CN115137709A - 一种足细胞主动靶向的强化生物均质复合膜纳米药物递送系统及其制备方法和应用 - Google Patents

一种足细胞主动靶向的强化生物均质复合膜纳米药物递送系统及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及纳米药物传递系统技术领域，具体涉及一种仿生工程介导的足细胞主动靶向的强化生物均质复合膜纳米药物递送系统及其制备方法和应用。本方案的纳米药物传递系统包括内核和强化生物均质复合膜；内核包括加载有mTORC1抑制剂的中空纳米粒子，发挥抑制糖尿病肾病纤维化进展及改善代谢的作用；强化生物均质复合膜的原料包括与足细胞特异性靶向配体、二氧化铈量子点和同源红细胞膜，可针对足细胞特异性靶向，避免药物提前释放，逃逸免疫系统识别及清除活性氧自由基作用。本方案解决了使用mTORC1抑制剂带来的全身不良反应和局部治疗效率不理想的技术难题。本纳米药物传递系统可替代全身用药和实现诊疗一体化，具有广阔的应用前景。

Description

一种足细胞主动靶向的强化生物均质复合膜纳米药物递送系 统及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及纳米药物传递系统技术领域，具体涉及一种足细胞主动靶向的强化生物均质复合膜纳米药物递送系统及其制备方法和应用。
背景技术
糖尿病肾病(Diabetic kidney disease,DKD)是糖尿病的主要并发症之一，是终末期肾脏病(End-stage kidney disease,ESRD)的首要原因。在我国，糖尿病肾病为病因的约占慢性肾脏病的26.96％，其总人口约为2400万人。目前尽管采用强化降糖方案，积极控制血压，合理使用肾素血管紧张素拮抗剂等，但糖尿病向糖尿病肾病进展的比例仍然非常高，为给社会及经济带来沉重负担。尽管最新的研究显示，钠-葡萄糖协同转运蛋白2(Sodium–glucose cotransporter 2，SGLT2)能显著延缓糖尿病肾病进展，但采用SGLT2的病人，仍有9.2％的病人肾功能在2年内快速进展(肾小球滤过率下降超过50％，或进入ESRD)，其中4.7％的病人最终导致死亡。因此，寻找能有效延缓糖尿病肾病进展的治疗策略具有重要的意义及价值。
糖尿病肾病早期的病理特点是肾小球系膜及基底膜增生，肾小球肥大及肾小球屏障功能障碍。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物1(mammalian target of rapamycincomplex 1,mTORC1)信号通路是经典的能量-营养代谢相关通路，在糖尿病中被广泛激活，雷帕霉素(Rapamycin)是其经典抑制剂。在糖尿病肾病的临床及动物研究中发现，过量的营养如高糖、氨基酸，生长激素，氧化应激等可以刺激mTORC1及其下游信号通路激活并导致糖尿病肾病进展。动物实验表明，雷帕霉素可以抑制糖尿病肾病中过度激活的mTORC1信号通路，并抑制炎症因子释放，减轻肾脏纤维化，缓解氧化应激损伤，防止肾脏损伤进展。在非糖尿病小鼠中，靶向激活足细胞mTORC1信号通路可以诱导产生类糖尿病肾病表现，如肾小球基底膜增厚，系膜基质弥漫增多，足细胞丢失及蛋白尿。在肾脏纤维化的研究中表明，雷帕霉素可以通过选择性抑制mTORC1信号通路，抑制纤连蛋白，平滑肌骨架蛋白及胶原蛋白表达从而抑制肾脏纤维化，延缓肾功能进展。而雷帕霉素类似物及新一代的mTORC1抑制剂在糖尿病肾病中也同样具有通过抑制mTORC1激活发挥肾脏保护作用。
尽管目前动物试验中，mTORC1抑制剂，如雷帕霉素显示出较好的肾脏保护作用，但全身应用仍有潜在巨大风险。如在肾脏移植病人临床观察中发现，雷帕霉素使移植病人免疫功能下降，导致病毒感染风险增加34％，真菌感染风险增加16％。其次雷帕霉素可以使移植病人水肿发生率增加60％，及口腔溃疡发生率增加55％。再次在雷帕霉素治疗期间，约有高达90％的病人经历脱发及脱甲的困扰。在男性患者中，口服雷帕霉素可以引起睾丸功能丢失，并导致生殖功能障碍。合并代谢性疾病患者中全身应用雷帕霉素可以引起高脂血症，胰岛素抵抗增加，血糖难以控制等。长期低剂量使用雷帕霉素可以引起腹泻，贫血，创面愈合困难，关节疼痛等症状。因此减少mTORC1抑制剂全身不良反应，提高肾脏局部治疗效率，是糖尿病肾病新的治疗策略。亟需研发一种能克服mTORC1抑制剂的副作用并能够充分发挥其肾脏保护作用的制剂，以满足临床应用的需求。
发明内容
本发明意在提供一种足细胞主动靶向的强化生物均质复合膜纳米药物递送系统，以突破和解决使用mTORC1抑制剂治疗糖尿病肾病及经常规方式带来的全身不良反应和局部治疗效率不理想的技术问题。
为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种足细胞主动靶向的强化生物均质复合膜纳米药物递送系统，包括内核和强化生物均质复合膜；所述内壳加载有mTORC1抑制剂的中空纳米粒子。
本方案还提供了一种足细胞主动靶向的强化生物均质复合膜纳米药物递送系统的制备方法，包括以下依次进行的步骤：
S1：提取红细胞膜；
S2：制备DSPE-PEG(2000)-BMS-470539；
S3：通过共孵育法将mTORC1抑制剂装载入中空纳米粒子中，获得加载有mTORC1抑制剂的中空纳米粒子；
S4：将DSPE-PEG(2000)-BMS-470539和胆固醇溶解于三氯甲烷和甲醇组成的混合溶剂中，再经旋转蒸发获得脂质薄膜；脂质薄膜水化后与红细胞膜以及量子点混合孵育；然后加入加载有mTORC1抑制剂的中空纳米粒子，在冰浴条件下经过超声处理，获得ESC-HCM-B。
本方案还提供了一种足细胞主动靶向的强化生物均质复合膜纳米药物递送系统在制备治疗糖尿病肾病的药物中的应用。
本方案的原理及优点是：
本技术方案基于糖尿病肾病足细胞炎症因子诱导的抗炎症相关信号通路而设计开发一种足细胞靶向配体，从抗炎角度出发“一举两得”实现足细胞主动靶向。基于mTORC1信号通路激活导致糖尿病肾病进展事实，而肾脏获益与副作用不平衡角度，率先探索了选择性mTORC1抑制剂靶向足细胞对延缓糖尿病肾病进展的影响，为糖尿病肾病的治疗提供新的治疗策略。基于前期研究基础，优化载mTORC1选择性抑制剂的药物递送系统的理化表征，实现纳米递送系统稳定性能佳，智能隐身长循环，高效率足细胞主动靶向。基于延缓糖尿病肾病肾小球纤维化进展为目的，探究糖尿病肾病足细胞中mTORC1/TGF-β1信号轴之间的分子关系，首次阐明延缓肾小球纤维化的新机制。
本方案采用了基于纳米工程的药物递送系统，能有效的避免药物的药代动力学的局限性，提高生物利用度及局部药物作用浓度，减少药物全身不良反应。发明人前期合成并验证了一种基于糖皮质激素的纳米主动靶向肾小球足细胞的药物系统，该系统能实现可视化的近足细胞药物释放，提高近足细胞局部药物浓度，有效的缓解膜性肾病所致足细胞损伤。但该系统所载的糖皮质激素并不适用于糖尿病肾病的治疗，且该系统纳米粒径较大，约为190nm左右，肾小球滤过屏障穿透效率有限。本技术方案完全可以克服前期研究中的缺陷，研发了一种足细胞主动靶向的强化生物均质复合膜纳米药物递送系统，提供了一种糖尿病肾病治疗的新策略和一种替代传统全身用药并具有诊疗一体化的特异性策略。
综上，本方案的药物递送系统具有高效、特异性的肾脏内肾小球、足细胞靶向能力，可持续性地在足细胞区域缓释mTORC1抑制剂，并兼具“纳米酶”功能以修复高糖所致的慢性线粒体损伤，延缓糖尿病肾病进展。本方案开发的基于选择性mTORC1抑制剂的药物递送系统，实现主动靶向足细胞进行药物精准传递。靶向足细胞抑制肾小球内mTORC1信号通路，提供了一条延缓糖尿病肾病进展的新的治疗策略。
进一步，所述的中空纳米子包括但不限于中空介孔二氧化硅纳米粒子、金纳米颗粒和MOF纳米颗粒中的至少一种无机纳米粒子。
进一步，所述强化生物均质复合膜的原料包括DSPE-PEG(2000)-BMS-470539、胆固醇和红细胞膜杂化的强化生物均质复合膜；DSPE-PEG(2000)-BMS-470539由DSPE-PEG(2000)-COOH和BMS-470539化学共轭制备而成。
以中空纳米粒子主要载体，负载mTORC1抑制剂等的集成药物传递系统作为外源“入侵物”，免疫系统的识别并清除能力将可能对药物传递系统发起主动攻击。因此构建一种“隐身、伪装”的药物传递系统将极大提高足细胞精准药物递送效率。采用细胞膜涂层纳米技术，应用自上而下的方法提取红细胞膜，制备的仿生药物传递系统具备“隐身、伪装”功能，同时避免药物提前释放，延长血液循环时间。
除此之外，强化生物均质复合膜材料包括偶联有BMS-470539的DSPE-PEG(2000)-BMS-470539，具有主动足细胞靶向功能，BMS-470539具有集成稳定足细胞应力纤维、降低ROS功能。BMS-470539通过PEG进一步实现生物相容性均质复合膜表面功能化修饰，赋予本药物传递系统针对足细胞的特异性主动靶向功能。
进一步，所述强化生物均质复合膜上加载有量子点。
活性氧自由基(Reactive Oxide Species,ROS)在糖尿病肾病足细胞剥离和凋亡中起着至关重要的作用，量子点可清除炎症性疾病中ROS。量子点具有极小的粒径和水溶液中分散性不佳的特性，然而药物递送系统很好的解决了量子点分散性及生物相容性。因此，该治疗单元的集成将极大提高该药物传递系统抗氧化应激能力，进而保护足细胞功能和结构完整性的作用。
进一步，所述量子点为具有清除活性氧自由基作用的量子点；所述述mTORC1抑制剂包括但不限于依维莫司。二氧化铈量子点(CeO2量子点)为现有技术中常用的用于清除活性氧自由基的量子点。依维莫司为mTOR抑制剂中的一种，该类抑制剂具有被证实的保护足细胞作用，但全身应用严重的副作用限制该类药物的临床应用，因此本专利实施并不是单一纳米颗粒携带药物，而是基于自主研发的足细胞靶向基础上，利用纳米药物递送系统策略，实施精准药物传递，进一步扩展药物的临床应用范围。
进一步，中空纳米粒子和mTORC1抑制剂的质量比为1：1至2：1；DSPE-PEG(2000)-BMS-470539、胆固醇、红细胞膜和量子点的用量比为5mg：5mg：5ml：0.2mg。
进一步，CeO2量子点的粒径范围为3-5nm；中空纳米粒子的粒径为20-40nm、表面积不低于1000m2/g、孔体积不低于0.9cm3/g。
进一步，所述红细胞膜由如下方法制备：使用与选择的研究模型同源的物种的抗凝血，4℃条件下3500rpm离心10min，获取下层红细胞；使用低渗PBS处理下层红细胞，获得红细胞悬液；多次离心处理红细胞悬液再使用PBS洗涤至上层清澈透明，收获下层沉淀即为红细胞膜。
综上所述，本方案建立了一种足细胞主动靶向的强化生物均质复合膜纳米药物递送系统，它由中空纳米粒子负载mTORC1抑制剂构成核心，以同源红细胞膜和强化脂质薄膜杂化并装载量子点后形成强化均质复合膜封装核心，形成壳核结构。复合膜表面共轭足细胞主动靶向配体BMS-470539。该药物递送系统因核心中空纳米粒子而实现高载药，外壳复合膜以同源红细胞膜为主体，杂化强化脂质薄膜，使得该药物递送系统具备逃避免疫吞噬，自控阀门式缓释药物和高稳定性等特点。体外实验证明，在该药物递送系统安全可靠，无明显细胞毒性和促凋亡，具备高效率的足细胞靶向能力。特别的，该药物递送系统携带的量子点进一步放大了“纳米酶”作用，减少高糖诱导的足细胞ROS水平，保护线粒体损伤和恢复线粒体能量代谢机能。体内实验证明，该药物递送系统高度特异性的靶向肾脏内肾小球，足细胞区域，能有效延缓糖尿病肾病纤维化进展和改善代谢。
附图说明
图1为实施例1的ESC-HCM-B的合成过程示意图及其表征测定实验结果。
图2为实施例2的ESC-HCM-B的足细胞靶向性验证实验结果。
图3为实施例3的ROS水平测定结果。
图4为实施例4的CCK-8测定实验结果。
图5为实施例6的ESC-HCM的体内靶向性验证实验结果。
图6为实施例6的ESC-HCM-B的体内靶向性验证实验结果。
图7为实施例6的ESC-HCM体内生物分布测定结果。
图8为实施例6的ESC-HCM-B的体内生物分布测定结果。
图9为实施例7的治疗疗效和延缓糖尿病肾病纤维化进展评价实验结果。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步详细的说明，但本发明的实施方式不限于此。若未特别指明，下述实施例以及实验例所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，且所用的材料、试剂等，均可从商业途径得到。
实施例1：
(1)红细胞细胞膜提取
首先，5mL新鲜的大鼠血液在4℃条件下低温离心(3500rpm,10min),然后下层红细胞用低渗PBS(25％PBS，即溶质浓度为现有技术中常规的1×PBS的四分之一，25％PBS即为使用双蒸水和1×PBS配制的浓度为25％的低渗PBS)充分重悬并置于冰箱中过夜。将红细胞悬液反复离心(13000rpm,15min)，PBS洗涤至上层清澈透明，收获下层沉淀即为红细胞膜，-80℃保存备用。上述提取的全过程是在冰浴中进行的。
(2)制备药物递送系统
采用碳二亚胺法将BMS-α与DSPE-mPEG2000-COOH偶联，HMRI和傅里叶红外光谱验证DSPE-PEG-BMS-α化学共轭是否成功(合成过程参见在先专利CN111557926B靶向性相变纳米药物系统及其制备方法与应用)。化合物BMS-470539(简称BMS-α)具有高效性、高选择性特点，它只激活MC1R而不激活其它任何亚型的黑素受体。因此纳米系统构建时将BMS-α连接在纳米微球外表，药物系统能特异性识别足细胞，实现靶向输送纳米药物系统。
用共孵育法将RAD001装载入中空介孔二氧化硅纳米粒子(MS-NPs)(粒径20-40nm，表面积1000m2/g、孔体积0.9cm3/g，西安瑞禧生物)中。简而言之,在200μL无水乙醇中加入MS-NPs(20mg)和RAD001(20mg)，室温下摇床上共孵育48h，然后离心洗涤3次(13000rpm,10min)获得载RAD001的MS-NPs。其中，Everolimus(RAD001)是一种Rapamycin的衍生物,也是一种有效的,选择性的和口服活性的mTOR1抑制剂。
将红细胞膜与增强脂质膜杂交制备仿生强化生物均质复合膜。首先，将10mg杂化脂质按确定的质量比(DSPE-PEG-BMS-α:Chol＝1:1)溶解于5mL三氯甲烷(CHCl3)和2mL甲醇(CH3OH)组成的混合物中。将混合溶液在55℃水浴中连续旋转蒸发1h，得到脂质薄膜。接着加入1mL PBS直至脂质薄膜完全水化。然后将水合脂质溶液、5mL全血所提取的红细胞膜量和0.2mg CeO2量子点(粒径3-5nm，西安瑞禧生物)混合溶液在4℃下共孵育24h。孵育结束，加入负载RAD001的MS-NPs后，使用超声探头(美国sonic&Materials公司)在冰浴中400W超声4分钟。最后，将所得的该药物递送系统(以下简称为：ESC-HCM-B)在4℃下离心(8000rpm,10min)，洗涤3次，去除多余未被包被的强化生物均质复合膜。
除了ESC-HCM-B外，还制备了ESC-HCM和ES-HCM。ESC-HCM即相对于ESC-HCM-B的制备，其他制备条件不变，但是使用DSPE-PEG(2000)-COOH来替换DSPE-PEG(2000)-BMS-470539，形成非靶向的纳米药物传递系统；ES-HCM即相对于ESC-HCM的制备，其他制备条件不变，但是制备中未加入CeO2量子点。
(3)ESC-HCM-B的表征测定
用透射电镜(TEM,Hitachi H-7600,Japan)观察ESC-HCM-B等的形态和结构。采用激光粒度分析仪系统(Nano,ZS90,Malvern instrument,Ltd)测定MS-NPs和ESC-HCM-B的粒径分布。用malvern Zeta仪检测Zeta电位。利用TEM(JEEOL Ltd.，Japan)行元素扫描研究ESC-HCM-B中的N、O、Si和Ce元素，以确定是否成功合成。采用ICP-MS(PerkinElmer NexION300X)测定ESC-HCM-B中二氧化铈量子点的含量。CeO2量子点，BMS-α，RAD001和ESC-BCM-B的光学吸收特性评估由紫外-可见分光光度计测定(uv-3600，日本岛津)。RAD001的载药率采用高效液相色谱法测定(C18柱，4.6×150mm，5μm)，乙腈和水(86:14)作为流动相，柱温设定为60℃。
ESC-HCM-B的合成过程示意图及其表征测定参见图1。其中，图1A为ESC-HCB-B的合成过程(Chol：胆固醇)；图1B为透射电子显微镜(TEM)下MS-NPs的形貌，标尺为50nm；图1C-D为透射电子显微镜(TEM)下ESC-HCM-B的形貌(红色箭头示生物均质复合膜；蓝色箭头示CeO2量子点)，标尺为50nm；图1E为红细胞膜(RBCM)和ESC-HCM-B的凝胶电泳蛋白分析；图1F为MS-NPs和ESC-HCM-B的粒度分布；图1G为透射电子显微镜线性扫描ESC-HCM-B中N、O、Si和Ce元素；图1H为通过ICP-MS测定ESC-HCM-B中的CeO2量子点包封率(EE＝5.0495％)和载药率(LE＝0.0505％)；图1I为CeO2量子点、BMS-470539(BMS-α)、依维莫司(Everolimus)和ESC-HCM-B的紫外-可见光吸收光谱；图1J-K为不同浓度依维莫司(Everolimus)的高效液相色谱曲线及描绘的标准浓度曲线；图1L为通过高效液相色谱法测定ESC-HCM-B中依维莫司(Everolimus)的包封率(EE＝32.495％)和载药率(LE＝16.245％)。
(4)关于本方案的纳米粒的制备难度说明
(4.1)二氧化铈量子点负载难度
本技术方案首次将二氧化铈量子点负载到纳米粒上，如何实现稳定负载，没有现有文献可以参考。发明人首先尝试了将二氧化铈量子点负载到中空的介孔二氧化硅纳米粒子上。但是，二氧化铈量子点粒径范围为3-5nm，难以实现二氧化铈量子点在介孔二氧化硅纳米粒子上的有效负载。例如，发明人尝试使用共孵育法实现二氧化铈量子点在介孔二氧化硅纳米粒子上的负载，但是，经过多次工艺参数调整，二氧化铈量子点包封率和载药率远远低于本方案的5.0495％和0.0505％，无临床应用价值。因此，发明人放弃了将二氧化铈量子点负载到纳米粒上的方案，改变了原有的研发思路，尝试将二氧化铈量子点负载到纳米粒子的其他部分。
经过大量实验研究，通过采用“强化生物均质复合膜”的手段，可以将二氧化铈量子点有效负载到纳米粒子外层的强化生物均质复合膜上。经反复证实，通过上述手段二氧化铈量子点成功负载于药物递送系统上(透射电镜及能量扫描证实)。
现有技术中，通常为了增加纳米药物呈递系统的生物相容性，将红细胞膜覆盖在纳米粒子外侧，但从未在红细胞膜的基础上尝试参杂杂化脂质。红细胞为磷脂双分子层薄膜，具有流动性和不稳定性。制备获得强化生物均质复合膜，可以进一步提高纳米药物递送系统的稳定性，并确保负载药物不至于提前或过早释放。
综上，强化生物均质复合膜的技术点的采用获得了双重效果：增加红细胞膜的稳定性，进而增加纳米药物递送系统的稳定性；实现了二氧化铈量子点在纳米药物递送系统的成功负载。
现列举如下的实验尝试作为证明强化生物均质复合膜功能的对比实验：
发明人曾经尝试直接将二氧化铈量子点附着在红细胞膜上，即采用了前文“(2)制备药物递送系统”中的制备方法，但是，不将红细胞膜与增强脂质膜杂交制备仿生强化生物均质复合膜，将5mL红细胞膜和0.2mg CeO2量子点(粒径3-5nm)混合溶液在4℃下共孵育24h。按照该方法合成的药物递送系统，其二氧化铈量子点包封率和载药率均为低于检测能力下限(ICP法)。
除此之外，强化脂质膜的成分对于二氧化铈量子点的装载也非常关键。发明人曾经尝试杂化脂质只含有DSPE-PEG-BMS-α，不加Chol。即，将10mg DSPE-PEG-BMS-α溶解于5mL三氯甲烷(CHCl3)和2mL甲醇(CH3OH)组成的混合物中，然后其他的操作步骤和“(2)制备药物递送系统”一致。按照该方法合成的药物递送系统，其二氧化铈量子点包封率为1.5463％和载药率为0.0147％。
(4.2)中空介孔二氧化硅纳米颗粒的包被具有技术难度
均质生物复合膜包被中空介孔二氧化硅纳米颗粒具有十足技术性难度。我们尝试冰浴摇床孵育法，将强化生物均质复合膜包覆在负载RAD001的MS-NPs外。具体地：将水合脂质溶液、5mL红细胞膜和0.2mg CeO2量子点(粒径3-5nm)混合溶液在4℃下共孵育24h；孵育结束，加入负载RAD001的MS-NPs，在冰浴和摇床条件下共孵育48h，获得纳米粒。经透射电子显微镜观察，存在如下的问题：一方面是膜包被中空介孔二氧化硅纳米颗粒效率低下，大量视野中的中空介孔二氧化硅纳米颗粒未被有效包被；另外是包被成功的膜厚薄并不“均匀”，严重影响其在血液循环系统中的稳定性。
在上述失败的尝试之后，发明人进而尝试了经典的“超声声振法”，然而超声的功率和时间将严重影响制备效率和成功率，经反复尝试，我们得到如下参数下包被效率最高，形成的被膜厚薄最为“均匀、均质”：400W，4分钟，每5s运停间隔脉冲，采用上述超声处理条件可以实现100％的中空介孔二氧化硅纳米颗粒的包被率，包被成功的膜厚薄“均匀”。
(4.3)肾脏肾小球滤过屏障具有特殊性，需要特别设计的纳米药物递送系统才能实现靶向效果
基于肾脏肾小球滤过屏障特殊性，纳米药物递送系统的设计并不是简单将已知元素杂合，而是考虑药物递送系统的粒径范围、电位、药物精准释放门控等因素。为此我们经筛选金纳米颗粒、MOF类、有机类纳米材料、细胞外囊泡等，最终选定中空介孔二氧化硅纳米粒子。关于粒径范围于足细胞靶向关系，经反复体外细胞靶向实验，体内细胞靶向验证，我们选择20-40nm粒径范围的二氧化硅纳米粒子构建药物递送系统，能很好的靶向足细胞区域位点。如果选择粒径过大或者过小的二氧化硅纳米粒子，则获得的药物呈递系统的靶向性不佳，例如，我们选择使用100nm的二氧化硅纳米粒子，以及10nm左右的二氧化硅纳米粒子制备药物呈递系统。参照实施例2的方法进行足细胞靶向性研究，90min后流式细胞术检测荧光染细胞百分比，两种作为对比的药物呈递系统的靶向率(荧光染细胞百分比)分别为35.45％(100nm的中空二氧化硅纳米粒子)和95.65％(10nm的中空二氧化硅纳米粒子)，虽然越小粒径的中空二氧化硅纳米具有更高的足细胞靶向性，但是理论上纳米药物系统的载药率将降低，且被体内巨噬细胞吞噬系统的清除效率将增高。
(4.4)靶向配体引入红细胞膜具有较高技术性难度
足细胞靶向配体引入红细胞膜具有较高技术性难度。为了在红细胞膜上引入足细胞靶向配体，首先我们将足细胞靶向配体与一种磷脂“化学共轭”，实验证实足细胞靶向配体的“氨基”基团与磷脂“羧基”基团脱水缩合成功，经HMRI方法和细胞实验和体内实验验证，化学共轭后并不改变足细胞靶向配体兼具“抗炎”作用。
综上所述，本专利申请中具体实施案例中举例“依维莫司”为mTOR抑制剂中的一种，该类抑制剂具有被证实的保护足细胞作用，但全身应用严重的副作用限制该类药物的临床应用，因此本专利实施并不是单一纳米颗粒携带药物，而是基于自主研发的足细胞靶向基础上，利用纳米药物递送系统策略，实施精准药物传递，进一步扩展药物的临床应用范围。
实施例2：ESC-HCM-B足细胞靶向性研究
为研究ESC-HCM-B的体外靶向能力，实验分为以DiI标记的无靶组(ESC-HCM)和靶向组(ESC-HCM-B)。首先，将大鼠肾足细胞接种于共聚焦培养皿中培养，待合适的细胞融合程度。无靶组与靶向组分别取40μL(2.5mg/mL)包括新鲜培养基共孵育0.5h，1h，1.5h，2h和3h。在37℃，5％CO2条件下。共孵育相应时间后，用含4％多聚甲醛的PBS在室温下固定细胞15min，PBS洗涤3次。细胞核用DAPI室温下复染色10min，PBS洗涤3次后，共聚焦显微镜(CLSM)观察并记录荧光成像。流式细胞术进一步评价细胞靶向效果，按照上述实验方案将细胞分组，接种于6孔板中，37℃，5％CO 2，加湿培养箱中培养24h。共孵育后，PBS洗涤，消化，离心，收集细胞，PBS洗涤。最后，用流式细胞仪分析靶向结合量。
实验结果如图2所示，图2A为DiI红色荧光染料标记的ESC-HCM和ESC-HCM-B分别与足细胞共孵育0.5h、1h、1.5h和3h后激光共聚焦显微镜观察其与足细胞的靶向结合率和分布；图2B为DiI红色荧光染料标记的ESC-HCM和ESC-HCM-B分布与足细胞共孵育0min、20min、40min、60min和90min后流式细胞术检测荧光染细胞百分比。
实施例3：ROS水平测定
大鼠足细胞(北京北纳生物)按照1×103密度接种于96孔板，细胞生长至融合度约60％后予以高糖(75mM)诱导48h，然后接受如下各种治疗方案后测定ROS水平。空白对照组(PBS)，RAD001组，MS-NPs组，CeO2量子点组，ES-HCM组，ESC-HCM组，ESC-HCM-B组。37℃，5％CO2条件下治疗24h后，加入25μM DCFDA孵育45min，洗涤2次。以过氧化叔丁基氢处理组为阳性对照组。CLSM观察，半定量方法对荧光强度进行分析。ROS、ATP和NAD水平测定结果参见图3，足细胞分组治疗后共孵育DCFDA。图3A为激光共聚焦显微镜观察结果；图3B为半定量分析ROS水平(Mean±SD，n＝6，荧光半定量分析，随机选取6个细胞测定荧光强度)；图3C为足细胞分组治疗后共孵育DCFDA，流式细胞术检测ROS水平。在图3中HG为普通饮食，HHG为高糖饮食(75mM)；图3C和图3A中的a-h分别依次代表图3B中的从左到右的横坐标所代表的实验组。
实施例4：CCK-8测定
大鼠足细胞以每孔1×104密度接种于96孔板中培养24h。分组如下:空白对照组(PBS)，RAD001组，MS-NPs组，CeO2量子点组，ES-HCM组，ESC-HCM组，ESC-HCM-B组。实验变量的剂量是相当的。首先，新鲜培养基含有各种实验变量添加到96孔板,取而代之的是10μLCCK-8方案和190μL无血清培养基添加于每孔并孵化24h。37℃，5％CO2条件下再孵育4h。吸光度测量由微型板块分光光度计系统在OD＝460nm处测定。
实验结果参见图4。其中，图4A为各组分孵育后流式细胞术分析细胞凋亡水平；图4B为MSNPs不同浓度与足细胞共孵育后CCK-8法测定细胞增殖与细胞毒性；图4C为Everolimus不同浓度与足细胞共孵育后CCK-8法测定细胞增殖与细胞毒性；图4D为ESC-HCM-B不同浓度与足细胞共孵育后CCK-8法测定细胞增殖与细胞毒性；图4E为各组分与足细胞共孵育后CCK-8法测定细胞增殖与细胞毒性。
实施例5：建立Ⅱ型糖尿病肾病大鼠模型
基因敲除鼠：以C57鼠背景，定制瘦素基因敲除鼠模型(db/db)。
STZ诱导：健康雄性SD大鼠120-150g，所有程序符合伦理及动物福利法。标准饲养条件下，自由获取高脂高糖饮食(10％猪油，20％蔗糖，2.5％胆固醇，0.5％胆酸钠，67％基础饲料)和水2个月。糖尿病肾病模型构建采用腹腔内注射0.1M柠檬酸盐缓冲液配置的新鲜的链脲菌素(STZ)，45mg/Kg体重。连续3天空腹血糖≥16.7mmol/L认定为糖尿病大鼠，通过尿蛋白，血清白蛋白，肌酐等指标判定糖尿病肾病模型。
实施例6：体内靶向性和生物分布
为研究ESC-HCM-B的体内足细胞靶向能力，实验分为以DiI为标记的无靶组(ESC-HCM)和靶向组(ESC-HCM-B)。无靶组与靶向组分别取生理盐水溶解的500μL(2.5mg/mL)。通过尾静脉注射后获取4h，8h，12h，16h，24h和48h的肾脏、心、肝、脾、肺组织，制备冰冻切片，DAPI复染后，共聚焦显微镜下观察(λex/λem＝488nm/525nm,λex/λem＝544nm/595nm和λex/λem＝400nm/450nm)。
ESC-HCM的体内靶向性实验结果参见图5：荧光探针DiI标记的ESC-HCM经尾静脉注射，在注射前及注射4h，8h，16h，24h，48h获取新鲜肾脏组织立即冰冻切片，DAPI复染(蓝色)细胞核，共聚焦显微镜下观察(λex/λem＝488nm/525nm,λex/λem＝544nm/595nm和λex/λem＝400nm/450nm)，第1列标尺为2000μm，第2列标尺为100μm，第3-6列标尺为40μm。
ESC-HCM-B的体内靶向性实验结果参见图6：荧光探针DiI标记的ESC-HCM-B经尾静脉注射，在注射前及注射4h，8h，16h，24h，48h获取新鲜肾脏组织立即冰冻切片，DAPI复染(蓝色)细胞核，共聚焦显微镜下观察(λex/λem＝488nm/525nm,λex/λem＝544nm/595nm和λex/λem＝400nm/450nm)，第1列标尺为2000μm，第2列标尺为100μm，第3-6列标尺为40μm。
ESC-HCM体内生物分布实验结果参见图7：荧光探针DiI标记的ESC-HCM经尾静脉注射，在注射前及注射4h，8h，16h，24h，48h获取新鲜肾心、肝、脾及肺组织立即冰冻切片，DAPI复染(蓝色)细胞核，共聚焦显微镜下观察(λex/λem＝544nm/595nm和λex/λem＝400nm/450nm)，标尺为500μm。
ESC-HCM-B的体内生物分布实验结果参见图8：荧光探针DiI标记的ESC-HCM-B经尾静脉注射，在注射前及注射4h，8h，16h，24h，48h获取新鲜肾心、肝、脾及肺组织立即冰冻切片，DAPI复染(蓝色)细胞核，共聚焦显微镜下观察(λex/λem＝544nm/595nm和λex/λem＝400nm/450nm)，标尺为500μm。
实施例7：体内治疗及疗效评估
治疗分组如下：空白对照组(生理盐水),RAD001组，MS-NPs组，CeO2量子点组，ES-HCM组，ESC-HCM组，ESC-HCM-B组。含RAD001组据其5mg/Kg/d为标准，根据包封率计算各组用量。未含RAD001组以相同浓度(质量)中空二氧化硅纳米粒子为标准。尾静脉注射。
为期8周治疗，结束获取肾脏组织，行PAS染色，PASM染色，天狼猩红染色。
治疗疗效和延缓糖尿病肾病纤维化进展评价实验结果参见图9：治疗后肾脏组织通过PAS染色、天狼猩红染色(Sirius red staining)以及PASM染色评估治疗疗效和延缓肾脏纤维化作用。实验结果表明：ESC-HCM-B组治疗和延缓糖尿病肾病纤维化的效果最佳。
以上所述的仅是本发明的实施例，方案中公知的具体技术方案和/或特性等常识在此未作过多描述。应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明技术方案的前提下，还可以作出若干变形和改进，这些也应该视为本发明的保护范围，这些都不会影响本发明实施的效果和专利的实用性。本申请要求的保护范围应当以其权利要求的内容为准，说明书中的具体实施方式等记载可以用于解释权利要求的内容。

Claims (10)

1.一种足细胞主动靶向的强化生物均质复合膜纳米药物递送系统，其特征在于：包括内核和强化生物均质复合膜；所述内核为加载有mTORC1抑制剂的中空纳米粒子。
2.根据权利要求1所述的一种足细胞主动靶向的强化生物均质复合膜纳米药物递送系统，其特征在于：所述的中空纳米子包括中空介孔二氧化硅纳米粒子、金纳米颗粒和MOF纳米颗粒中的至少一种无机纳米粒子。
3.根据权利要求2所述的一种足细胞主动靶向的强化生物均质复合膜纳米药物递送系统，其特征在于：所述强化生物均质复合膜的原料包括DSPE-PEG(2000)-BMS-470539、胆固醇和红细胞膜杂化的强化生物均质复合膜；DSPE-PEG(2000)-BMS-470539由DSPE-PEG(2000)-COOH和BMS-470539化学共轭制备而成。
4.根据权利要求2所述的一种足细胞主动靶向的强化生物均质复合膜纳米药物递送系统，其特征在于：所述强化生物均质复合膜上加载有量子点。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的一种足细胞主动靶向的强化生物均质复合膜纳米药物递送系统，其特征在于：中空纳米粒子和mTORC1抑制剂的质量比为1：1至2：1；DSPE-PEG(2000)-BMS-470539、胆固醇、红细胞膜和量子点的用量比为5mg：5mg：5ml：0.2mg。
6.根据权利要求5所述的一种足细胞主动靶向的强化生物均质复合膜纳米药物递送系统，其特征在于：所述量子点为具有清除活性氧自由基作用的量子点，其包括二氧化铈量子点；所述mTORC1抑制剂包括依维莫司。
7.根据权利要求6所述的一种足细胞主动靶向的强化生物均质复合膜纳米药物递送系统，其特征在于：CeO2量子点的粒径范围为3-5nm；中空纳米粒子的粒径为20-40nm、表面积不低于1000m2/g、孔体积不低于0.9cm3/g。
8.根据权利要求7所述的一种足细胞主动靶向的强化生物均质复合膜纳米药物递送系统的制备方法，其特征在于：包括以下依次进行的步骤：
S1：提取红细胞膜；
S2：制备DSPE-PEG(2000)-BMS-470539；
S3：通过共孵育法将mTORC1抑制剂装载入中空纳米粒子中，获得加载有mTORC1抑制剂的中空纳米粒子；
S4：将DSPE-PEG(2000)-BMS-470539和胆固醇溶解于三氯甲烷和甲醇组成的混合溶剂中，再经旋转蒸发获得脂质薄膜；脂质薄膜水化后与红细胞膜以及量子点混合孵育；然后加入加载有mTORC1抑制剂的中空纳米粒子，在冰浴条件下经过超声处理，获得ESC-HCM-B。
9.根据权利要求8所述的一种足细胞主动靶向的强化生物均质复合膜纳米药物递送系统的制备方法，其特征在于：所述红细胞膜由如下方法制备：使用与选择的研究模型同源的物种的抗凝血，4℃条件下3500rpm离心10min，获取下层红细胞；使用低渗PBS处理下层红细胞，获得红细胞悬液；多次离心处理红细胞悬液再使用PBS洗涤至上层清澈透明，收获下层沉淀即为红细胞膜。
10.根据权利要求1-7中任一项所述的一种足细胞主动靶向的强化生物均质复合膜纳米药物递送系统在制备治疗糖尿病肾病的药物中的应用。
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