CN115121195A - 藻酸盐-GelMA纤维微球、制法及其藻酸盐-GelMA纤维微球作为细胞载体的应用 - Google Patents
藻酸盐-GelMA纤维微球、制法及其藻酸盐-GelMA纤维微球作为细胞载体的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种藻酸盐‑GelMA纤维微球、制法及其藻酸盐‑GelMA纤维微球作为细胞载体的应用，藻酸盐‑GelMA纤维微球为壳‑核结构，核结构GelMA纤维微球是由GelMA纺丝纤维片段自身搭建起来的，具有疏松的多孔网状结构，极大的提高了GelMA微球内部的孔隙率，细胞能够均匀分布于整个GelMA纤维微球，材料的空间利用率大大提升。此外，这种多孔的GelMA纤维微球结构特性，为搭载细胞提供了适当的包裹和充足的附着位点，为细胞的增殖迁移、新组织和血管的形成提供更多的空间，极大的提升了细胞存活率；壳结构凝胶化的藻酸盐能够有效保证包覆于壳结构中的GelMA微球的独立性，以解决现有利用GelMA微球制备细胞载体，以及对细胞载体进行体外培养、保存时存在的GelMA微球团聚问题。
Description
技术领域
本发明涉及生物医学技术领域，具体涉及一种藻酸盐-GelMA纤维微球、制法及其藻酸盐-GelMA纤维微球在作为细胞载体的应用。
背景技术
牙髓组织是牙齿的重要组成部分，由神经、血管、淋巴管及结缔组织组成，有多种包括成牙本质细胞、成纤维细胞、具有多向分化潜能的干细胞及免疫细胞在内的细胞分布，为牙齿提供营养、感觉以及防御等功能。其四周为坚硬的牙本质包围，与下方的牙周组织仅通过一狭窄的根尖孔相连，是牙髓与外界进行营养与废物交换的主要途径。牙髓的独特结构使得其抵御外界伤害的能力极弱，一旦发生炎症，如深龋、外伤及根尖周疾病引起的牙髓感染，最终坏死的可能性极大，而其自我修复的潜力十分有限。应对牙髓疾患，目前普遍使用的治疗方法为根管治疗，即用非天然材料填充去除坏死组织和感染物的根管，以阻绝病变进一步蔓延，对于消炎止痛是最佳选择。然而，剩余的牙体组织因失去了牙髓的支持而变脆易折，又因为缺乏修复性牙体组织的形成，剩余牙体组织的寿命和功能都大打折扣。
细胞疗法为不可逆转的组织损伤和病变提供了新的治疗思路，通常在实际应用中，往往需要数量巨大的组织细胞，在众多递送细胞的支架材料中，微球以其比表面积大、可注射性，制备途径多样、材料来源丰富等优越的性能在再生领域中受到广泛研究。
目前常见应用于牙髓再生的微球有聚合材料和天然材料，其中聚合材料中聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)、聚乳酸(PLA)、左旋聚乳酸(PLLA)曾受到广泛研究，但研究发现，其酸性降解物带来的酸性环境不利于植入的细胞生存，甚至会引起周围组织的炎症，此外，这些聚合材料的降解速率极慢，也不利于组织的再生与重建。
天然材料中，GelMA材料生物相容性很高，细胞可以很好的在其中增殖、分化并分泌细胞外基质等蛋白，并且在体内生物降解效果较好。有学者通过静电液滴法制备出载有hDPSCs的GelMA微球，将其置入牙本质小管中并植入免疫缺陷小鼠皮下，验证了其生成牙髓样组织的能力。然而，在载hDPSCs的GelMA微球体外培养的过程中，细胞会逐渐聚集分布于微球的表面，而中心部位不再有活细胞分布，此外，微球会逐渐相互粘接成一整个团块，影响注射效果。
发明内容
针对现有技术中存在的上述问题，本发明提供了一种藻酸盐-GelMA纤维微球、制法及其藻酸盐-GelMA纤维微球作为细胞载体的应用，以有效的解决现有利用GelMA微球制备细胞载体，以及对细胞载体进行体外培养、保存时存在的GelMA微球团聚问题，并进一步解决细胞载体中的细胞存活率低下的问题。
具体发明内容如下：
第一方面，本发明提供一种藻酸盐-GelMA纤维微球，所述藻酸盐-GelMA纤维微球为壳-核结构，壳结构的组成材料为凝胶化的藻酸盐，核结构的组成材料为GelMA纺丝纤维片段，并且，不同所述GelMA纺丝纤维片段，在交叉接触的位点发生交联聚合形成具有贯通孔隙的GelMA纤维微球。
可选地，所述GelMA纺丝纤维片段的纤维直径为1μm-16μm，所述GelMA纺丝纤维片段的纤维长度为15μm-60μm。
可选地，所述核结构的平均粒径为178-185μm；所述壳结构的平均粒径为249-250μm。
第二方面，本发明提供一种上述第一方面所述的藻酸盐-GelMA纤维微球的制备方法，所述方法包括如下制备步骤：
S1、用适量的2,2,2-三氟乙醇将冻干的GelMA溶解，得到质量浓度为10％(w/v)的电纺液；
S2、将所述电纺液装入静电纺丝机中，调节电纺参数至合适后，制备得到GelMA纺丝纤维膜；
S3、将所述GelMA纺丝纤维膜浸泡于交联液中，20-24h后，使用PBS缓冲液漂洗被交联液浸泡后的GelMA纺丝纤维膜，得到交联处理后的GelMA纺丝纤维膜；
S4、将所述交联处理后的GelMA纺丝纤维膜放入PBS缓冲液中，进行超声细胞破碎、离心沉淀，得到GelMA纺丝纤维片段；
S5、将体积比为1：1-2的所述GelMA纺丝纤维片段与引发剂Lap混合均匀，得到核相前体溶液；
S6、配置质量浓度为2％w/v的藻酸盐溶液，作为壳相前体溶液；
S7、调节共轴静电液滴设备的相关参数，核相前体溶液与壳相前体溶液通过共轴静电液滴法以及蓝光照射，制备成具有壳-核结构的藻酸盐-GelMA纤维微球。
可选地，所述步骤S2中，所述调节电纺参数包括：调节推注速度为0.5mL/h，调节电压为25kV，注射器针尖据接收装置距离为15cm，接收装置转速为1000转/分。
可选地，所述步骤S3中，所述交联液由质量体积比为0.47g：0.28g：100mL的EDC、NHS和无水乙醇混合而成。
可选地，所述步骤S5中，所述引发剂是质量浓度为0.25％w/v的Lap。
可选地，所述步骤S7中，调节共轴静电液滴设备的相关参数包括：调节静电正电压为15kV，接受距离为12cm，核层溶液流速为15μL/min，壳层流速为50μL/min，共轴针头内径为25G，外径为16G。
可选地，所述步骤S7中，核相前体溶液与壳相前体溶液通过共轴静电液滴法以及蓝光照射，制备成具有壳-核结构的藻酸盐-GelMA纤维微球包括：
核相前体溶液与壳相前体溶液在共轴针头出口端，以壳相前体溶液包覆核相前体溶液的形式流出，流出的溶液在高压静电场的作用下，拉长、断裂，落入装有1％w/v氯化钙溶液的接收装置中，外层壳相前体溶液与钙离子交联形成凝胶，进一步对接收装置进行蓝光光照，内层核相前体溶液在蓝光光照和Lap作用下发生交联形成GelMA纤维微球。
第三方面，本发明提供一种如上述第一方面所述的藻酸盐-GelMA纤维微球作为细胞载体的应用。
与现有技术相比，本申请包括以下优点：
本发明提供了一种藻酸盐-GelMA纤维微球，该藻酸盐-GelMA纤维微球为壳-核结构的微囊，其中，核结构GelMA纤维微球是由GelMA纺丝纤维片自身搭建起来的，具有疏松的多孔网状结构，极大的提高了GelMA微球内部的孔隙率，细胞能够分布于整个GelMA纤维微球，材料的空间利用率大大提升。此外，这种多孔的GelMA纤维微球结构特性，为搭载细胞提供了适当的包裹和充足的附着位点，为细胞的增殖迁移、新组织和血管的形成提供更多的空间，极大的提升了细胞存活率；壳结构凝胶化的藻酸盐能够有效保证包覆于壳结构中的GelMA微球的独立性，以解决现有利用GelMA微球作为细胞载体递送细胞时存在的GelMA微球团聚问题。
附图说明
图1示出了本发明实施例提供的藻酸盐-GelMA纤维微球的制备方法流程图；
图2示出了本发明实施例提供的GelMA纺丝纤维膜的SEM图；
图3示出了本发明实施例提供的GelMA纺丝纤维膜的纤维直径分布图；
图4示出了本发明实施例提供的GelMA纺丝纤维片段在光镜下的结构图；
图5示出了本发明实施例提供的GelMA纺丝纤维片段的长度分布；
图6示出了本发明实施例提供的GelMA纺丝纤维片段的直径分布；
图7示出了本发明实施例提供的藻酸盐-GelMA纤维微球在光镜下的结构图；
图8示出了本发明实施例提供的GelMA纤维微球在光镜下的结构图；
图9出了本发明实施例提供的GelMA纤维微球的SEM图；
图10示出了本发明实施例提供的藻酸盐-GelMA纤维微球的直径分布；
图11示出了本发明实施例提供的GelMA纤维微球的直径分布；
图12示出了本发明实施例提供的藻酸盐-载hDPSCs的GelMA纤维微球在光镜下的结构图；
图13示出了本发明实施例提供的藻酸盐-载hDPSCs的GelMA实心微球在光镜下的结构图；
图14示出了本发明实施例提供的藻酸盐-载hDPSCs的GelMA纤维微球的直径分布；
图15示出了本发明实施例提供的载hDPSCs的GelMA纤维微球的直径分布；
图16示出了本发明实施例提供的藻酸盐-载hDPSCs的GelMA纤维微球与藻酸盐-载的纯GelMA微球中hDPSCs的存活情况；
图17示出了本发明实施例提供的藻酸盐-载hDPSCs的GelMA实心微球的激光共聚焦显微镜扫描图；
图18示出了本发明实施例提供的藻酸盐-载hDPSCs的GelMA纤维微球与藻酸盐-载hDPSCs的GelMA实心微球d14的子代分布峰图；
图19示出了本发明实施例提供的藻酸盐-载hDPSCs的GelMA纤维微球与藻酸盐-载hDPSCs的GelMA实心微球中hDPSCs的形态；
图20示出了本发明实施例提供的藻酸盐-载hDPSCs的GelMA纤维微球与藻酸盐-载hDPSCs的GelMA实心微球中干性基因表达情况。
具体实施方式
提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。
实施例中未注明具体实验步骤或者条件，按照本领域内的现有技术所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂以及其他仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。
本发明旨在提供一种具有壳-核结构的藻酸盐-GelMA纤维微球，其中，核结构GelMA纤维微球是由GelMA纺丝纤维片自身搭建起来的，具有疏松的多孔网状结构，极大的提高了GelMA微球内部的孔隙率，细胞能够分布于整个GelMA纤维微球，材料的空间利用率大大提升。此外，这种多孔的GelMA纤维微球结构特性，为搭载细胞提供了适当的包裹和充足的附着位点，为细胞的增殖迁移、新组织和血管的形成提供更多的空间，极大的提升了细胞存活率；壳结构凝胶化的藻酸盐能够有效保证包覆于壳结构中的GelMA微球的独立性，以解决现有利用GelMA微球作为细胞载体递送细胞时存在的GelMA微球团聚问题。
基于此，本发明的一个目的在于提供一种藻酸盐-GelMA纤维微球，所述藻酸盐-GelMA纤维微球为壳-核结构，壳结构的组成材料为藻酸盐，核结构的组成材料为GelMA纺丝纤维片段，并且，不同所述GelMA纺丝纤维片段，在交叉接触的位点发生交联聚合形成具有孔隙的GelMA纤维微球。
具体实施时，GelMA纺丝纤维片段中的醛基基团经过紫外光或蓝光的照射可相互交联，这些交联位点像锚一样可以将材料互相接触的位点彼此固定在一起形成具有贯通孔隙的球体。此外，GelMA纤维微球保留了水凝胶材料吸水、保水的特性，营养物质能够顺利的在GelMA纤维微球聚合物网络内传递、扩散，有利于细胞的增殖、迁移。组成核结构的藻酸盐是一种天然高分子材料，又称海藻酸盐、海藻酸胶、褐藻酸盐，主要存在于褐藻的细胞壁和细胞间黏胶质中，藻酸盐材料接触到钙离子时，可以迅速反应形成凝胶，凝胶化的藻酸盐作为壳结构，用于避免核结构发生团聚，影响注射效果。
本发明的另一个目的在于提供一种上述藻酸盐-GelMA纤维微球的制备方法，图1示出了本发明实施例提供的藻酸盐-GelMA纤维微球的制备方法流程图，如图所示，该制备方法包括如下步骤：
S1、用适量的2,2,2-三氟乙醇将冻干的GelMA溶解，得到质量浓度为10％(w/v)的电纺液；
S2、将所述电纺液装入静电纺丝机中，调节电纺参数至合适后，制备得到GelMA纺丝纤维膜；
S3、将所述GelMA纺丝纤维膜浸泡于交联液中，20-24h后，使用PBS缓冲液漂洗被交联液浸泡后的GelMA纺丝纤维膜，得到交联处理后的GelMA纺丝纤维膜；
S4、将所述交联处理后的GelMA纺丝纤维膜放入PBS缓冲液中，进行超声细胞破碎、离心沉淀，得到GelMA纺丝纤维片段；
S5、将体积比为1：1-2的所述GelMA纺丝纤维片段与引发剂Lap混合均匀，得到核相前体溶液；
S6、配置质量浓度为2％w/v的藻酸盐溶液，作为壳相前体溶液；
S7、调节共轴静电液滴设备的相关参数，核相前体溶液与壳相前体溶液通过共轴静电液滴法以及蓝光照射，制备成具有壳-核结构的藻酸盐-GelMA纤维微球。
具体实施时，本实施例制备方法通过结合静电纺丝法和共轴静电液滴法制备得到壳-核结构的藻酸盐-GelMA纤维微球，首先，将GelMA溶液通过静电纺丝装置制备出GelMA纺丝纤维膜，对GelMA纺丝纤维膜进行交联处理后，使用超声细胞破碎仪将纤维膜破碎成GelMA纺丝纤维片段；用含有引发剂的水溶液将GelMA纺丝纤维片段重悬得到核相前体溶液；进一步以藻酸盐溶液为壳相的前体溶液，通过共轴静电液滴法制备出藻酸盐-GelMA纤维微球。
为使本领域技术人员更加清楚地理解本发明，现通过以下实施例对本发明所述的藻酸盐-GelMA纤维微球的制备方法进行详细说明。
以下实施例所用到的DPSCs，是经四川大学华西口腔医院的伦理委员会批准，得到患者同意后，招募华西口腔医院颌面外科门诊患者(16-20岁)，获取因治疗需拔除的第三健康磨牙，经DPSCs的提取和培养得到的3-5代DPSCs细胞。
实施例1：GelMA纤维片段的制备及相关材料学表征
(1)GelMA纺丝纤维膜的制备及形貌分析
称取1g冻干的GelMA材料(GelMA-60)加入至装有10mL的2,2,2-三氟乙醇的离心管中，将该离心管置于设置为50℃的烘箱中，维持20min后取出稍摇晃，即可得到均匀的10％(w/v)GelMA-三氟乙醇纺丝前体溶液，均匀分成三份分别装进三个10mL针筒，各与24G不锈钢针头相连，并将其固定于静电纺丝机的推注泵上，将锡纸固定到接有负极的接收轴上，将正极接到将三个针头相连接的铁片上。
通过调控推注纺丝液的速度，来制备不同直径的纤维膜。经实验探究后，最终将推注速度分别设置为0.5mL/h、2.5mL/h以及5mL/h，其他纺丝参数保持一致(纺丝电压设置为25kv，接受轴与针头的距离约为15cm，接受轴的转速设置为1000rpm)，进行静电纺丝。
在高电压的作用下，GelMA纺丝液射流拉伸成纳米纤维，随机堆积在带有负电场的接受轴的锡纸上，三氟乙醇溶液在喷射过程中蒸发，最后在接收装置上留下GelMA纺丝纤维膜。
将三种推注速度制备成的GelMA纺丝纤维膜分别制成0.5cm×0.5cm的片状，通过导电胶固定在样品台上并喷金，在电压为20kv的条件下，通过SEM来观察其表面形貌及其微观结构，并通过粒径分析软件(Nanomeasurer)来测定纤维直径。每组取不同部位的三个纤维膜样品，每个样品均选取三个视野，测量纺丝纤维直径，并计算平均数。
图2示出了本发明实施例提供的GelMA纺丝纤维膜的SEM图，如图2所示，图2(a)为推注速度在0.5mL/h下，GelMA纺丝纤维无序堆叠成膜状，图2(b)为推注速度在2.5mL/h下，GelMA纺丝纤维无序堆叠成膜状，图2(c)为推注速度在5mL/h下，GelMA纺丝纤维无序堆叠成膜状，其中，推注速度为0.5mL/h及2.5mL/h时，纤维分布较均匀，推注速度为5mL/h的GelMA纤维膜有明显杂丝分布，大部分纤维形态较扁。图3示出了本发明实施例提供的GelMA纺丝纤维膜的纤维直径分布图，如图3所示，图3(a)、图3(b)、图3(c)分别示出推注速度为0.5mL/h、2.5mL/h、5.0mL/h的GelMA纺丝纤维膜的纤维直径分布情况，其平均直径分别为1.35μm、2.26μm、4.23μm，说明推注速度越大、得到的纤维直径越大。
GelMA纺丝纤维膜的一个重要结构参数是纤维直径，纤维直径的变化主要受到纺丝液浓度、纺丝电压、溶液推注速度以及接收距离等的影响，本实验主要通过调控溶液推注速度来调控纤维直径，可以看出，在其他纺丝参数保持不变的情况下，推注速度越大，纤维直径越粗，并且随着速度的增加，纺出来的纤维粗细越不均匀，甚至会出现杂丝，且在纺丝过程中，针头处材料凝胶，最终会导致材料的浪费。本实验较优的推注速度为0.5mL/h核2.5mL/h。
(2)GelMA静电纺丝膜的交联
由于GelMA材料可溶解于水，需对其交联处理。将推注速度为0.5mL/h的GelMA纺丝膜从锡纸上揭下，用剪刀将纺丝膜剪成边长约为5cm的正方形小片。
配备GelMA纺丝膜交联液：往100mL无水乙醇中加入0.47g EDC和0.28g NHS，混合均匀后向细胞培养大皿倒入约10mL的交联液，并放入数片剪好的纤维膜，再加入少量交联液，确保纤维膜被交联液覆盖；将大皿置于定轨摇床上，以匀速缓慢摇晃24h后，弃去交联液，并使用PBS缓冲液漂洗3次，每次漂洗时均浸泡5min以充分去除残留的交联液。
(3)GelMA纺丝纤维片段的制备及尺寸表征
为了得到单独的纤维片段，我们选择了超声波破碎法，可以很简便地的将一整块纤维破碎成分布均匀的纤维片段，仅有少量破碎成碎屑状，材料浪费较少，并且超声波破碎适用于大部分玻璃转移温度较高的材料制备成的纤维膜。
将交联漂洗好的推注速度为0.5mL/h的GelMA纤维膜取出，置于盛有80mL PBS缓冲液的烧杯中。将烧杯置于超声细胞破碎仪的工作台上，将安装有15号工作杆的超声波工作头放入烧杯中，调整工作杆底部至距离烧杯底部2cm的位置上，设置超声波工作功率为200w，超声开/关时间设置为1s/1s，工作总时长为15min。
使用巴氏管将GelMA纤维片段吹散，并将GelMA纺丝纤维片段悬液分别吸至15mL离心管中，通过台式离心机1600rpm，5min的离心沉淀，弃去上清液，向其中加入10mL 75％乙醇，再次经过台式离心机1600rpm，5min的离心沉淀脱水，弃去上清液，再加入10mL无水乙醇重复一遍脱水离心，弃去上清液，即可得到最终的纤维片段沉淀物。
取其中一管GelMA纺丝纤维片段，分别加入10mL PBS缓冲液，并转移至5个大皿中并向其中各再加入10mL PBS，在光学显微镜下观察，每组取两个不同视野的纤维片段样品，随机选取总共50根不同的纤维片段，通过粒径分析软件(Nano measurer)来测量纤维片段长度及直径，并计算平均数。
图4示出了本发明实施例提供的GelMA纺丝纤维片段在光镜下的结构图，如图4所示，GelMA纺丝纤维片段呈短棒状、部分呈卷曲状，长短不一；图5示出了本发明实施例提供的GelMA纺丝纤维片段的长度分布，图6示出了本发明实施例提供的GelMA纺丝纤维片段的直径分布，如图5、图6所示，GelMA纺丝纤维片段的长度及直径分布成近似正态分布，GelMA纺丝纤维片段的长度主要集中在15-60μm，平均长度为40μm；GelMA纺丝纤维片段的直径主要分布在1μm-16μm，平均直径为约8.78μm。
与图3结果比对发现，超声破碎后形成的GelMA纺丝纤维片段在缓冲液中会有一定的溶胀现象，这是因为在静电纺丝的过程中，我们采用的冻干GelMA材料溶于有机溶剂中，纤维膜中的有机溶剂挥发，因此，刚纺出来的纤维膜中间不含水分。当GelMA纺丝纤维膜转移至PBS缓冲液中时，GelMA材料高吸水能力使其快速溶胀，直径增大至未溶胀时的7倍，可见其含水量极高。
实施例2：藻酸盐-GelMA纤维微球的制备及其材料学表征
为了获得稳定且形态优良的藻酸盐-GelMA纤维微球，本实施例对制备工艺参数进行了相应的优化，其中包括藻酸盐的浓度、纤维片段悬液的密度、共轴针头的内、外径、外加电压的大小、两相流速的大小，并对制备得到的藻酸盐-GelMA纤维微球的尺寸分布，以及中间核相的尺寸分布和表面形貌进行了分析，同时我们也制备了藻酸盐-GelMA实心微球结构作为对比例。
(1)核相前体溶液的配备
为了制备不同出孔隙率的GelMA纤维微球进行比较，我们利用实施例1制备得到的GelMA纺丝纤维片段(经清洗、离心、干燥获得)，制备了两组不同体积浓度的GelMA纺丝纤维片段悬液组成实验组的核相前体溶液。并以含有5％w/v GelMA、0.25％w/v Lap引发剂的水溶液作为对比例的核相前体溶液。所有前体溶液均用锡纸包裹避光放置于四度冰箱。
Ⅰ：制备实验1组的核相前体溶液(1：1组GelMA纤维片段悬液)：取体积比为1：1的GelMA纤维片段与0.25％w/v苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基亚磷酸锂(Lap)将两者混合吹打均匀；
Ⅱ：制备实验2组的核相前体溶液(1：2组GelMA纤维片段悬液)：取体积比为1：2的GelMA纤维片段与0.25％w/v苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基亚磷酸锂(Lap)水溶液，将两者混合吹打均匀；
Ⅲ：制备对比例组的核相前体溶液(5％w/v GelMA水溶液)：配置含有5％w/vGelMA、0.25％w/v的Lap引发剂的水溶液；
(2)壳相前体溶液、交联液及其溶解液的配备
Ⅰ、分别配制1.0％、1.1％、1.2％、1.3％、1.4％、1.5％、1.6％、1.7％、1.8％、1.9％核2.0％(w/v)的藻酸盐溶液作为壳相前体溶液，通过超声震荡使溶液分布均匀；
Ⅱ、配制1％(w/v)氯化钙作为藻酸盐的交联液。
Ⅲ、将1g柠檬酸三钠溶解于100mL PBS中，得到1％(w/v)柠檬酸三钠溶液作为溶解液，用于溶解交联后的藻酸盐壳层。
(3)藻酸盐-GelMA纤维微球的制备、交联及其表征
共轴静电液滴设备由两台垂直放置的微量注射泵、高压静电装置及接收装置这三个部分组成构成，此外还有一个不锈钢共轴针头连接两台微量注射泵上的注射器。
壳-核微球制备的过程中，各个因素的具体参数都对最终微球的形态有决定性作用，包括藻酸盐的浓度、纤维片段悬液的密度、共轴针头的内外径、外加电压的大小、两相流速的大小，任意一个参数的变化都可能导致最终微球形态的变化，在本实验中，我们保持唯一不变的参数是两组GelMA纤维片段悬液的浓度及5％GelMA的浓度，并用单因素法分别针对以上参数进行试验，以摸索最佳参数。
我们尝试了1％-2％的藻酸盐，实施中发现1％-1.6％的浓度范围内，氯化钙溶液里收集到的为纯藻酸盐微球，和纯GelMA纤维片段，在喷射过程中，我们观察到针头处喷射出的液柱极不稳定，有四处飞溅的液滴；藻酸盐浓度在1.7％-1.9％时，我们观察到氯化钙溶液里藻酸盐微球内，包裹了少量GelMA纤维片段，呈条状或极其稀疏的几根，针头处的液柱可出现极不稳定的泰勒锥现象，且随着浓度的增大，内层GelMA纤维呈球状的数量增加，但形态多凹陷不饱满。最终选择2.0％藻酸盐溶液作为实验1组、实验2组壳相前体溶液。选择1.9％藻酸盐溶液作为对比例组壳相前体溶液。
我们尝试了内径为30G和20G的共轴针头，当针头更细时，针头处喷射产物喷射状态较稳定，但氯化钙溶液中会有细丝状产物，可能是针孔内径比较小，更有利于纤维的生成。当内径为20G时，喷射液柱中会有大的液滴滴落，氯化钙溶液中可见大量直径明显增大的纯藻酸盐微球，有的微球内也可见GelMA纤维微球团块，密度和体积都明显增加。这可能是针径大小与液柱的流量大小有关。
我们尝试了不同外加静电正电压的大小，依据研究表明，静电液滴过程中静电正电压的大小对液柱的稳定性和持续性有着重要作用，静电正电压越大，断裂成的液滴表面的斥力也会越大，而液滴的粒径也会越小。在本实验中，当电压小于14kV时，针头处喷出的液柱为稳定性极差，有大液滴滴落，小液滴飞溅，微球内部少有纤维微球内核形成，当电压逐渐从14kV升高，可以看到液柱逐渐稳定，形成泰勒锥样液柱，当电压达到15kV时，针头处为稳定的泰勒锥。
我们尝试了不同流速的推注速度，我们发现当外相流速过大时，针头处液柱不稳定，有大滴的液滴直接滴落，氯化钙溶液中各种形态的微球都有，分布极其不均匀；当流速过小时，针头处喷出的液柱呈细纤维状，氯化钙溶液里接收到细串珠样凝胶。
最终，经实验探究考察出的最优处方工艺为：静电正电压为15kV，接受距离为12cm，核层溶液流速为15μL/min，壳层流速为50μL/min，共轴针头内径为25G，外径为16G，且内针稍长于外针针头。
在高压静电场的作用下，均匀分布的壳-核结构的溶液拉长、断裂形成均匀的壳-核微球结构进入到接受装置中，通过钙离子的交联作用，外层藻酸盐交联成凝胶，随后使用蓝光照射90s，使得核层GelMA交联定型。
随后将壳-核微球转移到离心管内，去除上层的氯化钙溶液，使用PBS重悬清洗3次。
最终得到实验1组、实验2组提供的藻酸盐-GelMA纤维微球，以及对比例组提供的藻酸盐-GelMA实心微球。
进一步将1mL实验1组、实验2组提供的藻酸盐-GelMA纤维微球沉淀分别用6mL PBS重悬，并向6孔板中每孔各加入1mL微球悬液。将收集到的壳核微球放置于光学显微镜下，进行观察并拍摄照片。然后使用粒径分析软件(Nano Measurer)，对拍摄的至少每组3幅图像的至少100各微球进行粒径分析。
随后将实验1组、实验2组提供的藻酸盐-GelMA纤维微球转移到离心管内，去除上层的氯化钙溶液，使用PBS重悬清洗3次。
图7示出了本发明实施例提供的一种藻酸盐-GelMA纤维微球在光镜下的结构图，如图7所示，图7(a)、图7(b)分别示出了实验1组、实验2组提供的藻酸盐-GelMA纤维微球的光镜下结构图，光镜下可以看到壳-核结构，壳层结构呈现均匀球形。图8示出了本发明实施例提供的GelMA纤维微球在光镜下的结构图，如图8所示，溶解掉藻酸盐外壳后的GelMA纤维微球仍保持均匀球形，其中有大量孔隙。图9出了本发明实施例提供的GelMA纤维微球的SEM图，图9(a)、图9(b)分别示出了实验1组、实验2组提供的溶解掉藻酸盐外壳后的GelMA纤维微球的SEM图，如图9所示，溶解掉藻酸盐外壳后的GelMA纤维微球经冻干后，SEM图像显示，GelMA纤维微球由根根分明的GelMA纤维片段搭建而形成网状结构，其表面有不规则的多孔结构，且两组纤维微球表面的孔隙结构大小无明显差异。
进一步地，图10示出了本发明实施例提供的藻酸盐-GelMA纤维微球的直径分布，并且，图10(a)、图10(b)分别示出了实验1组、实验2组提供的藻酸盐-GelMA纤维微球的直径分布情况，图11示出了本发明实施例提供的GelMA纤维微球的直径分布，并且，图11(a)、图11(b)分别示出了实验1组、实验2组提供的GelMA纤维微球的直径分布情况，如图10、图11所示，壳-核结构的藻酸盐-GelMA纤维微球的粒径大小近似正态分布，实验1组中平均直径约为249μm，实验2组中平均直径约为250μm；核层GelMA纤维微球的粒径大小也呈正态分布，实验1组中平均直径约为185μm实验2组中平均直径约为178μm，核相GelMA纤维微球占总微球的70％。
由本实施例可知，核结构GelMA纤维微球是由GelMA纤维片段搭建起来的微球结构，和GelMA实心微球由聚合物网络形成的天然孔隙不同，纤维微球仅在不同纤维交叉接触的位点由甲基丙烯酸酯基团将彼此连接在一起，形成类似于渔网样多孔状结构，从而极大的提高了微球内部的孔隙率，并且不需要掺入任何有潜在毒性的致孔剂。藻酸盐溶液遇到钙离子会交联固化，利用这一特性，我们将藻酸盐溶液作为壳层溶液，包被内部的GelMA纤维片段，并在静电高压的作用下形成为微球后，壳层溶液立即接触钙离子交联维持微球的形态不坍塌不融合，从而辅助内部核结构GelMA纤维微球的成型；此外，由于藻酸盐交联后密度变大，微球的整体重量增加，可以自然地沉降至大皿底部，便于收集，而常规微球的制备通常需要将针头伸入油相液体里面，以免微球塌陷或破裂，从而收集微球时需要经过反复的离心和洗涤，将包裹在微球表面的油滴洗去，以免对内部包裹的细胞的活性产生影响。
本发明的再一个目的在于提供一种上述藻酸盐-GelMA纤维微球作为细胞载体的应用。
为使本领域技术人员更加清楚地理解本发明，现通过以下实施例对本发明所述的藻酸盐-GelMA纤维微球作为细胞载体的应用进行详细说明。
实施例3：藻酸盐-载hDPSCs的GelMA纤维微球中细胞的行为表征
(1)藻酸盐-载hDPSCs的GelMA纤维微球的制备
本实施例部分利用hDPSCs作为研究对象来评价该藻酸盐-GelMA纤维微球体系搭载细胞的性能，并以藻酸盐-5％纯GelMA微球作为对照。
Ⅰ：共轴静电液滴法制备藻酸盐-载hDPSCs的GelMA纤维微球
首先我们将所有需要用到的材料进行消毒灭菌处理，0.25％引发剂溶液、5％w/v纯GelMA水溶液以及2％w/v藻酸盐水溶液使用0.22μm一次性针头式滤器过滤除菌，将实施例1制备得到的GelMA纺丝纤维片段通过75％酒精浸泡过夜并用PBS漂洗3遍。
按前述实施例2介绍的方法，配制好实验1组GelMA纺丝纤维片段悬液、实验2组GelMA纺丝纤维片段悬液，避光放置一边备用。全程避免光直射。
将复苏后生长良好的第三代hDPSCs用胰蛋白酶消化下来，通过终止消化离心后得到细胞沉淀，去掉上清液。分别用实验1组GelMA纺丝纤维片段悬液、实验2组GelMA纺丝纤维片段悬液将处理后的第三代hDPSCs重悬得到核相混悬液，使得初始细胞混悬液的浓度为3×106cells/mL，即得到实验1组和实验2组核相前体溶液，同样的，用5％w/vGelMA水溶液将处理后的第三代hDPSCs重悬，即得到对比例组核相混悬液。
将实施例2制备壳核微球的设备经75％乙醇消毒后置于超净工作台中，紫外灯照射30min。除了外相流速更改为70之外，其余按照前述摸索出的参数。
分别制备出藻酸盐-载hDPSCs的GelMA纤维微球以及藻酸盐-载hDPSCs的GelMA实心微球的壳-核结构。经氯化钙、蓝光交联后的微球，使用PBS清洗掉交联液，随后加入生长培养基将微球均分于普通6孔板中培养，2-3天更换一次生长培养基，以供进一步实验探究。
图12示出了本发明实施例提供的藻酸盐-载hDPSCs的GelMA纤维微球在光镜下的结构图，其中，图12(a)示出的是以实验1组提供的GelMA纤维片段悬液重悬hDPSCs作核相前体溶液、以2.0％藻酸盐溶液作壳相前体溶液得到的实验1组藻酸盐-载hDPSCs的GelMA纤维微球，以下简称实验1组；图12(b)示出的是以实验2组提供的GelMA纤维片段悬液重悬hDPSCs作核相前体溶液、以2.0％藻酸盐溶液作壳相前体溶液得到的实验2组藻酸盐-载hDPSCs的GelMA纤维微球，以下简称实验2组。可见，核结构中，hDPSCs呈圆球状均匀分布于核层中，细胞折光性好、亮度高，提示细胞活性较好。也见到少数纤维微球组微球核层中不规则形态如半球形、条状等，但包裹细胞的能力不受影响，就像鸟巢一样为细胞提供适当的包裹和充足的附着位点。
图13示出了本发明实施例提供的藻酸盐-载hDPSCs的GelMA实心微球在光镜下的结构图。图13示出的是以5％w/v GelMA水溶液重悬hDPSCs作核相前体溶液、以1.9％藻酸盐溶液作壳相前体溶液得到的对比例组藻酸盐-载hDPSCs的GelMA实心微球，以下简称对比例组。
图14示出了本发明实施例提供的藻酸盐-载hDPSCs的GelMA纤维微球的直径分布，图14(a)、图14(b)和图14(c)分别示出了实验1组、实验2组提供的藻酸盐-载hDPSCs的GelMA纤维微球的直径分布和对比例组提供的藻酸盐-载hDPSCs的GelMA实心微球的直径分布，图15示出了本发明实施例提供的载hDPSCs的GelMA纤维微球的直径分布，图15(a)、图15(b)和图15(c)分别示出了实验1组、实验2组提供的载hDPSCs的GelMA纤维微球的直径分布以及对比例组提供的载hDPSCs的GelMA实心微球的直径分布，如图14、图15所示，实验组提供的实验1组、实验2组壳-核结构以及对比例提供的壳-核结构的平均直径分别约为331μm、311μm、301μm，其去壳层后的平均直径分别约为197μm、196μm、210μm，与未搭载细胞的壳核微球相比，尺寸稍增大，这与核相悬液中加入细胞有关，组间差异不是很大。
此外，由于有壳层的包裹，在静电液滴法制备的过程中，因液体飞溅未包进微球导致的浪费的细胞较少，在选择初始细胞浓度时可适当减小，这对于一些珍贵的细胞来说是很重要，可以很大程度上减少细胞损失。
(2)藻酸盐-载hDPSCs的GelMA纤维微球的体外培养
Ⅰ：藻酸盐-载hDPSCs的GelMA纤维微球与藻酸盐-载hDPSCs的GelMA实心微球中细胞的存活情况
在特定的时间点(1d、4d、7d、14d)，我们对藻酸盐-载hDPSCs的GelMA纤维微球与藻酸盐-载hDPSCs的GelMA实心微球内部细胞的生长情况进行评估。分别取三组微球悬液各1mL，使用PBS缓冲液清洗三次，除去残余的培养基。并依照活/死染色试剂盒的使用方法来检验细胞的存活率，并判断细胞的增殖情况。往2mL生理盐水中各加入1μL碘化丙二醇，和1μL钙蛋白酶-AM，配制成活/死染料溶液。向三组微球中各加入1mL染色液，将微球完全覆盖，使其避光并在37℃条件敷箱中孵育2min，转移至激光共聚焦荧光显微镜下观察，每组各拍摄10张照片进行统计分析，使用Image J软件计算活细胞与总细胞的比值即为细胞的存活率。
图16示出了本发明实施例提供的藻酸盐-载hDPSCs的GelMA纤维微球与藻酸盐-载hDPSCs的GelMA实心微球中hDPSCs的存活情况，如图16所示，三组实验中，hDPSCs的存活率均高于90％，在培养至第4、7、14天时，可看到实验1组、实验2组和对比例组的单个微球内hDPSCs数目逐渐增加。进一步地，图17示出了本发明实施例提供的藻酸盐-载hDPSCs的GelMA实心微球的激光共聚焦显微镜扫描图，由图17可知，hDPSCs仅分布在GelMA实心微球的表面。
Ⅱ：藻酸盐-载hDPSCs的GelMA纤维微球与藻酸盐-载hDPSCs的GelMA实心微球中细胞的增殖情况
CFSE染料(5(6)-羧基二乙酸荧光素N-琥珀酰亚胺酯)可以穿过细胞膜进入细胞内并与细胞骨架蛋白结合，并且可以激发出荧光。酶解后保留于细胞内，仅在细胞分裂时，随细胞骨架均分至子代细胞中，因此单细胞流式检测中，荧光强度越弱，分裂次数越多。在体外培养一天后，使用CFSE试剂盒对三组微球中包裹的细胞骨架进行标记，分别取三组微球悬液各2mL，使用PBS缓冲液漂洗微球一遍去除培养基，去除上清液，各加入1mL生理盐水，并加入1μl 5mM CFSE储存液，在避光条件下室温孵育20min，孵育完成后加入5mL培养基停止孵育5min，去除上清液，加入新鲜培养基洗涤两遍，最后加入培养基重悬，重新均分至6孔板中，每组各占两孔，避光置于敷箱中，每隔两天换液进行培养。
培养至14天时，将微球转移至ep管中，PBS洗涤三遍，加入柠檬酸三钠后轻轻吹打，离心后去除上清液，再加入1mL PBS以及6μL GelMA裂解液，重复上述吹打、离心、洗涤步骤得到三组细胞沉淀，使用1mL培养基重悬并过一道细胞筛，经过计数稀释后以每组106个细胞/mL，通过流式细胞仪检测细胞荧光强度。
图18示出了本发明实施例提供的藻酸盐-载hDPSCs的GelMA纤维微球与藻酸盐-载hDPSCs的GelMA实心微球d14的子代分布峰图，图18(a)、图18(b)、图18(c)分别为实验1组、实验2组提供的藻酸盐-载hDPSCs的GelMA纤维微球的子代分布峰图，以及对比例组提供的藻酸盐-载hDPSCs的GelMA实心微球d14的子代分布峰图，图18(d)为上述三组子代分布峰叠加效果展示，如图18所示，经过14天的体外培养，实验组(1:1组、1:2组)和对比例组中的细胞经流式检测呈现的结果为典型的连续多峰结构，相较于最右边的父代峰，实验1组、实验2组和对比例组纯中hDPSCs增殖子代峰所占比例分别为：54％、53％、47％，可见，实验1组、实验2组纤维微球增殖子代峰所占比例要高于对比例组，且对比例组中，代数更大的细胞所占比例呈递减趋势，而在实验1组和实验2组中，各代细胞所占比例较为均匀，且实验1组、实验2组组间差别不大，上述结果表明培养于GelMA纤维微球组中的hDPSCs具有更强的增殖能力。
Ⅲ：藻酸盐-载hDPSCs的GelMA纤维微球和藻酸盐-载hDPSCs的GelMA实心微球中细胞形态及干性基因表达
在特定的时间点(4d、7d、14d)，我们对内部细胞的细胞形态进行评估。分别取上述三组微球悬液各1mL，使用PBS缓冲液清洗三次，除去残余的培养基，加入4％多聚甲醛没过微球，于避光状态下在37℃下固定15min，随后去除上清液，使用PBS清洗三次，加入0.5％TritonX-100没过微球，在室温下对细胞膜打孔15min后，除去上清液并清洗三遍，加入1％(w/v)BSA没过微球，在37℃下封闭30min后，去上清，加入Phalloidin(1％BSA 1：200稀释)对细胞骨架进行标记，避光孵育染色30min，去上清并用PBS清洗三次，最后加入DAPI(1μg/mL)对细胞核进行标记，室温下孵育10min后去上清，PBS清洗三次去除剩余的染料。在CLSM下对上述载细胞微球中细胞形态进行观察，对整个微球每间隔5μm进行图像采集，并最后叠加Z轴，对细胞分布情况进行分析。
在体外培养两周后，对细胞分泌细胞外基质及细胞干性基因表达进行简单的评估和对比。
同样是三组载hDPSCs微球悬液各取1mL，PBS清洗后用前述方法对微球进行固定、打孔、封闭处理，每次加入新液体前均用PBS清洗三遍以去除前一液体的残余。使用细胞增殖抗原Ki67(1:200稀释)对微球进行染色标记，在4℃环境中避光孵育过夜。第二天去上清，用PBS漂洗三次去除剩余染料，接着用
488偶联抗体(1：200稀释)在37℃中避光孵育2h，并清洗掉残余染液以待观察。使用CLSM对上述微球进行荧光成像，采取5μm为图像采集间隔，最后进行Z轴叠加出三维重建图像。
图19示出了本发明实施例提供的藻酸盐-载hDPSCs的GelMA纤维微球与藻酸盐-载hDPSCs的GelMA实心微球中hDPSCs的形态，如图19所示，实验1组和实验2组的核结构在壳层的包裹下，并未出现相互粘连、聚集成团的现象，并且，实验1组和实验2组中细胞生长旺盛且分布均匀，而对比例组中细胞生长较为集中，且其生长速度明显低于实验组。
图20示出了本发明实施例提供的藻酸盐-载hDPSCs的GelMA纤维微球与藻酸盐-载hDPSCs的GelMA实心微球中干性基因表达情况，如图20所示，经过14天的体外培养，实验1组和实验2组与对比例组中的细胞均有干性基因表达。
由上述实施例3可知，通过体外培养发现，本发明提供的藻酸盐-载hDPSCs的GelMA纤维微球中，hDPSCs均可以成功粘附在材料上，并可以自由生长，这证实营养物质、代谢废物可以穿过藻酸盐壳层不受阻碍。
上述实施例3已经说明，本发明提供的藻酸盐-GelMA纤维微球作为载hDPSCs的载体，在体外培养条件下，hDPSCs具有良好的存活情况和增殖情况，发明人用下述实施例4进一步验证本发明提供的藻酸盐-GelMA纤维微球作为载hDPSCs的载体的动物实验的可行性，以证实本发明提供的藻酸盐-GelMA纤维微球具有制备细胞载体的应用价值。
以上对本发明所提供的一种藻酸盐-GelMA纤维微球、制法及其藻酸盐-GelMA纤维微球作为细胞载体的应用进行了详细介绍，本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本发明的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。
Claims (10)
1.一种藻酸盐-GelMA纤维微球，其特征在于，所述藻酸盐-GelMA纤维微球为壳-核结构，壳结构的组成材料为凝胶化的藻酸盐，核结构的组成材料为GelMA纺丝纤维片段，并且，不同所述GelMA纺丝纤维片段，在交叉接触的位点发生交联聚合，形成具有孔隙的GelMA纤维微球。
2.根据权利要求1所述的藻酸盐-GelMA纤维微球，其特征在于，所述GelMA纺丝纤维片段的纤维直径为1μm-16μm，所述GelMA纺丝纤维片段的纤维长度为15μm-60μm。
3.根据权利要求1所述的藻酸盐-GelMA纤维微球，其特征在于，所述核结构的平均粒径为178-185μm；所述壳结构的平均粒径为249-250μm。
4.一种上述权利要求1-3任一所述的藻酸盐-GelMA纤维微球的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下制备步骤：
S1、用适量的2,2,2-三氟乙醇将冻干的GelMA溶解，得到质量浓度为10％(w/v)的电纺液；
S2、将所述电纺液装入静电纺丝机中，调节电纺参数至合适后，制备得到GelMA纺丝纤维膜；
S3、将所述GelMA纺丝纤维膜浸泡于交联液中，20-24h后，使用PBS缓冲液漂洗被交联液浸泡后的GelMA纺丝纤维膜，得到交联处理后的GelMA纺丝纤维膜；
S4、将所述交联处理后的GelMA纺丝纤维膜放入PBS缓冲液中，进行超声细胞破碎、离心沉淀，得到GelMA纺丝纤维片段；
S5、将体积比为1：1-2的所述GelMA纺丝纤维片段与引发剂Lap混合均匀，得到核相前体溶液；
S6、配置质量浓度为2％w/v的藻酸盐溶液，作为壳相前体溶液；
S7、调节共轴静电液滴设备的相关参数，核相前体溶液与壳相前体溶液通过共轴静电液滴法以及蓝光照射，制备成具有壳-核结构的藻酸盐-GelMA纤维微球。
5.根据上述权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S2中，所述调节电纺参数包括：调节推注速度为0.5mL/h，调节电压为25kV，注射器针尖据接收装置距离为15cm，接收装置转速为1000转/分。
6.根据上述权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S3中，所述交联液由质量体积比为0.47g：0.28g：100mL的EDC、NHS和无水乙醇混合而成。
7.根据上述权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S5中，所述引发剂是质量浓度为0.25％w/v的Lap。
8.根据上述权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S7中，调节共轴静电液滴设备的相关参数包括：调节静电正电压为15kV，接受距离为12cm，核层溶液流速为15μL/min，壳层流速为50μL/min，共轴针头内径为25G，外径为16G。
9.根据上述权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S7中，核相前体溶液与壳相前体溶液通过共轴静电液滴法以及蓝光照射，制备成具有壳-核结构的藻酸盐-GelMA纤维微球包括：
核相前体溶液与壳相前体溶液在共轴针头出口端，以壳相前体溶液包覆核相前体溶液的形式流出，流出的溶液在高压静电场的作用下，拉长、断裂，落入装有1％w/v氯化钙溶液的接收装置中，外层壳相前体溶液与钙离子交联形成凝胶，进一步对接收装置进行蓝光光照，内层核相前体溶液在蓝光光照和Lap作用下发生交联形成GelMA纤维微球。
10.一种如上述权利要求1-3任一所述的藻酸盐-GelMA纤维微球作为细胞载体中的应用。
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Also Published As
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