CN115096881A - 一种微流控芯片检测细菌中银纳米颗粒、银离子含量的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种微流控芯片检测细菌中银纳米颗粒、银离子含量的方法，属于生物检测技术领域。本发明利用微流控芯片检测细菌中银纳米颗粒、银离子含量，本发明利用抗坏血酸还原得到的AA‑PtNPs作为纳米酶催化剂，能够催化H2O2分解产生水和氧气，随着氧气的增加气体会推动染料进入条形微通道；当待测样品中含有银纳米颗粒或银离子时，银纳米颗粒或银离子会结合在AA‑PtNPs表面，并且占据部分活性位点，导致AA‑PtNPs的酶活性下降，使得H2O2分解产生的氧气减少。本发明利用条形微通道的染色长度与银纳米颗粒、银离子的浓度呈线性关系检测细菌中银纳米颗粒、银离子含量，检测方法灵敏、准确。

Description

一种微流控芯片检测细菌中银纳米颗粒、银离子含量的方法
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，特别涉及一种微流控芯片检测细菌中银纳米颗粒、银离子含量的方法。
背景技术
银纳米粒子(AgNPs)由于具有良好的抗菌活性，已广泛应用于消费产品和医疗器械，如纺织品、食品包装、房间喷雾剂、伤口敷料和植入式导管等。AgNPs的广泛使用的一个不可避免的后果是它们有意或无意地释放到环境中。在体内研究中发现，在斑马鱼的各个发育阶段，AgNPs沉积在胚胎中，高剂量的AgNPs会引起明显的发育异常。虽然AgNPs的毒性研究较多，但其毒性机制尚不清楚。由于纳米尺度，AgNPs可能直接穿过细胞膜，与DNA或重要酶相互作用而造成损伤。另一方面，AgNPs的部分氧化可能导致Ag+的缓慢释放，这是已知的毒性最大的重金属之一。因此，一个核心问题是，AgNPs的生物毒性是由于纳米颗粒本身，还是与AgNPs溶解产生的Ag+有关。
一些毒理学研究报道了AgNPs在不同细胞系中的摄取和细胞内分布，其中AgNPs的摄取量是通过测定暴露细胞消化后的总银含量来确定的。这样就会高估细胞中AgNPs的确切数量，因为已经证明AgNPs除了可以通过内吞作用进入细胞外，Ag+也可以被摄取到细胞中。此外，细胞内的AgNPs可被代谢释放Ag+。因此，研究从复杂的生物培养基中选择性提取银纳米粒子或银离子的方法已成为迫切需要。
有研究提出浊点萃取法(CPE)在复杂生物介质中提取分离Ag+和AgNPs，具体的，使用电感耦合等离子体质谱(ICP-OES)对总Ag含量进行定量检测，获得总Ag含量(CTAg)，再采用CPE处理获得富集AgNPs的TX-114相和富集溶解Ag+的水相，通过ICP-OES测试AgNPs含量(CNAg)，根据式1计算溶解Ag+(CTAg+)的含量；
CTAg+＝CTAg-CNAg 式1。
但是，以上方法过于繁琐，且ICP-OES检测需要大型设备，对实验设备要求较高。
发明内容
有鉴于此，本发明目的在于提供一种微流控芯片检测细菌中银纳米颗粒、银离子含量的方法。本发明提供的微流控芯片能够简便、快捷、准确地检测出细菌中银纳米颗粒、银离子含量。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种银纳米颗粒或银离子检测用微流控芯片，包括底板1和与所述底板1贴合的顶板2；
所述底板1包括第一反应区1-1、第二反应区1-2、第三反应区1-3和入口与所述第三反应区1-3连通的条形微通道1-4；所述第一反应区1-1与第二反应区1-2间设有反应通道1-5；所述第一反应区1-1、第二反应区1-2、第三反应区1-3通过微流道1-6相互连通；
所述顶板2包括第一加样口2-1、第二加样口2-2、第三加样口2-3、第一出气口2-4和第二出气口2-5；所述第一加样口2-1位于第一反应区1-1上方，用于加入铂纳米颗粒与待测样品的混合物，所述铂纳米颗粒为抗坏血酸还原得到的铂纳米颗粒；所述第二加样口2-2位于第二反应区1-2上方，用于加入H2O2；所述第三加样口2-3位于第三反应区1-3方，用于加入染料；所述第一出气口2-4位于第一反应区1-1或第二反应区1-2的上方；所述第二出气口2-5位于条形微通道1-4的出口上方。
优选的，所述条形微通道1-4的直径为0.2～0.3mm，长度为45～50cm，深度为0.2～0.3mm；
所述微流道1-6的直径为0.2～0.3mm。
优选的，所述第一反应区1-1的直径为7～8mm，所述第二反应区1-2的直径为5～6mm，所述第三反应区1-3的直径为5～6mm；
所述第一加样口2-1、第二加样口2-2、第三加样口2-3、第一出气口2-4和第二出气口2-5的直径独立为0.8～1mm。
优选的，所述底板1和顶板2的材质为聚甲基丙烯酸甲酯；
所述染料为靛蓝胭脂红。
本发明提供了上述银纳米颗粒或银离子检测用微流控芯片的制备方法，包括以下步骤：
在底板1表面激光切割出第一反应区1-1、第二反应区1-2、第三反应区1-3、条形微通道1-4、反应通道1-5和微流道1-6，在顶板2上激光切割出第一加样口2-1、第二加样口2-2、第三加样口2-3、第一出气口2-4和第二出气口2-5；
将激光切割后的底板1和顶板2贴合，进行热压，得到银纳米颗粒或银离子检测用微流控芯片。
本发明提供了一种微流控芯片检测细菌中银纳米颗粒、银离子含量的方法，包括以下步骤：
(1)对细菌进行超声，得到细菌细胞裂解液；
将所述细菌细胞裂解液与水、酸液、Na2S2O3和表面活性剂混合，进行浊点萃取处理，得到表面活性剂相和水相，所述水相为银离子待测液，所述表面活性剂相为银纳米颗粒待测液；
(2)以所述银离子待测液或银纳米颗粒待测液作为待测样品，将待测样品与铂纳米颗粒混合，进行孵育，得到铂纳米颗粒与待测样品混合液，所述铂纳米颗粒为抗坏血酸还原得到的铂纳米颗粒；
将所述铂纳米颗粒与待测样品混合液、H2O2和染料分别加至上述微流控芯片的第一反应区1-1、第二反应区1-2和第三反应区1-3，密封反应区的孔，摇晃微流控芯片，使第一反应区1-1和第二反应区1-2的原料混合，测量固定时间下条形微通道1-4的染色长度；
根据所述染色长度和预定的标准曲线获得细菌中银离子或银纳米颗粒的含量；所述标准曲线为银离子浓度与染色长度的线性关系曲线或者银纳米颗粒浓度与染色长度的线性关系曲线。
优选的，所述步骤(1)中表面活性剂为TX-114；所述表面活性剂与水的体积比为0.2:9。
优选的，所述浊点萃取处理包括依次进行的孵育和离心分离，所述孵育的温度为30～40℃，时间为30～40min；所述离心分离的速率为3000～4000rpm，时间为5～10min。
优选的，所述抗坏血酸还原得到的铂纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：
将氯铂酸、抗坏血酸与水混合，进行水热反应，得到抗坏血酸还原得到的铂纳米颗粒；
所述水热反应的温度为60～80℃，时间为1～1.5h。
优选的，所述铂纳米颗粒的质量与待测样品的体积比为0.00078～0.00127mg:0.145mL。
优选的，所述银纳米颗粒含量的线性检测范围为0.05～1μM，检出限为2nM；
所述银离子含量的线性检测范围为0.05～1μM，检出限为1nM。
本发明提供了一种银纳米颗粒或银离子检测用微流控芯片，此微流控芯片为距离式微流控芯片。本发明利用抗坏血酸还原得到的铂纳米颗粒(AA-PtNPs)作为纳米酶催化剂，能够催化H2O2分解产生水和氧气，随着氧气的增加气体会推动染料进入条形微通道1-4；当待测样品中含有银纳米颗粒或银离子时，银纳米颗粒或银离子会结合在AA-PtNPs表面，并且占据AA-PtNPs表面的部分活性位点，导致AA-PtNPs的酶活性下降，使得H2O2分解产生的氧气减少，在固定时间内染料进入条形微通道1-4的距离明显变短，且条形微通道1-4的染色长度与银纳米颗粒、银离子的浓度呈线性关系。本发明提供的微流控芯片结构简单，便于携带，能够快速、准确检测出待测样品中银纳米颗粒或银离子的含量。
本发明提供了一种微流控芯片检测细菌中银纳米颗粒、银离子含量的方法，本发明先对细菌进行超声，得到细菌细胞裂解液；之后对所述细菌细胞裂解液进行浊点萃取处理，得到表面活性剂相和水相，所述水相为银离子待测液，所述表面活性剂相为银纳米颗粒待测液；使用上述微流控芯片对银离子待测液或银纳米颗粒待测液进行检测，获得微流控芯片检测细菌中银纳米颗粒、银离子含量。本发明检测方法能够灵敏、准确地检测出大肠杆菌中银纳米颗粒、银离子含量，其中银纳米颗粒含量的线性检测范围为0.05～1μM，检出限为2nM；银离子含量的线性检测范围为0.05～1μM，检出限LOD为1nM。
附图说明
图1为本发明银纳米颗粒或银离子检测用微流控芯片的结构示意图；
图2为微流控芯片上靛蓝胭脂红染料前进的距离随时间变化曲线；
图3为不同浓度Ag+下微流控芯片上靛蓝胭脂红染料前进的距离；
图4为微流控芯片实时检测Ag+标准曲线；
图5为微流控芯片实时检测AgNPs标准曲线；
图6为微流控芯片检测Ag+特异性结果。
具体实施方式
本发明提供了一种银纳米颗粒或银离子检测用微流控芯片，包括底板1和与所述底板1贴合的顶板2；
所述底板1包括第一反应区1-1、第二反应区1-2、第三反应区1-3和入口与所述第三反应区1-3连通的条形微通道1-4；所述第一反应区1-1与第二反应区1-2间设有反应通道1-5；所述第一反应区1-1、第二反应区1-2、第三反应区1-3通过微流道1-6相互连通；
所述顶板2包括第一加样口2-1、第二加样口2-2、第三加样口2-3、第一出气口2-4和第二出气口2-5；所述第一加样口2-1位于第一反应区1-1上方，用于加入铂纳米颗粒与待测样品的混合物，所述铂纳米颗粒为抗坏血酸还原得到的铂纳米颗粒；所述第二加样口2-2位于第二反应区1-2上方，用于加入H2O2；所述第三加样口2-3位于第三反应区1-3方，用于加入染料；所述第一出气口2-4位于第一反应区1-1或第二反应区1-2的上方；所述第二出气口2-5位于条形微通道1-4的出口上方。
在本发明中，所述染料优选为靛蓝胭脂红。
本发明提供的银纳米颗粒或银离子检测用微流控芯片包括底板1。在本发明中，所述底板1的材质优选为聚甲基丙烯酸甲酯。本发明对所述底板1的具体尺寸规格没有特殊的要求，根据实际情况进行相应设计即可。
在本发明中，所述底板1包括第一反应区1-1、第二反应区1-2、第三反应区1-3和入口与所述第三反应区1-3连通的条形微通道1-4；所述第一反应区1-1与第二反应区1-2间设有反应通道1-5；所述第一反应区1-1、第二反应区1-2、第三反应区1-3通过微流道1-6相互连通。在本发明中，所述第一反应区1-1的直径优选为7～8mm，所述第二反应区1-2的直径优选为5～6mm，所述第三反应区1-3的直径优选为5～6mm。在本发明中，所述条形微通道1-4的直径优选为0.2～0.3mm，长度优选为45～50cm，更优选为46～48cm，深度优选为0.2～0.3mm。在本发明中，所述条形微通道1-4的直径、长度影响着微流控芯片的灵敏度，在上述直径、长度下，当只有少量气体产生时，也会有肉眼可见的染料前进的距离。
在本发明中，所述条形微通道1-4的长度可测。
在本发明中，所述反应通道1-5的长度优选为0.4～0.6mm，宽度优选为0.2～0.25mm。在本发明中，所述第一反应区1-1内的样品可以通过反应通道1-5进入第二反应区1-2。
在本发明中，所述微流道1-6的直径优选为0.2～0.3mm，更优选为0.25mm。在本发明中，所述微流道1-6为气体流通通道。
本发明提供的银纳米颗粒或银离子检测用微流控芯片包括顶板2。在本发明中，所述顶板2的材质优选为聚甲基丙烯酸甲酯。在本发明中，所述顶板2的尺寸优选与底板1相同。
在本发明中，所述顶板2包括第一加样口2-1、第二加样口2-2、第三加样口2-3、第一出气口2-4和第二出气口2-5。在本发明中，所述第一加样口2-1、第二加样口2-2、第三加样口2-3、第一出气口2-4和第二出气口2-5的直径优选为0.8～1mm，更优选为0.9mm。
在本发明中，所述第一加样口2-1位于第一反应区1-1上方，用于加入铂纳米颗粒与待测样品的混合物，所述铂纳米颗粒为抗坏血酸还原得到的铂纳米颗粒；所述第二加样口2-2位于第二反应区1-2上方，用于加入H2O2；所述第三加样口2-3位于第三反应区1-3方，用于加入染料；所述第一出气口2-4位于第一反应区1-1或第二反应区1-2的上方；所述第二出气口2-5位于条形微通道1-4的出口上方。
在本发明中，所述银纳米颗粒或银离子检测用微流控芯片的制备方法，优选包括以下步骤：
在底板1表面激光切割出第一反应区1-1、第二反应区1-2、第三反应区1-3、条形微通道1-4、反应通道1-5和微流道1-6，在顶板2上激光切割出第一加样口2-1、第二加样口2-2、第三加样口2-3、第一出气口2-4和第二出气口2-5；
将激光切割后的底板1和顶板2贴合，进行热压，得到银纳米颗粒或银离子检测用微流控芯片。
本发明在底板1表面激光切割出第一反应区1-1、第二反应区1-2、第三反应区1-3、条形微通道1-4、反应通道1-5和微流道1-6，在顶板2上激光切割出第一加样口2-1、第二加样口2-2、第三加样口2-3、第一出气口2-4和第二出气口2-5。
本发明在所述激光切割前，本发明优选通过平面设计软件对顶板2、底板1的图案进行设计。在本发明中，所述平面设计软件优选为CorelDRAW软件。
在本发明中，所述激光切割优选为CO2激光切割。在本发明中，所述激光切割的切割速度优选为2～20mm/s，功率优选为50～90W，雕刻速度参数为1500mm/s。
所述激光切割后，本发明优选对激光切割后的底板1和顶板2进行清洗和干燥。在本发明中，所述清洗优选为超声清洗，所述超声清洗的时间优选为1h。在本发明中，所述干燥优选包括依次进行的60℃烘箱烘干和氮气吹干。
本发明将激光切割后的底板1和顶板2贴合，进行热压，得到银纳米颗粒或银离子检测用微流控芯片。在本发明中，所述热压优选在橡胶片中进行。在本发明中，所述热压的温度优选为105～110℃，压力优选为1～1.05MPa，时间优选为3～5min。
在本发明中，所述银纳米颗粒或银离子检测用微流控芯片的使用方法优选包括以下步骤：
将待测样品与铂纳米颗粒混合，得到铂纳米颗粒与待测样品混合液；
将所述铂纳米颗粒与待测样品混合液H2O2和染料分别加第一反应区1-1、第二反应区1-2和第三反应区1-3，密封反应区的孔，摇晃微流控芯片，使第一反应区1-1和第二反应区1-2的原料混合，测量固定时间下条形微通道1-4的染色长度。
在本发明中，所述摇晃微流控芯片的方式优选为手动甩动微流控芯片。
在本发明中，所述银纳米颗粒或银离子检测用微流控芯片的结构示意图如图1所示。图1中，1为底板，1-1为第一反应区1-1，1-2为第二反应区，1-3为第三反应区，1-4为条形微通道，1-5为反应通道，1-6为微流道；2为顶板，2-1为第一加样口，2-2为第二加样口，2-3为第三加样口，2-4为第一出气口，2-5为第二出气口。
本发明提供了一种微流控芯片检测细菌中银纳米颗粒、银离子含量的方法，包括以下步骤：
(1)对细菌进行超声，得到细菌细胞裂解液；
将所述细菌细胞裂解液与水、酸液、Na2S2O3和表面活性剂混合，进行浊点萃取处理，得到表面活性剂相和水相，所述水相为银离子待测液，所述表面活性剂相为银纳米颗粒待测液；
(2)以所述银离子待测液或银纳米颗粒待测液作为待测样品，将待测样品与铂纳米颗粒混合，进行孵育，得到铂纳米颗粒与待测样品混合液，所述铂纳米颗粒为抗坏血酸还原得到的铂纳米颗粒；
将所述铂纳米颗粒与待测样品混合液、H2O2和染料分别加至上述微流控芯片的第一反应区1-1、第二反应区1-2和第三反应区1-3，密封反应区的孔，摇晃微流控芯片，使第一反应区1-1和第二反应区1-2的原料混合，测量固定时间下条形微通道1-4的染色长度；
根据所述染色长度和预定的标准曲线获得细菌中银离子或银纳米颗粒的含量；所述标准曲线为银离子浓度与染色长度的线性关系曲线或者银纳米颗粒浓度与染色长度的线性关系曲线。
本发明对细菌进行超声，得到细菌细胞裂解液。在本发明中，所述细菌优选为大肠杆菌。
在本发明中，所述超声的时间优选为15～20min。本发明通过所述超声，使细菌细胞破碎。
所述超声后，本发明将所述细菌细胞裂解液与水、酸液、Na2S2O3和表面活性剂混合，进行浊点萃取处理，得到表面活性剂相和水相，所述水相为银离子待测液，所述表面活性剂相为银纳米颗粒待测液。在本发明中，所述酸液优选为硝酸溶液，所述硝酸溶液的浓度优选为0.05mol/L。在本发明中，所述混合优选为：先将细菌细胞裂解液与水混合，得到细菌细胞裂解液水分散液；再加入酸液调节pH值至3.5，之后加入Na2S2O3和表面活性剂。在本发明中，Na2S2O3可以和Ag+形成配合物，能够消除Ag+的干扰，增强相分离，从而提高AgNPs的提取效率。
在本发明中，所述Na2S2O3优选以水溶液的形式加入，所述Na2S2O3溶液的浓度优选为0.1mol/L，所述Na2S2O3溶液与细菌细胞裂解液水分散液的体积比优选为0.2:9。
在本发明中，所述表面活性剂优选为TX-114；所述表面活性剂与水的体积比优选为1～2:10，更优选为1.5:10。
在本发明中，所述浊点萃取处理包括依次进行的孵育和离心分离，所述孵育的温度优选为30～40℃，更优选为35℃；时间优选为30～40min，更优选为35min；所述离心分离的速率优选为3000～4000rpm，更优选为3500rpm；时间优选为5～10min，更优选为6～8min。
在本发明中，得到所述表面活性剂相后，本发明优选对所述表面活性剂进行微波消解。在本发明中，所述微波消解包括以下步骤：
将表面活性剂相与浓硝酸、H2O2混合，进行微波照射。
在本发明中，所述微波照射优选包括依次进行的第一微波照射和第二微波照射。在本发明中，所述第一微波照射的功率优选为600～800W，更优选为700W；温度优选为100～120℃，更优选为110℃；时间优选为8～10min，更优选为9min。
在本发明中，所述第二微波照射的功率优选为1500～1700W，更优选为1600W；温度优选为160～180℃，更优选为170℃；时间优选为20～40min，更优选为30min。
本发明以所述银离子待测液或银纳米颗粒待测液作为待测样品，将待测样品与铂纳米颗粒混合，进行孵育，得到铂纳米颗粒与待测样品混合液，所述铂纳米颗粒为抗坏血酸还原得到的铂纳米颗粒。
在本发明中，所述抗坏血酸还原得到的铂纳米颗粒的制备方法，优选包括以下步骤：
将氯铂酸、抗坏血酸与水混合，进行水热反应，得到抗坏血酸还原得到的铂纳米颗粒。
在本发明中，所述氯铂酸与抗坏血酸的摩尔比优选为1:2～4，更优选为1:3.75；在本发明中，所述水热反应的温度优选为60～70℃，更优选为65℃，时间优选为1～1.5h，更优选为1～1.2h。
所述水热反应后，本发明优选对所得水热反应液进行后处理，所述后处理优选包括以下步骤：
对所述水热反应液进行离心洗涤，得到铂纳米颗粒。
在本发明中，所述离心洗涤的速率优选为15000r/min，时间优选为10～15min；所述离心洗涤用洗涤剂优选为水，所述离心洗涤的温度优选为4℃，所述离心洗涤的次数优选为2次。
在本发明中，所述铂纳米颗粒的浓度优选为0.0008～0.0013mmol/L，更优选为0.001～0.0012mmol/L。在本发明中，所述铂纳米颗粒的质量与待测样品的体积比优选为0.00078～0.00127mg:0.145mL。在本发明中，所述孵育的温度优选为24～28℃，时间优选为0～30min，更优选为5～20min；在本发明中，当所述孵育时间为0min时，表示混合后不进行孵育即混即用。
本发明将所述铂纳米颗粒与待测样品混合液、H2O2和染料分别加至上述微流控芯片的第一反应区1-1、第二反应区1-2和第三反应区1-3，密封反应区的孔，摇晃微流控芯片，使第一反应区1-1和第二反应区1-2的原料混合，测量固定时间下条形微通道1-4的染色长度。
在本发明中，所述H2O2的浓度优选为8～10mol/L，更优选为9～10mol/L。在本发明中，所述铂纳米颗粒与待测样品混合液、H2O2和染料的体积比优选为1:2:2。在本发明中，所述铂纳米颗粒与待测样品混合液的加入量优选为5μL。
在本发明中，所述密封反应区的孔的方式优选为封口膜密封。
在本发明中，所述固定时间优选为8～10min。
本发明根据所述染色长度和预定的标准曲线获得细菌中银离子或银纳米颗粒的含量；所述标准曲线为银离子浓度与染色长度的线性关系曲线或者银纳米颗粒浓度与染色长度的线性关系曲线。在本发明中，所述银离子浓度与染色长度的线性关系曲线的绘制方法，优选包括以下步骤：
提供梯度已知浓度的银离子溶液；
以所述梯度已知浓度的银离子溶液作为待测样品，将待测样品与铂纳米颗粒混合，进行孵育，得到铂纳米颗粒与待测样品混合液，将所述铂纳米颗粒与待测样品混合液、H2O2和染料分别加至上述微流控芯片的第一反应区1-1、第二反应区1-2和第三反应区1-3，密封反应区的孔，摇晃微流控芯片，使第一反应区1-1和第二反应区1-2的原料混合，测量固定时间下不同浓度银离子溶液对应的条形微通道1-4的染色长度，以银离子溶液浓度为横坐标，以条形微通道1-4的染色长度为纵坐标，绘制标准曲线。
在本发明中，所述银纳米颗粒浓度与染色长度的线性关系曲线的绘制方法，优选包括以下步骤：
提供梯度已知浓度的银纳米颗粒溶液；
以所述梯度已知浓度的银纳米颗粒溶液作为待测样品，将待测样品与铂纳米颗粒混合，进行孵育，得到铂纳米颗粒与待测样品混合液，将所述铂纳米颗粒与待测样品混合液、H2O2和染料分别加至上述微流控芯片的第一反应区1-1、第二反应区1-2和第三反应区1-3，密封反应区的孔，摇晃微流控芯片，使第一反应区1-1和第二反应区1-2的原料混合，测量固定时间下不同浓度银纳米颗粒溶液对应的条形微通道1-4的染色长度，以银纳米颗粒溶液浓度为横坐标，以条形微通道1-4的染色长度为纵坐标，绘制标准曲线。
下面结合实施例对本发明提供的微流控芯片检测细菌中银纳米颗粒、银离子含量的方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
制备图1所示的微流控芯片，方法如下：
(1)用CorelDRAW软件设计和绘制微流控芯片微通道图形。
(2)通过CO2激光切割技术在微流控芯片的基材表面制备CorelDRAW软件设计的芯片图形，其中，切割参数包括：加样口2-1、2-2、2-3、2-4、2-5采用speed：2.0mm/s；power：90W；DPI：1500mm/s进行切割，微流控通道1-4采用speed：20.0mm/s；power：50W；DPI:1500mm/s进行切割，反应区1-1、1-2、1-3、1-5、1-6采用speed：10.0mm/s；power：50W；DPI：1500mm/s进行切割。
(3)将芯片基材切割后得到的上、下两片微流控芯片(300×300×2mm)，用超纯水洗涤并超声1h，再用60℃烘箱烘干，进一步用氮气吹干。
(4)用热压法将切割好的上下两片键合在一起。当温度升至110℃时，将板放置在橡胶片中，在1MPa下热压3min。然后将键合好的微流控芯片取出，放凉。
其中，微流控芯片中，三个反应区域直径分别为7mm、5mm、5mm。条形微通道1-4的直径为0.2mm，长度为50cm。
实施例2
(1)铂纳米颗粒AA-PtNPs的制备
将3mL 10mM AA(抗坏血酸)和4mL 2mM H2PtCl6(氯铂酸)加入到2mL超纯水中，60℃加热1h。溶液从浅黄色变为棕色再变为深棕色。离心后沉淀分散在超纯水中，备用。
(2)可行性实验
将10μL靛蓝胭脂红染料、10μL 10M H2O2、5μL 0.0013mM AA-PtNPs，按上述顺序分别加入微流控芯片的第三反应区1-3、第二反应区1-2和第一反应区1-1。用封口膜密封反应区后，用手甩动微流控芯片，使AA-PtNPs与H2O2充分混合，立即用计时器计时。记录反应2min、4min、6min、8min、10min时微流控芯片上靛蓝胭脂红染料前进的距离。
同理，作为对照组，将10μL靛蓝胭脂红染料，10μL 10M H2O2、5μL Ag+与0.0013mMAA-PtNPs混合液(Ag+浓度为1μM)，按上述顺序分别加入距离式微流控芯片的对应反应区。用封口膜密封反应区后，用手甩动微流控芯片，使AA-PtNPs与H2O2充分混合，立即用计时器计时。记录反应2min、4min、6min、8min、10min时微流控芯片上靛蓝胭脂红染料前进的距离。结果如图2所示，由图2可知，当存在银离子时，微流控芯片上靛蓝胭脂红染料前进的距离明显变短。
实施例3
(1)微流控芯片实时检测Ag+标准曲线
将10μL靛蓝胭脂红染料，10μL 10M H2O2、5μL 0.0013mM不同浓度Ag+(0.05μM、0.1μM、0.25μM、0.5μM、1μM、2.5μM、5μM、10μM、50μM)与AA-PtNPs的混合溶液，按上述顺序分别加入距离式微流控芯片的对应反应区。用封口膜密封反应区后，用手甩动微流控芯片，使AA-PtNPs与H2O2充分混合，立即用计时器计时。分别记录反应10min时微流控芯片上靛蓝胭脂红染料前进的距离，所得结果如图3所示。由图3可以看出，随着Ag(I)浓度的增加导致染料前进速度减慢，，当Ag+浓度高于1μM时，染料前进的距离变化不明显，说明过量添加Ag(I)甚至可以完全抑制材料的催化效果，使得没有气体产生无法推动染料进入微流控芯片的微通道。
固定记录检测10min内微流控芯片微通道染料前进的距离，在0.05μM至1μM的浓度范围内，定量检测Ag(I)的结果如图4所示。由图4可以看出，染料在前进的距离与Ag(I)浓度之间的线性回归方程为Lengthdye＝37.49452-32.4484CAg(I)，相关系数R2＝0.99682，检出限LOD为1nM。
(2)微流控芯片实时检测AgNPs标准曲线
在本实施例中，AgNPs浓度指通过ICP-OES法测定的溶液中AgNPs浓度，即AgNPs溶液中，Ag元素的总浓度。
将10μL靛蓝胭脂红染料，10μL 10M H2O2、5μL不同浓度AgNPs(0.05μM、0.2μM、0.4μM、0.6μM、0.8μM、1μM、5μM、10μM、50μM)与AA-PtNPs的混合溶液，按上述顺序分别加入距离式微流控芯片的对应反应区。用封口膜密封反应区后，用手甩动微流控芯片，使AA-PtNPs与H2O2充分混合，立即用计时器计时。分别记录反应10min时微流控芯片上靛蓝胭脂红染料前进的距离。由于AgNPs对AA-PtNPs有抑制作用，因此随着AgNPs浓度的增加导致染料前进速度减慢，当AgNPs浓度高于1μM时，染料前进的距离变化不明显，说明过量添加AgNPs甚至可以完全抑制材料的催化效果，使得没有气体产生无法推动染料进入微流控芯片的微通道。
固定记录检测10min内微流控芯片微通道染料前进的距离，在0.05μM至1μM的浓度范围内，定量检测AgNPs的结果如图5所示。由图5可以看出，染料在前进的距离与AgNPs浓度之间的线性回归方程为Lengthdye＝35.47936-32.71168CAgNPs，相关系数R2＝0.9965，检出限LOD为2nM。
实施例4
微流控芯片检测Ag+的特异性
为了确定距离式微流控芯片检测Ag+的特异性，随机选取20种不同价态的阴阳离子进行了干扰离子实验。干扰离子的浓度为5μM，是Ag+浓度(0.5μM)的10倍。所得结果如图6所示。由图6可以看出，检测干扰离子时染料在距离式微流控芯片前进的距离与空白样品的非常接近，说明干扰离子不能抑制AA-PtNPs纳米酶活性。此外，即使当Ag+含量非常少时，也会对AA-PtNPs纳米酶活性有较好的抑制作用，染料在微流控芯片上前进的距离明显变短。因此表明距离式微流控芯片对Ag+的分析检测具有良好特异性。
实施例5
基于微流控芯片检测大肠杆菌中银纳米颗粒、银离子含量
(1)AgNPs的合成
柠檬酸和单宁酸溶解在100mL水中(终浓度分别为5mM和1mM)，磁力搅拌加热到110℃，随后将硝酸银(1mL，25mM)溶液快速加入到上述混合物中，此时溶液颜色立即变为亮黄色，随后在110℃回流15分钟。当反应温度降至90℃后，依次加入柠檬酸钠(100μL，25mM)，单宁酸(250μL，2.5mM)和硝酸银(250μL，25mM)继续反应30分钟。通过离心洗涤两次(17500r/min，4℃)除去过量的单宁酸和柠檬酸钠，最后将AgNPs重新分散于水中，4℃保存备用。ICP-OES测定AgNPs中银元素的浓度为20.285mg/L。
(2)对与大肠杆菌孵育后的Ag+、AgNPs进行分离提取并定量检测。
将大肠杆菌暴露于10mg/L AgNPs在37℃下孵育24小时，再用超声进行细胞裂解后进行CPE处理。CPE处理后TX-114相中富集了AgNPs，将它进行微波消解后，用ICP-OES对AgNPs进行定量即CNAg；水相富集了溶解Ag+。
采用同一批在10mg/L AgNPs孵育24小时的大肠杆菌，用超声进行细胞裂解后再进行微波消解，再用ICP-OES对总Ag含量进行定量即CTAg。
其中，CPE处理包括以下步骤：
准备好10mL离心管，加入获得大肠杆菌并用超声裂解，之后加超纯水调整至9mL，再加0.05M HNO3把pH值调为3.5，然后加0.1mol/L Na2S2O3和10％(w/v)TX-114各0.2mL。将所得混合物混合，在40℃水浴中孵育30分钟，在室温下3000rpm离心5分钟，以促进相分离。
微波消解包括以下步骤：
将5mL浓硝酸与1mL浓缩H2O2及已获得TX-114相的AgNPs混合物混合，依次在800W微波下照射10min(120℃)、在1600W微波下照射30min(180℃)，所得样品用水稀释100mL，在4℃下存储。
按照CTAg+＝CTAg-CNAg可计算得出溶解Ag+的含量，所得结果如表1所示。
表1大肠杆菌中Ag+、AgNPs定量检测结果
Figure BDA0003752130130000151
用微流控芯片对从BL21大肠杆菌中提取的TX-114相AgNPs、水相中Ag+含量进行定量检测，所得结果如表2所示。
表2微流控芯片对大肠杆菌中Ag+、AgNPs的检测结果
Figure BDA0003752130130000152
由表2可以看出，本发明检测方法能够灵敏、准确地检测出大肠杆菌中银纳米颗粒、银离子含量。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种银纳米颗粒或银离子检测用微流控芯片，包括底板(1)和与所述底板(1)贴合的顶板(2)；
所述底板(1)包括第一反应区(1-1)、第二反应区(1-2)、第三反应区(1-3)和入口与所述第三反应区(1-3)连通的条形微通道(1-4)；所述第一反应区(1-1)与第二反应区(1-2)间设有反应通道(1-5)；所述第一反应区(1-1)、第二反应区(1-2)、第三反应区(1-3)通过微流道(1-6)相互连通；
所述顶板(2)包括第一加样口(2-1)、第二加样口(2-2)、第三加样口(2-3)、第一出气口(2-4)和第二出气口(2-5)；所述第一加样口(2-1)位于第一反应区(1-1)上方，用于加入铂纳米颗粒与待测样品的混合物，所述铂纳米颗粒为抗坏血酸还原得到的铂纳米颗粒；所述第二加样口(2-2)位于第二反应区(1-2)上方，用于加入H2O2；所述第三加样口(2-3)位于第三反应区(1-3)方，用于加入染料；所述第一出气口(2-4)位于第一反应区(1-1)或第二反应区(1-2)的上方；所述第二出气口(2-5)位于条形微通道(1-4)的出口上方。
2.根据权利要求1所述的银纳米颗粒或银离子检测用微流控芯片，其特征在于，所述条形微通道(1-4)的直径为0.2～0.3mm，长度为45～50cm，深度为0.2～0.3mm；
所述微流道(1-6)的直径为0.2～0.3mm。
3.根据权利要求1或2所述的银纳米颗粒或银离子检测用微流控芯片，其特征在于，所述第一反应区(1-1)的直径为7～8mm，所述第二反应区(1-2)的直径为5～6mm，所述第三反应区(1-3)的直径为5～6mm；
所述第一加样口(2-1)、第二加样口(2-2)、第三加样口(2-3)、第一出气口(2-4)和第二出气口(2-5)的直径独立为0.8～1mm；
所述底板(1)和顶板(2)的材质为聚甲基丙烯酸甲酯；
所述染料为靛蓝胭脂红。
4.权利要求1～3任意一项所述银纳米颗粒或银离子检测用微流控芯片的制备方法，包括以下步骤：
在底板(1)表面激光切割出第一反应区(1-1)、第二反应区(1-2)、第三反应区(1-3)、条形微通道(1-4)、反应通道(1-5)和微流道(1-6)，在顶板(2)上激光切割出第一加样口(2-1)、第二加样口(2-2)、第三加样口(2-3)、第一出气口(2-4)和第二出气口(2-5)；
将激光切割后的底板(1)和顶板(2)贴合，进行热压，得到银纳米颗粒或银离子检测用微流控芯片。
5.一种微流控芯片检测细菌中银纳米颗粒、银离子含量的方法，包括以下步骤：
(1)对细菌进行超声，得到细菌细胞裂解液；
将所述细菌细胞裂解液与水、酸液、Na2S2O3和表面活性剂混合，进行浊点萃取处理，得到表面活性剂相和水相，所述水相为银离子待测液，所述表面活性剂相为银纳米颗粒待测液；
(2)以所述银离子待测液或银纳米颗粒待测液作为待测样品，将待测样品与铂纳米颗粒混合，进行孵育，得到铂纳米颗粒与待测样品混合液，所述铂纳米颗粒为抗坏血酸还原得到的铂纳米颗粒；
将所述铂纳米颗粒与待测样品混合液、H2O2和染料分别加至权利要求1～3任意一项所述微流控芯片的第一反应区(1-1)、第二反应区(1-2)和第三反应区(1-3)，密封反应区的孔，摇晃微流控芯片，使第一反应区(1-1)和第二反应区(1-2)的原料混合，测量固定时间下条形微通道(1-4)的染色长度；
根据所述染色长度和预定的标准曲线获得细菌中银离子或银纳米颗粒的含量；所述标准曲线为银离子浓度与染色长度的线性关系曲线或者银纳米颗粒浓度与染色长度的线性关系曲线。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中表面活性剂为TX-114；所述表面活性剂与水的体积比为1～2:10。
7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于，所述浊点萃取处理包括依次进行的孵育和离心分离，所述孵育的温度为30～40℃，时间为30～40min；所述离心分离的速率为3000～4000rpm，时间为5～10min。
8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述抗坏血酸还原得到的铂纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：
将氯铂酸、抗坏血酸与水混合，进行水热反应，得到抗坏血酸还原得到的铂纳米颗粒；
所述水热反应的温度为60～80℃，时间为1～1.5h。
9.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述铂纳米颗粒的质量与待测样品的体积比为0.00078～0.00127mg:0.145mL。
10.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述银纳米颗粒含量的线性检测范围为0.05～1μM，检出限为2nM；
所述银离子含量的线性检测范围为0.05～1μM，检出限为1nM。
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