CN115093925A - 一种通用型微流控细胞提取芯片 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种通用型微流控细胞提取芯片，累积19片片层结构，由5模块不同功能的薄膜芯片密封组成，包块：分流层、提取层、流阻层、导流层、富集层。该芯片将分散在原始样品溶液中的细胞从原始溶液中提取至空白洗涤溶液中，并对提取后的细胞悬液进行富集。该芯片涉及提取结构利用水动力提取细胞，允许提取10至20μm宽尺寸段的细胞，且具有较高的吞吐量与细胞提取效率；涉及富集结构允许10至20μm的宽尺寸段细胞在提取层的工况下进行两次富集，便于收集细胞达到后续生化操作需求浓度。本发明自动实现细胞提取与细胞富集，具有广泛的细胞尺寸适用性，细胞提取过程更方便贴合于生化操作，为细胞实验样品制备提供了普遍适用且快捷高效的工具。

Description

一种通用型微流控细胞提取芯片

技术领域

本发明涉及微流控技术领域，尤其是一种通用型微流控细胞提取芯片。

背景技术

生化样品制备中的常见操作之一是将特定细胞（例如白细胞、癌细胞）与非目标物质（例如血浆、细胞碎片、原始分散系等）分离，并将目标细胞清洗到指定的缓冲液中，这一细胞提取并更换细胞液体环境的过程，根据所需结果往往需要多次重复进行，传统离心重悬技术对设备要求高，耗费大量人力的同时，频繁的移液操作带来样品污染风险，众多生化试剂对操作者的健康也存在不同程度的危害。

随着过去二十年中微流控技术的发展，微流体装置已成功用于在微通道流动条件下操纵粒子，得益于微通道特征尺寸与细胞尺寸刚好匹配的优势，奠定了在芯片上进行生化过程所需繁重操作的基础。

现有的用于洗脱细胞的主动和被动微流控设备受限于非常低的通量、低的溶液置换效率或是溶液置换后细胞样品出现体积膨胀问题，因此，如何以高吞吐量实现多种尺度细胞的快速高效洗脱与提取，对芯片上样品制备以及芯片上生物自动化检测具有重要的意义。

发明内容

本发明要解决的技术问题：在于解决现有细胞提取技术的缺陷，提供一种可高吞吐量地提取不同尺寸细胞，并进行细胞液体环境更换，并自动对细胞悬液进行多倍富集的通用型微流控细胞提取芯片。

本发明提供如下技术方案：一种通用型微流控细胞提取芯片，包括自上而下依次叠放的提取模块、流阻模块和富集模块；

所述提取模块内设有可将原始样品溶液中的细胞从原始溶液中提取至空白缓冲液的提取流道；去除细胞的原始溶液经流阻模块排出，含有细胞的缓冲液流至富集模块；

所述富集模块内设有可将细胞聚焦平衡在流道中心的聚焦流道，所述聚焦流道出口端设有用于排出细胞的中心流道和用于排出缓冲液的侧流道；

所述中心流道设置在所述聚焦流道的流道中心；所述中心流道连通细胞收集口。

进一步的，所述提取模块内设有细胞提取流道，所述细胞提取流道的流道呈螺旋线型；所述细胞提取流道末端设有靠近所述螺旋型细胞提取流道的内侧窄流道，和远离所述螺旋型细胞提取流道的外侧宽流道；

原始样品溶液沿所述细胞提取流道旋转990°后，所述原始样品溶液内细胞迁移至流道内侧壁，经所述内侧窄流道排出；去除细胞后原始样品溶液经流道外侧壁排出；

所述流阻模块包括连通所述外侧宽流道和提取废液出口的提取废液流道。

进一步的，所述提取模块设细胞提取流道，由5个直径依次增大的半圆流道和1个1/4圆流道首尾相连；

所述细胞提取流道的宽度设置260μm、高度设置80μm；

所述内侧窄流道和外侧宽流道的流道宽度比例为3:4。

所述内侧窄流道和外侧宽流道的流道宽度比例为3:4。

进一步的，所述富集模块的聚焦流道包括正弦流道和非对称正弦流道；

所述正弦流道由若干半圆弧流道交错排列连通，所述正弦流道的流道宽度为200μm、高度为60μm、流道中心曲率半径为350μm；

所述正弦流道末端设有三岔分支，所述三岔分支包括所述第一中心流道和设置在所述第一中心流道两侧的第一侧流道；所述三岔分支中，各流道宽度均为100μm；

所述中心流道连通所述非对称正弦流道；

所述非对称正弦流道由若干对大弧形流道和小弧形流道交错连通构成；所述大弧流道中心曲率半径370μm，所述弧形流道的流道宽度为100μm，流道中心曲率半径150μm；

所述非对称正弦流道始端与正弦流道末端的第一中心流道相连，所述设有三岔分支；所述三岔分支包括所述第二中心流道和设置在所述第二中心流道两侧的第二侧流道；所述三岔分支中，各流道宽度均为100μm；所述第二中心流道连通所述细胞收集口。

进一步的，包括自上而下依次平行叠放的分流模块、提取模块、流阻模块、导流模块和富集模块；

所述细胞提取流道包括结构相同的第一提取流道和第二提取流道；

所述分流模块包括用于原始样品溶液滴入的样品总入口、缓冲液总入口；

所述样品总入口通过样品分流道，将滴入样品总入口的原始样品溶液均匀分配至设置在样品分流道末端的第一样品入口和第二样品入口；

所述缓冲液总入口通过缓冲液分流道，将滴入缓冲液总入口的缓冲液均匀分配至设置在缓冲液分流道末端的第一缓冲液入口和第二缓冲液入口；

所述第一样品入口和第二样品入口、第一缓冲液入口和第二缓冲液入口均贯穿所述分流模块，并延伸至所述提取模块底面止；

所述提取流道包括第一细胞提取流道和第二细胞提取流道；

所述第一细胞提取流道起始端分别连通所述第一样品入口和第一缓冲液入口；

所述第二细胞提取流道起始端分别连通所述第二缓冲液入口和第二样品入口；

所述第一细胞提取流道末端的内侧窄流道连通第一提取出口；所述第一细胞提取流道末端的外侧宽流道连通第一提取废液入口；

所述第二细胞提取流道末端的内侧窄流道连通第二提取出口；所述第二细胞提取流道末端的外侧宽流道连通第一提取废液入口；

所述第一提取出口和第二提取出口贯穿所述提取模块，并延伸至所述导流模块底面止；

所述第一提取废液入口贯穿所述提取模块，并延伸至所述流阻模块底面止；

在所述流阻模块内，所述第一提取废液入口通过第一提取废液流道连通至所述第一提取废液出口。

进一步的，所述导流模块包括分别连通所述第一提取出口和第二提取出口的导流流道，以及设置在所述导流流道末端的富集总入口；

所述第一提取出口和第二提取出口中含有细胞的缓冲液经所述导流流道回流至所述富集总入口；

所述富集总入口贯穿至所述导流模块，并延伸至所述富集模块底面止。

进一步的，设置在所述第一中心流道两侧的第一侧流道分别连通第一富集流阻和第二富集流阻；所述第一侧流道排出的洗涤剂分别经所述第一富集流阻流至所述第一富集废液口，经所述第二富集流阻流至所述第二富集废液口；

设置在所述第二中心流道两侧的第二侧流道分别连通第一次级废液口和第二次级废液口；

所述导流模块还设有第一汇总流道和第二汇总流道；

所述第一汇总流道两端分别连通所述第一富集废液口和第一次级废液口；

所述第二汇总流道两端分别连通所述第二富集废液口和第二次级废液口；

所述第一富集废液口、第二富集废液口产生的多余缓冲液分别经富集模块的第一富集流阻和第二富集流阻与导流模块的第一汇总流道和第二汇总流道汇集后，从第一富集废液口、第二富集废液口排出。

进一步的，第一富集流阻与第二富集流阻流阻R2=R4+R1；

其中：R1为次级富集流道的流阻；R2为第一富集流阻与第二富集流阻的流阻；R3为第一提取废液流道和第二提取废液流道的流阻；R4为非对称正弦流道的流阻；R5为正弦流道的流阻；

所述内侧窄流道和外侧宽流道的流道流阻比例为为4:3，即R3=R5+R2//R2//(R4+R1)。

进一步的，还包括设置在所述细胞提取流道末端分叉处正上方，用于观察细胞提取过程的提取视窗；

还包括设置在所述正弦流道末端三岔分支处，用于观察第一级细胞富集过程的一级富集视窗；

还包括设置在所述非对称正弦流道末端三岔分支处，用于观察第二级细胞富集过程二级富集视窗。

进一步的，所述细胞提取芯片由19片自上而下依次平行叠放的片层结构累积密封而成；

包括分流层上盖板、分流层、分流层下盖板、1-2连接层、提取层上盖板、提取层、提取层下盖板、2-3连接层、流阻层上盖板、流阻层、流阻层下盖板、3-4连接层、导流层上盖板、导流层、导流层下盖板、4-5连接层、富集层上盖板、富集层和富集层下盖板；

所述通用型微流控细胞提取芯片的分流层上盖板与分流层和分流层下盖板通过等氧离子清洗后分别键合，密封形成分流模块；

提取层上盖板与提取层和提取层下盖板键合密封形成提取模块；

流阻层上盖板与流阻层和流阻层下盖板键合密封形成流阻模块；

导流层上盖板与导流层和导流层下盖板键合密封形成导流模块；

富集层上盖板与富集层和富集层下盖板键合密封形成富集模块；

所述分流层、提取层、流阻层、导流层和富集层均采用硅胶材质

所述分流层、提取层、流阻层、导流层和富集层的上下盖板均采用采用PET材质；

所述分流层、提取层、流阻层、导流层和富集层间的连接层均采用透明双面胶材质。

本发明与现有技术相比的有益效果：

1.本发明注重广的细胞尺寸适用性，提取模块与富集模块的流道结构使该发明满足粒径10-20μm细胞的高效提取与富集。本发明能够自动完成对细胞样品溶液的更换、细胞样品的浓缩过程，代替现有离心重悬操作，为生化应用中细胞操作提供便捷的工具，也为微流控样品制备领域的芯片集成提供手段。

2.提取模块的螺旋流道协调不同尺寸在流道中的所受惯性升力与Dean力的大小，使10-20微米尺寸的细胞在同一流速下，受力逐渐向流道一侧迁移，在通出提取模块时离开原始样品液进入缓冲液。

3.富集模块设有正弦流道及非对称正弦流道，含细胞的缓冲液流经正弦流道及非对称正弦流道，进行两次富集，该结构协调了10-20μm细胞在流道中受惯性升力与Dean力的影响，使得10-20μm细胞在正弦流道、非对称正弦流道产物的流速（400μL/min）下实现细胞聚焦平衡在流道中心。

4.正弦流道和非对称正弦流道都实现3倍的浓缩效果，且目标细胞从所需流道排出，非对称正弦流道末端的三岔分支流阻需相同为R1，第一/二富集流阻R2=R4+(R1//R2//R3)；为定量产物与废液的体积比例，协调各模块工作的流量设计，满足提取流道末端Y字形岔口3:4的流量比对，不仅Y字形岔口两侧的流道宽度比例设计为3:4，且两端相连的流道流阻应设计为4:3，即R3=R5+R2//R2//(R4+R1)，即富集模块流阻的1.5倍。

5.在本发明中，分流层、提取层、流阻层、导流层和富集层均采用硅胶材质；分流层、提取层、流阻层、导流层和富集层的上下盖板均采用采用PET材质；分流层、提取层、流阻层、导流层和富集层间的连接层均采用透明双面胶材质。硅胶层与PET层经过等离子清洗后键合密封形成完整的流道模块；模块与模块之间用上述双面胶连接层黏结。本芯片的加工时间短（<1min/层），加工精度高（偏差约5μm），制造成本低且灵活可靠。

附图说明

图1为本发明的整体结构示意图。

图2为图1的俯视图；

图3为本发明的爆炸结构示意图。

图4为本发明的分流层结构示意图。

图5为本发明的提取层的结构示意图。

图6为本发明的流阻层结构示意图。

图7为本发明的导流层结构示意图。

图8为本发明的富集层结构示意图。

图9为本发明的流阻匹配示意图。

图10为本发明提取流道末端最佳工况下10/15/20微米粒子实验效果图。

图11为本发明富集层流道最佳工况下10/15/20微米粒子实验效果图；

图12为本发明的片层结构示意图。

图13为本发明的分流层上盖板结构示意图。

图14为本发明的分流层下盖板结构示意图。

图15为本发明的1-2连接层结构示意图。

图16为本发明的提取层上盖板结构示意图。

图17为本发明的提取层下盖板结构示意图。

图18为本发明的2-3连接层结构示意图。

图19为本发明的流阻层上盖板结构示意图。

图20为本发明的流阻层下盖板结构示意图。

图21为本发明的3-4连接层结构示意图。

图22为本发明的导流层上盖板结构示意图。

图23为本发明的导流层下盖板结构示意图。

图24为本发明的4-5连接层结构示意图。

图25为本发明的富集层上盖板结构示意图。

图26为本发明的富集层下盖板结构示意图。

图27为本发明中螺旋流道具体结构示意图。

图中：1、分流层上盖板；2、分流层；3、分流层下盖板；4、1-2连接层；5、提取层上盖板；6、提取层；7、提取层下盖板；8、2-3连接层；9、流阻层上盖板；10、流阻层；11、流阻层下盖板；12、3-4连接层；13、导流层上盖板；14、导流层；15、导流层下盖板；16、4-5连接层；17、富集层上盖板；18、富集层；19、富集层下盖板；20、定位孔；21、样品总入口；22、缓冲液总入口；23、第一提取视窗；24、第二提取视窗；25、第三提取视窗；26、第四提取视窗；27、一级富集视窗；28、二级富集视窗；29、第一提取废液出口；30、第一富集废液口；31、细胞收集口；32、第二富集废液口；33、第二提取废液出口；34、样品四分流道；35、缓冲液四分流道；36、第一样品入口；37、第一缓冲液入口；38、第二缓冲液入口；39、第二样品入口；40、第三样品入口；41、第三缓冲液入口；42、第四缓冲液入口；43、第四样品入口；44、第一细胞提取流道；45、第二细胞提取流道；46、第三细胞提取流道；47、第四细胞提取流道；48、第一提取出口；49、第一提取废液入口；50、第二提取出口；51、第三提取出口；52、第二提取废液入口；53、第四提取出口；54、第一提取废液流道；55、第二提取废液流道；56、导流流道；57、富集总入口；58、第一汇总流道；59、第二汇总流道；60、第一次级废液口；61、第二次级废液口；62、正弦流道；63、第一富集流阻；64、第二富集流阻；65、非对称正弦流道；66、分流模块；67、提取模块；68、流阻模块；69、导流模块；70、富集模块。

具体实施方式

为使本发明的目的，技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实例中的附图，对本发明中的技术方案进行更加清楚，完整地描述。

本实施例的通用细胞提取芯片，如图1-26所示，包括分流层上盖板1、分流层2、分流层下盖板3、1-2连接层4、提取层上盖板5、提取层6、提取层下盖板7、2-3连接层8、流阻层上盖板9、流阻层10、流阻层下盖板11、3-4连接层12、导流层上盖板13、导流层14、导流层下盖板15、4-5连接层16、富集层上盖板17、富集层18、富集层下盖板19，各层一侧堆叠并封装成多个功能模块的集成芯片，模块包括分流模块66、提取模块67、流阻模块68、导流模块69、富集模块70；

如图3/4/13/14所示，分流模块66由分流层上盖板1、分流层2与分流层下盖板3密封构成。

分流模块66具有定位孔20用于各层定位组装、用于向该模块通入液体的样品总入口21、缓冲液总入口22；用于观察提取模块关键位置细胞与样品液相对位置的第一提取视窗23、第二提取视窗24、第三提取视窗25、第四提取视窗26；用于观察富集模块关键位置细胞聚焦与迁移现象的一级富集视窗27、二级富集视窗28；用于平均分配液体的样品四分流道34、缓冲液四分流道35，以及将均分后液体分别通入提取模块的第一样品入口36、第一缓冲液入口37、第二样品入口39、第二缓冲液入口38、第三样品入口40、第三缓冲液入口41、第四样品入口43、第四缓冲液入口42；用于排出提取废液（原样品溶液）的第一提取废液出口29、第二提取废液出口33；用于排出最终细胞产物的细胞收集口31；用于排出富集废液（缓冲溶液）的第一富集废液口30、第二富集废液口32；

如图15所示，1-2连接层4的结构有定位孔20、第一/二/三/四样品入口36/39/40/43、第一/二/三/四缓冲液入口37/38/41/42、第一/二/三/四提取视窗23/24/25/26、一/二级富集视窗27/28、第一/二提取废液出口29/33、第一/二富集废液口30/32、细胞收集口31；1-2连接层为双面胶材质，用于连接分流模块与提取模块；

如图5/16/17所示，提取模块67由提取层上盖板5、提取层6与提取层下盖板7密封构成。

提取模块67的提取流道包括依次第一流道44-1、第二流道44-2、第三流道44-3、第四流道44-4、第五流道44-5和第六流道44-6；

其中，第一流道44-1、第二流道44-2、第三流道44-3、第四流道44-4和第五流道44-5为半圆型流道，第六流道44-6为1/4圆流道；其中，第一流道44-1、第二流道44-2、第三流道44-3、第四流道44-4、第五流道44-5到第六流道44-6的流道直径逐步增加；

原始样品溶液进入细胞提取流道后，依次进入第一流道44-1、第二流道44-2、第三流道44-3、第四流道44-4、第五流道44-5和第六流道44-6，共计回旋旋转990°后，完成细胞与去除细胞的原始样品溶液的分离；

原始样品溶液内细胞迁移至流道内侧壁，经所述内侧窄流道排出；去除细胞后原始样品溶液经流道外侧壁排出。

提取模块67具有定位孔20用于各层定位组装、用于向该模块通入液体的第一/二/三/四样品入口36/39/40/43、第一/二/三/四缓冲液入口37/38/41/42；一/二级富集视窗27/28；

用于实现细胞与原样品液分离并提取至缓冲液中的第一细胞提取流道44、第二细胞提取流道45、第三细胞提取流道46、第四细胞提取流道47；用于排出含有细胞的缓冲液的第一提取出口48、第二提取出口50、第三提取出口51、第四提取出口53；用于将原样品废液导入流组模块68的第一提取废液入口49、第二提取废液入口52；第一/二提取废液出口29/33、细胞收集口31、第一/二富集废液口30/32；

如图18所示，2-3连接层8的结构有定位孔20、第一/二/三/四提取出口48/50/51/53、第一/二提取废液入口49/52、一/二级富集视窗27/28、第一/二提取废液出口29/33、第一/二富集废液口30/32、细胞收集口31；2-3连接层为双面胶材质，用于连接提取模块与流阻模块；

如图6/19/20/15所示，流阻模块68由流阻层上盖板9、流阻层10与流阻层下盖板11密封构成。

流阻模块68具有定位孔20；用于将液体通入该模块的第一提取废液入口49及第二提取废液入口52；

用于将含有细胞的缓冲液引入导流模块69的第一提取出口48、第二提取出口50、第三提取出口51及第四提取出口53；

用于满足提取模块出口流量比例的流阻流道——第一提取废液流道54及第二提取废液流道55；第一/二/三/四提取视窗23/24/25/26、一/二级富集视窗27/28；第一/二提取废液出口29/33、细胞收集口31、第一/二富集废液口30/32；

具体的，如图20所示，流阻层下盖板未设置第一提取废液出口29与第二提取废液出口33，提取模块67所产生的废液经过流组模块68后由该两出口直接排出芯片。

如图21所示，3-4连接层12的结构有定位孔20、第一/二/三/四提取出口48/50/51/53、一/二级富集视窗27/28、第一/二/三/四提取视窗23/24/25/26、第一/二富集废液口30/32、细胞收集口31；3-4连接层为双面胶材质，用于连接流阻模块与导流模块；

如图7/22/23所示，导流模块69由导流层上盖板13、导流层14、导流层下盖板15密封构成。

导流模块69具有定位孔20；用于将液体通入该模块的第一提取出口48、第二提取出口50、第三提取出口51及第四提取出口53；用于将几个提取出口通入液体汇合的流道—导流流道56；用于将汇合后液体通入富集模块70的富集总入口57；用于将富集模块70的次级流道所产生废液通入该模块的第一次级废液口60、第二次级废液口61；用于将富集模块70的初级流道产生废液与次级产生废液汇合的流道——第一汇总流道58及第二汇总流道59；第一/二/三/四提取视窗23/24/25/26、一/二级富集视窗27/28；细胞收集口31、第一/二富集废液口30/32；

具体的，如图22所示，导流层上盖板13未设置第一次级废液口60与第二次级废液口61，富集模块70次级流道产生的废液由导流层下盖板15流入导流模块69后于第一/二富集废液口30/32排出芯片。

如图24所示，4-5连接层16的结构有定位孔20、富集总入口57、一/二级富集视窗27/28、第一/二/三/四提取视窗23/24/25/26、第一/二次级废液口60/61、第一/二富集废液口30/32、细胞收集口31；4-5连接层为双面胶材质，用于连接导流模块与富集模块；

如图8/25/26所示，富集模块70由富集层上盖板17、富集层18、富集层下盖板19密封构成。

富集模块70具有定位孔20；用于将液体通入该模块的富集总入口57、对细胞进行初级聚焦与富集的正弦流道62、匹配下游流流量的第一富集流阻63与第二富集流阻64；对细胞进行次级富集的非对称正弦流道65、将非对称正弦流道通出的废液排出的第一次级废液口60与第二次级废液口61；第一/二/三/四提取视窗23/24/25/26、细胞收集口31、第一/二富集废液口30/32；

具体的，如图26所示，富集层下盖板19只设置有定位孔20与第一/二/三/四提取视窗23/24/25/26，该层也作为芯片的最外层对芯片进行密封，视窗的设置尽可能优化提取位置的观察视野。

上述实施例中，分流层上/下盖板1/3、提取层上/下盖板5/7、流阻层上/下盖板9/11、导流层上/下盖板13/15、富集层上/下盖板17/19均采用PET材质；分流层2、提取层6、流阻层10、导流层14、富集层18均采用硅胶材质。硅胶层与PET层经过等离子清洗后键合密封形成完整的流道模块；模块与模块之间用上述双面胶连接层黏结。

本芯片的加工时间短（<1min/层），加工精度高（偏差约5μm），制造成本低且灵活可靠。

上述实施例中，具体形成方式如下：

如图10所示，为满足各模块所需的流量要求，本发明设计有特定的流道来匹配流阻，其流阻大小的设计原则类比于电流与电阻的相互关系。

图中R1为次级富集流道65的流阻；

R2为第一富集流阻63与第二富集流阻64的流阻；

R3为第一提取废液流道54和第二提取废液流道55的流阻；

R4为非对称正弦流道65的流阻；

R5为正弦流道62的流阻。

为满足初级富集即正弦流道62与次级富集，即非对称正弦流道65都实现3倍的浓缩效果，且目标细胞从所需流道排出，非对称正弦流道65流道末端的三岔分支流阻需相同，非对称正弦（次级富集）流道流阻为R1，第一/二富集流阻R2=R4+R1；

为定量产物与废液的体积比例，协调各模块工作的流量设计，满足提取流道末端Y字形岔口3:4的流量比对，不仅Y字形岔口两侧的流道宽度比例设计为3:4，且两端相连的流道流阻应设计为4:3，即R3=R5+R2//R2//(R4+R1)，即富集模块流阻的1.5倍。

对于导流模块流道，设置其流道宽度在保证压力的条件下尽可能大，目的减小该模块对上述流阻匹配的影响。

如图10所示，所示为本发明提取模块的螺旋流道末端，10/15/20微米尺寸聚苯乙烯微球模拟细胞实验拍摄观察窗口图片，以及富集模块中一级富集视窗27和二级富集视窗28的图片，箭头表示为溶液的的流向。

在螺旋流道末端，细胞聚焦从内侧出口排出，而代表原始样品的黑色染液从外侧出口排出，实现从黑色染液中提取微粒进入缓冲液的过程。而在两个蛇形流道的末端，三种尺寸的微粒均可良好聚焦在流道中心，流向中间侧岔口。

本发明设计的提取流道满足可靠地提取10-20μm的细胞，提取流道44/45/46/47设置流道宽度260μm，高度80μm，5.5个半圆弧结构，流道曲率由内向外逐渐增大。

由于在弯曲流道的曲率半径方向流体动量不匹配，流道中心线附近的流体比靠近通道壁的流体具有更高的动量，因此向外流动并延圆周向内驱动通道壁附近相对停滞的流体，在流道的横截面上形成了一对方向相反的涡流。原样本溶液随涡流在流道横截面上反复迁移，而目标细胞会逐渐聚焦靠近内侧壁面，在螺旋流道末端达到细胞与原样本溶液的分离进入缓冲液中。

如图8所示，为克服细胞提取后浓度稀释的问题，本发明设计有特殊结构的富集模块可适配在提取模块的最佳工况下，实现对10-20μm细胞的高效富集。本发明采用两级富集流道串联的方式：富集模块采用两级蛇形流道进行“3*3”共9倍的浓缩富集。

初级富集为正弦流道62，流道宽度设置200μm、高度60μm、流道中心曲率半径350μm，由24个半圆弧流道构成，末端形成100μm宽的三岔分支，含细胞的缓冲液流经正弦流道，细胞在惯性力与Dean力的作用下聚焦于流道中心，最后从三岔分支的中间分支流入次级富集；

次级富集为非对称正弦流道65，由18对大小弧形流道交错构成，其小弧设置流道宽度为100μm，流道中心曲率半径150μm，大弧流道中心曲率半径370μm；其始端与正弦流道（62）末端的中心分岔相连，末端形成100μm宽的三岔分支，含细胞的缓冲液流经非对称正弦流道，变化的曲率与流道宽度改变流道内细胞所受的惯性升力与Dean力比例，往复的细胞受力情况加速细胞聚焦过程，细胞在非对称正弦流道中聚焦至流道中心，最终由三岔分支的中间分支流入细胞收集口31。

本发明的具体工况及实施过程如下：

将细胞样本液以400μL/min的通量通入样品总入口21，缓冲液以2400μL/min的通量通入缓冲液总入口22；细胞样本液与缓冲液分别在分流模块66的样品四分流道34及缓冲液四分流道35的作用下均分为四份，各自到达第一/二/三/四样品入口36/39/40/43与第一/二/三/四缓冲液入口37/38/41/42。

细胞样品液与缓冲液进入提取模块67，两者汇集在第一/二/三/四提取流道44/45/46/47中，并以每个流道700μL/min的通量（细胞样品液100μL/min、缓冲液600μL/min）运动，细胞、样品液、缓冲液在流道中迁移。细胞在惯性升力和Dean力的共同作用下在逐渐向流道内侧迁移，原样品溶液在流道内往复循环。在螺旋流道末端，细胞迁移至流道内壁侧，原样品液迁移至流道外侧壁，实现从样品溶液中提取细胞至缓冲液。细胞聚焦并流向第一/二/三/四提取出口48/50/51/53；样品液流向第一/二提取废液入口49/52。

在细胞提取流道的末端设置有Y字形分岔，分岔两端流道宽度设置120μm及160μm，配合设计的流阻使流向第一/二/三/四提取出口48/50/51/53的溶液通量均为300μL/min，而流向第一/二提取废液入口49/52的溶液通量均为400μL/min。

从第一/二提取废液入口49/52流入流阻模块68的通量400μL/min两股溶液，其内容为全部的样品液及少量的缓冲液，他们流经第一/二提取废液流道54/55后由第一/二提取废液出口29/33向上流经提取模块67与分流模块66，最终排出芯片；

第一/二/三/四提取出口48/50/51/53的通量均为300μL/min的四股溶液，其内容为含有细胞的缓冲液，他们贯穿流组模块68进入导流模块69。

四股溶液（含细胞的缓冲液）进入导流模块69后，经过导流流道56汇集，通量1200μL/min，流向富集总入口57并进入富集模块70。

含细胞的缓冲液从富集总入口57流经正弦流道62，细胞在流道内聚焦并平衡在流道中心位置，经过正弦流道末端的三岔分支被均分为三份。

多余的缓冲液从两侧岔口流入第一/二富集流阻63/64，并通过第一/二富集废液口30/32，贯穿导流模块69、流阻模块68、提取模块67与分流模块66排出芯片。

因溶液及内部微粒更倾向于流入流阻小的地方，富集流阻流道阻值大小与后续非对称正弦流道阻值相同，确保细胞不改变其流道中心的聚焦位置可以正确流向回收的中心岔口。

聚焦的细胞径直从中间岔口流入非对称正弦流道65，通量400μL/min，

在非对称正弦流道65中因为变化的曲率与流道宽度，如同在对称正弦流道中设置了缩扩结构效果，改变细胞在流道中所受惯性升力与Dean力的比例，加速细胞的聚焦过程，在流道末端同样有三岔分支分走多余缓冲液，聚焦的细胞径直进入细胞收集口，通量约133.3μL/min，贯穿导流模块69、流阻模块68、提取模块67与分流模块66排出芯片。

在非对称正弦流道65末端的两侧岔口排出的多余缓冲液进入第一/二次级废液口60/61，进而进入导流模块中通过第一/二汇总流道58/59与上述初级富集产生的废液汇集，一起从第一/二富集废液口30/32，贯穿导流模块69、流阻模块68、提取模块67与分流模块66排出芯片。

上述具体实施方式，仅为说明本发明的技术构思和结构特征，目的在于让熟悉此项技术的相关人士能够据以实施，但以上内容并不限制本发明的保护范围，凡是依据本发明的精神实质所作的任何等效变化或修饰，均应落入本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种通用型微流控细胞提取芯片，其特征在于：包括自上而下依次平行叠放的提取模块（67）、流阻模块（68）和富集模块（70）；

所述提取模块（67）内设有可将原始样品溶液中的细胞从原始溶液中提取至空白缓冲液的提取流道；去除细胞的原始溶液经流阻模块（68）排出，含有细胞的缓冲液流至富集模块（70）；

所述富集模块（70）内设有可将细胞聚焦平衡在流道中心的聚焦流道，所述聚焦流道出口端设有用于排出细胞的中心流道和用于排出缓冲液的侧流道；

所述中心流道设置在所述聚焦流道的流道中心；所述中心流道连通细胞收集口（31）。

2.根据权利要求1所述的通用型微流控细胞提取芯片，其特征在于：所述提取模块（67）内设有细胞提取流道，所述细胞提取流道的流道呈螺旋线型；所述细胞提取流道末端设有靠近所述螺旋型细胞提取流道的内侧窄流道，和远离所述螺旋型细胞提取流道的外侧宽流道；

原始样品溶液沿所述细胞提取流道旋转990°后，所述原始样品溶液内细胞迁移至流道内侧壁，经所述内侧窄流道排出；去除细胞后原始样品溶液经流道外侧壁排出；

所述流阻模块（68）包括连通所述外侧宽流道和提取废液出口（29）的提取废液流道。

3.根据权利要求2所述的通用型微流控细胞提取芯片，其特征在于：所述提取模块（67）设细胞提取流道，由5个直径依次增大的半圆流道和1个1/4圆流道首尾相连；

所述细胞提取流道的宽度设置260μm、高度设置80μm；

所述内侧窄流道和外侧宽流道的流道宽度比例为3:4。

4.根据权利要求3所述的通用型微流控细胞提取芯片，其特征在于：所述富集模块（70）的聚焦流道包括正弦流道（62）和非对称正弦流道（65）；

所述正弦流道（62）由若干半圆弧流道交错排列连通，所述正弦流道（62）的流道宽度为200μm、高度为60μm、流道中心曲率半径为350μm；

所述正弦流道（62）末端设有三岔分支，所述三岔分支包括所述第一中心流道和设置在所述第一中心流道两侧的第一侧流道；所述三岔分支中，各流道宽度均为100μm；

所述中心流道连通所述非对称正弦流道（65）；

所述非对称正弦流道（65）由若干对大弧形流道和小弧形流道交错连通构成；所述大弧流道中心曲率半径370μm，所述弧形流道的流道宽度为100μm，流道中心曲率半径150μm；

所述非对称正弦流道（65）始端与正弦流道（62）末端的第一中心流道相连，所述设有三岔分支；所述三岔分支包括所述第二中心流道和设置在所述第二中心流道两侧的第二侧流道；所述三岔分支中，各流道宽度均为100μm；所述第二中心流道连通所述细胞收集口（31）。

5.根据权利要求4所述的通用型微流控细胞提取芯片，其特征在于：包括自上而下依次平行叠放的分流模块（66）、提取模块（67）、流阻模块（68）、导流模块（69）和富集模块（70）；

所述细胞提取流道包括结构相同的第一提取流道（44）和第二提取流道（45）；

所述分流模块（66）包括用于原始样品溶液滴入的样品总入口（21）、缓冲液总入口（22）；

所述样品总入口（21）通过样品分流道（34），将滴入样品总入口（21）的原始样品溶液均匀分配至设置在样品分流道（34）末端的第一样品入口（36）和第二样品入口（39）；

所述缓冲液总入口（22）通过缓冲液分流道（35），将滴入缓冲液总入口（22）的缓冲液均匀分配至设置在缓冲液分流道（35）末端的第一缓冲液入口（37）和第二缓冲液入口（38）；

所述第一样品入口（36）和第二样品入口（39）、第一缓冲液入口（37）和第二缓冲液入口（38）均贯穿所述分流模块（66），并延伸至所述提取模块（67）底面止；

所述提取流道包括第一细胞提取流道（44）和第二细胞提取流道（45）；

所述第一细胞提取流道（44）起始端分别连通所述第一样品入口（36）和第一缓冲液入口（37）；

所述第二细胞提取流道（45）起始端分别连通所述第二缓冲液入口（38）和第二样品入口（39）；

所述第一细胞提取流道（44）末端的内侧窄流道连通第一提取出口（48）；所述第一细胞提取流道（44）末端的外侧宽流道连通第一提取废液入口（49）；

所述第二细胞提取流道（45）末端的内侧窄流道连通第二提取出口（50）；所述第二细胞提取流道（45）末端的外侧宽流道连通第一提取废液入口（49）；

所述第一提取出口（48）和第二提取出口（50）贯穿所述提取模块（67），并延伸至所述导流模块（69）底面止；

所述第一提取废液入口（49）贯穿所述提取模块（67），并延伸至所述流阻模块（68）底面止；

在所述流阻模块（68）内，所述第一提取废液入口（49）通过第一提取废液流道（54）连通至所述第一提取废液出口（29）。

6.根据权利要求5所述的通用型微流控细胞提取芯片，其特征在于：所述导流模块（69）包括分别连通所述第一提取出口（48）和第二提取出口（50）的导流流道（56），以及设置在所述导流流道（56）末端的富集总入口（57）；

所述第一提取出口（48）和第二提取出口（50）中含有细胞的缓冲液经所述导流流道（56）回流至所述富集总入口（57）；

所述富集总入口（57）贯穿至所述导流模块（69），并延伸至所述富集模块（70）底面止。

7.根据权利要求5所述的通用型微流控细胞提取芯片，其特征在于：设置在所述第一中心流道两侧的第一侧流道分别连通第一富集流阻（63）和第二富集流阻（64）；所述第一侧流道排出的洗涤剂分别经所述第一富集流阻（63）流至所述第一富集废液口（30），经所述第二富集流阻（64）流至所述第二富集废液口（32）；

设置在所述第二中心流道两侧的第二侧流道分别连通第一次级废液口（60）和第二次级废液口（61）；

所述导流模块（69）还设有第一汇总流道（58）和第二汇总流道（59）；

所述第一汇总流道（58）两端分别连通所述第一富集废液口（30）和第一次级废液口（60）；

所述第二汇总流道（59）两端分别连通所述第二富集废液口（32）和第二次级废液口（61）；

所述第一富集废液口（30）、第二富集废液口（32）产生的多余缓冲液分别经富集模块（70）的第一富集流阻（63）和第二富集流阻（64）与导流模块（69）的第一汇总流道（58）和第二汇总流道（59）汇集后，从第一富集废液口（30）、第二富集废液口（32）排出。

8.根据权利要求5所述的通用型微流控细胞提取芯片，其特征在于：

第一富集流阻(63)与第二富集流阻(64)流阻R2=R4+R1；

其中：R1为次级富集流道(65)的流阻；R2为第一富集流阻(63)与第二富集流阻(64)的流阻；R3为第一提取废液流道（54）和第二提取废液流道（55）的流阻；R4为非对称正弦流道（65）的流阻；R5为正弦流道（62）的流阻；

所述内侧窄流道和外侧宽流道的流道流阻比例为为4:3，即R3=R5+R2//R2//(R4+R1)。

9.根据权利要求5所述的通用型微流控细胞提取芯片，其特征在于：还包括设置在所述细胞提取流道末端分叉处正上方，用于观察细胞提取过程的提取视窗；

还包括设置在所述正弦流道（62）末端三岔分支处，用于观察第一级细胞富集过程的一级富集视窗（27）；

还包括设置在所述非对称正弦流道（65）末端三岔分支处，用于观察第二级细胞富集过程二级富集视窗（28）。

10.根据权利要求5所述的通用型微流控细胞提取芯片，其特征在于：所述细胞提取芯片由19片自上而下依次平行叠放的片层结构累积密封而成；

包括分流层上盖板（1）、分流层（2）、分流层下盖板（3）、1-2连接层（4）、提取层上盖板（5）、提取层（6）、提取层下盖板（7）、2-3连接层（8）、流阻层上盖板（9）、流阻层（10）、流阻层下盖板（11）、3-4连接层（12）、导流层上盖板（13）、导流层（14）、导流层下盖板（15）、4-5连接层（16）、富集层上盖板（17）、富集层（18）和富集层下盖板（19）；

所述通用型微流控细胞提取芯片的分流层上盖板（1）与分流层（2）和分流层下盖板（3）通过等氧离子清洗后分别键合，密封形成分流模块（66）；

提取层上盖板（5）与提取层（6）和提取层下盖板（7）键合密封形成提取模块（67）；

流阻层上盖板（9）与流阻层（10）和流阻层下盖板（11）键合密封形成流阻模块（68）；

导流层上盖板（13）与导流层（14）和导流层下盖板（15）键合密封形成导流模块（69）；

富集层上盖板（17）与富集层（18）和富集层下盖板（19）键合密封形成富集模块（70）；

所述分流层（2）、提取层（6）、流阻层（10）、导流层（14）和富集层（18）均采用硅胶材质

所述分流层（2）、提取层（6）、流阻层（10）、导流层（14）和富集层（18）的上下盖板均采用采用PET材质；

所述分流层（2）、提取层（6）、流阻层（10）、导流层（14）和富集层（18）间的连接层均采用透明双面胶材质。

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