磷脂酰胆碱中的一种或几种的混合物；二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇及其衍生物选自二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇5000、二硬脂酰磷脂酰乙酰胺-聚乙二醇-氨基、二硬脂酰磷脂酰乙酰胺-聚乙二醇-马来酰亚胺、二硬脂酰磷脂酰乙酰胺-聚乙二醇-巯基中的一种或几种的混合物；拉曼分子与磷脂类分子的摩尔比为1:0.2-1:50，脂质体的粒径为50-1000nm。
5.按权利要求1所述的拉曼分子，其特征在于，将所述的拉曼分子包载于胶束材料制成胶束制剂，使拉曼分子在制剂中聚集，经近红外光(700-900nm)照射，在894和1264cm-1拉曼位移产生强拉曼信号，实现体内拉曼成像；所述胶束制剂的组成包括拉曼分子和二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇及其衍生物，其中，二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇及其衍生物选自二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇5000、二硬脂酰磷脂酰乙酰胺-聚乙二醇-氨基、二硬脂酰磷脂酰乙酰胺-聚乙二醇-马来酰亚胺、二硬脂酰磷脂酰乙酰胺-聚乙二醇-巯基中的一种或几种的混合物；拉曼分子与二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇及其衍生物的摩尔比为1:0.2-1:50，胶束的粒径为50-1000nm。
6.按权利要求1所述的拉曼分子，其特征在于，将所述的拉曼分子与白蛋白制备成纳米制剂，使拉曼分子在制剂中聚集，经近红外光(700-900nm)照射，在894和1264cm-1拉曼位移产生强拉曼信号，实现体内拉曼成像；所述纳米制剂的组成包括拉曼分子和白蛋白，其中，白蛋白选自人血清白蛋白、重组人血清白蛋白或牛血清白蛋白中的一种或几种的混合物；拉曼分子与白蛋白的摩尔比为1:0.2-1:50，白蛋白纳米制剂的粒径为50-1000nm。
7.按权利要求1所述的拉曼分子，其特征在于，将所述的拉曼分子包载于聚乙二醇类嵌段共聚物纳米粒子制成纳米制剂，使拉曼分子在制剂中聚集，经近红外光(700-900nm)照射，在894和1264cm-1拉曼位移产生强拉曼信号，实现体内拉曼成像；所述纳米制剂的组成包括拉曼分子和聚乙二醇类嵌段共聚物，其中，聚乙二醇类嵌段共聚物选自聚乙二醇-聚乳酸羟基乙酸嵌段共聚物、聚乙二醇-聚己内酯嵌段共聚物、聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物、聚乙二醇-聚碳酸酯嵌段共聚物的一种或者几种，拉曼分子与聚乙二醇类嵌段共聚物的摩尔比为1:0.2-1:50，纳米粒子的粒径为50-1000nm。
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