CN115089339B

CN115089339B - 一种大熊猫发情启动时间的预测方法

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Publication number: CN115089339B
Application number: CN202210963760.7A
Authority: CN
Inventors: 黄河; 侯蓉; 刘玉良; 奉永友; 李翰; 叶宗金; 蔡志刚; 胡贤彪
Original assignee: CHENGDU RESEARCH BASE OF GIANT PANDA BREEDING
Current assignee: CHENGDU RESEARCH BASE OF GIANT PANDA BREEDING
Priority date: 2022-08-11
Filing date: 2022-08-11
Publication date: 2023-05-16
Anticipated expiration: 2042-08-11
Also published as: CN115089339A

Abstract

本发明公开了一种大熊猫发情启动时间的预测方法，包括如下步骤：根据各个大熊猫往年进入发情期早晚，从每年1月上旬逐步开始对大熊猫每周采集一次尿液，并分别测定大熊猫尿液中肌酐浓度和褪黑素浓度；计算经肌酐校正后的褪黑色素水平；在发情启动未发生前，计算相邻两次尿液中褪黑色素水平的下降幅度；当下降幅度在32.6％～52.4％(95％CI)之间时，则将相邻两次尿液中的后一次尿液的采样时间记为第1天；大熊猫发情启动时间为第12.6～15.3天；本发明公开的预测方法具有非常高的可靠性，为提前改变大熊猫饲养管理方式和制定具体繁殖配种实施方案，填补了大熊猫研究领域的空白，对促进大熊猫保护具有重要意义。

Description

一种大熊猫发情启动时间的预测方法

技术领域

本发明涉及大熊猫繁殖技术领，具体涉及一种大熊猫发情启动时间的预测方法。

背景技术

科学完善的大熊猫繁殖管理可以更有效促进大熊猫繁育与保护。目前，在大熊猫的繁殖管理中，通过激素测定判断大熊猫发情启动。在发情季节当性腺激素首次出现雌激素大于10ng/mg Cr且孕激素小于10ng/mg Cr时，表明大熊猫发情启动，反之则表明大熊猫未启动发情，但对于大熊猫发情启动时间的预测难以准确判断。

在圈养大熊猫的繁殖管理相关报道中，陈超等(2015)通过对大熊猫活动休息频率、叫声、采食等行为变化观察来判断大熊猫是否进入发情启动，但该行为观察结果具有主观性，难以做到准确判断。另外，采用尿中雌二酮水平检测分析雌性大熊猫所处发情阶段(杨胜林等，2007；Kersey et al.，2011)。Cai et al(2017)发现，综合分析尿液中促黄体生成素与雌激素变化水平可以准确判断雌性大熊猫交配窗口期，但是在指示发情启动上则存在一定的滞后性。

发明内容

本发明的目的在于提供一种大熊猫发情启动时间的预测方法，以解决现有方法对于大熊猫发情启动时间的预测难以准确判断的问题，对提前制定相应个体配种方案的实施，优化圈养大熊猫的繁殖管理具有重要意义。

本发明提供一种大熊猫发情启动时间的预测方法，包括如下步骤：

根据大熊猫往年发情时间的早晚，从每年1月逐步开始对相应大熊猫每周采集一次尿液，并分别测定大熊猫尿液中肌酐浓度和褪黑素浓度；

计算经肌酐校正后的褪黑色素水平；

在发情启动未发生前，计算相邻两次尿液中褪黑色素水平的下降幅度；当下降幅度在32.6％～52.4％(95％CI)之间时，则将相邻两次尿液中的后一次尿液的采样时间记为第1天；大熊猫发情启动时间为第12.6～15.3天。

本发明公开的上述预测方法利用大熊猫尿液中肌酐浓度和褪黑素浓度，利用经过肌酐校正后得到的褪黑色素水平，并且根据相邻两次尿液中褪黑色素水平的下降幅度来预测大熊猫发情启动时间；该预测方法不仅科学指导大熊猫发情启动时间，降低性腺激素(雌激素与孕激素)测定工作强度；并且对提前改变参加繁殖生产大熊猫的饲养管理和制定具体繁殖配种实施方案，对优化圈养大熊猫的繁殖管理，促进大熊猫保护具有重要意义。

作为一种可能的优选方式，相邻两次尿液的采集时间相差5～7天，使得相邻两次尿液中的褪黑素水平具有一定幅度的差异，减少尿液检测的次数，从而降低工作量。

作为一种可能的优选方式，所述尿液的采集时间为早上7:00～9：00之间。作为一种可能的优选方式，所述褪黑色素水平＝褪黑素浓度/肌酐浓度，以使得预测结果更加准确。

本发明中，所述发情启动未发生是指大熊猫尿液中雌激素小于10ng/mg Cr或孕激素大于10ng/mg Cr。

作为一种可能的优选方式，从每年1月上旬逐步开始每只大熊猫每周采集一次尿液。

本发明的有益效果：本发明是将大熊猫褪黑素水平变化结合发情启动出现时间统计验证，具有非常高的可靠性。利用褪黑素下降幅度预测出大熊猫发情启动出现时间范围，不仅为及时掌握大熊猫发情启动，科学指导大熊猫尿液样品采集和激素测定频率，而且为提前改变大熊猫饲养管理方式和制定具体繁殖配种实施方案，填补了大熊猫研究领域的空白，对促进大熊猫保护具有重要意义。

具体实施方式

为了使本发明所要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明针对现有方法对于大熊猫发情启动时间的预测难以准确判断的问题，比如陈超等(2015)通过对大熊猫活动休息频率、叫声、采食等行为变化观察来判断大熊猫是否进入发情启动，该预测方法具有主观性，难以做到准确判断；再比如采用尿中雌二酮水平检测分析雌性大熊猫所处发情阶段(杨胜林等，2007；Kersey et al.，2011)。Cai et al(2017)发现，综合分析尿液中促黄体生成素与雌激素变化水平可以准确判断雌性大熊猫交配窗口期，但是在指示发情启动上则存在一定的滞后性。

针对现有方法存在的上述问题，本发明基于动物发情活动受下丘脑-垂体-性腺(HPG)内分泌轴调控，褪黑激素介导的光照时间长短变化则是影响动物季节性发情的主要因素。在整个发情启动调控相关通路中，垂体-性腺内分泌轴位于下游，因此，对应激素(如雌激素、孕激素)在指示发情启动上具有一定滞后性。而褪黑素是位于季节性发情启动调控通路上游，联系光周期与动物发情活动的关键因子。因此，褪黑素水平的变化先于性激素，可通过褪黑素水平的变化对下游性腺激素水平变化的趋势进行预测。

基于上述发明构思，本发明提供一种大熊猫发情启动时间的预测方法，包括如下步骤：

S1.根据各个大熊猫往年进入发情期早晚，从每年1月上旬逐步开始，大熊猫每周采集一次尿液，并分别测定大熊猫尿液中肌酐浓度和褪黑素浓度；

本发明中，在圈养大熊猫的发情繁殖中，有少部分大熊猫在每年2月开始发情。因此，在大熊猫实际管理中，根据各个大熊猫以往发情时间记录，避免发情早的大熊猫错过预测的最佳时间，因此对大熊猫于每年1月即开展褪黑素水平测定。

一般来说，开始采集大熊猫尿液的时间可以为1月中的任何一个时间，合适地，1月上旬，便于提早监测褪黑色素的变化情况。

本发明中，相邻两次大熊猫尿液的采集时间一般相隔5～7天，以使得降幅不会出现较大或较小的变化，便于观察。

本发明中，大熊猫尿液的采集时间一般是在早上的7:00～9:00，褪黑素分泌具有节律性，晚上分泌量多，白天分泌量少。因此，固定在同一个时间段的尿液样品间褪黑素水平才有可比性。在实际大熊猫饲养中，7:00～9：00大熊猫在兽舍内，同时，饲养员开始工作便于采集大熊猫尿样的时间段。

本发明中，大熊猫尿液的采集方法可以如下：待大熊猫排尿后用一次性注射器从干净的兽舍地面吸取尿液2ml，装入采样管，标注好对应大熊猫名字与采样日期后进行测定分析。

本发明中，可以采用酶联免疫法测定大熊猫尿液中褪黑素浓度，具体可以如下：将大熊猫尿液样品在室温下3000r/min离心10min，取离心后尿样按照对应ELISA试剂盒(IBL公司，货号RE54031，德国，灵敏度1.0μg/L，批次内变异系数小于2％，批次间变异系数小于14％)说明检测尿液中褪黑素浓度。

肌酐浓度采用以下方法检测得到，检测程序如下：

(1)标记12×75mm试管：从高到低分别标记为100，50，25，12.5，6.25(μg/mL)和0孔(空白对照)；

(2)取150μL标肌酐准品原液(100μg/mL)加入到标记为100的试管；向标记50试管加入150μL标准品原液后，加入150μL工作液进行等倍稀释；从标记50试管中取150μL混合液至标记为25试管中，加入150μL工作液进行等倍稀释；如此连续等倍稀释；

(3)样品准备：取上述离心大熊猫尿液样品(大熊猫尿液样品在室温下3000r/min离心10min)，各尿样用工作液进行20倍稀释；

(4)向96孔酶标板中，按照A1→B1孔顺序，从空白对照到高浓度顺序依次加入各浓度标准品，接着加入检测样品，标准品和检测样品每孔加入50μL，均做复孔处理。加样将标准品和检测样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁；

(5)向标准品和检测样品各孔用8道移液器加入50μL去离子水；

(6)向标准品和检测样品各孔用8道移液器加入50μL 0.75N NaOH；

(7)向标准品和检测样品各孔用8道移液器加入50μL 0.4N Picric Acid；

(8)轻轻震荡酶标板，室温(18～25℃)放置20分钟；

(9)读数：以空白空调零，用酶标仪在490nm(参考波长620nm)波长检测光密度值，根据标准品读数绘制标准曲线，计算各检测样品肌酐浓度。当肌酐值低于0.1mg/mL时认为样品被过度稀释(通常是被水污染)。

S2.计算经肌酐校正后的褪黑色素水平；

由于不同于粪便和血液中激素含量的表达单位，尿液中的激素浓度受到动物饮水、食物含水量的影响。随动物饮水等不同，尿液呈现或稀释或浓缩等状态，进而引起尿液中激素浓度不同，不能反映出动物体内实际激素的浓度变化。肌酐是肌肉在动物体内的代谢产物，随尿液排出后，肌酐浓度与尿液浓度有很好的相关性。为此，为校正尿样中水分含量变化带来的差异，将每个尿样中激素浓度(ng/mL)除以肌酐(creatinine，Cr)浓度(mg/mL)，将(ng/mg Cr)作为尿液中激素计量单位，即用测到的激素浓度(每1mL尿中所含的激素分泌量)除以肌酐含量(每1mL尿中所含肌酐mg数)来“代表”激素的实际水平。本发明中，即用褪黑激素浓度除以对应尿样肌酐浓度为最终校正后的褪黑激素水平进行预测，以使得预测结果更加准确。

本发明中，所述褪黑色素水平可以按照以下公式计算。

所述褪黑色素水平＝褪黑素浓度/肌酐浓度，所述褪黑色素水平的单位为ng/mgCr。

S3.在发情启动未发生前，计算相邻两次尿液中褪黑色素水平的下降幅度；当下降幅度在32.6％～52.4％(95％CI)之间时，则将相邻两次尿液中的后一次尿液的采样时间记为第1天；大熊猫发情启动时间为第12.6～15.3天。

如本文所用，所述“发情启动未发生”是指大熊猫尿液中雌激素小于10ng/mg Cr或孕激素大于10ng/mg Cr。因此大熊猫发情启动时满足雌激素大于10ng/mg Cr且孕激素小于10ng/mg Cr。

如本文所用，所述“95％CI”是指置信区间的意思，置信区间是指由样本统计量所构造的总体参数的估计区间。在统计学中，一个概率样本的置信区间(Confidenceinterval)是对这个样本的某个总体参数的区间估计。

实施例1

一种大熊猫发情启动时间的预测方法，包括以下步骤：

S1.根据各个大熊猫往年发情早晚，在每年1月上旬逐步开始在自然光下采集大熊猫尿液样品，每周每只个体采集1次，相邻两次采样时间满足相差5～7天。采样时间为7:00～9:00时，待大熊猫排尿后用一次性注射器从干净的兽舍地面吸取尿液2ml，装入采样管，标注好对应大熊猫名字与采样日期后进行测定分析。

S2.将采集得到的大熊猫尿液样品在室温下以3000r/min离心10min，取离心后尿液按照对应ELISA试剂盒说明检测尿液中褪黑素浓度。

S3.测定步骤S2中离心后大熊猫尿液样品中肌酐(creatinine，Cr)浓度；

S4.将尿液测定褪黑素浓度除以该尿样肌酐(creatinine，Cr)浓度的比值作为经肌酐校正后尿样褪黑素水平(ng/mg Cr)。

S5.在发情启动未发生前，相邻两次尿液样品后一个样品比前一个样品的褪黑素水平下降幅度达到32.6％～52.4％(95％CI)时，将后一个样品计为第1天，大熊猫发情启动发生在第(12.6～15.3)天(95％CI)。

实验例1

本申请发明人通过从2018年1月5日起对大熊猫“阿宝”尿液按照实施例1中公开的大熊猫发情启动时间的预测方法进行预测，预测过程中得到的数据如表1所示。

表1

由表1可知，(1)从1月开始进行尿液褪黑素水平变化监测。在大熊猫非发情阶段，褪黑素分泌水平与日照长短相关，短日照条件褪黑素分泌量增加，随着日照时间延长，褪黑素分泌量逐渐降低。大熊猫“阿宝”褪黑素水平在1月12日达到测定最高水平后，随着日照时间变长，从1月12日至2月22日褪黑素水平逐渐缓慢降低，相邻两次尿液样品，后一个样品比前一个样品的褪黑素水平下降均低于15％。各个日期对应的雌激素均小于10ng/mg Cr或孕激素大于10ng/mg Cr，表明大熊猫未发情启动。(2)相邻两次尿液从2018/2/22到2018/3/1褪黑素水平大幅度下降达到42.8％，处于32.6％～52.4％(95％CI)之间，符合专利褪黑素水平下降幅度。以2018/3/1为第1天，预测大熊猫将在(12.6～15.3)天后(95％CI)发情启动。实际大熊猫于2018/3/15即14天后对应雌激素10.38ng/mg Cr且孕激素4.27ng/mg Cr，表明大熊猫发情启动，符合预测范围。

实验例2

本申请发明人通过从2018年1月6日起对大熊猫“家园”尿液按照实施例2中公开的大熊猫发情启动时间的预测方法进行预测，预测过程中得到的数据如表2所示。

表2

由表2可知，大熊猫“家园”褪黑素水平在2018/1/12日达到测定最高水平后开始逐渐缓慢下降。从2018/1/12至2018/2/1相邻两次尿液样品，后一个样品比前一个样品的褪黑素水平下降均低于20％，对应各个日期对应的雌激素均小于10ng/mg Cr或孕激素大于10ng/mg Cr，表明大熊猫未发情启动。(2)相邻两次尿液从2018/2/1到2018/2/7褪黑素水平大幅度下降达到35.7％，处于32.6％～52.4％(95％CI)之间，符合专利褪黑素水平下降幅度。以2018/2/7为第1天，预测大熊猫将在(12.6～15.3)天后(95％CI)发情启动。实际大熊猫于2018/2/20即13天后对应雌激素14.60ng/mg Cr且孕激素7.58ng/mg Cr，表明大熊猫发情启动，符合预测范围。

实验例3

本申请发明人通过从2018年2月3日起对大熊猫“雅莉”尿液按照实施例3中公开的大熊猫发情启动时间的预测方法进行预测，预测过程中得到的数据如表3所示。

表3

由表3可知，大熊猫“雅莉”褪黑素水平从2018/2/3至2018/2/23相邻两次尿液样品，后一个样品比前一个样品的褪黑素水平下降均低于20％，对应各个日期对应的雌激素均小于10ng/mg Cr或孕激素大于10ng/mg Cr，表明大熊猫未发情启动。(2)相邻两次尿液从2018/2/23到2018/3/1褪黑素水平大幅度下降达到47.6％，处于32.6％～52.4％(95％CI)之间，符合专利褪黑素水平下降幅度。以2018/3/1为第1天，预测大熊猫将在(12.6～15.3)天后(95％CI)发情启动。实际大熊猫于2018/3/15即14天后对应雌激素12.94ng/mg Cr且孕激素8.87ng/mg Cr，表明大熊猫发情启动，符合预测范围。

实验例4

本申请发明人通过从2018年2月3日起对大熊猫“淼淼”尿液按照实施例4中公开的大熊猫发情启动时间的预测方法进行预测，预测过程中得到的数据如表4所示。

表4

由表4可知，大熊猫“淼淼”褪黑素水平从2018/2/3至2018/3/7相邻两次尿液样品，后一个样品比前一个样品的褪黑素水平下降均低于20％，对应各个日期对应的雌激素均小于10ng/mg Cr或孕激素大于10ng/mg Cr，表明大熊猫未发情启动。(2)相邻两次尿液从2018/3/7到2018/3/12褪黑素水平大幅度下降达到38.7％，处于32.6％～52.4％(95％CI)之间，符合专利褪黑素水平下降幅度。以2018/3/12为第1天，预测大熊猫将在(12.6～15.3)天后(95％CI)发情启动。实际大熊猫于2018/3/27即15天后对应雌激素14.73ng/mg Cr且孕激素6.58ng/mg Cr，表明大熊猫发情启动，符合预测范围。

由上述实验例可知，本发明所公开的大熊猫发情启动时间的预测方法具有非常高的可靠性。利用褪黑素下降幅度预测出大熊猫发情启动出现时间范围，不仅为及时掌握大熊猫发情启动，科学指导大熊猫尿液样品采集和激素测定频率，而且为提前改变大熊猫饲养管理方式和制定具体繁殖配种实施方案，填补了大熊猫研究领域的空白，对促进大熊猫保护具有重要意义。

以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种大熊猫发情启动时间的预测方法，其特征在于，包括如下步骤：

根据各个大熊猫往年发情时间早晚，从每年1月逐步开始对大熊猫每周采集一次尿液，

并分别测定大熊猫尿液中肌酐浓度和褪黑素浓度；

计算经肌酐校正后的褪黑色素水平，所述褪黑色素水平＝褪黑素浓度/肌酐浓度；

在发情启动未发生前，计算相邻两次尿液中褪黑色素水平的下降幅度；当下降幅度在32 .6％～52 .4％之间时，则将相邻两次尿液中的后一次尿液的采样时间记为第1天；大熊猫发情启动时间为第12 .6～15 .3天；

所述发情启动未发生是指大熊猫尿液中雌激素小于10ng/mg Cr或孕激素大于10ng/mgCr。

2.根据权利要求1所述的预测方法，其特征在于，相邻两次尿液的采集时间相差5～7天。

3.根据权利要求1或2所述的预测方法，其特征在于，所述尿液的采集时间为早上7:00～9：00之间。

4.根据权利要求1所述的预测方法，其特征在于，根据各个大熊猫往年进入发情期早晚，从每年1月上旬逐步开始对大熊猫每周采集一次尿液。