CN115068499A

CN115068499A - 乙酰多巴胺多聚体及其衍生物在预防和/或治疗神经炎症中的应用

Info

Publication number: CN115068499A
Application number: CN202210833222.6A
Authority: CN
Inventors: 黄莉钧; 邓赟; 王栋; 郭大乐
Original assignee: Chengdu University of Traditional Chinese Medicine
Current assignee: Chengdu University of Traditional Chinese Medicine
Priority date: 2022-07-15
Filing date: 2022-07-15
Publication date: 2022-09-20

Abstract

本发明公开了一种乙酰多巴胺多聚体及其衍生物在制备预防和/或治疗炎症药物中的应用，所述炎症为神经炎症，所述乙酰多巴胺多聚体及其衍生物为N‑乙酰多巴胺二聚体(NADD)，NADD可通过抑制神经小胶质细胞的激活、降低炎症信号通路的表达、抑制炎症小体的表达以及降低炎症细胞因子的水平进而显著降低神经炎症水平，以TLR4为靶点的药物有望成为神经炎症治疗的一种新手段，可用于制备预防或治疗神经炎症及其相关疾病的药物，因此其具有较高的临床应用价值和开发前景。

Description

乙酰多巴胺多聚体及其衍生物在预防和/或治疗神经炎症中的应用

技术领域

本发明涉及药学领域，特别涉及一种乙酰多巴胺多聚体及其衍生物在制备预防和/或治疗神经炎症药物中的应用。

背景技术

蝉花又名土蝉花、虫花、蝉草、胡蝉、蝉菌、蝉蛹草、金蝉花、蝉茸或蚕茸等，为一种菌虫复合体，是蝉在土中的幼虫被麦角菌科真菌大蝉草的分生孢子寄生致死的带菌尸体，在其头部长菌丝形成的子座，形似花蕾故名蝉花。蝉花可依不同的寄主及感染菌种分类为大蝉花或金蝉草(C.cicadae)、小蝉花(C.sobolifera)及蝉草或蝉生虫草(C.cicadicola)三种。蝉花多产于长江以南热带和亚热带地区，在中国为福建、浙江、四川、云南及江苏等地。蝉花为名贵传统中药材，此药材中含乙酰多巴胺二聚体、三聚体、四聚体、五聚体，N-乙酰多巴胺二聚体(NADD)是从中药蝉花中提取的一种小分子化合物，已有研究表明，此类成分具有较强的活性，是蝉花的主要活性物质之一。

神经炎症是中枢神经系统(Central Nervous System,CNS)中免疫细胞对损伤、感染、毒素及自身免疫等作出的免疫应答，CNS中的免疫细胞有小胶质细胞和星型胶质细胞，其中小神经胶质细胞被认为是神经炎症中涉及的重要的主要细胞类型。小胶质细胞是中枢神经系统的先天性免疫细胞，其对神经炎症迅速起作用。然而，小胶质细胞的长时间激活(如在慢性或急性神经炎症中)会导致对脑组织和血脑屏障的损伤，从而引起神经退行性疾病，如阿尔茨海默病(AD)、帕金森病和多发性硬化症(MS)、抑郁症、精神分裂症、术后认知功能障碍(POCD)、脊髓损伤(SCI)、AIDS痴呆综合征(ADC)、缺血、中风、创伤性脑损伤(TBI)、脑或中枢神经系统感染、脑肿瘤等。

专利文献CN113144142A公开了一种治疗肾炎的中药组合物及其医药用途，所述中药组合物由白僵蚕、蝉蜕、姜黄和大黄作为中药原料药制备而成，其中含有乙酰多巴胺多聚体类成分，其可以治疗肾病，包括过敏性紫癜性肾炎、慢性肾炎。

专利文献CN110464720A公开了一种具有防治肠易激综合征的蝉蜕乙酰多巴胺多聚体组合物，所述蝉蜕乙酰多巴胺组合物可降低肠易激综合征模型小鼠血浆SP、血浆CGRP水平；减少结肠VIP、结肠5-HT含量，可从多层次、多环节改善肠易激综合征内脏高敏感性，具有很好的治疗肠易激综合征的作用。

现有技术中已证实NADD具有抑制肾炎、肠炎的作用，但目前现有技术中尚未见NADD与神经炎症相关、利用NADD对神经炎症疾病进行防治的相关报道，鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明克服了现有技术中存在的缺陷，提供了一种乙酰多巴胺多聚体及其衍生物在制备预防和/或治疗神经炎症的药物中的应用。

进一步地，所述乙酰多巴胺多聚体及其衍生物可以由乙酰多巴胺及乙酰多巴胺盐聚合而成。

进一步地，所述乙酰多巴胺及乙酰多巴胺盐选自：乙酰多巴胺、乙酰多巴胺盐酸盐、乙酰多巴胺硫酸盐、乙酰多巴胺硝酸盐、乙酰多巴胺氢溴酸盐、乙酰多巴胺磷酸盐、乙酰多巴胺甲酸盐、乙酰多巴胺乙酸盐、乙酰多巴胺丙酸盐、乙酰多巴胺苹果酸盐、乙酰多巴胺乳酸盐、乙酰多巴胺柠檬酸盐、乙酰多巴胺抗坏血酸盐、乙酰多巴胺钠盐和乙酰多巴胺钾盐中的一种或两种以上的组合。

在本发明的一个实施方式中，所述乙酰多巴胺多聚体由乙酰多巴胺聚合而成。

进一步地，所述乙酰多巴胺多聚体及其衍生物选自：乙酰多巴胺二聚体、三聚体、四聚体和五聚体中的一种或两种以上的组合。

在本发明的一个实施方式中，所述乙酰多巴胺的结构为：

在本发明的一个实施方式中，所述的乙酰多巴胺多聚体为N-乙酰多巴胺二聚体。

进一步地，所述神经炎症为脂多糖(LPS)诱导的神经小胶质细胞炎症。

进一步地，所述神经炎症为由神经小胶质细胞过度活化所导致的神经炎症。

进一步地，所述神经炎症为急性神经炎症和/或慢性神经炎症，优选地，所述神经炎症为慢性神经炎症。

进一步地，所述神经炎症为与神经退行性疾病相关的神经炎症。

进一步地，所述神经退行性疾病包括慢性神经退行性疾病和/或急性神经退行性疾病。

在本发明的一个实施方式中，所述的神经退行性疾病为慢性神经退行性疾病。

进一步地，所述慢性神经退行性疾病选自：抑郁症、精神分裂症、阿尔茨海默病(AD)、帕金森病、多发性硬化症(MS)、亨廷顿病(HD)、肌萎缩性侧索硬化(ALS)、脊髓小脑共济失调(SCA)、术后认知功能障碍(POCD)、脊髓损伤(SCI)和AIDS痴呆综合征(ADC)中的一种，优选地，所述的慢性神经退行性疾病为阿尔茨海默病(AD)和/或帕金森病。

进一步地，所述急性神经退行性疾病选自：脑缺血、脑损伤和癫痫中的一种。

进一步地，所述的神经小胶质细胞为M1型小胶质细胞。

进一步地，所述预防和/或治疗神经炎症包括降低神经炎症的强度和/或缩短神经炎症的持续时间。

进一步地，所述预防和/或治疗神经炎症包括抑制神经小胶质细胞的激活。

进一步地，所述抑制神经小胶质细胞的激活包括降低脂多糖(LPS)的受体的表达。

进一步地，所述脂多糖(LPS)的受体为TLR4。

进一步地，所述降低脂多糖(LPS)的受体的表达包括NADD直接和/或间接与TLR4结合。

进一步地，所述预防和/或治疗神经炎症还包括抑制炎症小体的表达。

进一步地，所述炎症小体选自：NLRP1炎症小体、NLRP3炎症小体、NLRC4炎症小体、IPAF炎症小体和AIM2炎症小体中的一种或两种以上的组合，优选地，所述的炎症小体为NLRP3炎症小体。

进一步地，所述预防和/或治疗神经炎症还包括抑制炎症小体下游蛋白的表达，所述的蛋白可以为ASC(一类蛋白质)和Cleaved-Capsase-1。

进一步地，所述预防和/或治疗神经炎症还包括降低炎症信号通路的表达。

进一步地，所述炎症信号通路为TLR4/NF-κB和/或NLRP3/Capsae-1信号通路。

进一步地，所述预防和/或治疗炎症还包括降低炎症细胞因子的水平。

进一步地，所述炎症细胞因子选自：iNOS因子、IL-1β因子和COX-2因子中的一种或两种以上的组合。

进一步地，所述降低炎症细胞因子的水平包括降低炎症细胞因子的含量和/或降低炎症细胞因子的mRNA表达水平和/或降低炎症细胞因子的蛋白表达水平。

进一步地，所述神经炎症的症状包括所述炎症细胞因子的水平升高。

进一步地，所述炎症细胞因子的水平升高包括炎症细胞因子的含量升高和/或炎症细胞因子的mRNA表达水平升高和/或炎症细胞因子的蛋白表达水平升高。

进一步地，所述药物的剂型可以采用任意的剂型，特别是口服剂型，本领域技术人员可以根据情况选用，包括，但不限于，片剂(包括糖衣片剂、膜包衣片剂、舌下片剂、口腔崩解片、口腔片剂等等)、丸剂、粉剂、颗粒剂、胶囊剂(包括软胶囊、微胶囊)、锭剂、糖浆剂、溶液剂、乳剂、混悬剂、控制释放制剂(例如，瞬时释放制剂、缓释制剂、缓释微囊)、气雾剂、膜剂(例如，口服崩解膜剂、口腔粘膜-粘附膜剂)。

进一步地，所述药物的给药方式可以采用任意的给药方式，特别是口服给药，本领域技术人员可以根据情况选用，包括，但不限于，口服、呼吸道给药(如鼻腔给药)和黏膜给药等。

本发明的第二方面提供了一种乙酰多巴胺多聚体及其衍生物在制备预防和/或治疗神经退行性疾病的药物中的应用。

进一步地，所述神经退行性疾病为与神经炎症相关的神经退行性疾病。

在本发明的一个实施方式中，所述乙酰多巴胺的结构为：

本发明发现了NADD在预防和/或治疗神经炎症方面的新用途，NADD可通过抑制神经小胶质细胞的激活、降低炎症信号通路的表达、抑制炎症小体的表达以及降低炎症细胞因子的水平进而显著降低神经炎症水平，以TLR4为靶点的药物有望成为神经炎症治疗的一种新手段，可用于制备预防或治疗神经炎症及其相关疾病的药物，因此其具有较高的临床应用价值和开发前景。

附图说明

图1为NADD的结构和毒性，其中：(A)为NADD结构；(B)为CCK8测定NADD的毒性，每组左侧直方图显示NADD对无LPS刺激的BV-2小胶质细胞无毒性，每组右侧直方图显示NADD对LPS激活的BV-2小胶质细胞无毒性。

图2为NADD对神经炎症的影响，其中：(A)为BV-2小胶质细胞经不同浓度NADD处理1h后，再经LPS或DMSO处理24h后的形态，红色箭头表示激活的小胶质细胞，白色标尺＝100μm；(B)为BV-2小胶质细胞形态学变化细胞的统计分析；(C)为BV-2细胞细胞上清中NO生成的统计分析；(D-E)为不同处理下BV-2细胞上清中IL-6(D)和TNF-α(E)的ELISA检测结果，与DMSO组比较(*p<0.05，**p<0.01)，与NADD-60μM组比较(#p<0.05，##p<0.01)，与LPS组比较(&p<0.05，&&p<0.01)时，差异均有统计学意义。

图3为NADD对炎症调节分子的影响，其中：(A)为BV-2小胶质细胞经不同浓度的NADD预处理1h，再经LPS或DMSO处理24h后产生ROS的情况，白色箭头表示DCFH-DA在小胶质细胞内通过ROS氧化产生的DCF，白色标尺＝50μm；(B)为BV-2小胶质细胞产生ROS的荧光面积统计分析；(C)为iNOS转录水平的统计分析；(D)为不同处理下BV-2细胞iNOS和COX-2蛋白表达变化，β-Actin为内参；(E)为iNOS和COX-2表达的统计分析，与DMSO组比较(*p<0.05，**p<0.01)，与NADD-60μM组比较(#p<0.05，##p<0.01)，与LPS组比较(&p<0.05，&&p<0.01)，差异均有统计学意义。

图4为斑马鱼体内ROS的生成，其中：(A)为斑马鱼在不同处理组中产生ROS(DCF+，绿色)的代表性图像；(B)为用ImageJ定量DCF的荧光强度，并进行统计分析，与DMSO组比较(*p<0.05，**p<0.01)，与LPS组比较(&p<0.05，&&p<0.01)，差异均有统计学意义。

图5为NADD对LPS刺激的BV-2小胶质细胞中TLR4/NF-κB通路的影响，其中：(A)为不同浓度NADD预处理1h，LPS或DMSO再处理24h后，BV-2小胶质细胞NF-κB核转位的变化，白色箭头表示NF-κB已转位到细胞核内，标尺＝50μm；(B)为统计分析NF-κB转位到BV-2小胶质细胞细胞核的细胞数百分比；(C)为不同处理下BV-2细胞TLR4、NF-κB蛋白表达变化，β-Actin为内参；(D)为TLR4、NF-κB表达的统计分析，与DMSO组比较(*p<0.05，**p<0.01)，与NADD-60μM组比较(##p<0.01)，与LPS组比较(&p<0.05，&&p<0.01)，差异均有统计学意义。

图6为LPS和NADD处理后NLRP3/Caspase-1通路因子的蛋白水平，其中：(A)为不同处理下BV-2细胞NLRP3、ASC和Cleaved-Caspase-1蛋白水平的变化，β-Actin作为内参；(B)为NLRP3表达的统计分析；(C)为ASC表达的统计分析；(D)为Cleaved-Caspase-1蛋白水平的统计分析；(E)为不同处理组BV-2细胞中IL-1βmRNA的表达水平，与DMSO组比较(*p<0.05，**p<0.01)，与NADD-60μM组比较(#p<0.05，##p<0.01)，与LPS组比较(&p<0.05，&&p<0.01)，差异均有统计学意义。

图7为NADD与TLR4相互结合的示意图，其中：(A)为SPR检测NADD与TLR4蛋白的相互结合情况；(B)为分子对接分析NADD与TLR4结合后的具体位置。

具体实施方式

为了能够更清楚地理解本发明的技术内容，特举以下实施例详细说明，其目的仅在于更好理解本发明的内容而非限制本发明的保护范围。

实施例1实验材料和方法

材料：

Dulbecco的改良Eagle培养基(DMEM)购自Gibco(C11995500BT，美国)；胎牛血清(FBS)购自Gemini；青霉素-链霉素溶液购自Hyclone(SV30010,USA)；0.25％胰蛋白酶购自Servicebio(G4004，武汉，中国)；二甲基亚砜(DMSO)购自Gibco；脂多糖(LPS)购自Beyotime(ST1470，中国上海)；细胞计数试剂盒(CCK8)购自MCE(HY-K0301，美国)；一氧化氮(NO)检测试剂盒购自Beyotime(S0021S，中国上海)；活性氧类检测试剂盒购自UElandy(R6033，中国苏州)；核因子-κB激活、核转位检测试剂盒(兔多克隆抗体)购自Beyotime(SN368，中国上海)；RNA分离器总RNA提取试剂购自Vazyme(R401-01，中国南京)；RT EasyTM II试剂盒(用于实时PCR RT-01022的第一链cDNA合成的主预混物)和实时荧光定量PCREasyTM-SYBRGreenI试剂盒(QP-01012)购自Foregene(中国成都)；BCA蛋白检测试剂盒购自Beyotime(P0012,中国上海)；QuickBlock^TM Western封闭缓冲液来自Beyotime(P0252,中国上海)；Immobilon Western ChemiluminescentHRP底物购自Millipore(WBKLS0500，美国)；TLR4蛋白(纯度≥87％)购自Sinobiological。

细胞培养：

BV-2小胶质细胞在含有10％胎牛血清和100单位/mL青霉素和100μg/mL链霉素的DMEM中培养，在含有5％二氧化碳和37℃的潮湿环境中培养。当细胞被传代或接种到培养皿中时，用0.25％的胰蛋白酶消化细胞。NADD和LPS溶于DMSO中。在给药前，用不含胎牛血清的DMEM饥饿6小时。然后用NADD预处理BV-2小胶质细胞1h后，再以LPS刺激24h，以DMSO作为对照。

细胞活力测定：

将BV-2小胶质细胞接种于96孔板中，每孔8×10³个细胞，培养过夜。当细胞融合率达到60％左右时，分别用0μM、10μM、30μM、60μM、100μM和200μM NADD预处理1h，然后用1μg/mL LPS共处理24h，不用LPS刺激的组加相应体积的DMSO。每孔加入10μL CCK8试剂，培养箱孵育4h。最后，在450nm处测量各孔的吸光度。

细胞形态分析：

将BV-2小胶质细胞接种到6孔板中。当细胞融合达到60％左右时，饥饿6h，然后分别用低浓度(15μM)、中浓度(30μM)和高浓度(60μM)的NADD处理1h，然后用1μg/mL的LPS共处理24h，不用LPS刺激的组加相应体积的DMSO。最后，用光学显微镜(SOPTOP ICX41，Pooher，上海，中国)观察各组的形态。

NO信号检测：

将BV-2小胶质细胞接种到6孔板中。当细胞融合达到约60％时，饥饿6h，然后分别用低(15μM)、中(30μM)和高(60μM)浓度的NADD预处理1h，然后用1μg/mL LPS共处理24h，不用LPS刺激的组加相应体积的DMSO。之后，收集细胞上清液，根据制造商的NO测定试剂盒说明检测各组中NO的产生。

ELISA分析：

将BV-2小胶质细胞接种到6孔板中。当细胞融合达到60％左右时，饥饿6h，然后分别用低浓度(15μM)、中浓度(30μM)和高浓度(60μM)的NADD处理1h，然后用1μg/mL的LPS共处理24h，不用LPS刺激的组加相应体积的DMSO。之后，收集细胞上清检测各组中IL-6和TNF-α的产生，具体实验步骤参照小鼠IL-6ELISA试剂盒和小鼠TNF-αELISA试剂盒说明书。

活性氧(ROS)生成的检测：

在体外，将BV-2小胶质细胞接种于6孔板中。当细胞融合率达到60％左右时，饥饿6h，然后分别用低浓度(15μM)、中浓度(30μM)和高浓度(60μM)的NADD处理1h，再加1μg/mLLPS共处理24小时，不用LPS刺激的组加相应体积的DMSO。用DCFH-DA(Ueland，R6033，中国苏州)检测BV-2小胶质细胞中ROS的产生，按厂家说明书进行检测，荧光显微镜下观察细胞内ROS氧化DCFH-DA产生的DCF。在体内，用低浓度(15μM)、中浓度(30μM)和高浓度(60μM)的NADD预处理斑马鱼胚胎1h,。然后用10μg/mL LPS对相应的组与NADD共处理72h。在次期间，每隔24h换一次新鲜的含药培养液。接着，用DCFH-DA对斑马鱼处理1h,然后用三卡因麻醉斑马鱼。最后，在共聚焦荧光显微镜下观察斑马鱼中ROS产生情况(OlympusFV1200,日本)。

NF-κB的核易位：

将BV-2小胶质细胞接种到24孔板中。当细胞融合达到约60％时，饥饿6h，然后用低(15μM)、中(30μM)和高(60μM)浓度的NADD预处理1h，然后用1μg/mL共同处理LPS 2小时，不用LPS刺激的组加相应体积的DMSO。然后根据制造商的说明，通过NF-κB激活/核易位检测试剂盒检测细胞的NF-κB核易位。简而言之，细胞在室温下用多聚甲醛固定15分钟，细胞经过洗涤后，用封闭缓冲液进行封闭，然后与NF-κB/P65抗体在4℃孵育过夜，洗涤后加入Rabbit-Cy3抗体，室温孵育1h，然后加入DAPI在室温下染色细胞核5分钟，最后在荧光显微镜下观察细胞(Olympus，IX73，日本)。

逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)：将BV-2小胶质细胞接种到6孔板中，当细胞融合达到60％左右时，饥饿6h，然后用低(15μM)、中(30μM)和高(60μM)浓度的NADD预处理1h，再加1μg/mL的LPS共处理24小时，不用LPS刺激的组加相应体积的DMSO.然后，用总RNA提取试剂消化细胞，并按照制造商的说明提取总RNA，随后，用RTEasyTMII试剂盒将RNA逆转录成cDNA，以cDNA为模板，采用实时荧光定量PCREasyTM-SYBR GreenI试剂盒进行荧光定量PCR反应。测定IL-1β(正向引物5’-TGAAATGCCACCTTTTGACAG-3’,，反向引物5’-CCACAGCCACAATGAGTGATAC-3)，iNOS(正向引物5’-GAGCCACAGTCCTCTTTGCTA-3’,反向引物5’-TGTCACCACCAGCAGTAGTTG-3’)。所有这些方案都是按照试剂盒制造商的说明执行的。

蛋白质印迹：

将BV-2小胶质细胞接种到6孔板中。当细胞融合达到约60％时，饥饿6h，然后用低(15μM)、中(30μM)和高(60μM)浓度的NADD预处理1h，然后与1μg或不加1μg/mLLPS共处理24h，之后，用1×SDS裂解缓冲液裂解细胞，煮沸30分钟。然后，根据制造商的说明，通过BCA蛋白检测试剂盒检测各组的蛋白浓度。之后，将各组等量的蛋白质进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳，并转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，室温封闭1h。随后，将PVDF膜与一抗在4℃摇床中孵育过夜。一抗如下：TLR4(1:4000,Proteintech,66350-1-Ig,China),NF-κB(1:1,000,CST,8242s,United States),NLRP3(1:1000,CST,15101S),Caspase-1(1:1000,Proteintech,22915-1-Ig),ASC/TMS1(1:1000,proteintech,69494-1-Ig),iNOS(1:1,000,NOVCCS,NB300-605SS,美国)、COX-2(1:1,000,abcam,ab179800,UnitedStates),β-Actin(1:20,000,proteintech,66009-1-Ig,China)。然后，将PVDF膜与二抗在室温下孵育2小时。最后用PBS洗膜3次，用Immobilon Western Chemiluminescent HRPSubstrate显像目的蛋白，用化学发光成像系统捕获印迹图像。

SPR分析：

TLR4/CD284蛋白(Sinobiological，中国)溶解在乙酸钠(25μg/mL，pH 4.5)中，按照厂家的操作规程，用胺偶联的方法固定在CM5传感器芯片上，NADD用含5％二甲基亚砜的PBS缓冲液溶解，注入TLR4蛋白传感器表面(结合和解离时间分别为180s和200s，流速为30μL/min)。

分子对接：

TLR4/M2复合物的晶体结构从RCSB蛋白数据库(PDBID：2Z66)中获得。然后选择最优的晶体结构分辨率。使用薛定谔软件对NADD与TLR4/M2进行对接分析。利用薛定谔的蛋白质晶体结构、三维结构、天然配体的再生状态、氢键分配优化、NADD能量最小化和水去除。最后，根据已知的配体相互作用图模块进行分子相互作用。

统计分析：

所有这些实验均重复3次，所有这些数据均采用SPSS 26进行分析，采用平均±标准差(SD)的单因素方差分析。当p值<为0.05时，认为差异有统计学意义。

实施例2实验结果

1.NADD可抑制由LPS刺激的炎症反应

NADD从Isariacicadaas中提取得到(图1A)。BV-2小胶质细胞用不同浓度的NADD联合或不联合LPS处理24h后，显微镜观察其形态，并进行CCK8检测，收集细胞上清，测定NO和促炎因子的产生。结果显示，无论LPS是否激活BV-2细胞，NADD对细胞活力均无抑制作用(图1B),并且NADD呈浓度梯度依赖性抑制BV-2细胞的活化(图2A-B)，NADD以浓度依赖性的方式抑制炎症信息NO的产生(图2C)。此外，NADD还呈浓度依赖性抑制了IL-6和TNF-α等促炎因子的产生(图2D-E)。这些结果表明，NADD可以抑制炎症信号和促炎因子。

2.NADD抑制炎症调节因子的产生或表达

发明人对ROS、iNOS和COX-2的水平进行了检测。随后进行NADD治疗，与LPS组相比，ROS产生以剂量依赖性方式减少(图3A和3B)。逆转录-聚合酶链式反应的结果表明，随着NADD浓度的增加，NADD下调iNOS的mRNA水平(图3C)。蛋白质印迹结果显示NADD以剂量依赖性方式显著降低iNOS和环氧合酶2(COX-2)的蛋白质水平(图3D和3E)。

3.NADD在体内的抗炎作用：

发明人检测了LPS刺激的斑马鱼中ROS的产生。结果显示，NADD处理以剂量依赖性的方式显著降低了ROS的绿色荧光信号(图4A和4B)。这些结果与体外ROS的测定结果一致。

4.NADD抑制TLR4/NF-κB通路

发明人检测了NADD给药后BV-2细胞中NF-κB的核易位以及TLR4和NF-κB的蛋白质水平。结果表明，NADD以剂量依赖性方式显着抑制NF-κB的激活(图5A和5B)。此外，蛋白质印迹结果显示，与LPS组相比，NADD显著抑制TLR4和NF-κB的蛋白质表达(图5C和5D)。

5.NADD抑制NLRP3/Caspase-1通路

发明人通过蛋白质印迹和逆转录-聚合酶链式反应检测了该通路中蛋白质的变化。结果表明，LPS显著增加了NLRP3和ASC的蛋白质表达,以及Caspase-1的激活(图6A-D)，并增加了IL-1β的转录水平(图6E)。然而，当NADD处理BV-2小胶质细胞24h时，NLRP3和ASC的蛋白水平在浓度梯度上显着降低(图6A-D)，并且IL-1β的转录水平呈剂量依赖性降低方式也是如此(图6E)。这些结果表明NADD通过NLRP3/Caspase-1途径抑制神经炎症。

6.NADD对TLR4蛋白具有亲和力

NADD通过SPR和分子对接将TLR4与LPS竞争性结合。SPR结果表明NDAA对TLR4蛋白表现出亲和力，KD值为8.8μM(图7A)。此外，对接结果显示gscore为-6.119，分子对接分析表明NADD可以与TLR4/MD-2的口袋对接，与ARG-96、SER-98、CYS-105等多种氨基酸相互作用,ARG-106,HIS-179,预测NADD可以直接与TLR4/M2复合物结合,阻止M2蛋白与TLR4受体结合(图7B),这一结果与SPR测定的结果一致。发明人的研究数据表明，NADD可能通过与LPS竞争性结合TLR4/MD-2来抑制神经炎症反应，其中主要通过阻止LPS与MD-2的结合而发挥作用。

综上所述，NADD具有抑制神经炎症的作用。具体表现为：NADD可抑制LPS诱导的小胶质细胞炎症反应、抑制炎症调节因子的产生或表达。其作用机制主要为NADD与TLR4相互结合从而抑制下游炎症相关信号通路(TLR4/NF-κB信号通路)以及通过抑制NLRP3信号通路起到抑制神经炎症的作用。应用SPR技术和分子对接技术，发现NADD对TLR4蛋白表现出亲和力，说明NADD的作用靶点为TLR4。

Claims

1.一种乙酰多巴胺多聚体及其衍生物在制备预防和/或治疗神经炎症的药物中的应用。

2.一种乙酰多巴胺多聚体及其衍生物在制备预防和/或治疗神经退行性疾病的药物中的应用。

3.权利要求1所述的应用或权利要求2所述的应用，其特征在于，所述乙酰多巴胺多聚体及其衍生物由乙酰多巴胺及乙酰多巴胺盐聚合而成，所述乙酰多巴胺及乙酰多巴胺盐选自：乙酰多巴胺、乙酰多巴胺盐酸盐、乙酰多巴胺硫酸盐、乙酰多巴胺硝酸盐、乙酰多巴胺氢溴酸盐、乙酰多巴胺磷酸盐、乙酰多巴胺甲酸盐、乙酰多巴胺乙酸盐、乙酰多巴胺丙酸盐、乙酰多巴胺苹果酸盐、乙酰多巴胺乳酸盐、乙酰多巴胺柠檬酸盐、乙酰多巴胺抗坏血酸盐、乙酰多巴胺钠盐和乙酰多巴胺钾盐中的一种或两种以上的组合。

4.权利要求1所述的应用或权利要求2所述的应用，其特征在于，所述乙酰多巴胺多聚体及其衍生物选自：乙酰多巴胺二聚体、三聚体、四聚体和五聚体中的一种或两种以上的组合；

优选地，所述乙酰多巴胺多聚体为N-乙酰多巴胺二聚体。

5.权利要求2所述的应用，其特征在于，所述神经退行性疾病包括慢性神经退行性疾病和/或急性神经退行性疾病，所述慢性神经退行性疾病选自：抑郁症、精神分裂症、阿尔茨海默病(AD)、帕金森病、多发性硬化症(MS)、亨廷顿病(HD)、肌萎缩性侧索硬化(ALS)、脊髓小脑共济失调(SCA)、术后认知功能障碍(POCD)、脊髓损伤(SCI)和AIDS痴呆综合征(ADC)中的一种，所述急性神经退行性疾病选自：脑缺血、脑损伤和癫痫中的一种。

6.权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的神经退行性疾病为慢性神经退行性疾病，优选地，所述的慢性神经退行性疾病为阿尔茨海默病(AD)和/或帕金森病。

7.权利要求1所述的应用，其特征在于，所述预防和/或治疗神经炎症包括降低神经炎症的强度和/或缩短神经炎症的持续时间。

8.权利要求1所述的应用，其特征在于，所述神经炎症为急性神经炎症和/或慢性神经炎症。

9.权利要求1所述的应用，其特征在于，所述神经炎症为慢性神经炎症。

10.权利要求1所述的应用或权利要求2所述的应用，其特征在于，所述药物的剂型选自：片剂、丸剂、粉剂、颗粒剂、胶囊剂、锭剂、糖浆剂、溶液剂、乳剂、混悬剂、控制释放制剂、气雾剂和膜剂中的一种。