CN115073548A - 一种用于重组蛋白药物电荷异构体制备的缓冲体系 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种用于重组蛋白药物电荷异构体制备的缓冲体系，包括：一个阳极电解液、一个阳极占位缓冲液、一个分离缓冲液和一个阴极稳定缓冲液、一个阴极电解液，所述阳极电解液为100mM硫酸，250mMGLYGLY，所述阴极电解液为100mMNaOH，300mMEACA。电泳时，本体系在电场的作用下在pH6.5‑7.5之间形成稳定的pH梯度，最佳分辨率可以达到0.02pH，用于抗体类药物的电荷异构体的分离制备。
Description
技术领域
本发明涉及电荷异构体技术领域，具体为一种用于重组蛋白药物电荷异构体制备的缓冲体系。
背景技术
电荷异构体分析是生物治疗蛋白质的一项监管要求。这些大的异质分子在生产过程中历经多种酶促翻译后修饰，例如糖基化和赖氨酸切断。此外，在纯化和储存过程中可发生多种化学修饰，例如氧化或脱氨。自由流电泳是制备蛋白质药物电荷异构体的最佳方法。
自由流电泳(Free Flow Electrophoresis，FFE)是半制备型分离技术，具有可连续分离、多种分离模式、无固定支持介质和分离条件温和等优势，特别适用于生物材料的分离纯化和制备。自由流等电聚焦电泳(IEF-FFE)利用连续流动的两性电解质溶液，在分离室内的电场方向形成线性pH梯度。样品随溶液纵向流动，并在电场作用下发生横向偏转，达到其等电点处不再横向移动，被强制聚焦在某位置，不受扩散和对流的影响，仅在溶液流动方向移动。具有不同等电点的蛋白质或肽等良性物质可通过IEF-FFE达到分离。
由于电荷异构体是生物治疗蛋白质的一项监管条件，每个组分的异构体的活性、化学修饰以及分子量均不相同，对每个组分进行分析有利于后续药物的改进，对于融合蛋白类药物来说，等电点基本上集中在6.0-7.5之间，因此提高这个pH区间内的灵敏度可以更好的获得单组份的异构体，可以更好的对异构体的活性、分子量以及修饰进行分析。
发明内容
本发明所解决的技术问题在于提供一种用于重组蛋白药物电荷异构体制备的缓冲体系，以解决技术背景中所提到的问题。为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种用于重组蛋白药物电荷异构体制备的缓冲体系，包括：一个阳极电解液、一个阳极占位缓冲液、一个分离缓冲液和一个阴极稳定缓冲液、一个阴极电解液，所述阳极电解液为100mM硫酸，250mM GLYGLY，所述阴极电解液为100mM NaOH，300mM EACA。
优选地，所述阳极占位缓冲液为60mM硫酸，50mM乙醇酸，250mM GLYGLY。
优选地，所述分离缓冲液为0.5％pharmalyte5-8，1％servalyt5-7。
优选地，所述阴极稳定缓冲液为100mM NaOH，300mM EACA。
优选地，所述缓冲体系的最佳分辨率在0.03pH。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：电泳时，本体系在电场的作用下在pH6.5-7.5之间形成稳定的pH梯度，最佳分辨率可以达到0.02pH，用于抗体类药物的电荷异构体的分离制备。
附图说明
为了更清楚地说明本发明的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为实施例中不同等电点的标准品的420nm光吸收作图；
图2为实施例中不同等电点的标准品均匀分散在不同的分流孔；
图3为实施例中毛细管等电聚焦法分离电荷异构体结果图；
图4为实施例中本体系所得的电荷异构体420nm光吸收作图。
具体实施方式
为了使本发明的技术手段、创作特征、工作流程、使用方法达成目的与功效易于明白了解，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，及进行非创造性的扩展而得出的其它结论，都属于本发明保护的范围。
实施例
一种用于重组蛋白药物电荷异构体制备的缓冲体系，一个阳极电解液、一个阳极占位缓冲液、一个分离缓冲液和一个阴极稳定缓冲液、一个阴极电解液，所述阳极电解液为100mM硫酸，250mM GLYGLY，所述阴极电解液为100mM NaOH，300mM EACA，所述阳极占位缓冲液为60mM硫酸，50mM乙醇酸，250mM GLYGLY，所述分离缓冲液为0.5％pharmalyte5-8，1％servalyt5-7，所述阴极稳定缓冲液为100mMNaOH，300mM EACA，其中阳极电解液pH 5.7，阳极占位缓冲液pH 3.12、分离缓冲液pH6.15和阴极稳定缓冲液pH 10.46、阴极电解液pH10.82。使用该缓冲体系在分离室内的电场方向形成线性pH梯度，加入不同等电点的标准品，结果如图1和图2所示。由图2中可以看到不同颜色的标准品均匀分散在不同的分流孔中。从图上可以看到最后两个marker的pH是6.5和7.5，在1个pH单位分散了40个孔，孔之间的pH相差0.025个pH单位，因此灵敏度在0.025个pH内；
对原始样本进行毛细管等电聚焦法分离电荷异构体，结果如图3所示，可知原始样本中有四个电荷异构体。使用该缓冲体系对原始样本进行分离，分离结果的420nm光吸收作图如图4所示，图上的吸收峰和原始样本的四个异构体可以一一对应。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征及本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明的要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
Claims (5)
1.一种用于重组蛋白药物电荷异构体制备的缓冲体系，其特征在于，包括：一个阳极电解液、一个阳极占位缓冲液、一个分离缓冲液和一个阴极稳定缓冲液、一个阴极电解液，所述阳极电解液为100mM硫酸，250mM GLYGLY，所述阴极电解液为100mM NaOH，300mM EACA。
2.根据权利要求1所述的一种用于重组蛋白药物电荷异构体制备的缓冲体系，其特征在于：所述阳极占位缓冲液为60mM硫酸，50mM乙醇酸，250mM GLYGLY。
3.根据权利要求1所述的一种用于重组蛋白药物电荷异构体制备的缓冲体系，其特征在于：所述分离缓冲液为0.5％pharmalyte5-8，1％servalyt5-7。
4.根据权利要求1所述的一种用于重组蛋白药物电荷异构体制备的缓冲体系，其特征在于：所述阴极稳定缓冲液为100mM NaOH，300mM EACA。
5.根据权利要求1所述的一种用于重组蛋白药物电荷异构体制备的缓冲体系，其特征在于：所述缓冲体系的最佳分辨率在0.03pH。
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Country Status (1)
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| CN (1) | CN115073548A (zh) |
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2022
- 2022-08-01 CN CN202210914659.2A patent/CN115073548A/zh active Pending
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