CN115069320A - 整体柱纳流电渗泵集成芯片及制造方法、分析系统与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种整体柱纳流电渗泵集成芯片及制造方法、分析系统与应用，优点在于第一泵区微管道内聚合有负性电渗整体柱，第二泵区微管道内聚合有正性电渗整体柱，分离区微管道内聚合有色谱分离整体柱，将电渗泵驱动系统与色谱分离系统集成在一块芯片上；通过在基板微通道交汇处设置通孔并粘接连通接头，在负、正性电渗整体柱动态聚合过程中，连通接头处排制备液，防止两种制备液因混合掺杂而导致柱体不纯粹；在色谱检测时，连通接头连接毛细管凝胶电极作为电场去耦合器，消除电渗流汇合时的部分电渗流内耗，提高有效推动力，提升分离速度；在色谱检测完成后，连通接头作流动相进料口冲洗工作液残留；从而可反复进行电渗泵驱动纳流色谱分离检测。

Description

整体柱纳流电渗泵集成芯片及制造方法、分析系统与应用

技术领域

本发明属于微全分析系统技术领域，尤其是涉及一种整体柱纳流电渗泵集成芯片及其制造方法，还涉及基于该整体柱纳流电渗泵集成芯片的分析系统与应用。

背景技术

微流控芯片是当前微全分析系统发展的热点领域。微流控芯片分析以芯片为操作平台，以分析化学为基础，以微机电加工技术为依托，以微管道网络为结构特征，以生命科学为目前主要应用对象，是当前微全分析系统领域发展的重点。目标是把整个化验室的功能，包括采样、稀释、加试剂、反应、分离、检测等集成在微流控芯片上，且可以多次使用。

其中，电渗泵根据电渗驱动的原理驱动流体运动，具有可连续输液、无脉动、无可移动部件、无机械磨损和材料的疲劳，以及避免了单向阀和动态密封的微渗漏等特点，是目前较为成功的一种微流体驱动和控制技术，在微流控芯片上有着广泛的应用前景。相关技术人员设计了整体柱电渗泵-毛细管离子色谱联用技术，用微流控芯片集成的整体柱电渗泵推动试验样品在毛细管内流动，在通过毛细管离子色谱柱分离后经检测仪器获得试验样品的色谱图，在检测领域具有很好的市场前景。但是其构造的联用系统没有进行集成化，装配较为麻烦，也不方便冲洗反复利用，不利于商业化应用，市场上也未能发现将电渗泵整体柱与色谱分离整体柱集成在一起的联用芯片，亟待开发。

发明内容

本发明所要解决的一个技术问题是提供一种整体柱纳流电渗泵集成芯片，将电渗泵整体柱与色谱分离整体柱集成在一块芯片上，可用于反复进行电渗泵驱动色谱分离检测。

本整体柱纳流电渗泵集成芯片解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种整体柱纳流电渗泵集成芯片，包括永久键合的基板与盖板，基板与盖板之间设有Y型微通道，正极接口与微通道交汇处之间的第一泵区微管道内聚合有负性电渗整体柱，负极接口与微通道交汇处之间的第二泵区微管道内聚合有正性电渗整体柱；微通道交汇处与微通道出口之间的分离区微管道内聚合有色谱分离整体柱；基板的微通道交汇处设有轴线沿基板厚度方向设置的通孔，通孔上面粘接有用于连接出料毛细管、进料毛细管或毛细管凝胶电极的连通接头。

与现有技术相比，本整体柱纳流电渗泵集成芯片的优点在于通过在基板的微通道交汇处设置垂直于微通道的通孔，通孔上面粘接连通接头，可在连通接头连接出料毛细管、进料毛细管或毛细管凝胶电极；在负、正性电渗整体柱动态聚合过程中，分离区微管道出口封堵情况下，连通接头中连接出料毛细管作出口使用，排出多余的负、正性电渗整体柱制备液，防止负、正性电渗整体柱制备液混合掺杂而聚合，保证负、正性电渗整体柱的纯粹性；在色谱分离整体柱聚合过程中，分离区微管道出口打开情况下，连通接头中连接进料毛细管作色谱分离整体柱制备液的进料口使用；在冲洗色谱分离整体柱中，分离区微管道出口打开情况下，连通接头中连接进料毛细管作冲洗液的进料口使用；在冲洗负、正性电渗整体柱时，正极接口和负极接口汇通后与装有冲洗液的第一液相泵连接，正极接口和负极接口的汇通支路上连接分流毛细管，分离区微管道出口封堵情况下，连通接头中连接出料毛细管作负、正性电渗整体柱的制备液残留的出口使用；在添加检测样品时，连通接头连接充有检测样品和流动相的进料毛细管及精密注射泵连通，作检测样品和流动相的进料口使用；在色谱检测时，分离区微管道出口与色谱检测仪连接，连通接头连接毛细管凝胶电极，正极接口与毛细管凝胶电极之间连接正高压电源，负极接口与毛细管凝胶电极之间连接负高压电源，连通接头与毛细管凝胶电极作为电场去耦合器使用，使电渗流汇合时消除部分电渗流内耗，从而加大对检测样品和流动相的推动力，提升检测样品的分离速度；在色谱检测完成后，分离区微管道出口打开情况下，连通接头连接进料毛细管做流动相的进料口使用，将检测样品残留和流动相从分离区微管道出口处冲出；从而将负、正性电渗整体柱和色谱分离整体柱集成在本整体柱纳流电渗泵集成芯片上，可用于反复进行电渗泵驱动色谱分离检测。

作为优选，所述通孔为外大内小的阶梯孔，阶梯孔的内侧孔孔径小于毛细管凝胶电极的外径。内侧孔用于连接毛细管凝胶电极与Y型微通道，且能够避免毛细管凝胶电极直接插到Y型微通道中，造成Y型微通道堵塞。

作为优选，盖板底面微通道交汇处、正极接口和负极接口的下方胶粘有金属抗压片。用于增加本整体柱纳流电渗泵集成芯片薄弱处的抗压能力，可将本整体柱纳流电渗泵集成芯片的最高承压能力提升到10MPa，能够选择更好的冲洗压力，提高对色谱分离整体柱和负、正性电渗整体柱的冲洗效率。

本发明所要解决的另一个技术问题是提供一种上述将电渗泵整体柱与色谱分离整体柱集成在一起的整体柱纳流电渗泵集成芯片的制造方法。

本制造方法解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种整体柱纳流电渗泵集成芯片的制造方法，具体步骤包括：

S1芯片本体的制作：包括在基板的微通道交汇处进行通孔的打孔操作，在通孔上面粘接连通接头；

S2在第一泵区微管道和第二泵区微管道内同步进行负性电渗整体柱和正性电渗整体柱的动态聚合；

S3在分离区微管道内进行色谱分离整体柱的聚合；

S4先对分离区微管道内的色谱分离整体柱进行冲洗，然后对第一泵区微管道内的负性电渗整体柱和第二泵区微管道内的正性电渗整体柱进行冲洗。

与现有技术相比，本制造方法的优点在于在基板的微通道交汇处设置垂直于微通道的通孔，通孔上面粘接连通接头，可在连通接头中连接出料毛细管、进料毛细管或毛细管凝胶电极，从而能够在负性电渗整体柱和正性电渗整体柱动态聚合后进行色谱分离整体柱的聚合，并分步进行色谱分离整体柱和负性电渗整体柱与正性电渗整体柱的冲洗，从而将负性电渗整体柱与正性电渗整体柱和色谱分离整体柱集成在同一块芯片上，以用于反复进行电渗泵驱动色谱分离检测。

作为优选，步骤S1通孔的打孔操作中，先在基板顶面微通道交汇处往内打外侧孔，外侧孔的深度大于等于基板厚度的一半，然后从微通道交汇处往外打内侧孔直至连通外侧孔。减小超细钻头的钻入深度，降低打孔难度，同时能够降低对内侧孔外端壁的破坏，以减少外侧孔的死体积。

作为优选，步骤S2正性电渗整体柱和负性电渗整体柱的动态聚合中：将分离区微管道的出口堵住，连通接头连接出料毛细管，用遮光纸盖住微通道交汇处和分离区微管道，对连接在正极接口和负极接口上的进样管均做避光处理，然后由氮气同步推动负性电渗整体柱制备液和正性电渗整体柱制备液，在流动状态中紫外灯照射下于第一泵区微管道内聚合生成负性电渗整体柱，于第二泵区微管道内聚合生成正性电渗整体柱，并通过风扇对流散热使整体柱聚合均匀。能够避免正性电渗整体柱和负性电渗整体柱的制备液进入到分离区微管道中，用遮光纸盖住微通道交汇处以防止整体柱在上述区域的聚合；连通接头连接出料毛细管用于排出未反应的制备液，在流动状态中聚合防止正性电渗整体柱制备液与负性电渗整体柱制备液掺杂，导致正性电渗整体柱与负性电渗整体柱不纯粹，同时在流动加压下聚合更均匀；风扇对流散热以保证大面积整体柱聚合均匀，不出现连续床分断。

作为优选，步骤S3色谱分离整体柱的聚合中：先将分离区微管道出口打开，从连通接头处引入色谱分离整体柱制备液往分离区微管道出口流动，色谱分离整体柱制备液充满暴露的分离区微管道后停止引入，并堵上分离区微管道出口，在静态中紫外灯照射下于暴露的分离区微管道内聚合生成色谱分离整体柱。能够在设定的曝光区聚合色谱分离整体柱，与正性电渗整体柱和负性电渗整体柱聚合在同一芯片的不同功能区域内。

作为优选，步骤S4色谱分离整体柱、正性电渗整体柱和负性电渗整体柱的冲洗中：先在盖板底面微通道交汇处、正极接口和负极接口的下方胶粘金属抗压片的情况下，将分别连接正极接口和负极接口的进样管相互汇通后与装有冲洗液的第一液相泵连通，并在正极接口和负极接口的汇通支路上分别连接分流毛细管，连通接头通过进料毛细管连接装有冲洗液的第二液相泵及分流毛细管；打开分离区微管道出口，由第二液相泵推动冲洗液将色谱分离整体柱冲洗干净，然后将分离区微管道出口堵住，连通接头处换接成出料毛细管，在分流毛细管分流泄压下，第一液相泵推动冲洗液将正性电渗整体柱和负性电渗整体柱冲洗干净。胶粘金属抗压片后，去除了芯片本体的抗压薄弱点，能够将芯片本体的最高承压能力提升到10MPa以上，能够选择更好的冲洗压力，以提高对色谱分离整体柱和负、正性电渗整体柱的冲洗效率；分流毛细管在冲洗过程中保护刚聚合的整体柱不会因为压力骤升或压力积累而损伤。

本发明所要解决的还有一个技术问题是提供一种基于上述整体柱纳流电渗泵集成芯片的分析系统，将电渗泵整体柱与色谱分离整体柱集成在一块芯片上，以简化分析系统的构造。

本分析系统解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种基于上述整体柱纳流电渗泵集成芯片的分析系统，连通接头上连接毛细管凝胶电极以与带铂电极的第一电解质溶液小瓶电导通；正极接口处粘接装载工作液的第一液槽，第一液槽与带铂电极的第二电解质溶液小瓶通过毛细管凝胶电极连接并实现电导通；负极接口处粘接装载工作液的第二液槽，第二液槽与带铂电极的第三电解质溶液小瓶通过毛细管凝胶电极连接并实现电导通；第二电解质溶液小瓶上铂电极与第一电解质溶液小瓶上的铂电极之间连接正高压电源，第三电解质溶液小瓶上的铂电极与第一电解质溶液小瓶上铂电极之间连接负高压电源；出口横孔上的出口毛细管连通毛细管柱上紫外检测器，毛细管柱上紫外检测器与色谱工作站通信连接。

与现有技术相比，本分析系统的优点在于其整体柱纳流电渗泵集成芯片将负、正性电渗整体柱与色谱分离整体柱集成在一起，使整体结构简化，装配快捷；加装电解质溶液小瓶用于确保分析系统电导通，并将工作液与铂电极隔离，以消除电解产生的气泡及电解产物对分析系统的干扰，确保分析系统的稳定性；连通接头与毛细管凝胶电极作为电场去耦合器使用，使电渗流汇合时消除部分电渗流内耗，从而加大对检测样品和流动相的有效推动力，提升检测样品的分离速度。

上述基于整体柱纳流电渗泵集成芯片的分析系统可应用于分离预先从与连通接头连通的进料毛细管中加入的检测样品并获得色谱图。

附图说明

图1为本发明整体柱纳流电渗泵集成芯片的爆炸图（无金属抗压片）。

图2为本发明整体柱纳流电渗泵集成芯片的俯视立体图（含金属抗压片）。

图3为图2A区的放大示意图。

图4为本发明电渗泵正、负性电渗整体柱的聚合装置的简易示图。

图5为本发明整体柱纳流电渗泵集成芯片的示意图（加装了推动色谱分离整体柱制备液流动的液相泵）。

图6为本发明冲洗色谱分离整体柱的简易装置图。

图7为本发明冲洗电渗泵正、负性电渗整体柱的简易装置图。

图8为本发明基于整体柱纳流电渗泵集成芯片的分析系统的简易示图。

图9为本发明负性电渗整体柱的聚合原理图。

图10为本发明正性电渗整体柱的聚合原理图。

图11为本发明色谱分离整体柱的聚合原理图。

图12为本发明分析系统分离H2016多肽混合物获得的色谱图。

具体实施方式

以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。

本优选实施例如图1所示为一种整体柱纳流电渗泵集成芯片，其芯片本体包括永久键合的基板1与盖板2，基板1与盖板2之间设有Y型微通道3和出口横孔4，出口横孔4与Y型微通道3的末端连通，Y型微通道3由第一泵区微管道3-1与第二泵区微管道3-2及分离区微管道3-3在中心处交汇而成，正极接口1-1设在基板1上并与第一泵区微管道3-1连通，负极接口1-2也设在基板1上并与第二泵区微管道3-2连通，基板1 的微通道交汇处设有轴线沿基板1厚度方向设置的通孔1-3（也称竖孔），通孔1-3上面安装有用于连接出料毛细管14、进料毛细管31或毛细管凝胶电极50的连通接头8（采用IDEX Health & Science LLC的Upchurch Scientific接头），连通接头8的连接强度最高为10MPa；其中，基板1与盖板2的厚度为1.7 mm ~1.9mm，基板1和盖板2选用光学玻璃，以利于显微镜观察；第一泵区微管道3-1和第二泵区微管道3-2的宽度为120μm ~130μm，第一泵区微管道3-1和第二泵区微管道3-2的深度均为50μm；分离区微管道3-3的宽度为200μm ~210μm，分离区微管道3-3的深度也为50μm；正极接口1-1和负极接口1-2为孔径1.6mm的通孔。第一泵区微管道3-1上设有聚合而成的负性电渗整体柱（Negative Monolith）5，第二泵区微管道3-2上设有聚合而成的正性电渗整体柱（Positive Monolith）6，分离区微管道3-3上设有聚合而成的色谱分离整体柱7，且色谱分离整体柱7靠近Y型微通道3的末端，负性电渗整体柱5和正性电渗整体柱6的长度相同为10cm左右，色谱分离整体柱7的长度为1cm~2cm。

作为优选，如图2所示，盖板2底面微通道交汇处、正极接口1-1和负极接口1-2的下方胶贴有金属抗压片9，能够提高本整体柱纳流电渗泵集成芯片的耐高压性能。因为冲洗压力越大，负性电渗整体柱5、正性电渗整体柱6和色谱分离整体柱7的冲洗和活化效率越高，能够成倍的缩短前处理时间。而实验人员在冲洗操作中发现正极接口1-1和负极接口1-2下方的盖板2较为容易破裂，经测试发现在微通道交汇处、正极接口1-1和负极接口1-2下方的盖板2为本整体柱纳流电渗泵集成芯片的抗压薄弱点，在未胶贴金属抗压片9的情况下，盖板2在正极接口1-1和负极接口1-2的下方处最高受压小于6MPa，盖板2底面微通道交汇处的下方处最高受压为8MPa左右，其原因在于这几处整体厚度相较于本整体柱纳流电渗泵集成芯片的其他地方要薄，且正极接口1-1和负极接口1-2的面积比通孔1-3大很多。当胶贴有金属抗压片9后，芯片本体能够承受超过10MPa的压力，且通常聚合效果好的负性电渗整体柱5、正性电渗整体柱6和色谱分离整体柱7与Y形微通道3的连接强度大，能够承受20MPa左右的压力，因此可以选取较高的冲洗压而不破坏负性电渗整体柱5、正性电渗整体柱6和色谱分离整体柱7，且使本整体柱纳流电渗泵集成芯片可反复进行电渗泵驱动色谱分离检测。

作为优选，如图3所示，通孔1-3为外大内小的阶梯孔，阶梯孔的外侧孔径为0.37mm，阶梯孔的内侧孔径为0.12mm~0.15 mm，小于毛细管凝胶电极50的外径0.36mm，能够避免毛细管凝胶电极50直接插入到Y型微通道3中导致Y型微通道3堵塞。

上述整体柱纳流电渗泵集成芯片的制造方法，具体步骤包括：

S1芯片本体的制作：包括掩膜版的设计与加工，基板1与盖板2上Y型微通道3的光刻与蚀刻，基板1上正极接口1-1、负极接口1-2、通孔1-3的打孔操作，基板1与盖板2之间的出口横孔4的打孔操作，基板1与盖板2的键合，连通接头8的粘接，出口毛细管15的粘接，以及进样管18的粘接。

使用CorelDRAWX3画图软件绘制设计芯片Y型微通道网络，委外加工光刻掩膜版，其中掩膜版上第一泵区微管道3-1和第二泵区微管道3-2的宽度为80μm，分离区微管道3-3的宽度为160μm。基板1与盖板2的掩膜版为对称形状。

用N₂（氮气）将掩膜版吹净，在暗室黄光下，将掩膜版带有微图形的一面朝下，覆盖在涂有光刻胶的铬版玻璃基片上，铬版玻璃基片由长沙韶光铬板有限公司供应，掩膜版与铬版玻璃基片对准后放置在光刻机（上海学泽光学机械有限公司的JKG-2A型光刻机）的光圈下方，光刻机发出的紫外光透过掩膜版照射到铬版玻璃基片上，曝光时间为60s。将曝光后的铬版玻璃基片浸入显影液（质量分数0.5% NaOH水溶液）中，以除去曝光图形区的光刻胶，显影过程中，铬版玻璃基片在显影液中轻轻晃动，显影时间为10s。显影后取出用流动的超纯水漂洗干净，N₂吹干后放入135℃烘箱中改性15min。将改性后的铬版玻璃基片浸入除铬液（25 g硝酸铈铵+110 ml的蒸馏水+6.45 ml 70%高氯酸）中并微微晃动，浸泡时间为90s，以除去Y型微通道表面暴露的铬层，除铬后取出，以流动超纯水冲洗干净。此时，铬版玻璃基片表面Y型微通道处的玻璃露出，而其它位置仍有铬和光刻胶遮盖。显微镜下检查除铬后的铬版玻璃基片，若合格则将其浸入盛有刻蚀液（摩尔比HF:NH₄F:HNO₃=1:0.5:0.75）的容器中，使铬版玻璃基片与刻蚀液充分接触，然后将该容器转移至恒温水浴锅（江苏天由有限公司的SHZ-82A型恒温水浴震器）中；控制恒温水浴锅温度为39℃，根据所要得到的微管道宽度、深度确定本次刻蚀时间为25分钟；刻蚀完后取出铬版玻璃基片，用大量流动超纯水冲洗干净，N₂吹干，此时铬版玻璃基片表面获得一定深度的微凹槽结构，刻蚀深度通过台阶仪检测，确定为25µm，第一泵区微管道3-1和第二泵区微管道3-2的宽度为130μm，分离区微管道3-3的宽度为210μm（由于铬层和光刻胶的遮挡，微管道刻蚀后的宽度会有所减小，第一泵区微管道3-1和第二泵区微管道3-2的宽度在120μm以上，分离区微管道3-3的宽度在200μm以上）。将刻蚀好的铬版玻璃基片浸入丙酮溶液中，待表面由红棕色变为亮黄色，取出后用超纯水冲洗干净，此时铬版玻璃基片表面的光刻胶已除掉；接着放入除铬液中，待露出透明的玻璃基片表面后取出，用超纯水冲洗干净，如发现玻璃基片表面有尚未除净的铬，可继续放入除铬液中，直至完全除去表面的铬。

将502胶水涂于基板1玻璃基片带通道的一面，粘合于一片干净的玻璃垫片上，等胶水完全凝固后，固定于台钻的刻床之上，基板1玻璃基片朝上；台钻装配1.55mm的磨砂钻钻头，调节刻床下方的平移台，使钻头正好处于正极接口1-1或负极接口1-2的正上方；在基板1玻璃基片的顶面滴加去离子水，轻轻按压使钻头接触基板1玻璃基片，先在顶面磨一段时间（约一分钟），再将钻头打入基板1玻璃基片直至打通；然后调节刻床下方的平移台，用相同的方法在基板1玻璃基片上打通另外一个通孔；换成磨孔钻头后对通孔进行打磨，打磨后正极接口1-1和负极接口1-2的孔径为1.6mm。

换用0.35mm的钻头，再次调节平移台，在显微镜观察下，使基板1玻璃基片的微通道交汇处与钻头对齐，然后在基板1玻璃基片的顶面滴加少量去离子水，轻轻按压使钻头接触基板1玻璃基片，先在顶面磨一段时间（约一分钟），将钻头慢慢钻入基板1玻璃基片中约1mm左右（约十分钟），最后孔径为0.37mm，即为通孔1-3的外侧孔；取下基板1玻璃基片与玻璃垫片，放于恒温水浴锅中进行加热，30min后取出，从玻璃垫片上取下基板1玻璃基片，除去基板1玻璃基片上面残留的502胶水并且用纸拭干；在通孔1-3的外侧孔中加入少量的红色墨水并用502胶水封住，将502胶水涂于基板1玻璃基片不带通道的一面，再次粘合于玻璃垫片上，固定到刻床上，依旧是基板1玻璃基片朝上；换用0.12mm的钻头，调节平移台，在显微镜观察下，使钻头与基板1玻璃基片的微通道交汇处对齐，在微通道交汇处滴加少量去离子水，用钻头慢慢打入基板1玻璃基片的微通道交汇处，去离子水中出现红色墨水后，停留一小段时间（约半分钟）以保证通孔1-3完全通畅，取下基板1玻璃基片与玻璃垫片，放于恒温水浴锅中进行加热，30min后取出，从玻璃垫片上取下基板1玻璃基片，用丙酮把芯片基板1玻璃基片表面残留的502胶水全部处理干净，然后放入超声波清洗器中进行超声处理；将基板1玻璃基片放入显微镜中观察正极接口1-1、负极接口1-2和通孔1-3的情况。

将少量的双面胶粘在盖板2玻璃基片上，与打完正极接口1-1、负极接口1-2和通孔1-3的基板1玻璃基片粘接（带有通道的一面相贴合），再在四周涂抹热熔胶，胶固后固定在刻床上；钻机采用0.35mm的钻头，把钻机靠近基板1与盖板2的粘合处，通过CCD探头，观察Y型微通道3末端的轴线是否与钻头的轴线在同一直线上，微调升降台，使钻头正好处于Y型微通道3的正中间。将钻头慢慢钻入基板1与盖板2的粘合处，用去离子水流冲洗钻孔处，打入约1.5mm左右；换用0.35mm的平头钻头，磨进去约0.5mm左右，继续用去离子水流冲洗钻孔处，然后原处打磨一段时间；用乙醇除去基板1与盖板2外围的热熔胶，然后浸入装有硫酸溶液的烧杯中，并放在加热板之上，温度约为80℃左右，直到基板1与盖板2能够完全分开，用蘸丙酮溶液的无脂棉用力擦拭基板1与盖板2，以除去残留的双面胶，擦干净之后，放到浓硝酸溶液中，超声30min左右，如此重复3-5次；再用洗洁精和去离子水清理表面，直至在显微镜下观察通道无残留物。将基板1与盖板2干燥后浸入浓硫酸溶液中，直至封合前拿出。

将基板1与盖板2从浓硫酸溶液中取出，垂直平行相对，将刻蚀有微通道图形的一面朝内，保持一定的间距，在连续自来水流下冲洗；逐渐将基板1与盖板2对准、贴合；把贴合的基板1与盖板2放在显微镜下进行对准，静置20-30 min至水分挥发；再将完全对准贴合的基板1与盖板2转移至加热板上，温度为80℃，加热30min后，完成预封接；转移至真空干燥箱中，在110℃的恒温下真空-1atm下烘1h；再转移至程控箱式电阻炉中，升温程序为：将温度从室温升至100℃，升温时间为10min，100℃恒温40min，然后升至550℃，升温时间为40min，并在550℃下，恒温2h，最后缓慢降至室温，即可获得永久键合的芯片本体。

堵住正极接口1-1、负极接口1-2和通孔1-3；对出口横孔4进行打磨，打磨后出口横孔4孔径为0.37mm；去除堵头，将出口横孔4向下的芯片本体依次放入硝酸溶液、纯水、碱溶液中各超声处理30分钟，然后用纯水清净。

先用棉棒蘸取丙酮溶液将芯片本体表面（基板1顶面）擦拭干净；将外为0.36mm长半厘米的小段毛细管插到通孔1-3外侧孔用于定位，先将粘接片放到芯片本体表面通孔1-3处，再依次放上环型垫圈和接头座，用夹子固定好在165℃的烘箱中加热1h。这里，连通接头8由粘接片、环型垫圈、接头座和螺纹连接头组成，附图中未分开标示，接头座和螺纹连接头之间螺纹配合将插入连通接头8中的出料毛细管14、进料毛细管31或毛细管凝胶电极50固定。将AB胶（环氧树脂）1:1混合，搅拌均匀后静置30min，用AB胶在粘接片与芯片本体连接处涂上一圈，可使粘合的更加牢固。

先将出口毛细管15前端（0.5mm左右）外壁的涂层用刀片刮除，并用砂纸磨平出口毛细管15的前端，用丙酮清洁，晾干。粘少量AB胶均匀涂抹在出口毛细管15前端1mm以后的部位，对准出口横孔4插入到底，将粘好后的芯片本体水平放置，使其自然凝固即可。

先切两根15cm长外径为1.6mm的PFA特氟龙管，再将PFA特氟龙管的端口用刀片切平整，插入到正极接口1-1和负极接口1-2中，在进样管18与芯片本体连接处用AB胶涂上一圈，将粘好后的芯片本体水平放置，使其自然凝固即可。

S2在第一泵区微管道3-1和第二泵区微管道3-2中同步进行负性电渗整体柱5和正性电渗整体柱6的聚合。

整体柱纳流电渗泵集成芯片的预处理：

a.从通孔1-3处加入丙酮，在0.04MPa下用丙酮冲洗第一泵区微管道3-1、第二泵区微管道3-2和分离区微管道3-3五分钟。

b.从通孔1-3处去离子水，在0.04MPa下用去离子水冲洗第一泵区微管道3-1、第二泵区微管道3-2和分离区微管道3-3十分钟。

c.从通孔1-3处加入1mol/L NaOH，在0.04MPa下用1mol/L NaOH 冲洗第一泵区微管道3-1、第二泵区微管道3-2和分离区微管道3-3二十分钟。

d.从通孔1-3处加入去离子水，在0.06MPa下用去离子水冲洗第一泵区微管道3-1、第二泵区微管道3-2和分离区微管道3-3二十分钟。

e.从通孔1-3处加入1mol/L HCl，在0.04MPa下用1mol/L HCl 冲洗第一泵区微管道3-1、第二泵区微管道3-2和分离区微管道3-3二十分钟。

f.从通孔1-3处加入去离子水，在0.04MPa下用去离子水冲洗第一泵区微管道3-1、第二泵区微管道3-2和分离区微管道3-3十五分钟。

g.从通孔1-3处加入无水乙腈，在0.04MPa下用无水乙腈冲洗第一泵区微管道3-1、第二泵区微管道3-2和分离区微管道3-3十五分钟。

h.从通孔1-3处接入氮气，用氮气干燥第一泵区微管道3-1、第二泵区微管道3-2和分离区微管道3-3一个小时，压强为0.02MPa。

i.堵住出口横孔4，正极接口1-1和负极接口1-2汇通后接入装有30%γ-MAPS-乙腈溶液的密封小瓶，在0.04MPa下氮气推动30%γ-MAPS-乙腈溶液在第一泵区微管道3-1和第二泵区微管道3-2流动，当通孔1-3处流出30%γ-MAPS-乙腈溶液时堵住通孔1-3，然后继续增加氮气压力，当30%γ-MAPS-乙腈溶液继续前行充满分离区微管道3-3曝光区时停止加压，保持压力平衡,并在芯片本体底部用加热板加热，维持芯片本体50℃的温度，持续十四小时。其中，30%γ-MAPS乙腈溶液的制备：用5ml的移液枪移取2.1ml乙腈溶液放到棕色样品瓶中，用1000μl的移液枪移取900μlγ-MAPS试剂放到盛有乙腈的棕色样品瓶中配制成30%γ-MAPS乙腈溶液，再用10μl的移液枪移取6μl醋酸放入棕色样品瓶中，将棕色样品瓶放到漩涡混合器上震荡1min充分混合，储存在4℃冰箱中备用。

j.从通孔1-3处加入乙腈，然后在0.04MPa下用乙腈冲洗第一泵区微管道3-1、第二泵区微管道3-2和分离区微管道3-3十分钟。

k.从通孔1-3处接入氮气，在0.02Mpa下用氮气干燥第一泵区微管道3-1、第二泵区微管道3-2和分离区微管道3-3两小时后备用。

负性电渗整体柱制备液的配制：由1% 2-丙烯酰胺基-2-甲基丙磺酸（AMPS），23%甲基丙烯酸丁酯（BMA），16% 乙二醇二甲基丙烯酸酯（EDMA），41.53% 1-丙醇，12.46% 1,4-丁二醇和6.01%水构成质量分数为100%的混合溶液加入到密封的第一储液瓶21，超声混合至均匀透明，并用氮气除氧10分钟，加入质量分数1% 的偶氮二异丁腈（AIBN）超声溶解1分钟，即得负性电渗整体柱制备液（质量分数101%），待用。

正性电渗整体柱制备液的配制：由0.72% [2-(甲基丙烯酰氧基)-乙基]-三甲基氯化铵（META），23.28% 甲基丙烯酸丁酯（BMA），16% 乙二醇二甲基丙烯酸酯（EDMA），37.53%1-丙醇，16.45% 1,4-丁二醇和6.02%的水构成的质量分数100%的混合溶液加入到密封的第二储液瓶22，超声混合至均匀透明，并用氮气除氧10分钟，加入质量分数1% 的偶氮二异丁腈（AIBN）超声溶解1分钟，即得正性电渗整体柱制备液（质量分数101%），待用。

这里，第一储液瓶21和第二储液瓶22采用棕色的色谱小瓶，能够避紫外光。

将第一储液瓶21和第二储液瓶22与预处理后的整体柱纳流电渗泵集成芯片装配在如图4所示的聚合装置上。该聚合装置包括紫外箱11、设在紫外箱11顶部的紫光灯12、紫光灯12下方的操作平台（图中未示出）和操作平台两旁的风扇13（其中一个风扇未示出，用于提供对流空气）、相连通的氮气源24与氮气中转瓶23，氮气中转瓶23用于使负、正性电渗整体柱制备液的输出同步。整体柱纳流电渗泵集成芯片放置在操作平台上，用堵头17堵住出口毛细管15出料端的二通接头16，插入连通接头8中的出料毛细管14的自由端插到开孔的空色谱小瓶中（图中未示出），氮气中转瓶23的输气管分别插入第一储液瓶21和第二储液瓶22中，输气管管头在制备液液面上方，连接第一储液瓶21与正极接口1-1上的进样管和连接第二储液瓶22与负极接口1-2上的进样管的输液毛细管的端部均插到瓶底，进样管18外均用不透光的胶带遮盖，微通道交汇处和分离区微管道3-3粘贴不透光的遮光纸10进行遮盖。室温环境下，将氮气源24的输出压力调整为0.06MPa（不小于0.04 MPa），观察第一储液瓶21和第二储液瓶22是否有负、正性电渗整体柱制备液流出，管路通畅下持续流30分钟，将管路中的气体排除干净。风扇13向避光箱体11内吹对流空气，氮气源24的输出压力调到0.02MPa，以保证制备液是流动的且流速不会太快，打开8W的紫外灯12，在365nm波长紫外光照下反应6~8小时，得到聚合均匀的连续床负性电渗整体柱5和正性电渗整体柱6，关闭紫外灯12，关闭氮气源24，并使第一储液瓶21和第二储液瓶22的压力恢复至一个大气压。负性电渗整体柱5和正性电渗整体柱6的聚合原理分别如图9和10所示。

S3在分离区微管道3-3上进行色谱分离整体柱7的聚合。

色谱分离整体柱制备液的配制：由18% 甲基丙烯酸十八烷基酯（SMA），12% 二甲基丙烯酸乙二醇酯(EDMA)，31.52% 1,4-丁二醇和38.48% 环己醇构成的质量分数100%的混合溶液加入色谱小瓶中，超声混合至均匀透明，过滤到新的色谱小瓶中密封，并用氮气除氧10分钟，加入质量分数1% 的偶氮二异丁腈（AIBN）超声溶解1分钟，即得色谱分离整体柱制备液，用充氮气的注射器33吸入，并排空氮气，待用。

打开连通接头8，往连通接头8内滴入乙腈，用微量注射器吸取残留制备液，再往连通接头8内滴入一滴乙腈，然后如图5所示将堵住出口毛细管15出料端的二通接头16打开，在连通接头8连接进料毛细管31前，注射器33将色谱分离整体柱制备液推满进料毛细管31，然后进料毛细管31与连通接头8完全连接，注射器33推动色谱分离整体柱制备液流往分离区微管道3-3，在色谱分离整体柱制备液充满暴露区的那段分离区微管道3-3（放大镜观察下分离区微管道3-3隐去）时停止注射，用堵头17将出口毛细管15出料端的二通接头16堵住，打开8W的紫外灯12，在静态中365nm波长紫外灯照射下6小时于暴露区的分离区微管道3-3内原位生成色谱分离整体柱7。色谱分离整体柱7的聚合原理如图11所示。

S4先对分离区微管道3-3上的色谱分离整体柱7进行冲洗，然后对第一泵区微管道3-1和第二泵区微管道3-2上的负性电渗整体柱5和正性电渗整体柱6进行冲洗。

如图6所示，先在盖板2底面微通道交汇处、正极接口1-1和负极接口1-2的下方胶贴金属抗压片9（也可以在粘接进样管18后进行）；正极接口1-1和负极接口1-2汇通后连接装载冲洗液的第一液相泵41，正极接口1-1和负极接口1-2的汇通支路上均连接有分流毛细管42，连通接头8通过进料毛细管31连接装载冲洗液的第二液相泵43及分流毛细管。打开出口毛细管15出料端的二通接头16，在分流毛细管分流泄压下，第二液相泵推动冲洗液在2MPa下冲洗色谱分离整体柱7，除去分离区微管道3-3上的废液；这里，冲洗液先为100%乙腈（冲洗1小时），后为体积配比20%水和80%乙腈（冲洗1小时），最后冲洗液为流动相（体积分数15.9%乙腈，84%水，0.1%三氟乙酸），流动相充满分离区微管道3-3即可；分流毛细管的内经10μm，长度为50cm。

然后如图7所示，用堵头17将出口毛细管15出料端的二通接头16堵住，连通接头8连接出料毛细管14，在分流毛细管42分流泄压下，第一液相泵41推动冲洗液将第一泵区微管道3-1和第二泵区微管道3-2冲洗干净，活化负性电渗整体柱5和正性电渗整体柱6。这里，冲洗液先为100%乙腈（6MPa冲洗2小时），后为体积配比20%水和80%乙腈（4MPa冲洗1小时），最后冲洗液为电渗用的工作液（体积分数99.9%纯水，0.1%三氟乙酸（TFA））。

需要注意的是，第一液相泵41和第二液相泵43均采用纳流液相泵。

连通接头8通过连接1.5cm长的毛细管凝胶电极50以与带铂电极的第一电解质溶液小瓶51实现电导通；将正极接口1-1和负极接口1-2上的进样管18去除，并在正极接口1-1胶粘带侧孔的第一液槽52，第一液槽52内加满工作液，在负极接口1-2胶粘带侧孔的第二液槽55，第二液槽55内加满工作液，第一液槽52与带铂电极的第二电解质溶液小瓶53通过1.5cm长毛细管凝胶电极连接并实现电导通，第二液槽55与带铂电极的第三电解质溶液小瓶56通过1.5cm长毛细管凝胶电极连接并实现电导通；第二电解质溶液小瓶53上铂电极与第一电解质溶液小瓶51上的铂电极之间连接正高压电源54，第三电解质溶液小瓶56上的铂电极与第一电解质溶液小瓶51上铂电极之间连接负高压电源57；出口横孔4上的出口毛细管15连接TriSep-2100毛细管柱上紫外检测器（美国通微公司）58，毛细管柱上紫外检测器58与KF-98色谱工作站59通信连接，构成如图8所示的基于整体柱纳流电渗泵集成芯片的分析系统。这里，加装电解质溶液小瓶用于确保分析系统电导通，将工作液与铂电极隔离，消除电解产生的气泡及电解产物对分析系统的干扰，确保分析系统的稳定性；连通接头8与毛细管凝胶电极50作为电场去耦合器使用，使电渗流汇合时消除部分电渗流内耗，从而加大对检测样品和流动相的有效推动力，提升检测样品的分离速度。TriSep-2100毛细管柱上紫外检测器58也可以替换为毛细管柱上荧光检测器或质谱仪。

该分析系统用于分离从与连通接头8连接的进料毛细管31中加入的检测样品并获得色谱图。

检测样品的制备：将0.5mg/1mL的H2016多肽混合物（Sigma，美国）用9mL的0.1%的TFA水溶液稀释至0.05mg/1mL，置于色谱小瓶中，充分混匀，放置于4℃冰箱内保存待用。

先用带进料毛细管31（充满流动相（0.1%TFA，乙腈：水=15.9%∶84%））的注射器吸取检测样品4~5µL，装入精密注射泵中，将进料毛细管31与连通接头8连接，开动精密注射泵，将检测样品及10倍样品量的流动相推入分离区微管道3-3内，停止精密注射泵，将进料毛细管31换成毛细管凝胶电极50与连通接头8连接。同时启动正高压电源54和负高压电源57，正高压电源54的电压为6000V，负高压电源57的电压为-6000V，工作液推动背压大于2MPa，工作液流速为4nL/s，8分钟内完成分离检测，KF-98色谱工作站59同步给出检测样品的色谱图，如图12所示。谱图中组份峰依次为1.Giy-Tyr（甘氨酸-酪氨酸）；2.Val-Tyr-Val（缬氨酸-酪氨酸-缬氨酸）；3.Met-enkephalin（甲硫氨酸-脑啡肽）；4.Leu-enkephalin（亮氨酸-脑啡肽）；5.Angiotensin II（血管紧张素II）。

Claims (10)

1.一种整体柱纳流电渗泵集成芯片，包括永久键合的基板（1）与盖板（2），基板（1）与盖板（2）之间设有Y型微通道（3），正极接口（1-1）与微通道交汇处之间的第一泵区微管道（3-1）内聚合有负性电渗整体柱（5），负极接口（1-2）与微通道交汇处之间的第二泵区微管道（3-2）内聚合有正性电渗整体柱（6）；其特征在于，微通道交汇处与微通道出口之间的分离区微管道（3-3）内聚合有色谱分离整体柱（7）；基板（1）的微通道交汇处设有轴线沿基板（1）厚度方向设置的通孔（1-3），通孔（1-3）上面粘接有用于连接出料毛细管（14）、进料毛细管（31）或毛细管凝胶电极（50）的连通接头（8）。

2.根据权利要求1所述的整体柱纳流电渗泵集成芯片，其特征在于：所述通孔（1-3）为外大内小的阶梯孔，阶梯孔的内侧孔孔径小于毛细管凝胶电极（50）的外径。

3.根据权利要求1所述的整体柱纳流电渗泵集成芯片，其特征在于：盖板（2）底面微通道交汇处、正极接口（1-1）和负极接口（1-2）的下方都胶粘有金属抗压片（9）。

4.一种如权利要求1至3任一项所述整体柱纳流电渗泵集成芯片的制造方法，其特征在于，具体步骤包括：

S1芯片本体的制作：包括在基板（1）的微通道交汇处进行通孔（1-3）的打孔操作，在通孔（1-3）上面粘接连通接头（8）；

S2在第一泵区微管道（3-1）和第二泵区微管道（3-2）内同步进行负性电渗整体柱（5）和正性电渗整体柱（6）的动态聚合；

S3在分离区微管道（3-3）内进行色谱分离整体柱（7）的聚合；

S4先对分离区微管道（3-3）内的色谱分离整体柱（7）进行冲洗，然后对第一泵区微管道（3-1）内的负性电渗整体柱（5）和第二泵区微管道（3-2）内的正性电渗整体柱（6）进行冲洗。

5.根据权利要求4所述的整体柱纳流电渗泵集成芯片的制造方法，其特征在于，步骤S1通孔（1-3）的打孔操作中，先在基板（1）顶面微通道交汇处往内打外侧孔，外侧孔的深度大于等于基板（1）厚度的一半，然后从微通道交汇处往外打内侧孔直至连通外侧孔。

6.根据权利要求4所述的整体柱纳流电渗泵集成芯片的制造方法，其特征在于，步骤S2正性电渗整体柱（6）和负性电渗整体柱（5）的动态聚合中：将分离区微管道（3-3）的出口堵住，连通接头（8）连接出料毛细管（14），用遮光纸（10）盖住微通道交汇处和分离区微管道（3-3），对连接在正极接口（1-1）和负极接口（1-2）上的进样管（18）均做避光处理，然后由氮气同步推动负性电渗整体柱制备液和正性电渗整体柱制备液，在流动状态中紫外灯（12）照射下于第一泵区微管道（3-1）内聚合生成负性电渗整体柱（5），于第二泵区微管道（3-2）内聚合生成正性电渗整体柱（6），并通过风扇（13）对流散热使整体柱聚合均匀。

7.根据权利要求4所述的整体柱纳流电渗泵集成芯片的制造方法，其特征在于，步骤S3色谱分离整体柱（7）的聚合中：先将分离区微管道（3-3）出口打开，从连通接头（8）处引入色谱分离整体柱制备液往分离区微管道（3-3）出口流动，色谱分离整体柱制备液充满暴露的分离区微管道（3-3）后停止引入，并堵上分离区微管道（3-3）出口，在静态中紫外灯（12）照射下于暴露的分离区微管道（3-3）内聚合生成色谱分离整体柱（7）。

8.根据权利要求4所述的整体柱纳流电渗泵集成芯片的制造方法，其特征在于，步骤S4色谱分离整体柱（7）、正性电渗整体柱（6）和负性电渗整体柱（5）的冲洗中：先在盖板（2）底面微通道交汇处、正极接口（1-1）和负极接口（1-2）的下方胶粘金属抗压片（9）的情况下，将分别连接正极接口（1-1）和负极接口（1-2）的进样管（18）相互汇通后与装有冲洗液的第一液相泵（41）连通，并在正极接口（1-1）和负极接口（1-2）的汇通支路上分别连接分流毛细管（42），连通接头（8）通过进料毛细管（31）连接装有冲洗液的第二液相泵（43）及分流毛细管；打开分离区微管道（3-3）出口，由第二液相泵（43）推动冲洗液将色谱分离整体柱（7）冲洗干净，然后将分离区微管道（3-3）出口堵住，连通接头（8）处换接成出料毛细管（14），在分流毛细管（42）分流泄压下，第一液相泵（41）推动冲洗液将正性电渗整体柱（6）和负性电渗整体柱（5）冲洗干净。

9.一种基于如权利要求1至3任一项所述整体柱纳流电渗泵集成芯片的分析系统，其特征在于，连通接头（8）上连接毛细管凝胶电极（50）以与带铂电极的第一电解质溶液小瓶（51）电导通；正极接口（1-1）处粘接装载工作液的第一液槽（52），第一液槽（52）与带铂电极的第二电解质溶液小瓶（53）通过毛细管凝胶电极连接并实现电导通；负极接口（1-2）处粘接装载工作液的第二液槽（55），第二液槽（55）与带铂电极的第三电解质溶液小瓶（56）通过毛细管凝胶电极连接并实现电导通；第二电解质溶液小瓶（53）上铂电极与第一电解质溶液小瓶（51）上的铂电极之间连接正高压电源（54），第三电解质溶液小瓶（56）上的铂电极与第一电解质溶液小瓶（51）上铂电极之间连接负高压电源（57）；出口横孔（4）上的出口毛细管（15）连通毛细管柱上紫外检测器（58），毛细管柱上紫外检测器（58）与色谱工作站（59）通信连接。

10.一种如权利要求9所述基于整体柱纳流电渗泵集成芯片的分析系统的应用，其特征在于，用于分离预先从与连通接头（8）连通的进料毛细管（31）中加入的检测样品并获得色谱图。

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