CN115135144A

CN115135144A - 大豆中饱和脂肪的增加

Info

Publication number: CN115135144A
Application number: CN202180012006.9A
Authority: CN
Inventors: 单奇伟; 扎卡里·德莫雷斯特; 詹姆斯·普雷斯奈尔
Original assignee: Carrickett Co
Current assignee: Hibos International LP; Cibus Europe BV
Priority date: 2020-01-31
Filing date: 2021-02-01
Publication date: 2022-09-30
Also published as: BR112022014799A2; EP4096392A1; US20230062896A1; WO2021155376A1; JP2023519087A; CA3165554A1; WO2021155376A8

Abstract

提供了制备由调节SACPD‑C基因、FATB‑1A基因、或SACPD‑C和FATB‑1A基因两者的表达的一个或多个突变导致的油组成改变的大豆变种的材料和方法。例如，提供了大豆植物、植物部分或植物细胞，其所产生的油与由缺失所述一个或多个突变的相应的大豆植物、植物部分或植物细胞产生的油相比，具有增加的饱和脂肪酸含量。

Description

大豆中饱和脂肪的增加

背景技术

大豆(Glycine max)由于其能够固定大气氮，是全球重要的豆类作物。大豆也用作主要的动物饲料蛋白来源，并且大豆油应用范围覆盖从烹饪/煎到工业用途和生物柴油。大豆油包含11％棕榈酸(C16∶0)、4％硬脂酸(C18∶0)、23％油酸(C18∶1)、54％亚油酸(C18∶2)和7.6％亚麻酸(C18∶3)。总饱和脂肪酸(棕榈酸和硬脂酸)占比总脂肪酸组成的约15％。

上述的大豆油的脂肪酸组成可能并不太适于用在特别食物和化妆品生产应用中。可以通过化学氢化克服一些限制，但是部分氢化导致产生的反式脂肪酸与不利的健康效果相关联。棕榈油或棕榈仁油，两者均来自于油棕树(油棕(Elaeis guineensis))，已经替代部分氢化油用于食物应用中，因为棕榈油在室温下是固态以及其馏分产生出宽范围的功能性熔化曲线。该油具有高熔点以及高饱和脂肪，其是使乳膏和化妆品产生期望的肌肤感的理想之选，并且增加糖果点心口感。棕榈油的独特化学性还能够耐受烹饪高温，该油抗腐败使得含有该油的产品具有更长的货架期。

棕榈油的栽培经常涉及到环境可持续问题，使得棕榈油并不是受欢迎的选择。存在为棕榈油用于食物和化妆品用同寻找替代品的压力。基于外来脂肪诸如乳木果、可可脂以及其他脂肪的非棕榈脂肪的主要缺点之一是原材料价格高昂。而且，这些脂肪可能也具有可持续问题。液态油像油菜籽油、葵花籽油或大豆油不能在各种应用中完全替代棕榈馏分。极其希望能够提供具有充分提升了棕榈酸和硬脂酸含量的大豆变种，以产生在应用中与棕榈油馏分的具有相同特性的固态脂肪。

对大豆油的营养成分和商业质量上的改进能够进一步增加基于油类的产品的价值。需要改变大豆油含量和组成从而增加饱和脂肪酸含量来提供更高营养含量和更大稳定性的产品。而且，具有增加的饱和脂肪酸含量的大豆油可以降低对工业氢化多元不饱和油以用于食物应用的需求，因此降低了与反式脂肪相关的对健康的负面影响。

发明内容

本公开的特征在于大豆植物、植物部分和植物细胞产生具有提升的饱和脂肪酸含量的油。本文提供用于创建产生具有以重量计占总脂肪酸含量大于约15％的饱和脂肪酸含量的大豆的大豆变种的材料和方法。本公开至少部分地基于以下发现：在大豆植物、植物部分或植物细胞中调节SACPD-C基因、FATB-1A基因、或者SACPD-C和FATB-1A基因两者的表达的突变，该突变能够增强饱和脂肪酸诸如硬脂酸和棕榈酸的积累，在其固态脂肪或馏分生产中无需氢化即具有棕榈油、可可脂或其他外来脂肪的功能性熔化曲线。而且，本公开基于调节SACPD-C基因、FATB-1A基因、或者SACPD-C和FATB-1A基因两者表达的靶向突变，其避免与随机诱变有关的多向性缺陷，诸如完全敲除突变体或者非特异性过度表达突变体在发育上可见的有害影响。

相应地，本公开的一方面特征为包括调节SACPD-C基因、FATB-1A基因、或者所述SACPD-C和FATB-1A基因两者的表达的一个或多个突变的大豆植物、植物部分或植物细胞，其中与缺失所述一个或多个突变的相应的大豆植物、植物部分或植物细胞产生的油相比，所述植物、植物部分或植物细胞产生的油具有增加的饱和脂肪酸含量，以及其中调节SACPD-C基因的表达的所述一个或多个突变包括由稀有切割内切核酸酶诱导的靶向突变。所述大豆植物、植物部分或植物细胞能够包括导致所述SACPD-C基因表达降低的突变。导致所述SACPD-C基因表达降低的所述突变可以是在所述SACPD-C基因的一个或多个等位基因或者其可操作连接的启动子中的突变。导致所述SACPD-C基因表达降低的突变也可以是敲除突变。所述敲除突变可以是种子特异性敲除突变。所述种子特异性敲除突变可以包括将在所述SACPD-C基因的天然基因组基因座处的种子特异性启动子替换为在发育大豆种子中低活性或没有可检测活性的启动子。导致所述SACPD-C基因表达降低的所述突变可以在SEQID NO：17、20、23、26、29、32、35、38、41、44或47中所示的序列中。导致所述SACPD-C基因表达降低的所述突变可以是可操作地连接至在发育大豆种子中低活性或没有可检测活性的启动子的功能性SACPD-C基因的敲入突变。在以上一种或多种实施方式中的在发育大豆种子中低活性或没有可检测活性的所述启动子可以是瘤特异性基因启动子。在以上的一种或多种实施方式中，所述大豆植物、植物部分或植物细胞包括导致所述FATB-1A基因表达增加的突变。增加所述FATB-1A基因表达的所述突变可以是将所述FATB-1A基因的内源性启动子靶向替换为过度表达启动子。所述过度表达启动子能够是强种子特异性启动子，任选地FAD2A启动子或FAD2B启动子。

另一方面，本公开特征为一种用于生成包括有调节SACPD-C基因、FATB-1A基因、或者所述SACPD-C和FATB-1A基因两者的表达的突变的大豆植物的方法，包括：

(a)将来自产生具有饱和脂肪酸含量占总脂肪酸组成约15％的油的大豆植物中的大豆植物细胞群与一种或多种核酸序列接触诱导：

(i)导致所述SACPD-C基因表达降低的突变，其中所述突变是由稀有切割内切核酸酶诱导的靶向突变；

(ii)导致所述FATB-1A基因表达增加的突变；或

(iii)其组合；

(b)从所述群中选择细胞，所述细胞中SACPC-C基因表达降低、所述FATB-1A基因表达增加、或SACPC-C基因表达降低并且所述FATB-1A基因表达增加，和

(c)将所选择的植物细胞再生成为大豆植物。

降低所述SACPD-C基因表达可以包括诱导在所述SACPD-C基因的一个或多个等位基因或者其可操作连接的启动子中的突变。所述诱导突变可以是敲除突变或种子特异性敲除突变。降低所述SACPD-C基因表达可以包括将在SACPD-C基因的天然基因组基因座处的种子特异性启动子替换为在发育大豆种子中低活性或没有可检测活性的启动子。降低所述SACPD-C基因表达可以进一步包括将包括可操作地连接至在发育大豆种子中低活性或没有可检测活性的启动子的功能性SACPD-C基因的表达盒递送至大豆植物细胞群。在发育大豆种子中低活性或没有可检测活性的启动子可以是瘤特异性启动子。在上述的一种或多种实施方式中，所述方法可以包括通过将所述FATB-1A基因的内源性启动子替换为过度表达启动子增加所述FATB-1A基因的表达。增加所述FATB-1A基因的表达可以包括将包括一个或多个所述FATB-1A基因拷贝的表达盒递送至所述大豆植物细胞群。所述FATB-1A基因的一个或多个拷贝可以可操作地连接至强种子特异性启动子。

在另一方面，本公开的特征为一种大豆油组合物，包括由调节SACPD-C基因、FATB-1A基因、或者所述SACPD-C和FATB-1A基因两者的表达的一个或多个突变的大豆植物、植物部分或植物细胞产生的大豆油，其中与缺失所述一个或多个突变的相应的大豆植物、植物部分或植物细胞产生的油相比，所述大豆油具有增加的饱和脂肪酸含量，以及其中调节所述SACPD-C基因的表达的所述一个或多个突变包括由稀有切割内切核酸酶诱导的靶向突变。所述大豆油组合物可以具有大于10％的硬脂酸含量、大于10％的棕榈酸含量或大于20％的饱和脂肪酸含量，其中所有百分比基于所述油的总脂肪酸的重量。

一个或多个实施例详细描述于下文的说明之中。其他特征、目标和优势将在说明书和权利要求书中变的显而易见。

附图说明

本撰写公开描述了示例性实施方式，其是非限制性和未穷尽的。在附图中，并不是必要地依比例绘制，相似附图标记基本上描述了贯穿几种视图的相似部件。具有不同字母后缀的相似附图标记表示基本上相似的部件不同实例。附图基本上，以实例的方式但不是限制的方式，示例本文件中所讨论的各种实施方式。

参考附图中所描述的示例性实施方式，其中：

图1显示在不同组织中的瘤特异性基因Glyma05g01360、Glyma13g44970和Glyma14g27990(SACPD-C)的表达谱。

图2显示在不同组织中的种子特异性基因FAD2A(Glyma10g42470)、FAD2B(Glyma20g24530)和FATB-1A(Glyma05g08060)的表达谱。

图3A-B显示描述归一化之后在不同组织中的候选基因表达谱的表1：(A)包括嫩叶、花、一cm豆荚、豆荚壳(盛开之后10和14天(DAF))、根和瘤组织；和(B)包括种子组织(10、14、21、25、28、35和42DAF)。

图4显示描述用于调节GmSACPD-C基因表达(SEQ ID NO：15-47)的TALEN的表2，根据本公开的一种或多种实施方式(例如，方法1A和1B)。

图5显示描述用于调节GmFATB-1A基因表达(SEQ ID NO：48-62)的TALEN的表3，根据本公开的一种或多种实施方式(例如，方法1C)。

图6A-B显示来自再生T0植物的若干个已确认的突变谱的代表性GmSACPD-C DNA序列。下划线序列表示TAL效应物内切核酸酶的靶位点。(A)野生型GmSACPD-C序列在SEQ IDNO：63中示出，以及突变体序列在SEQ ID NO：64-66中示出。(B)其他突变体序列在SEQ IDNO：67-70中示出。

图7显示来自再生T0植物的若干个已确认的突变谱的代表性GmSACPD-C DNA序列的对齐。下划线序列表示TAL效应物内切核酸酶的靶位点。野生型GmSACPD-C序列在SEQ IDNO：71中示出，以及突变体序列在SEQ ID NO：72-76中示出。

图8A-B描述用于SACPD-C的种子特异性沉默的方法1B。(A)示例用于靶向包括TALEN对和供体模板的SACPD-C编码序列的上游的示例性双生病毒二元载体的组分。瘤特异性启动子和5′UTR(Glyma13g44970)的2kb序列侧接有左同源臂(LHA)和右同源臂(RHA)。(B)示出在被核酸酶切割和与供体模板复制子进行同源重组时的基因靶向事件。根据本公开的一种实施方式，靶向启动子替换供体模板序列在SEQ ID NO：79中示出以及预期编辑RHA序列在SEQ ID NO：80中示出。

图9显示方法1B的代表性靶向启动子替换供体模板序列(SEQ ID NO：79)。

图10示出使用图9的模板(SEQ ID NO：80)替换内源性SACPD-C基因启动子的预期编辑的RHA序列。

图11A-B描述用于FATB-1A的种子特异性过度表达(OE)的方法1C。(A)示出用于靶向包括TALEN对和供体模板的FATB-1A的编码序列的上游的示例性双生病毒二元载体的组分，被LHA和RHA侧接。(B)示出在被核酸酶切割和与供体模板复制子进行同源重组时的基因靶向事件。

图12显示方法1C的代表性靶向启动子替换供体模板序列(SEQ ID NO：81)。

图13显示用于产生具有SACPD-C和FATB-1A的组织特异性表达的植物、植物部分或植物种子的方法2A的DNA构建体的代表，所显示的构建体包括两个表达盒：具有SAPCD-C的编码序列和Glyma13g44970的启动子(瘤特异性)和终止子序列的盒1和具有FATB-A1编码序列和FAD2A的启动子和终止子序列的盒2。用于方法2A的代表性构建体的序列显示在SEQ IDNO：82中。

具体实施方式

本公开特征为能够用于产生具有由于在植物细胞内涉及调节脂肪酸合成基因的表达的一个或多个突变而提升了饱和脂肪酸含量的油的大豆植物、植物部分和植物细胞，以及用于生成所述植物和源自所述植物的油的方法。本文所描述的方法可以用于生成含有具有至少10％的硬脂酸含量和/或至少10％的棕榈酸含量的油的大豆变种。在一些实施方式中，通过完全地或以种子特异性方式改变大豆SACPD-C基因的表达或过度表达大豆FATB-1A基因实现油组成的改变。根据本文提供的一些方法，使用非转基因技术实现修饰。本文所描述的靶向突变最小化或避免在大豆作物中能够导致有害表型的多向性效应。

定义

对于本公开，术语定义如下：

术语“顺基因”是指具有编码来自植物本身或性相容供体植物的性状的天然基因的植物的基因修饰。顺基因修饰是与转基因修饰相区别的，其中植物是由来自不可杂交种的基因或由合成基因进行遗传修饰。

“内源性基因”是指核酸分子，其包含存在于野生型植物中的野生型序列的序列，或具有允许其保留编码产物的功能的同一性百分比的序列，例如具有至少90％同一性的序列，并且可以从植物或植物部分的细胞获得，或者可以合成产生。进一步的实施方式提供具有至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的序列。在本文描述的实施方式中，在与野生型基因的基因座不同的基因座处能够插入内源性基因核苷酸序列以及可操作地连接至与野生型基因不同的启动子。

“SACPD”指Δ9-硬脂酰-酰基载体蛋白脱饱和酶。相应地，“SACPD基因”指编码Δ9-硬脂酰基-酰基载体蛋白脱饱和酶蛋白的基因。在大豆中已经鉴定出SACPD基因的三种异构体。该基因的异构体中的两种，SACPD-A和SACPD-B，均在营养和生殖组织中表达，而第三种，SACPD-C(Glyma14g27990)，主要在发育种子和瘤中表达。

“FATB”指编码棕榈酰基载体蛋白硫酯酶的基因。

术语“大豆植物”或“植物部分”广泛用于包括处于任何发育阶段的大豆植物，或大豆植物的一部分，包括植物插条、植物细胞、植物细胞培养物、植物器官、植物种子和秧苗。植物细胞是植物的结构和生理单元，包括原生质体和细胞壁。植物细胞可以是分离的单个细胞或细胞聚集体的形式，例如脆弱的愈伤组织或培养细胞，或者可以是更高组织单元的一部分，例如植物组织、植物器官或植物。因此，植物细胞可以是原生质体、产生配子的细胞，或者可以再生成整株植物的细胞或细胞集合。因此，包含多个植物细胞并且能够再生成完整植物的种子被认为是用于本公开目的的植物细胞。植物组织或植物器官可以是种子、原生质体、愈伤组织或组织成结构或功能单元的植物细胞的任何其他组。植物的特别有用的部分包括可收获的部分和可用于后代植物繁殖的部分。植物的可收获部分可以是植物的任何有用部分，例如花、花粉、幼苗、叶、茎、种子荚、种子、根、瘤等。可用于繁殖的植物部分包括例如种子、种子荚、插条、幼苗、根茎等。“种子”是指植物胚珠在其开花的正常成熟点后继续分化而形成的任何植物结构，无论其是否在受精情况下形成，也无论种子结构是否受精。

“表达盒”意指能够引导特定核苷酸序列在适合宿主细胞中表达的DNA序列，包括可操作地连接至目的核苷酸序列的启动子，其任选地可操作地连接至终止信号和/或其他调控元件。表达盒还可以包括核苷酸序列的需要合适翻译的序列。编码区通常编码目的蛋白但也可以编码目的功能性RNA，例如在正义或反义方向上的反义RNA或者非翻译RNA。包括目的核苷酸序列的表达盒可以是嵌合的，意指它的组分的至少一个相较于它的其他组分的至少一个是异源。表达盒也可以是自然发生但是已经以对于异源表达有用的重组形式获得的那个。表达盒可以是全部细胞外组装成(例如，通过重组克隆技术)。然而，表达盒也可以是部分地使用内源性组分组装成。例如，表达盒可以通过置入(或插入)内源性序列的启动子序列上游而获得，其因此由所述启动子序列功能性地连接和控制。

A.SACPD-C基因表达突变体

本公开的实施方式特征为包括调节SACPD-C基因表达的一个或多个突变的大豆植物、植物部分或植物细胞。一个或多个突变可以存在于SACPD-C基因的编码或非编码序列中。所述一个或多个突变能够存在于SACPD-C基因内，即在该基因的开放阅读框内，或在SACPD-C基因的调节表达区域处，即在SACPD-C基因的调节区内，或者其组合。例如，干扰SACPD-C启动子的结合序列的启动子-靶向的突变能够降低SACPD-C基因的表达。在一些情况下，改变SACPD-C基因的表达的一个或多个突变存在于SACPD-C基因的内含子区、外显子区、增强子区、启动子区、非翻译区(UTR 5′或3′)或这些区中的两个或更多个的组合中。Glycine max SACPD-C基因的基因组序列是公开可用的。例如，SACPD-C基因的天然基因组序列Glyma.14g27990能够从Soybase Database(www.soybase.org)下载。调节SACPD-C基因的表达的突变可以在该基因的一个或多个等位基因中。自然发生的Glycine max SACPD-C核苷酸序列的编码序列的代表性实例示出在(SEQ ID NO：1)中。编码CDS不包含天然内含子，并且编码与天然基因组序列相同的多肽。在一些实施方式中，本文所提供的大豆植物、细胞、植物部分、种子和其后代可以具有在每个内源性SACPD-C等位基因或它的启动子(例如，种子特异性启动子)中的突变，使得在植物中或在特定组织中该基因的表达被降低或完全抑制。因此，在一些情况下，植物、细胞、植物部分、种子、和后代不显示由内源性SACPD-C基因表达的A9-硬脂酰基-酰基载体蛋白脱饱和酶的可检测水平。

在某些实施方式中，SACPD-C基因或其启动子的突变降低所述表达。降低植物、植物部分或植物细胞中基因的表达包括抑制、中断、敲除或敲低基因，使得与相应的其中基因或多肽的表达未被抑制、中断、敲除或敲减的对照植物、植物细胞或者植物群或植物细胞群相比，基因的转录和/或编码的多肽的翻译降低。例如，使用RNAi技术可以进行基因敲减。降低涵盖与相应的对照植物、植物细胞或者植物群或植物细胞群相比表达水平的任何减少(例如，减少10％或更多、20％或更多、30％或更多、40％或更多、50％或更多、60％或更多、70％或更多、80％或更多、90％或更多或者甚至100％)。在一些实施方式中，将表达降低50％或更多可能特别有用。可以使用方法诸如逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)、Northern印迹、斑点杂交、原位杂交、核连缀(nuclear run-on)和/或核失控(nuclear run-off)、RNase保护或免疫学和酶促方法诸如ELISA、放射免疫测定和蛋白质印迹来测量表达水平。

在一些情况下，本文提供的植物、植物细胞、植物部分、种子和后代能够使用稀有切割内切核酸酶(例如，转录激活因子样效应物核酸酶(TALE核酸酶))系统生成以在SACPD-C基因的一个或多个等位基因中进行靶向敲除。靶向敲除的基因能够具有在SEQ ID NO：1或与SEQ ID NO：1具有75％序列同一性的SACPD-C基因中示出的编码序列。

在特定核酸和由特定序列识别号指定的序列之间的序列同一性百分比是以如下确定。首先，使用来自包含BLASTN版本2.0.14的独立版本的BLASTZ的BLAST 2 Sequences(B12seq)程序将核酸与特定序列识别号所示的序列进行比较。如果所比较的两条序列具有同源性，则指定的输出文件会将那些同源的区域显示为对齐的序列。如果所比较的两条序列不具有同源性，则指定的输出文件将不显示对齐的序列。一旦对齐，则通过对两条序列中显示的相同核苷酸残基的位置的数目进行计数来确定匹配的数目。通过如下确定序列同一性百分比：将匹配数目除以所识别的序列(例如，SEQ ID NO：1)中示出的序列的长度，或除以铰接长度(例如，来自所识别的序列中示出的序列的100个连续核苷酸或氨基酸残基)，然后将结果值乘以100。将序列同一性百分比值四舍五入到最接近的十分之一。例如，敲除基因可以具有与SEQ ID NO：1至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性的编码序列。

本公开提供了用于使用稀有切割内切核酸酶(例如，TALE-核酸酶)以生成大豆植物及相关产物(例如，种子和植物部分)的材料和方法，所述大豆植物及相关产物因SACPD-C基因的靶向敲除，特别适用于提供高饱和脂肪酸油。还可以使用其他序列特异性核酸酶生成希望的植物材料，包括工程化兆核酸酶/归巢内切核酸酶(例如I-SceI或I-CreI)、锌指核酸酶(ZFN)和簇状规则间隔短回文重复序列(CRISPR)/CRISPR-关联蛋白9(Cas9)。

稀有切割内切核酸酶可以是天然的或经改造的蛋白质，其具有针对具有长度为约12-40bp(例如长度为14-40、15-36或16-32；参见，例如，Baker，Nature Methods 9：23-26，2012)的识别序列(靶序列)的核酸序列的内切核酸酶活性。典型的稀有切割内切核酸酶在其识别位点内引起切割，留下4个核苷酸(nt)交错切口，带有3′OH或5′OH突出端。在一些实施方式中，稀有切割内切核酸酶可以是兆核酸酶，诸如野生型或变体归巢内切核酸酶(例如，属于十二肽家族的归巢内切核酸酶(参见WO 2004/067736)。稀有切割内切核酸酶的另一种类型在本文称为“Cas9/CRISPR系统”。该系统特征为组合使用来自细菌Cas9家族的内切核酸酶和引导所述内切核酸酶至通常20个碱基对的DNA靶序列的单链引导RNA。一般选择该DNA靶标置于称为PAM(原间隔相邻基序)序列基序(NGG或NAG)的基因组上游，由Cas9识别。引导RNA分子(gRNA)，通常是导向进入活细胞内部使Cas9进行切割和具有特异性的单链RNA。它是设计为在基因组上游中将期望的20bp序列匹配PAM的合成RNA。Belhaj等人(2013)已经综述Cas9/CRISPR在植物中的使用，其以引用的方式并入。在一些实施方式中，稀有切割内切核酸酶可以是包含DNA结合结构域和具有切割活性的催化结构域的融合蛋白。TALE核酸酶和ZFN是DNA结合结构域与内切核酸酶FokI的催化结构域融合的例子。定制的TALE核酸酶可商购，商标名TALEN^TM(Cellectis，巴黎，法国)。转录激活因子样(TAL)效应物的特异性取决于效应物可变重复序列。多态性主要存在于本文称为重复可变双残基(RVD)的重复位置12和13处。

TAL效应物的RVD以直接、线性的方式对应于其靶位点中的核苷酸，一个RVD对应一个核苷酸，具有一定的简并性，没有明显的环境依赖性。该蛋白质-DNA识别机制使得能够进行针对新靶标特异性TAL效应物的靶位点预测，以及对所选择位点具有结合特异性的新TAL效应物的靶位点选择和工程化。

TAL效应物DNA结合结构域可以与其他序列诸如内切核酸酶序列融合，使得嵌合内切核酸酶靶向特定的所选择DNA序列，并导致随后在靶序列处或附近切割DNA。例如，在DNA中这样的切割(双链断裂)可以通过NHEJ或同源重组诱导突变成野生型DNA序列。在一些情况下，TALE核酸酶可以用于在复杂基因组中高精度和高效率地协助定点诱变、敲除或另外改变基因功能。如本文所描述，靶向G.max SACPD-C基因的TALE-核酸酶可以用于诱变内源性基因，导致植物或植物组织检测不到SACPD-C的表达。一些内切核酸酶(例如，FokI)用作二聚体的事实可以用于增强TALE-核酸酶的靶特异性。例如，在一些情况下可以使用一对TALE核酸酶单体靶向不同的DNA序列(例如，在图4；SEQ ID NO：16和17、19和20、22和23、25和26、28和29、31和32、34和35、37和38、40和41、43和44、and 46和47中示出的靶序列)。在所述过程中有用的相关序列包括公开序列中的“功能变体”。功能变体包括例如具有一个或多个核苷酸替换、缺失或插入的序列以及其中该变体保留所需活性。功能变体可以通过本领域技术人员可用的多种方法中的任意一种来创建，诸如通过定点诱变、诱导突变、鉴定为等位基因变体、通过使用限制酶进行切割等。

当两个TALE核酸酶识别位点接近时，失活的单体可以聚在一起创建切割DNA的功能性酶。通过需要DNA结合来激活核酸酶，可以创建高位点特异性限制酶。可以根据本文其他处的描述执行用于选择内源性靶序列和生成靶向这样的序列的TALE-核酸酶的方法。参见例如美国专利申请公开No.US 201I/0145940A1(2011年六月)，其通过援引并入。在一些实施方式中，软件特异性鉴定TALE-核酸酶识别位点。

本公开的方法包括使用稀有切割内切核酸酶(例如，TALE核酸酶)生成在一种或多种内源性基因中具有突变的大豆植物、植物细胞或植物部分。例如，可以将编码靶向选择的SACPD-C序列的TALE核酸酶的一种或多种核酸(例如，SACPD-C序列，“hitSeq”显示在表2中(图4，即，SEQ ID NO：15、18、21、24、27、30、33、36、39、42或45，或与表2中的序列具有至少95％的同一性的序列)转到植物细胞中(例如，原生质体)，并在那里将它们表达出来。在一些情况下，可以将一种或多种TALE核酸酶蛋白引入到植物细胞中(例如，原生质体)。随后可以分析细胞或植物细胞系或从细胞生成的植物部分，从而确定突变是否已经在(一个或多个)靶位点处被引入，如以上描述通过基于核酸测定或基于蛋白质测定来检测表达水平，例如，或使用基于核酸测定(例如，PCR和DNA测序，或PCR后进行T7E1测定)来检测在基因组基因座处的突变。在T7E1测定中，可以从合并的愈伤组织中分离基因组DNA，并且可以对SACPD-C的TALE核酸酶识别位点侧翼的序列进行PCR扩增。然后可以对扩增产物进行变性和重新退火。如果重新退火的片段形成异源双链，则T7内切核酸酶I在错配位点切割。可以通过凝胶电泳可视化消化的产物以量化TALE核酸酶的诱变活性。

在一些实施方式中，本文提供的方法可以包括使具有功能性SACPD-C等位基因的大豆植物细胞群与靶向内源性SACPD-C序列的稀有切割内切核酸酶接触，从细胞群中选择至少一个SACPD-C等位基因已经被失活的细胞，以及培育所选择的细胞成为大豆植物。所述植物可以产生与不含有失活的SACPD-C等位基因的对照大豆植物相比具有提升的饱和脂肪酸水平的油。稀有切割内切核酸酶可以通过编码稀有切割内切核酸酶的核酸(例如，载体或mRNA)或作为蛋白质引入细胞群中。在一些情况下，本文提供的方法可以包括培养含有(一个或多个)失活的SACPD-C等位基因的植物细胞以生成一种或多种植物品系的步骤。另外，或可替换地，本文提供的方法可以包括从植物细胞中分离包含至少SACPD-C基因座的一部分的基因组DNA的步骤。

在一些实施方式中，用于递送序列特异性核酸酶到大豆植物的方法可以包括用编码序列特异性核酸酶的T-DNA对植物部分或植物细胞(例如叶、茎、叶柄、节间外植体、愈伤组织或原生质体)进行农杆菌(Agrobacterium)介导的转化、用编码序列特异性核酸酶的一种或多种核酸对植物部分或植物细胞进行基因枪转化和/或用纯化的序列特异性核酸酶或编码序列特异性核酸酶的核酸(RNA或DNA)对植物部分或植物细胞进行细胞穿透肽介导的转化。基因枪转化利用粒子轰击。已经使用本方法在包括大豆的不同作物植物中递送基因组编辑试剂。粒子轰击是基于使用金属粒子(例如金或钨粒子)将核酸序列直接递送至植物细胞内。该系统可以经改造后递送蛋白质。待递送的核酸序列可以是DNA，包括大的DNA片段和RNA，诸如mRNA。例如，使用DNA，本方法包括使用DNA包被粒子，以及将包被粒子以高速射向植物组织，目的是渗透植物组织和细胞壁，因此一些粒子寄宿在植物细胞内部。一旦进入细胞内部，DNA洗脱粒子并且瞬时表达或稳定整合入宿主基因组。核酸序列向细胞的物理递送规避了有时遇到农杆菌(Agrobacterium)的宿主范围限制，并且不需要二元载体。可以使用粒子轰击转化各种组织和细胞类型。借助共转化的高频率能够递送多质粒。递送的其他方法包括根据在本领域的标准方法的昆虫载体、移植或DNA损伤(DNA abrasion)。

在一些实施方式中，可以通过聚乙二醇(PEG)介导的转化生成在一个或多个SACPD-C等位基因中具有突变的大豆系。例如，可以从表面经灭菌的叶子中分离原生质体，并在PEG存在下用编码一种或多种序列特异性核酸酶的质粒转化。可以通过递送可检测的标志物例如YFP质粒来监测转化效率，可以使用荧光显微镜或流式细胞仪对该可检测的标志物进行可视化。在PEG介导的转化后，可以使用原生质体培养领域普通技术人员已知的方法和培养基培养原生质体。经过适当长的培养时间后，鉴定为突变体的衍生自原生质体的愈伤组织可以生长，转移到芽诱导培养基中，然后(一旦形成根)转移到土壤中并生长至成熟用于种子生产。

在一些实施方式中，可以通过瞬时递送或稳定整合进入宿主基因组实现将一种或多种序列特异性核酸酶递送至大豆植物中。为了瞬时递送序列特异性核酸酶，可以将转化的大豆植物部分或植物细胞(使用上述方法)置于不含选择剂的再生培养基上，并且可以再生大豆植物。可以筛选再生植物以鉴定含有核酸酶诱导的突变的那些植物。为了将基因组工程化试剂稳定地整合到宿主基因组中，可以将编码序列特异性核酸酶的核酸与编码植物可选择标志物的核酸共同递送。可选择标志物可以与(一种或多种)序列特异性核酸酶位于同一载体上，或者可以作为单独的载体递送。转化后，可以将大豆植物部分或植物细胞置于含有适当的可选择剂的再生培养基上，以及可以再生成转基因大豆植物。在优选实施方式中，大豆植物不包括转基因。

在一些实施方式中，使用本文所描述的递送方法(例如粒子轰击)可以将核酸酶与编码一种或多种核酸外切酶蛋白的质粒共同递送至植物细胞，以提高序列特异性核酸酶诱导的诱变效率。这种核酸外切酶包括但不限于核酸外切酶的TREX(治疗红细胞交换外切核酸酶)家族的成员，例如TREX2。其他的外切核酸酶也可以用于本文提供的方法中。

另一个可以用于本文所提供的方法中的基因组工程工具基于来自II型原核CRISPR(聚簇有规律间隔的短回文重复序列)适应性免疫系统的RNA引导的Cas9核酸酶。该系统允许切割侧接短序列基序的DNA序列，所述短序列基序称为原间隔相邻基序(PAM)。切割是通过工程化与靶序列互补的特定crRNA实现的。crRNA联结异源表达的Cas9内切核酸酶一起进入活细胞中。在crRNA/Cas9复合物中，双重反式crRNA：crRNA结构充当引导RNA，其将Cas9内切核酸酶引导至同源靶序列。在大豆SACPD-C基因中存在的PAM基序允许设计对SACPD-C基因特异性的crRNA，以在其中转染和然后表达Cas9内切核酸酶和crRNA的大豆植物细胞中引入突变或使一个或多个SACPD-C等位基因失活。在一些实施方式中，因此，该方法可以用于获得如本文所描述的SACPD-C突变体植物。

通过将包括植物基因的基因组或编码序列的核酸序列的拷贝插入到与植物基因的基因座不同的基因组基因座中可以改变植物基因的表达。基因组或编码序列的拷贝可操作地连接至启动子以及其中不同基因组基因座有转录活性。待插入的序列可以是顺基因或内源性，并且可以从植物获得或合成创建。在一些情况下，本文提供的方法可以涉及原始内源性SACPD-C基因的靶向敲除和包括顺基因SACPD-C基因的编码序列的SACPD-C表达盒的插入，所述顺基因SACPD-C基因可操作地连接至在另一个基因组基因座处提供期望表达谱的启动子。通过“可操作地连接”，各个编码序列在框内融入到启动子，使得编码序列被忠实地转录、剪接和翻译。基因组基因座中盒插入处可以是基因组中与原始内源性SACPD-C基因不同的位置。基因座可以是在与原始内源性SACPD-C基因不同的染色体上，或在相同的染色体上。优选的，插入处是在与内源性基因相同的染色体上，插入的基因组基因座将不引发原始内源性SACPD-C基因的启动子的转录活性。

所述启动子是由DNA分子的区域，典型地转录开始点处的上游(一般接近RNA聚合酶II的起始位点)所组成的表达对照序列。启动子涉及RNA聚合酶和其他蛋白质的识别和结合以启动和调节转录。启动子典型地包括至少核心(基础的)启动子。启动子还可以包括至少一个控制元件诸如上游元件。所述元件包括上游激活区域(UAR)以及，可选地，影响多核苷酸的转录的其他DNA序列诸如合成上游元件。在本方法中有用的启动子的选择取决于要实现的期望表达的类型。因素包括但不限于效率、选择能力、可诱导性、期望的表达水平和细胞或组织的特异性。例如可以使用使得分别仅在或占优势地在特定组织、器官和细胞类型之中转录的组织-、器官-和细胞-优选的启动子。在一些实施方式中，对营养组织诸如茎、薄壁组织、基本分生组织、维管束、形成层、韧皮层、皮层、芽尖分生组织、侧枝分生组织、根尖分生组织、侧根分生组织、叶原基、叶肉或叶表皮特异性的启动子可以是适合的调节区域。在一些实施方式中，在种子中不激活的启动子可以是有用的。启动子的其他类别包括但是不限于，诱导型启动子，诸如使得转录对诱导子，诸如外部刺激诸如化学剂、发育刺激或环境刺激响应的启动子。启动子可以是针对植物的特定组织、器官或其他部分的优势表达的启动子，或者可以在发育的特定阶段期间或者在特定条件下表达。当提及优势表达时，其意指在特定植物组织中比在其他植物组织中更高水平的表达。

目的启动子可以具有强或弱转录活性。技术人员理解，可以修饰启动子序列以提供一定表达水平范围的和可操作地连接的异源核酸分子。通常，“弱启动子”意指驱动编码序列以低水平表达的启动子。“低水平”意指约1/10,000转录物至约1/100,000转录物至约1/500,000转录物的水平。相反，强启动子驱动编码序列以高水平表达，或者以约1/10转录物至约1/100转录物至约1/1,000转录物。认可的是，为了增加转录水平，能够利用增强子联合启动子区。

使用原始内源性SACPD-C基因的敲除突变改变表达，能够导致所有SACPD-C基因表达受到可操作地连接的启动子的控制。对于敲入的SACPD-C，可以期望是瘤特异性启动子。在一些情况下，本方法包括鉴定匹配期望表达谱的内源性基因，以及克隆内源性基因的调控元件。例如，用于纳入用于瘤特异性SACPD-C表达的表达盒中的合适启动子可以包括，例如，瘤特异性基因Glyma05g01360和Glyma13g44970的启动子。SEQ ID2-5显示用于Glyma05g01360和Glyma13g44970的启动子和终止子序列。在其他条件下，可以期望是组织特异性、阶段特异性或诱导性表达。

可以采用提供高效转化的任何方法。例如，用于植物细胞转化的方法包括Ti-或Ri-质粒、微注射、电穿孔、DNA粒子轰击、脂质体融合等的应用。在很多情况下，期望具有由T-DNA在一边或双边接界的构建体，特别地具有左和右边界，更特别地右边界。这在当构建体使用根癌农杆菌(A.tume向ciens)或发根农杆菌(A.rhizogenes)作为转化模式时特别有用，尽管可能会发现T-DNA边界与其他转化模式一起使用。

在一种实施方式中，本文提供的方法可以涉及原始内源性SACPD-C基因的靶向敲除和SACPD-C(基因组或CDS)的靶向插入到具有在目的启动子附近的基因序列的基因座之中。敲除原始内源性SACPD-C基因能够导致所有SACPD-C基因表达受目的启动子控制。优选的，所述启动子在发育种子中是不激活的，例如瘤或根特异性启动子。在其他条件下，可以期望获得阶段特异性或诱导性表达。在一些情况下，本方法包括鉴定匹配期望表达谱的内源性基因。用于鉴定具有期望表达特征的几种方法和软件程序是可获得的。这些包括但是不限于RNA测序(全转录物组鸟枪法测序)。一旦鉴定了具有期望表达谱的基因，可以理解，与由启动子表达的实际基因相对，启动子序列(通常目的基因的上游或附近)是本方法所使用的关键组分。最后步骤是确定需要引发鉴定的启动子的转录活性的基因组编辑的特定类型。

在一些情况下，本文所提供的方法可以涉及SACPD-C基因的种子特异性敲除。例如，能够将双生病毒序列用作靶向载体基因来靶向SACPD-C基因的内源性启动子和将SACPD-C基因的内源性启动子替换为在发育种子中不激活的启动子。双生病毒是包含环形、单链DNA基因组的植物病毒的大家族，其序列能够用作基因靶向载体。例如，可以工程化双生病毒基因组以包含被同源序列侧接至靶基因座的期望的修饰。在一些情况下，这可以通过将非必需双生病毒核苷酸序列(例如CP序列)替换为期望的修复模板来完成。双生病毒的实施例包括卷心菜卷叶病毒、番茄金色花叶病毒、大豆黄矮病毒、非洲木薯花叶病毒、小麦矮缩病毒、芒草条斑病毒、烟草黄矮病毒、番茄黄叶卷曲病毒、大豆金色花叶病毒、甜菜卷曲顶病毒、玉米条纹病毒和番茄假卷曲顶病毒。

相应地，修复模板包含与内源性SACPD-C基因的启动子序列的同源性。典型地，修复模板包括在植物内将替换内源性靶序列的核酸，由与内源性序列同源的序列侧接到靶标的任何一边上。侧翼同源序列可以称为“同源臂”。在这种情况下，内源性序列被替换为以上描述的启动子序列之一。在修复模板内，侧翼同源序列可以具有任何适合的长度。侧翼同源序列的适合长度将与期望的替换的长度相关。因此，所述长度可以是最少约25nt和包括750nt或更长的序列。在一些情况下，侧翼同源序列能够长于800nt、900nt，或长于1,000nt。可以使用本领域中标准的技术制备修复模板和DNA病毒质粒。可以使用例如基因枪轰击将包含修复模板的(一种或多种)构建体递送至植物细胞。替换地，根据在本领域的标准方法可以使用农杆菌(Agrobacterium)-介导的转化、昆虫载体、移植或DNA损伤来递送修复模版。

除了修复模板，本方法涉及能够定制以靶向特定核苷酸序列和在那个序列处或附近产生双链断裂的内切核酸酶。所述定制的内切核酸酶的实施例包括ZFN、兆核酸酶和TALE核酸酶以及以上描述的CRISPR/Cas系统。类似于TALE核酸酶，例如，能够在双生病毒构建体中将CRISPR/Cas系统(Cas9内切核酸酶和crRNA和反式crRNA，或cr/反式crRNA杂交体)递送至细胞。

在用修复模板和缔合的内切核酸酶感染或转染植物后，可以使用任何合适的方法确定内源性SACPD-C基因的种子特异性敲除是否发生。例如，可以使用基于PCR的方法确定基因组靶位点是否包含修复模板序列，和/或在修复模板的5′和3′端是否发生精确重组。

公开的策略可以将常规育种与以上描述的靶向方法相结合。可以在目的大豆的任何植株、种或品种上实施SACPD-C基因表达靶向基因编辑，不限于此。在一些实施方式中，可以在已经具有产生具有提升的饱和油含量的油的特征(例如遗传预先倾向性)的种质或其他植物组织中实施靶基因编辑或其他遗传修饰。

B.FATB-1A基因表达突变体

本公开的实施方式特征为包括调节FATB-1A基因表达的一个或多个突变的大豆植物、植物部分或植物细胞。一个或多个突变可以是在FATB-1A基因的调节区中，诸如FATB-1A基因的增强子区、启动子区、UTR区(5′或3′)、沉默子区或区的组合。与Glycine max FATB-1A基因座缔合的基因组序列是公开可用的。例如，能够从Soybase Database(www.soybase.org)下载天然大豆FATB-1A基因的序列Glyma05g08060。突变可以在与内源性FATB-1A基因不同的基因组基因座处。例如，自然发生的G.max FATB-1A核苷酸序列(例如，代表序列显示于(SEQ ID NO：6)中)的编码序列可以插入到基因组的任何基因座中，或插入多个基因座中，因此提供至少两种功能性FATB-lA基因。编码CDS不包含天然内含子，并且编码与天然基因组序列相同的多肽，使得该基因的表达在植物中或在特定组织中(例如，在发育种子中)被提升或增加。因此，在一些情况下，植物、细胞、植物部分、种子和后代显示由一种或多种大豆FATB-1A基因表达的酰基-ACP硫酯酶的水平提升。

可以修改以上描述的用于调节SACPD-C基因表达的基因编辑技术以增强FATB-1A的表达。在一种或多种实施方式中，本文提供的方法可以涉及将FATB-1A启动子靶向替换为过度表达启动子。该启动子可以是天然大豆启动子，其可以是种子特异性启动子诸如编码β-伴球蛋白和凝集素的基因的启动子。可以基于种子特异性基因的表达谱选择适合的启动子。在一些情况下，本方法包括鉴定匹配期望表达谱的内源性基因。用于鉴定具有期望表达特征的几种方法和软件程序是可获得的。这些包括但是不限于RNA测序(全转录物组鸟枪法测序)。一旦鉴定了具有期望表达谱的基因，可以理解，与由启动子表达的实际基因相对，启动子序列(通常目的基因的上游或附近)是本方法所使用的关键组分。最后步骤是确定需要引发鉴定的启动子的转录活性的基因组编辑的特定类型。合适的种子特异性启动子可以是在发育的特定阶段驱动表达的启动子。优选的，所述启动子在发育种子中提供高表达。更优选的，在种子中的高表达，例如发育种子，与在其他组织中无或者很低水平的表达相结合。在一些情况下，所述启动子来自编码脂肪酸脱饱和酶的基因。例如，如在实施例中的描述，发明人已经鉴定GmFAD2A(Glyma10g42470)和GmFAD2B(Glyma20g24530)的表达谱是驱动FATB-1A过度表达的适合候选者。因此，能够设计双生病毒靶向内源性FATB-1A启动子并且将内源性FATB-1A启动子替换为内源性FAD2A或FAD2B基因的启动子。能够基于5′-UTR序列设计靶向FATB-1A5′-UTR区的TALEN。示例性TALEN在图5(表3)中示出，其显示SEQ ID NO：49和50、52和53、55和56、58和59以及61和62。

在一些情况下，可以不靶向大豆FATB-1A的突变增强表达。例如，能够将包括可操作地连接至强启动子或种子启动子的大豆FATB-1A基因的编码序列的表达盒插入到任何基因组基因座中(例如，通过基因枪法)。能够基于期望的表达谱选择适合的顺基因启动子。例如能够基于在发育种子中高表达并且在其他组织中无或者低水平表达来选择启动子。在一些情况下，可操作地连接的启动子可以是SEQ ID NO：7或8中所示的序列。所述盒可以包括GmFAD2A(Glyma10g42470)或GmFAD2B(Glyma20g24530)(分别是SEQ ID NO：9和10)的终止序列。

增加的表达涵盖与相应的对照植物、植物细胞或者植物群或植物细胞群相比在总表达水平中任何程度的增加(例如，增加10％或更多、20％或更多、30％或更多、40％或更多、50％或更多、60％或更多、70％或更多、80％或更多、90％或更多或者甚至100％或更多)。例如，与对照植物、植物细胞或其群相比，表达能够增加约2倍、约5倍或约10倍。可以使用方法诸如逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)、Northern印迹、斑点杂交、原位杂交、核连缀(nuclear run-on)和/或核失控(nuclear run-off)、RNase保护或免疫学和酶促方法诸如ELISA、放射免疫测定和蛋白质印迹来测量表达水平。

公开的策略可以将常规育种与以上描述的靶向方法相结合。可以在目的大豆的任何植株、种、或品种上实施FATB-1A基因表达靶向基因编辑，不限于此。在一些实施方式中，可以在已经具有产生具有提升的饱和油含量的油的特征(例如遗传预先倾向性)的种质或其他植物组织中实施靶基因编辑或其他遗传修饰。

C.混合性状

以具有调节SACPD-C和FATB-1A基因两者表达的突变的大豆植物、植物部分或植物细胞为特征的实施方式落在本公开的范围内，其中与由缺失一个或多个突变的相应大豆植物、植物部分或植物细胞产生的油相比，所述植物、植物部分或植物细胞产生具有增加的饱和脂肪酸含量的油。特别地，本公开特征为具有超过一种导向增加产生的油的饱和脂肪酸含量的突变的植物品系。在一些情况下，植物品系能够提供与大豆硬脂酰基-ACP脱饱和酶的组织特异性表达和/或大豆硬脂酰基-ACP硫酯酶的过度表达相配合的一种或多种其他目的序列的转录或转录和翻译。

提供的用于组合效应的转化植物可以涉及使用多个单独的核酸构建体或转化事件。例如，可以通过相同或不同的方法将如上所述的多个构建体引入植物细胞中，包括通过在单个转化载体中纳入两个转录盒来引入这样的性状，同时转化两个表达构建体，用表达一个具有第二基因的表达构建体的构建体的植物组织重新转化，或通过传统植物育种方法杂交转基因植物，只要所得产物是具有整合到其基因组中的两种特征的植物。在一些情况下，使用以上描述的构建体转化和再生大豆植物。具有期望序列的再生植物自交以移除基因编辑质粒和保留靶向突变。然后能够杂交具有特定突变的结果为无效分离子(nullsegregant)植物品系以提供表现组合效应的植物种子或植物。例如，能够将种子特异性SACPD-C敲除品系的无效分离子与种子特异FATB-1A过度表达品系的无效分离子相杂交，以及能够将泛敲除SACPD-C品系的无效分离子与以种子特异性方式过度表达SACPD-C和FATB-1A两者的无效分离子相杂交。

能够利用方法的任何组合实现GmSACPD-C和GmFATB-1A基因的组合调节。例如，组合调节可以包括TALEN介导的一个或多个SACPD-C等位基因的敲除、包括可操作地连接至GmSACPD-C的编码序列的瘤启动子的第一线性顺基因盒的插入、以及包括可操作地连接至GmFATB-1A的编码序列的种子启动子的第二线性顺基因盒的插入。在一些情况下，第一线性顺基因盒具有SEQ ID NO：13中所示的序列，其包括瘤Glyma13g44970启动子-GmSACPD-C-Glyma13g44970终止子，以及第二线性顺基因盒具有SEQ ID NO：14中所示的序列，其包括种子FAD2A启动子-GmFATB1A-FAD2A终止子。

从个体、致突变植物细胞(以及由其成长的植物)中能够获得一种或多种大豆植物，以及植物中的至少一种可以被鉴定为包含调节SACPD-C基因或FATB-1A基因的表达的突变。提供共享总基因库的大豆植物群。例如，可以用“M₀”表示暴露于TAL效应物核酸酶的植物细胞(以及由其长成的植物)，而“M₁”表示由M₀植物自花授粉产生的种子，以及由所述种子长成的植物。“M₂”是自花授粉Mi植物的后代(种子和植物)，“M₃”是自花授粉M₂植物的后代，以及“M₄”、“M₅”、“M₆”等是上一代的自花授粉植物的各自后代。如本文使用的术语“自交”意指自花授粉。

在一些情况下，植物中的至少一个可以鉴定为包含在SACPD-C基因中的突变以及植物中的至少一个可以被鉴定为包含敲入SACPD-C基因。携带等位基因大豆植物可用于植物育种程序中以产生新颖且有用的品系和品种。因此，在一些实施方式中，将在内源性SACPD-C基因中包含突变的大豆植物与包含可操作地连接至在发育种子中不驱动表达的启动子的SACPD-C基因的至少一个插入的第二大豆植物相杂交，杂交的后代被鉴定其中显示有所述基因突变。在其他实施方式中，包含调节SACPD-C基因表达的至少一个突变和调节FATB-1A基因表达的至少一个突变的大豆植物与第二大豆植物相杂交，以及杂交的后代被鉴定其中显示有所述基因突变。应理解的是，第二大豆植物能够包含与其杂交的植物相同的突变、不同的突变或在SACPD-C或FATB-1A基因表达上是野生型。

可以通过已知程序进行育种。可以将DNA指纹、SNP或类似技术用于标志物辅助选择(MAS)育种程序，以将调节SACPD-C或FATB-1A等位基因的突变转移或培育到其他大豆植物中。例如，育种人能够创建从包括具有农艺期望的基因型的突变等位基因的基因型的杂交中分离的群。可以使用从突变序列或其片段中培育的标志物筛选F₂或回交后代中的植物。可以将经鉴定具有所述突变的的植物回交或自花授粉以创建待筛查的第二群。在回交以辅助鉴定所期望的个体植物的每个循环之前，将所选择的植物进行自花授粉可能是必要的，这取决于期望的遗传方式或使用的MAS技术。在轮回亲本的期望表型被恢复之前，能够重复回交或其他育种程序。

成功的杂交产生可繁育的F₁植物并且如果需要可以与亲本之一回交。在一些实施方式中，针对SACPD-C和FATB-1A基因表达来筛选在F₂代中的植物群，例如，植物被鉴定为在发育种子中未表达SACPD-C以及由于根据本标准方法的突变的过度表达FATB-1A。选择的植物然后与亲本中的一个杂交以及将第一回交(BC₁)代植物进行自花授粉以产生BC₁F₂群并且针对变体基因表达被再筛选。重复回交、自花授粉和筛选的工艺，例如至少四次，直至最终筛选产生可繁育以及与轮回亲本合理相似的植物。该植物，如果需要能够自花授粉，以及随后可以再次筛选后代以确认该植物在发育种子中缺少SACPD-C表达以及过度表达FATB-1A。任选地能够对所选的植物执行细胞遗传学分析以确认染色体组分和染色体配对关系。能够使用包括例如油分析以确定包括硬脂酸和棕榈酸的饱和脂肪酸的水平的标准方法产生育种人的选择的植物的种子。

在将第一突变大豆亲本和第二野生型大豆亲本之间杂交产生的原始F₁杂交体杂交或回交至突变大豆亲本的情况下，能够将回交后代自花授粉以创建用于突变筛选的BC₁F₂代。

使用本文描述的突变大豆植物的植物培育程序的结果可以是新的和有用的品系和变种。如本文使用的，术语“变种”指植物群共享恒定特征从而将其与相同种的其他植物分开。变种经常，但非总是，商业可售的。虽然具有一种或多种独特的性状，但变种可以进一步特征为在变种之内的个体之间的很小的总体变化。可以通过几代自花授粉和选择，或使用组织或细胞培养技术从单亲本的无性繁殖创建“纯品系”变种。变种能够基本上衍生自其他品系或变种。变种“基本上衍生自”初始品种如果：a)占优势地衍生自初始品种，或衍生自占优势地源于初始品种的变种，并且保留来自初始品种的基因型或基因型组合的基本特征的表达；b)明显区别于初始品种；和c)除了由衍生行为导致的区别之外，它在由初始品种的基因型或基因型组合导致的基本特征的表达方面与初始品种一致。能够获得基本衍生变种，例如，通过选择自然或诱导突变、体细胞变体、来自初始品种的植物的变体个体、回交或转化。“品系”区别于变种最经常意指用于非商业，例如在植物研究中的一组植物。品系典型地显示出针对一种或多种目的性状的个体之间总体上很少变化，尽管可能存在针对其他性状的个体之间的一些变化。

与来自野生型植物的相应植物部分或产物相比，本文提供的方法可用于生产具有增加的饱和脂肪酸含量的植物部分(例如种子)或植物产物(例如油)。能够使用标准方法评价植物部分或植物产物的脂肪酸含量。

D.高饱和脂肪酸大豆及其用途

本文描述的突变提供与由缺失一个或多个所述突变的相应大豆植物、植物部分或植物细胞产生的油相比，能够产生具有增加的饱和脂肪酸含量的油的大豆植物、植物部分或植物细胞。

在本公开的一种或多种实施方式中，突变导致大豆植物、植物部分或植物细胞能够产生包括总饱和脂肪酸含量至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％和多达约80％的油。总饱和脂肪酸含量优选在约20％至约50％的范围内。本文所示的脂肪酸的百分比，除非另外指示，否则因此是以重量为基础。从由大豆植物产生的大豆种子中提取油与从具有低饱和脂肪酸含量的标准大豆种子中提取的油相比，具有增加的稳定性和优越的烹饪特征。此外，所述油相较于商品大豆油具有更高水平的固态，使得其是用于制备食物产品诸如人造黄油、豆粉、豆浆和起酥油的更优选材料。所述油的酯交换能够进一步增强固态含量，以及所述油在食物产品制备中的应用。更高的饱和脂肪酸含量能够提供对例如棕榈油馏分或可可脂的替代。

更高的饱和脂肪酸含量可以是硬脂酸的水平增加和棕榈酸的水平增加中的一者或多者的结果。例如，本公开的实施方式包括具有至少约10％的硬脂酸含量诸如总脂肪酸组成的约10-24％的大豆油，具有至少约10％的棕榈酸含量诸如总脂肪酸组成的约10-24％的大豆油，以及其组合。例如，获得的棕榈酸浓度可以是总脂肪酸组成的至少约14％而获得的硬脂酸浓度可以是总脂肪酸组成的至少约10％，或者本发明的大豆品系的棕榈酸含量可以是至少约10％而硬脂酸含量是至少约20％或更多。特定应用将通常指定期望的总饱和脂肪酸含量。例如，棕榈酸和硬脂酸含量的相对水平可以改变为依应用的特定需要而定制的特定酸含量。

本公开的实施方式包括具有期望的棕榈酸和硬脂酸含量和具有不同含量的油酸、亚油酸和亚麻酸的大豆。可以针对特定应用调整这些脂肪酸和其他的水平。例如，在本发明的范围之内通过纳入(通过基因改变或通过其他方式)希望的其他脂肪酸改变本文所描述的大豆植物、植物部分和植物细胞。

大豆和它们提取的油可以用于多种用途。例如，本文所描述的大豆油可以用于部分或完全地替换棕榈油、可可脂或其他外来油。大豆油可以用作与其他饱和和/或三酰甘油的酯交换一起混合的原料而节约成本。食物用途包括例如，人造黄油和起酥油，以及含有这些成分的产品(例如，烘焙食品和糖果)。高饱和脂肪酸含量在皮肤护理组合物上也有优势。例如，棕榈酸促进自然油再生，辅助皮肤维持其保护屏障。硬脂酸主要用作润滑剂。它允许皮肤保持适当湿润平衡。相应地，提取的大豆油可以包括到包含乳膏、洗剂和喷雾油的局部用组合物之中，该组合物可以易于用于头发、皮肤和指甲上。

高饱和脂肪酸大豆可以用于基于大豆的食物产品诸如豆腐和豆浆的生产中。此外，大豆可以研磨成全脂豆粉，其能够用于糖果、肉汁、酱汁、冷冻甜点、意大利面、肉制品和烘焙食品。豆粉可以用于增加烘焙产品的蛋白质含量且不影响质地。

实施例

以下实施例旨在示例以上发明并且不应当被解释为缩小其范围。本领域技术人员应当已经知晓审查员提示可以以很多其他方式实施本发明。在本发明的范围之内可以进行多种变化或修饰。

I.SACPD基因的表达谱

已经鉴定的大豆油中硬脂酸含量的变化的主要根源涉及A9-硬脂酰基-酰基载体蛋白脱饱和酶(SACPD)基因中的突变。这些酶在质粒中将硬脂酰基-ACP脱饱和为油酰基-ACP。在大豆中已经鉴定出SACPD的三种异构体。该异构体中的两种，SACPD-A和SACPD-B，均在营养和生殖组织中有活性而第三种，SACPD-C(Glyma14g27990)，主要在发育种子和瘤中表达。在大豆中化学诱变的SACPD-C突变体品系报告作为产生的油具有硬脂酸含量范围为6-14％，其是Williams 82品种的野生型种子中含量水平的1.5至3倍。候选基因测序揭示，所有这些品系在编码将硬脂酸转化为油酸所必须的SACPD-C的基因中携带氨基酸置换。进一步研究还揭示SACPD-C突变体具有一些固氮瘤和叶结构上的缺陷。

II.脂肪A和脂肪B基因的表达谱

作为在脂肪酸生物合成途径中的最终步骤，酰基-酰基载体蛋白(ACP)硫酯酶确定酰基的链长度将质粒留在胞质溶胶中进一步代谢。基于氨基酸序列能够将更高的植物酰基-ACP硫酯酶分成两个不同的类别。参考脂肪A和脂肪B，分别地，脂肪A硫酯酶主要水解不饱和16∶1和18∶1-ACP，脂肪B用于C8-C16饱和酰基-ACP。

III.调节GmSACPD的表达

为完全失活或敲除GmSACPD-C基因(A.K.A“泛KO”)，设计序列特异性核酸酶。设计TAL效应物内切核酸酶对以在第一外显子上靶向GmSACPD-C(图4显示表2)。

选择TAL效应物内切核酸酶用于在大豆细胞中表达。这些TAL效应物内切核酸酶的活性在大豆中在它们的内源性靶位点上进行评估。每个TAL效应物内切核酸酶被克隆到诱导型启动子的T-DNA载体下游中并且然后将其转化到发根农杆菌(Agrobacteriumrhizogenes)的植株中，然后在将其用于感染大豆的半子叶并且产生转基因毛细根。在感染后三周，收集毛细根并且在液氮中冷冻，以及使用标准方法制备基因组DNA。

为确定NHEJ-介导的突变是否由TAL效应物内切核酸酶在大豆基因组的靶位点处创建，来自九根毛细根的DNA经受PCR富集测定。具有TAL效应物内切核酸酶诱导的NHEJ突变的样品可能在间隔序列中缺少限制性酶切位点，导致在凝胶上呈现为全长带的未消化PCR产物。因此，针对GmSACPD-C基因观测到未消化的PCR产物。

克隆未消化的PCR产物并测序以验证它们包含TAL效应物内切核酸酶诱导的突变。使用可商购的克隆试剂盒根据厂商的说明书克隆PCR产物。对来源于给定的未消化片段的个体克隆进行测序，并且将DNA序列与野生型GmSACPD-C基因序列对齐。

使包括失活或敲除GmSACPD-C基因的植物成长以评估结瘤表型。

为提供能够用于在包括失活或敲除GmSACPD-C基因的根或瘤组织中恢复GmSACPD-C基因表达的顺基因表达盒，检索大豆表达数据库SoyBase以鉴定两种瘤特异性基因。选择Glyma05g01360和Glyma13g44970作为候选者，这基于它们的表达谱。两种基因在瘤和根中像SACPD-C一样高度表，然而在发育种子中表现出无或非常低水平的表达(图1和3A-B)。SEQID：2-5显示用于Glyma05g01360和Glyma13g44970的各自的启动子和终止子序列。克隆包括可操作地连接至GmSACPD-C的瘤启动子的线性顺基因盒并且使用基因枪法引入到大豆植物。

为提供GmSACPD-C的种子特异性敲除，设计双生病毒将内源性GmSACPD-C启动子替换为瘤特异性启动子。通过农杆菌(Agrobacterium)介导的转化将构建体递送至大豆植物。

IV.调节GmFATB-1A的表达

使用以下方法中的一种或多种实现在发育种子中的GmFATB-1A基因的过度表达：

选择两种种子特异性基因GmFAD2A(Glyma10g42470)和GmFAD2B(Glyma20g24530)作为用于基于表达谱(即，在发育种子中高度表达但是在其他组织中无或非常低水平的表达(图2和3A-B)的种子启动子的候选者。SEQ ID No.6显示GmFATB-1A的编码基因。SEQ ID7-10显示用于GmFAD2A(Glyma10g42470)和GmFAD2B(Glyma20g24530)的启动子和终止子序列。

为提供增强的GmFATB-1A表达，合成包括可操作地连接至GmFATB-1A的线性顺基因盒。通过基因枪共同递送将顺基因盒与线性或环形选择标志物基因一起引入至大豆植物。

平行地，为提供种子特异性启动子敲入以驱动FATB-1A基因的过度表达，设计双生病毒将内源性GmFATB-1A启动子替换为驱动内源性GmFAD2A或GmFAD2B表达的启动子序列。GmFAD2A和GmFAD2B的编码序列分别在SEQ ID NO：11和12中提供。在第一外显子上设计靶向内源性FATB-1A基因基因座的GmFAD2A(或GmFAD2B)上游的TALEN。通过农杆菌(Agrobacterium)介导的转化将构建体递送至大豆植物。

V.调节GmSACPD-C和GmFATB-1A两者的表达(方法2A)

用于TALEN介导的gmSACPD-C敲除的技术与具有可操作地连接至具有Glyma13g44970终止子的GmSACPD-C编码序列的Glyma13g44970启动子的线性顺基因盒以及具有可操作地连接至具有FAD2A终止子的GmFATB-1A的FAD2A启动子的线性顺基因盒的引入相结合。

VI.脂肪酸组成分析

对来自使用以上构建体中的一种或多种转化的大豆品系的种子的脂肪酸含量进行分析。敲除、顺基因和对照大豆品系中的每一个的一个到五个种子被研磨用于提取油。提取来自研磨大豆种子的油并衍生成甲酯。在己烷中萃取获得的脂肪酸甲酯并且经气相色谱法(GC)解析。

来自种子油的脂肪酸组成分析结果显示，硬脂酸(C18：0)水平和/或棕榈酸水平(C16：0)显著增加超过从非转化对照植物的种子油获得的水平。总饱和脂肪酸水平增加至约20-40％。

VII.通过靶向突变降低的SACPD-C表达(方法1A)

验证在内源性靶位点靶向修饰创建TAL效应物内切核酸酶之后，进行实验以在GmSACPD-C中创建具有突变的大豆植物。为了完成这个，将TAL效应物内切核酸酶对克隆到细菌载体中，并且通过农杆菌介导的转化或通过使用基因枪将其递送至植物细胞。

使用标准转化方法产生表达TAL效应物内切核酸酶的转基因大豆植物。在具有编码GmSACPD-C-T03 TAL效应物内切核酸酶的序列的大豆(cv Bert)转化之后，推定再生转基因植物。将植物转移到土壤中，大约生长4周后，从每株植物中收集一片小叶子用于DNA提取和基因分型。来自独立转化的在靶位点处生成具有双等位基因或纯合突变的事件#1-#5。通过对GmSACPD-C-T03 TAL效应物内切核酸酶结合位点的侧翼的GmSACPD-C的DNA序列进行下一代测序来分析DNA样品。然后将所得读数与野生型序列对齐以确定等位基因类型。结果总结在表4中并且代表性序列SEQ ID NO：63-71显示在图6A-B和7中。这些结果同时确认使用TAL效应物内切核酸酶GmSACPD-C-T03在T₀大豆植物中成功诱变GmSACPD-C。

表4：SACPD-C诱变总结

VII.通过靶向启动子替换的SACPD-C的种子特异性沉默(方法1B)

用于将内源性SACPD-C启动子替换为瘤特异性启动子的基因组工程化试剂被递送到大豆原生质体。使用常规方法制备原生质体。简言之，在转化前五天在无菌条件下使大豆种子在发芽培养基上离体成长。然后过夜消化大豆幼苗的第一批真叶和胚轴。隔夜消化之后的那天进行分离和转化。在分离期间，首先筛选原生质体以确保适当产生一百万细胞。在洗涤缓冲液溶液中将这些细胞冲洗几次并且为每个构建体分配200,000个细胞用于通过黄色荧光蛋白(YFP)盒验证或它的基因组DNA提取。

构建用于靶向启动子替换的双生病毒二元载体(图8A中示意性显示)。通过在具有编码每个TALEN对(“GmSACPD-C-T10”SEQ ID NO：42和43)的质粒的MMg缓冲溶液的悬浮培养液中的聚乙二醇，并与双生病毒供体分子(SEQ ID NO：79)一起转化原生质体细胞。图8B示出靶向替换事件。

通过从原生质体提取基因组DNA和进行PCR以扩增包含瘤启动子的插入DNA的每个同源臂，在分子水平检测供体分子的基因靶向和成功插入。设计两个引物对以扩增每个同源臂。对于每对，一个引物结合至同源臂外部的基因组DNA以及另一个结合至新插入的DNA，在这种情况下是瘤启动子。由这些PCR反应扩增的预期DNA带长是左同源臂(LHA)1144碱基对和右同源臂(RHA)1171碱基对。凝胶电泳确认在SACPD-C位点处的靶向编辑。RHA序列的预期序列在图10中示出(SEQ ID NO：80)。

VIII.通过靶向启动子替换的FATB-1A的种子特异性上调(方法1C)

将针对FATB-1A的基因组工程化试剂递送至大豆原生质体。此处，在转化前五天在无菌条件下使大豆种子在发芽培养基上离体成长。然后过夜消化大豆幼苗的第一批真叶和胚轴。隔夜消化之后的那天进行分离和转化。在分离期间，首先筛选原生质体以确保适当产生一百万细胞。在洗涤缓冲液溶液中将这些细胞冲洗几次并且为每个构建体分配200,000个细胞用于通过黄色荧光蛋白(YFP)盒验证或针对它的基因组DNA进行提取。

分别使用TALEN对“GmFATB1A-T2”SEQ ID NO：52和53、“GmFATB1A-T3”SEQ ID NO：55和56、“GmFATB1A-T4”SEQ ID NO：58和59构建用于靶向启动子替换的双生病毒二元载体(在图11A中示意性地显示)。通过在具有编码每个TALEN对的质粒的MMg缓冲溶液的悬浮培养液中的聚乙二醇，并与双生病毒供体分子(SEQ ID NO：81)一起转化原生质体细胞。图11B示出靶向替换事件。通过从原生质体提取基因组DNA和进行PCR以扩增包含FAD2A启动子的插入DNA的每个同源臂，在分子水平检测供体分子的基因靶向和成功插入。设计两个引物对以扩增每个同源臂。对于每对，一个引物结合至同源臂外部的基因组DNA以及另一个结合至新插入的DNA，在这种情况下是FAD2A启动子。由这些PCR反应扩增的预期DNA带长是LHA1365碱基对和RHA1430碱基对。凝胶电泳确认在FATB-1A位点处的靶向编辑。基于TALEN对的活性，收集SEQ ID NO：55和56为之后用。

IX.通过顺基因盒的FATB-1A的种子特异性上调和SACPD-C的瘤/叶特异性表达(方法2A)

用于SACPD-C和FATB-1A基因的组织特异性表达的线性顺基因构建体被构建并具有SEQ ID NO：82中示出的序列。

从未成熟大豆豆荚中切分出未成熟的子叶并且在大豆体细胞胚性愈伤组织形成(4-8周)之前在振动器上的液体培养基中使其成长。使用由具有盒1和2的DNA构建体(图13)和可选择标志物包被的金粒子共同轰击大豆体细胞胚性愈伤组织。在再生培养基中静置一周之后，添加筛选剂。选择培养基每周更换并进行大约4周。然后将转化的胚性愈伤组织破裂成1-2mm块并且放置在富含木炭的成熟培养基上4-8周。在移至根培养基之前使转化的成熟胚胎脱水。

也可以使用本公开的其他实施方式。尽管以上本说明书包含很多特定性，这些都不应当解释为限制本公开的范围，但是仅仅作为提供本公开的目前优选实施方式的一些示例。还应当考虑可以对实施方式的特定特征和方面进行各种组合和子组合，并且其仍旧落入本公开的范围之内。公开的实施方式的各种特征和方面能够彼此相互组合或替换以形成各种实施方式。因此，所意指的是本公开中的至少一些的范围不应当被本文所描述的实施方式所限制。

本公开的范围由所附权利要求书和它们的法律等效物所决定。本公开的范围涵盖对于本领域技术人员显而易见的其他实施方式。因此，本公开的范围只能由所附权利要求书限定，其中除非明确地如此陈述，否则，以单数形式的元件并非意指“一个和仅一个”而是“一个或多个”。本领域普通技术人员所熟知的以上所描述的优选实施方式的元件的所有结构的、化学的和功能的等效物明确地通过援引加入并入本文并且意在被当前的权利要求书所涵盖。此外，一种装置或方法并非必须解决本公开寻求解决并且当前权利要求书涵盖的每个问题。而且，本公开中的元件、组件或方法步骤都没有意指贡献于公众，无论该元件、组件或方法步骤是否在权利要求书中明确引用。

本公开的各种优选实施方式的上述说明已经出于示例和描述的目的而呈现。本公开并无意穷尽或被限制到精确的实施方式，并且鉴于以上教导很多修饰和变形很明显是能够进行的。选择和描述如以上所描述的实例实施方式是为了更好地解释本公开的原则和它的实际应用，因此使得本领域的其他技术人员能够最好地以各种实施方式和各种修饰利用本公开以适应其考虑的特定应用。所意指的是，本公开的范围通过本文所附权利要求书限定。

已经描述了各种实施例。这些和其他实施例在以下的权利要求书范围之内。

Claims

1.一种大豆植物、植物部分或植物细胞，包括调节SACPD-C基因、FATB-1A基因、或者所述SACPD-C基因和FATB-1A基因两者的表达的一个或多个突变，其中，与缺失所述一个或多个突变的相应的大豆植物、植物部分或植物细胞产生的油相比，所述植物、植物部分或植物细胞产生的油具有增加的饱和脂肪酸含量，以及其中调节所述SACPD-C基因的表达的所述一个或多个突变包括由稀有切割内切核酸酶诱导的靶向突变。

2.根据权利要求1所述的大豆植物、植物部分或植物细胞，其中，所述大豆植物、植物部分或植物细胞包括导致所述SACPD-C基因表达降低的突变。

3.根据权利要求2所述的大豆植物、植物部分或植物细胞，其中，所述导致所述SACPD-C基因表达降低的突变是在所述SACPD-C基因的一个或多个等位基因或者其可操作连接的启动子中的突变。

4.根据权利要求2或3所述的大豆植物、植物部分或植物细胞，其中，所述导致所述SACPD-C基因表达降低的突变是敲除突变。

5.根据权利要求4所述的大豆植物、植物部分或植物细胞，其中，所述敲除突变是种子特异性敲除突变。

6.根据权利要求5所述的大豆植物、植物部分或植物细胞，其中，所述种子特异性敲除突变包括将在所述SACPD-C基因的天然基因组基因座处的种子特异性启动子替换为在发育大豆种子中低活性或没有可检测活性的启动子。

7.根据权利要求7所述的大豆植物、植物部分或植物细胞，其中，所述突变在SEQ IDNO：15、18、21、24、27、30、33、36、39、42或45中所示的序列中，或者在与SEQ ID NO：15、18、21、24、27、30、33、36、39、42或45中所示的序列具有至少95％同一性的序列中。

8.根据权利要求2-7中任一项所述的大豆植物、植物部分或植物细胞，包括可操作地连接至发育大豆种子中低活性或没有可检测活性的启动子的功能性SACPD-C基因的敲入突变。

9.根据权利要求6或8所述的大豆植物、植物部分或植物细胞，其中，所述发育大豆种子中低活性或没有可检测活性的启动子是瘤特异性基因启动子。

10.根据权利要求1-9中任一项所述的大豆植物、植物部分或植物细胞，其中，所述大豆植物、植物部分或植物细胞包括导致所述FATB-1A基因表达增加的突变。

11.根据权利要求10所述的大豆植物、植物部分或植物细胞，其中，增加所述FATB-1A基因表达的所述突变是将所述FATB-1A基因的内源性启动子靶向替换为过度表达启动子。

12.根据权利要求11所述的大豆植物、植物部分或植物细胞，其中，所述启动子或过度表达启动子是强种子特异性启动子，任选地FAD2A启动子或FAD2B启动子。

13.一种用于生成包括调节SACPD-C基因、FATB-1A基因、或者所述SACPD-C基因和FATB-1A基因两者的表达的突变的大豆植物的方法，包括：

(ii)导致所述FATB-1A基因表达增加的突变；或

(iii)其组合；

(c)将所选择的植物细胞再生成为大豆植物。

14.根据权利要求13所述的方法，其中，降低所述SACPD-C基因表达包括诱导在所述SACPD-C基因的一个或多个等位基因或者其可操作连接的启动子中的突变，任选地其中所述诱导的突变是敲除突变或种子特异性敲除突变。

15.根据权利要求14所述的方法，其中，降低所述SACPD-C基因表达包括将在所述SACPD-C基因的天然基因组基因座处的种子特异性启动子替换为在发育大豆种子中低活性或没有可检测活性的启动子。

16.根据权利要求14所述的方法，进一步包括将包括可操作地连接至发育大豆种子中低活性或没有可检测活性的启动子的和任选地可操作地连接至瘤特异性启动子的功能性SACPD-C基因的表达盒递送至所述大豆植物细胞群。

17.根据权利要求13-16中任一项所述的方法，其中，增加所述FATB-1A基因表达包括将所述FATB-1A基因的内源性启动子替换为过度表达启动子。

18.根据权利要求13-17中任一项所述的方法，其中，增加所述FATB-1A基因表达包括将包括任选地可操作地连接至强种子特异性启动子的所述FATB-1A基因的一个或多个拷贝的表达盒递送至所述大豆植物细胞群。

19.一种大豆油组合物，包括由包括调节SACPD-C基因、FATB-1A基因、或者所述SACPD-C基因和FATB-1A基因两者的表达的一个或多个突变的大豆植物、植物部分或植物细胞产生的大豆油，其中，与缺失所述一个或多个突变的相应的大豆植物、植物部分或植物细胞产生的油相比，所述大豆油具有增加的饱和脂肪酸含量，以及其中调节所述SACPD-C基因的表达的所述一个或多个突变包括由稀有切割内切核酸酶诱导的靶向突变。

20.根据权利要求19所述的大豆油组合物，其中，所述大豆油具有大于10％的硬脂酸含量、大于10％的棕榈酸含量或大于20％的饱和脂肪酸含量，其中所有百分比基于所述油的总脂肪酸的重量。