CN109715158A - 用于治疗核糖体障碍和核糖体病的钙调蛋白抑制剂、Chk2抑制剂和RSK抑制剂 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于治疗核糖体障碍和核糖体病(例如Diamond Blackfan贫血(DBA))的方法、组合物和试剂盒。在一些实施方式中，本发明涉及新型化合物(即RSK(p90S6K)抑制剂；p70S6K抑制剂；以及rps6抑制剂)在治疗核糖体障碍和核糖体病方面的用途。在一些实施方式中，本发明涉及特定Chk2抑制剂在治疗核糖体障碍和核糖体病(例如DBA)方面的用途以及特定吩噻嗪衍生物在治疗核糖体障碍和核糖体病(例如DBA)方面的用途。

Description

用于治疗核糖体障碍和核糖体病的钙调蛋白抑制剂、Chk2抑 制剂和RSK抑制剂
相关申请的交叉引用
本申请要求2016年7月13日提交的名称为“CALMODULIN INHIBITORS,CHK2INHIBITORS AND RSK INHIBITORS FOR THE TREATMENT OF RIBOSOMAL DISORDERSAND RIBOSOMAPATHIES”的美国临时专利申请No.62/361,631的权益和优先权，在此通过整体引用的方式将其并入本文。
政府支持
本发明部分地是在美国国立卫生研究院(National Institutes of Health)基金号NHLBI 5U01 HL10001-02的美国政府的支持下完成。美国政府享有本申请的一定权利。
技术领域
总体而言，本发明涉及用于治疗核糖体障碍(ribosomal disorder)和核糖体病(ribosomopathy)(例如Diamond Blackfan贫血(DBA))的方法、组合物和试剂盒。在一些实施方式中，本发明涉及新型化合物(即RSK(p90S6K)抑制剂；p70S6K抑制剂；以及rps6抑制剂)在治疗核糖体障碍和核糖体病方面的用途。在一些实施方式中，本发明涉及特定Chk2抑制剂在治疗核糖体障碍和核糖体病(例如DBA)方面的用途以及特定吩噻嗪衍生物在治疗核糖体障碍和核糖体病(例如DBA)方面的用途。
背景技术
Diamond Blackfan贫血(DBA)是一种先天性贫血，通常在一岁之前出现在儿童中(Vlachos等，2008)。这些患者的主要症状是红系分化阻断和造血干细胞(HSC)中可能的缺陷，并且一些患者还具有颅面畸形。核糖体蛋白S19(RPS19)是DBA患者中发现突变的首个基因(Draptchinskaia等，1999)。对患者样品进行的测序在超过50％的患者中鉴定出大(60s)亚基核糖体蛋白或小(40s)亚基核糖体蛋白的突变(Vlachos等，2010)，最近鉴定出的是rps29的突变。对于这些突变，患者是杂合型的，始终保持受影响的核糖体蛋白基因的野生型拷贝。
核糖体蛋白敲低导致游离核糖体蛋白增加。一些核糖体蛋白(包括RPL11和RPL5)因其能够结合MDM2并使MDM2与p53隔离可阻止p53的降解(Fumagalli等，2009)。已经证明了RPL26因其可结合p53mRNA(增加p53mRNA的翻译)，从而通过另一种机制增加p53蛋白(Tagaki等，2005)。p53活化在DBA发病机制以及其中核糖体基因及相关基因突变的其它疾病(目前称为核糖体病)中起重要作用。这包括其中RPS14的一个拷贝丢失的5q-骨髓增生异常综合征(5q-myelodysplastic syndrome)。p53活化也是骨髓衰竭障碍(bone marrowfailure disorder)(例如Fanconi贫血)中的常见特征(Ceccaldi等，2012)。在人CD34+细胞中，RPS19敲低导致p53活化(Ebert等，2005；Flygare等，2005)，伴随在红系细胞中的积聚增加。p53抑制可挽救分化缺陷(Dutt等，2011)。RPS19突变或敲低的小鼠模型具有造血缺陷，该造血缺陷可通过p53突变而得以挽救(McGowan等，2008；Jaako等，2011)。Rps19在斑马鱼胚胎中被吗啉基靶向，并且rpl11突变型斑马鱼中的造血缺陷通过p53敲低而得以挽救(Danilova等，2008；Torihara等，2011；Danilova等，2011)。
核糖体蛋白突变在患有Diamond Blackfan贫血(DBA)的患者中是常见的，所述患者具有红细胞再生障碍(red cell aplasia)和颅面畸形。本发明人先前已描述了具有造血缺陷和内皮缺陷的斑马鱼突变体rps29(rps29是小亚基中的核糖体蛋白)(Taylor等，2012)。Rps29-/-胚胎具有头部形态缺陷以及减少的造血干细胞、血红蛋白和内皮标志物的染色。与DBA的其它模型一致，敲低p53近乎完全挽救了rps29突变体表型。
本发明人先前已证明了Rps29-/-胚胎在动脉特化(arterial specification)方面具有缺陷，导致受精后24小时(hpf)的节间血管(intersegmental vessel)中的减少的flk1表达和减少的HSC。因为rps29-/-胚胎具有较少的血红蛋白，原始红细胞生成也受到影响。这些胚胎还具有增加的细胞凋亡(特别是在头部)并且在受精后5天(dpf)死亡。p53途径在胚胎中被激活，并且p53突变挽救了所有的造血表型和细胞凋亡表型。使用该模型系统，本发明人发现钙调蛋白(CAM)抑制剂和Ca2+抑制剂可挽救Rps29-/-表型，并且可用于治疗核糖体障碍或核糖体病，例如Diamond Blackfan贫血(DBA)(参见例如美国公开2015/0265627)。
虽然在鉴定治疗用的化合物方面取得了重大进展，但对于核糖体障碍或核糖体病(例如，核糖体蛋白突变)、特别是对于DBA而言，目前的治疗选择远远不是最佳的。因此，发现用于与核糖体障碍或核糖体病(例如核糖体蛋白突变)相关的此类疾病的新的、有效的且靶向的疗法仍然是当务之急。特别地，本领域迫切需要用小分子药物治疗DBA的改善方法。
发明内容
总体而言，本发明针对用于治疗核糖体障碍和核糖体病(例如，Diamond Blackfan贫血(DBA))的方法、组合物和试剂盒。在一些实施方式中，本发明涉及新型化合物(即，RSK(p90S6K)抑制剂，例如SL和SK；和p70S6K抑制剂，例如PF；以及rps6抑制剂)在治疗核糖体障碍和核糖体病方面的用途。在一些实施方式中，本发明涉及特定Chk2抑制剂(例如CCT和III)用于治疗核糖体障碍和核糖体病(例如DBA)的用途。在一些实施方式中，本发明涉及以下特定吩噻嗪衍生物在治疗核糖体障碍和核糖体病(例如DBA)方面的用途：例如，奋乃静(PerSucc)、或ACV、或221E、或DB-4-088-2(088-2)、或DB-4-088-3(088-3)、或DB-4-086(086)、或DB-4-087-2(087-2)、或DB-4-087-3(087-3)、或DB-4-089(089)。
具体而言，本发明部分地基于以下发现：RSK信号传导在核糖体蛋白缺乏细胞(例如，RPA19缺乏细胞)中被上调。本发明人发现CD34+细胞中的RPS19缺乏时，RSK被激活，并且RSK(p90s6K)抑制剂以及p70s6K抑制剂增加rps29-/-斑马鱼胚胎(核糖体蛋白缺陷的体内模型)中的血红蛋白(Hb)。本发明人进一步确定，特定的先前未公开的Chk2抑制剂(即CCT和III)挽救rps29-/-胚胎中的Hb。
另外，本发明人鉴定出特别擅于挽救rps29-/-斑马鱼胚胎中的形态缺陷以及造血缺陷和内皮缺陷的特定的、先前未公开的吩噻嗪衍生物，例如ACV、22E1、PerSucc、DB-4-088-2(088-2)、DB-4-088-3(088-3)和DB-4-089(089)。吩噻嗪衍生物DB-4-088-2(088-2)有利地在行为筛选中不改变斑马鱼的行为，吩噻嗪衍生物DB-4-089在低浓度下增加Hb以及增加红系分化。吩噻嗪衍生物化合物DB-4-083(083)、DB-4-084(084)和DB-4-086(086)在与DB-4-089相同的低浓度下不增加Hb。
在某些实施方式中，用于治疗核糖体障碍和核糖体病(例如DBA)的吩噻嗪化合物是式(I)化合物及其异构体和药学上可接受的盐：
其中：
X为O或S；
R1为H、烷基、烯基、炔基、环基(cyclyl)、杂环基、酰基、芳基、杂芳基、烷基杂芳基或烷基芳基；
R各自独立地为H、卤素、烷基、烷基、烯基、炔基、卤代烷基、CN、OH、NH2、烷基氨基、二烷基氨基、CO2H、酰基、SH、硫代烷氧基、SO2H或SO3H。参见本文中标题为吩噻嗪化合物的部分。
在一些实施方式中，用于治疗核糖体障碍和核糖体病(例如DBA)的吩噻嗪化合物是式II的化合物及其异构体和药学上可接受的盐：
其中：
R21各自独立地选自于由如下所组成的组：H、卤素、烷基、卤代烷基、CN、OH、NH2、烷基氨基、二烷基氨基、CO2H、酰基、SH、硫代烷氧基、SO2H和SO3H。参见本文中标题为吩噻嗪化合物的部分。
在一个实施方式中，用于治疗核糖体障碍和核糖体病(例如DBA)的吩噻嗪化合物是具有如下结构的化合物：
因此，RSK信号传导的抑制剂(例如，RSK p90s6K和p70s6K的抑制剂、rsp6抑制剂)以及本文所公开的特定吩噻嗪衍生物和(CaM)抑制剂化合物(例如BABTA)可在用于治疗患有如下疾病的受试者的方法中使用：核糖体蛋白障碍或核糖体病，例如Diamond Blackfan贫血(DBA)和其它核糖体病(例如脊髓发育不良，包括人受试者中的5q-脊髓发育不良、Shwachman-Diamond综合征和Treacher Collins综合征)。
因此，本发明的一方面涉及治疗患有核糖体障碍或核糖体病的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者给予有效量的RSK(p90S6k)抑制剂，以在所述受试者中的红系细胞、红系分化细胞或CD34+细胞的至少一种中减少RSK(p90s6K)的活性和减少活性p53(active p53)。在一个实施方式中，p90S6k抑制剂抑制选自于由RSK1、RSK2和RSK3所组成的组中的变体。在一个实施方式中，p90s6K抑制剂选择性地抑制RSK2。任何p90s6K抑制剂在本发明的方法中都是有用的，例如，所述抑制剂可为核酸(例如DNA或RNA(如RNAi或shRNA等))、或小分子化合物、或蛋白质(例如肽或抗体、或抗体片段)。在一个实施方式中，p90S6k抑制剂是选自于由如下所组成的组的化合物：SL0101(SL)或SL的衍生物或类似物；BI-D1870(BI)或BI的衍生物或类似物；或者SK或该化合物的衍生物或类似物。
在本发明的另一方面，提供了治疗患有核糖体障碍或核糖体病的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者给予有效量的p70S6K抑制剂，以在所述受试者中的红系细胞、红系分化细胞或CD34+细胞的至少一种中减少p70S6K的活性和减少活性p53。任何p70S6K抑制剂在本发明的方法中都是有用的，例如，所述抑制剂可为核酸(例如DNA或RNA(如RNAi、或shRNA等))，或者可为小分子化合物、或蛋白质(例如肽或抗体或其片段)。在一个实施方式中，p70S6k抑制剂是化合物PF-4708671(PF)或该化合物的衍生物或类似物。
在另一方面，提供了治疗患有核糖体障碍或核糖体病的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者给予有效量的Chk2抑制剂，以在所述受试者中的红系细胞、红系分化细胞或CD34+细胞的至少一种中减少活性p53，其中，所述Chk2抑制剂包括选自于由CCT和III所组成的组中的化合物或其衍生物。
在又一方面，提供了治疗患有核糖体障碍或核糖体病的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者给予有效量的钙调蛋白抑制剂，以在所述受试者中的红系细胞、红系分化细胞或CD34+细胞的至少一种中减少活性p53；其中，所述钙调蛋白抑制剂是吩噻嗪化合物、或所述吩噻嗪化合物的衍生物或类似物；其中，所述吩噻嗪化合物选自于由如下所组成的组：ACV-1-235(ACV)、JJM-II-221E(221E)、DB1026(PerSucc)、DB-4-088-2(088-2)、DB-4-088-3(088-3)、DB-4-086(086)、DB-4-087-2(087-2)、DB-4-087-3(087-3)、DB-4-089(089)、或式I化合物或式II化合物。
另一方面提供的是治疗患有核糖体障碍或核糖体病的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者给予有效量的钙通道阻滞剂BAPTA-AM或其衍生物或类似物，以在至少一种CD34+细胞中减少活性p53。
在本发明所有方面的一些实施方式中，所述方法包括对患有核糖体障碍的受试者进行治疗，其中，所述受试者具有Diamond Blackfan贫血(DBA)或遗传性幼红细胞减少症(inherited erythroblastopenia)，例如，其中所述受试者具有DBA1、DBA2、DBA3、DBA4、DBA5、DBA6、DBA7或DBA8。在一些实施方式中，患有核糖体障碍的受试者具有核糖体蛋白19(RPS19)突变。在可替代的实施方式中，患有核糖体障碍的受试者具有核糖体蛋白突变，所述核糖体蛋白来自于如下中的至少一种(但不限于)：RPS7、RPS10、RPS19、RPS24、PRS26、RPS17、PRS27L RPS29.RPL35A、PRL5和PPL11。
在一些实施方式中，患有核糖体障碍的受试者具有核糖体蛋白突变，所述核糖体蛋白选自于由如下所组成的组：rPL2A、rPL2B、rPL3、rpL4A、rPL4B、rPL7A、rPL7B、rPL10、rPL11、rPL16A、rPL17A、rPL17B、rPL18A、rPL18B、Rpl19A、rPL19、rPL25、rPL29、rpL31A、rpL31B、rPL36A、rPL40A、rPS1A、rPS6A、rPS6B、rPS14A、rPS15、rPS19、rPS23B、rPS25A、rPS26B、rPS29、rPS29B以及rPS31。
在本发明所有方面的一些实施方式中，所述方法进一步包括给予另一种治疗性试剂以治疗核糖体蛋白缺陷，所述治疗性试剂选自于由如下所组成的组：皮质类固醇(corticosteroids)、输血和本领域普通技术人员已知的其它治疗。
在本发明所有方面的一些实施方式中，向所述受试者给予的抑制剂增加所述受试者中的CD71+红系细胞的数量和/或增加所述受试者中的血红蛋白水平。
在本发明所有方面的一些实施方式中，本文所公开的方法和抑制剂可用于治疗患有核糖体障碍(如具有颅面畸形和/或巨红细胞性贫血(macrocytic anemia)症状的DBA)的受试者。
在本发明所有方面的一些实施方式中，本文所公开的方法和抑制剂可用于治疗患有核糖体病(如5q-脊髓发育不良)的受试者，例如，其中所述受试者具有Rps14突变或Rps14表达减少。在一些实施方式中，患有5q-脊髓发育不良的受试者具有发育不良的骨髓。
在本发明所有方面的一些实施方式中，本文所公开的方法和抑制剂可用于治疗患有核糖体病(如Shwachman-Diamond综合征)的受试者，例如，其中所述受试者具有Sbds突变。在一些实施方式中，患有Shwachman-Diamond综合征的受试者具有选自如下的一种或多种症状：胰功能不全、骨髓功能障碍、骨骼畸形。
在本发明所有方面的一些实施方式中，本文所公开的方法和抑制剂可用于治疗患有核糖体病(如TreacherCollins综合征)的受试者，例如，其中所述受试者具有TCOF1(核仁)突变。在一些实施方式中，患有Treacher Collins综合征的受试者具有一种或多种颅面缺损。
在一些实施方式中，本发明还提供了在本文所公开的用于治疗患有核糖体蛋白障碍或疾病或核糖体病的受试者的方法中使用的试剂盒，所述试剂盒包含组合物，所述组合物包含本文所公开的抑制剂。
附图说明
本专利或申请文件含有至少一幅以彩色绘制的附图。官方将根据请求以及必要费用的支付提供具有彩色附图的本专利或专利申请公开的副本。
图1示出了与Diamond Blackfan贫血(DBA)相关的临床特征、治疗和遗传学。一半以上的患者具有核糖体蛋白基因突变(所有突变均是杂合的)。没有可用于这些患者的有效的、靶向的治疗。
图2是示出其它核糖体病的图表，最常见的是MDS的5q-亚型。我们发现的在我们的DBA模型中起作用的任何药物也将有助于患有其它核糖体病的患者。
图3是核糖体蛋白缺乏的分子后果的示意图。核糖体生物发生的破坏通过游离核糖体蛋白的积聚导致p53活化，所述游离核糖体蛋白结合并隔离p53的负调节因子MDM2。这使得活性p53在细胞核中积聚，然后活性p53可激活p53的下游靶标(如p21和GADD45)。
图4A-图4B是斑马鱼照片。图4A示出了通过联苯胺染色(其对血红蛋白(Hb)进行染色)的缺少显示，具有rps29突变的斑马鱼具有减少的cmyb(造血标志物)、flk1(内皮血管标志物)表达，并且是贫血的。这些核糖体蛋白鱼模拟DBA(Taylor,A.M.等，(2012).Exp.Hematol.40,228-237.e5.；Mirabello,L.等，(2014).Blood 124,24-32)。图4B示出了经挽救的表型的斑马鱼照片。与DBA的其它动物模型一致，将rps29突变体与p53突变体杂交挽救了这些表型，说明了造血缺陷和内皮缺陷是通过p53介导的。
图5A和图5B示出了斑马鱼照片以及可在我们的DBA模型中挽救Hb缺陷的新的化合物的结构。特定Chk2抑制剂CCT和III可在鱼中挽救Hb。图5A：A-3、W-7、CCT和III挽救的斑马鱼照片。图5B：通过化学筛选鉴定出在rps 29-/-胚胎中挽救Hb的化合物TFP、A-3、W-7、CCT和III的化学结构。
图6示出了钙调蛋白功能的简易示意图。钙调蛋白：1)在进化上是保守的；2)在细胞中是丰富的；3)是Ca2+传感器；4)与蛋白质相互作用；5)激活激酶/磷酸酶；6)CaM抑制剂是FDA批准的抗精神病药；7)三氟拉嗪(TFP)。
图7A-图7C是示出我们的抑制剂在DBA的人体外模型中的结果的示意图和图。图7A示意图：将脐带血来源的CD34+细胞培养扩增4天，然后用含有针对RPS19或荧光素酶(作为对照)的发夹的慢病毒进行感染。进行选择3天后，将细胞移至红系分化培养基中并与药物一起孵育直至第12天。然后收获细胞用于流式细胞术分析和RNA。在第12天，RPS19缺乏细胞仅有40％的红系前体细胞，而我们的对照细胞有70％的红系前体细胞。图7B：TFP处理后第12天的红系前体细胞％。用TFP处理增加了CD71+细胞的百分比。RPS19缺乏增加了p21 mRNA水平。图7C是TFP处理后p21水平的图。用TFP进行的处理剂量依赖性地减少p21 mRNA。用我们的Chk2抑制剂我们也见到了这一点(数据未示出)。因此，CAM抑制剂挽救DBA的人体外模型并降低p53靶基因的表达。
图8A-图8D是示出TFP在DBA诱导型小鼠模型(使用dox诱导型RPS19敲低小鼠模型)(Jaako,P.等，(2011).Blood 118,6087-6096)中部分地拯救挽救贫血的示意图和图。图8A：程序示意图。对WT小鼠进行辐射并向其移植来自供体小鼠的骨髓(含有针对RPS19的dox诱导型发夹)。植入后，给小鼠喂食dox以诱导Rps19缺乏，并将小鼠每隔一天用TFP处理2周。2周后，收集血液和骨髓用于分析。图8B：p21 mRNA水平的图。使用p21 mRNA水平测量小鼠骨髓中p53的活性，Rps19缺乏小鼠具有增加的p21 mRNA水平。用TFP处理小鼠减少了小鼠中的p21 mRNA水平。图8C：红细胞数量图。图8D：血红蛋白水平图。用TFP处理RPS19缺乏的小鼠显著增加了红细胞数量和血红蛋白水平。因此，在斑马鱼化学筛选中发现的化合物能够挽救DBA的人体外模型和哺乳动物体内模型。
图9A-图9C示出了示意图和图。图9A：野生型P53和缺失调控区的p53(p53reg)的示意图。图9B：程序示意图。将Saos2细胞(无p53细胞)用p53构建体瞬时转染，并用载剂(vehicle)或20μM TFP处理24小时。通过由qPCR测量的TFP降低p21 mRNA水平的能力，来评估p53上的TFP活性。图9C是p21 RNA表达图。由于我们的化合物减少了p53活性，我们想确定p53负责CaM抑制剂活性的区域。核定位序列的突变对TFP活性没有影响，而且TFP并不抑制p53形成四聚体的能力。接下来，将p53的c-末端的30个氨基酸(363-393)移除。该构建体是p53-reg。我们发现p53的调控区(REG)对TFP活性而言是必需的。
图10A至图10C示出了说明CaM抑制剂和Chk2抑制剂降低S392磷酸化的示意图、图和凝胶。图10A是保守的调控区磷酸化位点的示意图。图10B是无偏质谱分析图，该图寻找在CaM抑制剂TFP或Chk2抑制剂BML的存在下经改变的p53的翻译后修饰。将293T细胞用标记有GFP的WT-p53转染，并用TFP或BML处理3小时。使用针对GFP的抗体对p53进行免疫沉淀，并进行质谱分析。令人惊讶的是，发现在TFP和BML的存在下仅有1个残基被差异磷酸化。通过两种不同的质谱方法(常规质谱或通过对肽进行TMT标记)，我们发现在两种情况下在经TFP和BML处理的样品中，含有磷酸化丝氨酸392的肽的百分比均被降低(图10B)。还注意到该丝氨酸在斑马鱼和小鼠中均是保守的(图10A)。图10C是说明磷酸化减少的蛋白质印迹。丝氨酸6和丝氨酸315经鉴定是磷酸化的，但含有这些磷酸化的肽的百分比并未随TFP或BML处理而变化。
图11A至图11C是说明p53S392磷酸化模拟物阻止TFP降低p53活性的示意图和图。为了确认CaM抑制剂阻断p53磷酸化的能力的重要性，我们通过用天冬氨酸替换S392来建立磷酸化模拟物p53(其模拟组成型磷酸化)。我们还生成了对照磷酸化模拟物p53(其中用天冬氨酸替换S15)。该突变体应当对TFP降低p53活性的能力没有影响。图11A是用于测试这些突变体的实验的示意图，我们将WT p53、S15D和S392D瞬时转染到Saos2细胞中并用载剂或TFP处理细胞。为了评估p53的活性，我们检查了p21和MDM2的mRNA水平。图11B是p21表达图。图11C是MDM2 mRNA表达图。在含有WT p53或S15D p53的细胞中，TFP能够降低p21和MDM2的水平。然而，在含有p53 S392D的细胞中，TFP不能降低p21和MDM2的水平。确认了阻断S392磷酸化对TFP的活性而言是重要的。
图12示出了CaM抑制剂和Chk2抑制剂的体外激酶活性的抑制百分比的图。我们想知道CaM抑制剂和Chk2抑制剂是否阻断特定激酶。磷酸化S392的已知激酶是CK2和p38。然而，这些激酶的抑制剂并未在rps29-/-鱼中挽救Hb。因此，问题变成了TFP在上游抑制的是什么？它是否抑制磷酸化S392的激酶？我们使用Thermo Fisher的SelectScreen对CaM抑制剂和Chk2抑制剂进行了激酶性能分析(Kinase profiling)。通过对100种激酶进行筛选，我们发现多种CaM抑制剂和Chk2抑制剂均在核糖体s6蛋白激酶家族p70S6K和p90S6K(RSK)中阻断多种激酶的活性。
图13示出了CaM抑制剂和Chk2抑制剂对RSK家族成员(RSk1(p90S6K)、RSK2(p90S6K)、RSK3(p90S6K)、RSK4(p90S6K))和p70S6K的体外激酶活性的抑制百分比的图。
图14是示出CaM在翻译和RSK途径中起作用的文献证据的示意图。引用了以下文献：RSK inhibitors were found in a screen of 23K shRNAs for p53 inhibitorsthat reduce p53 activity(p21 levels)but not protein levels Berns,K.等，(2004).Nature 428,431–437；Increased Calcium or ionomycin treatment causes sustainedRSK activation Chuderland,D.,Marmor,G.,Shainskaya,A.和Seger,R.(2008).J.Biol.Chem.283,11176–11188；AA acids activate mTOR through Ca/CaM signalingGulati,P.等，(2008).Cell Metabolism 7,456–465；RSK2 and 3 are elevated inrps29-/-microarray compared to WT/HET and p70S6K,downstream of mTOR and RSK,can phosphorylate p53 S392 Ci,Y.等，(2014).Cell Death and Disease 5,e1542–10。我们假设RP缺乏增加RSK信号传导，并且CaM抑制剂和Chk2抑制剂阻断来自RSK的下游信号传导，我们想知道在核糖体蛋白缺乏期间RSK活性是否增加。
图15A-图15B是说明相比于rps29+/+胚胎，Rps29-/-胚胎具有增加水平的RSK(p90S6k)、p70s6K和RPS6的凝胶和图表。(磷酸化RSK抗体在斑马鱼中不起作用)。图15A：胚胎裂解物的凝胶。将整个胚胎在RIPA缓冲液中裂解并在10％SDS-PAGE凝胶上电泳。泳道1：WT＝WT/rps29+/-48hpf胚胎裂解物。泳道2：MU＝rps29-/-48hpf胚胎裂解物。图15B：对24hpf的WT和rps29-/-胚胎进行比较的微阵列，鉴定出RSK2是最差异表达的基因，其平均倍数变化值超过WT胚胎的1.6倍。为了比较，将对于p53和MDM2而言的平均倍数变化值(已知在rps缺乏期间是高的)包括在内。
图16A-图16C：RSK抑制剂和p70S6K抑制剂增加rps29-/-胚胎中的Hb。图16A：胚胎vs.SL1010的Hb水平％的条形图。图16B：胚胎vs.SL1010的Hb水平％的条形图。图16C：代表性斑马鱼图像；SL＝RSK抑制剂；PF＝p70S6K抑制剂；FLU＝CaM抑制剂。CaM抑制剂氟奋乃静(fluphenazine，FLU)比单独的RSK抑制剂或p70S6K抑制剂更好地进行挽救。
图17A-图17C是说明CaM抑制剂和Chk2抑制剂在RP缺乏期间选择性地阻断p70S6K的磷酸化的示意图和凝胶。图17A示意图：我们使用293T细胞，并使用针对RPS19或Luc(对照)的shRNA诱导核糖体蛋白缺乏。图17B：说明在核糖体蛋白缺乏期间TFP和BML选择性地抑制p70S6K的磷酸化的凝胶。这些抑制剂增加了ERK的磷酸化，这一点用RSK抑制剂也是可见到的。图17C：Luc shRNA和RPS10 shRNA对磷酸化的S392的作用的凝胶。CaM抑制剂和Chk2抑制剂抑制人细胞中的核糖体s6激酶家族。RSK抑制剂通过负反馈回路增加ERK磷酸化。因此，TFP和BML以相同的方式相似的影响ERK。
图18是人细胞中测定RSK活化的示意图。血液领域中最相关的体外模型是原代人细胞-例如外周血单核细胞(PBMC)。
图19A-图19B示出了在CD34细胞中当RPS19缺乏时RSk被激活。图19A：示出了来自RPS19缺乏的CD34细胞的TFP处理的结果的磷酸化的凝胶，说明在RPS19敲低细胞中RSK被激活以及RPS6磷酸化增加。图19B：RP缺乏的示意图。TFP处理降低P-RPS6和P-p53S392和p53的总水平。
图20是示出p-70S6K在10分钟内在S392处直接使p53磷酸化的凝胶。使用重组活性p70S6K或RSK并将其与重组p53和ATP结合，我们见到仅p70S6K可在S392处磷酸化p53。与ATP孵育30分钟后，RSK没有使p53磷酸化。S15、S20和S315未被p70S6K磷酸化，而RSK1/RSK2/RSK3在相同条件下没有使p53磷酸化(数据未示出)。
图21是我们当前模型的示意图：在RP缺乏期间，没有足够的功能性核糖体也没有足够的翻译。细胞尝试使翻译上调(特别是在RBC中，当它们需要制造大量珠蛋白时)。为了补偿，RSK轴在RP缺乏期间更加活跃，以试图获得更多的翻译。钙需要CaM来激活许多激酶并用于mTOR轴和RSK轴两者的信号传导。不受理论的束缚，我们提出CaM抑制剂通过结合于可利用的CaM并因此阻断信号传导从而抑制这些激酶。Chk2抑制剂直接作用于对RSK和p70S6K的抑制(通过我们的体外激酶性能分析得以示出)。
图22A和图22B示出了说明在RP缺乏细胞中细胞内Ca2+水平增加，而螯合作用降低p70S6K和RS6的磷酸化的图和凝胶。在我们的体外激酶性能分析中，并不是所有的CaM抑制剂都直接抑制RSK或p70S6K。我们假设CaM抑制是间接的，钙信号传导需要CaM。图22A：细胞裂解物中钙的图，使用比色(colormetric)钙检测试剂盒，我们测量了细胞裂解物中钙的量，并发现具有RPS19敲低的细胞具有增加水平的钙，并且用钙螯合剂BAPTA-AM处理这些裂解物能够降低钙的水平。图22B是磷酸化的凝胶，我们示出了细胞中的螯合钙使p70S6K和RPS6的磷酸化降低，与我们的CaM抑制剂(TF)相似。RSK抑制剂：SL和B1。P70s6K抑制剂：PF。综上所述，我们示出了：1)CaM抑制剂和Chk2抑制剂在核糖体蛋白缺乏期间更大程度地降低了p53的S392磷酸化；2)CaM抑制剂和Chk2抑制剂在RP缺乏期间也更大程度地减少了P-p70S6K；3)p70S6K在体外可直接使p53S392磷酸化；4)在RP缺乏期间，RSK、p70S6K和rps6的总蛋白水平在体外和体内均有所增加；5)在我们的微阵列中，RSK2在rps20-/-vs WT的24hpf胚胎中增加；蛋白质验证了该上调；6)在RP缺乏期间，钙水平增加；7)阻断CaM-钙信号传导(CaM抑制剂)或直接抑制RSK或p70S6K(Chk2抑制剂)使得P-p53和p53活性减少。降低的p53活性使得更少的RBC经历细胞凋亡，从而缓解贫血。
图23是说明经FDA批准的吩噻嗪(如奋乃静和氟奋乃静)增加贫血的rps29-/-斑马鱼胚胎中的Hb的条形图。然而，长期暴露于吩噻嗪与负面的神经性副作用有关。因此，我们想筛选吩噻嗪衍生物。我们的理论基础：吩噻嗪损害斑马鱼的自发活动(locomotoractivity)(Boehmler W等，Genes,Brain and Behavior.(2007))，我们需要一种将不进入脑的化合物，其他人生成吩噻嗪衍生物并且存在用行为排除的针对BBB的高通量筛选。
图24是生成吩噻嗪衍生物的示意图，使用2种一般的合成方法生成待测试的化合物。合成1：化合物保留活性化学型(吩噻嗪环系)并在远离脂肪族哌嗪的容许位点系统性地进行多样化。简而言之，我们使用高效且高度并行的偏向文库策略。合成2：聚焦文库以探索三环环系周围的对于生物活性的决定因素。
图25A-图25D是说明所合成的两种样品衍生物增加rps29-/-胚胎中的Hb的条形图和斑马鱼照片：奋乃静succ(Perphenazine succ，PerSucc)参见图25A，ACV参见图25C。图25B：与DMSO胚胎相比的经Persucc处理的胚胎。图25D：与DMSO胚胎相比的经ACV处理的胚胎。
图26是行为跟踪板的样品照片。使用6dpf WT斑马鱼，96孔板的每个孔1只鱼。将药物递送至养鱼的水中，我们向孔中加入药物并跟踪运动2小时。然后我们使用Matlab算法来定量运动。药物：奋乃静Succ(PerSucc)：221E和ACV。黄色方块突出了游泳非常不规律的代表性的鱼。
图27A-图27C是记录2小时内鱼活动的热图。221E(图21B)和Persucc(图21C)是药物。DMSO是对照载剂(图21A)。
图28A-图28B是总结了在静息时(图28A)或活动时(图28B)在PerSucc的加入下的鱼在2小时内的运动的图形数据。经PerSucc处理的鱼比经DMSO处理的鱼更不活跃且静息更多。
图29A-图29B是总结了在静息时(图29A)或活动时(图29B)在ACV的加入下的鱼在2小时内的运动的图形数据。经ACV处理的鱼比经DMSO处理的鱼更加活跃且静息更少。
图30A-图30B是总结了在静息时(图30A)或活动时(图30B)在221E的加入下的鱼在2小时内的运动的图形数据。经221E处理的鱼具有更不规律的活动，因为它们比经DMSO处理的鱼静息更少且移动更多。它们停下来然后非常快速地移动，然后停下来并再做一次。因此，行为研究代表了可区分斑马鱼运动的强大且快速的测定：更多和更少的活动vs.不规律，并且每次处理只需8条鱼即可获得统计数据。
图31示出了在本发明的一些实施方式中使用的化合物的化学结构。
图32示出了特定吩噻嗪衍生物的化学结构。
图33示出了特定吩噻嗪衍生物的化学结构。注意缩写化合物名称为例如DB-4-083＝083。
图34A-图34B是血红蛋白水平的评分方法的斑马鱼照片。野生型水平(图34A)。高水平、中水平和低水平显示在(图34B)中。
图35A和图35B是示出各种吩噻嗪衍生物对rps-/-胚胎中的Hb水平的作用的条形图。图35A：083、084、086和087-2的作用。图35B：087-3、088-2、088-3和089的作用。
图36A-图36D是在DMSO或药物下的运动次数的图。图36A：氟奋乃静。图36B：Ch2抑制剂。图36C：083。图36D：083的化学结构。083减少斑马鱼的运动。
图37A-图37D是在DMSO或药物下的运动次数的图。图36A：氟奋乃静。图37B：Ch2抑制剂。图37C：088-2。图37D：088-2的化学结构。088-2没有改变斑马鱼的运动。
图38A-图38D是在DMSO或药物下的运动次数的图。图38A：氟奋乃静。图38B：Ch2抑制剂。图38C：089。图38D：089的化学结构。089改变斑马鱼的运动。
图39A-图39D是在DMSO或药物下的运动次数的图。图39A：氟奋乃静。图39B：Ch2抑制剂。图39C：088-3。图39D：088-3的化学结构。088-3改变斑马鱼的运动。
图40是在DBA的人体外模型中对新的吩噻嗪衍生物进行测试的示意图。用RPS19-GFP shRNA转导原代人外周血单核细胞(PBMC)以产生核糖体蛋白缺乏。将细胞转移至红系分化培养基中并用药物处理一次，持续5天。将细胞收获并通过针对CD71+细胞的流式细胞术针对红系前体细胞进行分析。
图41：如图40中所示的在各种吩噻嗪衍生物的存在下针对CD71+细胞的流式细胞图。
图42是描绘红系细胞相比于经DMSO处理的细胞的绝对数量的条形图。吩噻嗪衍生物增加红系细胞的绝对数量。
图43：包括吩噻嗪衍生物对Hb、行为和红细胞(RBC)分化的作用的简要总结的图表。
具体实施方式
本发明部分地基于以下发现：RSK信号传导在核糖体蛋白缺乏细胞(例如，RPA19缺乏细胞)中被上调。本发明人发现在CD34细胞中一旦RPS19缺乏，RSK被激活，并且RSK(p90s6K)抑制剂以及p70s6K抑制剂增加rps29-/-斑马鱼胚胎(核糖体蛋白缺陷体内模型)中的血红蛋白(Hb)。本发明人进一步确定了Chk2抑制剂挽救rps29-/-胚胎中的Hb。
因此，本发明涉及新型化合物(即，RSK(p90S6K)抑制剂，例如SL；p70S6K抑制剂，例如PF；和rps6抑制剂)在治疗核糖体障碍和核糖体病方面的用途。在一些实施方式中，本发明涉及特定Chk2抑制剂(即CCT和III)用于治疗核糖体障碍和核糖体病(例如DBA)的用途。在一些实施方式中，本发明涉及以下特定吩噻嗪衍生物在治疗核糖体障碍和核糖体病(例如DBA)方面的用途：例如，PerSucc、ACV和221E、DB-4-088-2(088-2)、DB-4-088-3(088-3)、DB-4-086(086)、DB-4-087-2(087-2)、DB-4-087-3(087-3)、DB-4-089(089)、三氟化取代基衍生物、或式I化合物或式II化合物。
为了方便起见，此处收集了在申请文件、实施例和所附权利要求中本文中所用的若干术语。除非另有说明或在上下文中有所暗示，下列术语和短语包括下文提供的含义。除非另有明确说明或从上下文中可明显看出，下列术语和短语不排除该术语或短语在其所属领域所获得的含义。提供所述定义以辅助描述具体实施方式，而由于本发明的范围仅受权利要求所限，因此并不旨在限制所请求保护的发明。除非另有定义，本文中使用的所有技术术语和科学术语具有与该发明所属技术领域中的普通技术人员通常认为的含义相同的含义。
定义
提及基因表达而在本文中所使用的术语“调控(regulate)”是指对例如基因表达产生作用。在一些实施方式中，所述作用可以是刺激性的，例如增加基因表达。在一些实施方式中，所述作用可以是抑制性的，例如减少基因表达。术语“调控”和“调节(modulate)”在本文中可互换使用。
本文中可互换使用的术语“钙调蛋白抑制剂(calmodulin inhibitor)”一般是指抑制钙调蛋白的活性或表达的试剂或分子。钙调蛋白抑制剂可以是合成来源或生物来源的。它们可以是抑制钙调蛋白的有机或无机分子、或肽、抗体或反义RNA。本发明的钙调蛋白的抑制剂是可抑制钙调蛋白的表达和/或钙调蛋白的生物活性的化学实体或分子，例如先前已确定在治疗核糖体障碍方面是有用的TFP和FLU的化合物、其前药、衍生物和药学上可接受的盐(参见美国公开2015/0265627)。用于监测钙调蛋白活性的测定法是本领域已知的，参见例如美国公开2015/0265627。在本文中，本发明人已鉴定出特别擅于治疗核糖体障碍的先前未公开的化合物，例如，ACV、221E和PerSucc、DB-4-088-2(088-2)、DB-4-088-3(088-3)、DB-4-086(086)、DB-4-087-2(087-2)、DB-4-087-3(087-3)、DB-4-089(089)、三氟化取代基衍生物、或式I化合物或式II化合物(参见图25和图32)。
在本文中也称为“r-蛋白”的术语“核糖体蛋白(ribosomal protein)”是指与蛋白质合成有关的任何细胞内核糖核蛋白颗粒；它们由可逆的可解离单元组成并且发现结合至细胞膜或游离在细胞质中。它们可单独存在或成簇存在(多核糖体(polyribosome))。它们可单独存在或成簇存在(称为多核糖体或多聚核糖体(polysome)，其为由mRNA连接的核糖体并积极参与蛋白质合成)。核糖核蛋白(经常称为“RNPs”)在蛋白质合成中是重要的；它们由两个(一个大的(L)和一个小的(S))可逆的可解离单元组成(在真核生物中也称为60S亚基和40S亚基(细菌中为50S和30S))。该术语包括连同rRNA一起构成参与细胞翻译过程的核糖体亚基的任何蛋白质。该术语涵盖核糖体的小(S)亚基和大(L)亚基的蛋白质。由于核糖体的RNA部分和蛋白质部分与来自酵母和细菌的核糖体生物发生机制的高度保守性，关于这些有机分子的大部分知识来自于大肠杆菌(E.coli)核糖体的研究，并且其也适用于人。在大肠杆菌核糖体的小(30S)亚基中，表示为S4、S7、S8、S15、S17、S20的蛋白质独立地结合至16S rRNA。在组装这些初级结合蛋白后，S5、S6、S9、S12、S13、S16、S18和S19结合至生长中的核糖体。这些蛋白质还增强了S2、S3、S10、S11、S14和S21的加入。蛋白质与螺旋连接的结合对启动RNA的正确三级折叠和组织整体结构而言是重要的。几乎所有的蛋白质都含有一个或多个球状结构域。而且，几乎所有都含有长的延伸部(extension)，所述延伸部可在深至远处的区域接触RNA。蛋白质的碱性残基产生额外的稳定性，这是因为碱性残基中和RNA骨架的电荷排斥。还存在蛋白质-蛋白质相互作用，以通过静电相互作用和氢键相互作用将结构固定在一起。理论研究指出在组装过程期间蛋白质结合对结合亲和力的关联作用[2]。
术语“核糖体障碍(ribosomal disorder)”或“核糖体蛋白障碍(ribosomalprotein disorder)”是指与核糖体蛋白的突变功能和/或异常功能相关的疾病或障碍。其可包括与正常健康对照受试者相比，归因于核糖体蛋白突变的疾病、或归因于核糖体蛋白水平减少或功能部分丧失的疾病、或者可替代地，归因于核糖体蛋白水平增加的疾病。术语核糖体障碍包括核糖体蛋白的遗传疾病，包括但不限于Diamond Blackfan贫血(DBA)、脊髓发育不良、Shwachman-Diamond综合征(SDS)和Treachers Collins综合征(TCS)。
术语“核糖体病(ribosomopathy/ribosomopathies)”是指核糖体的任何疾病或机能不良(malfunction)。核糖体是在所有细胞中均发现的小细胞器，其通过翻译信使RNA参与蛋白质的产生。核糖体的疾病或机能不良包括：(i)核糖体生物发生蛋白疾病；(ii)小核仁核糖核蛋白疾病；以及(iii)核糖体蛋白疾病(如上文在“核糖体蛋白障碍”定义中所讨论的)，并且全部综述在Freed等，Mol.Biosyst.2010；6(3)；481-493；标题为“When ribosomesgo bad:diseases of ribosome biogenesis”中(以引用的方式将其整体并入本文)。核糖体生物发生蛋白疾病包括但不限于：Treachers Collins综合征(TCS)，归因于UTP14c突变的男性不育症；美国本土印第安儿童肝硬化(native American indian childhoodcirrhosis，NAIC)；Bowen-Conradi综合征(BCS)；脱发神经性缺陷和内分泌腺病综合征(ANE综合征)；shwachman-dimaond综合征(SDS)；原发性开角型青光眼(POAG)的候选基因和I型神经纤维瘤病(NF1)调节剂。小核仁核糖核蛋白疾病包括但不限于：Anauxetic发育不良(AD)、软骨毛发发育不良(也称为干骺端软骨发育不良，McKusick型；CCH)、无少毛症的干骺端发育不良(metaphyseal dysplasia without hypotrichosis，MDWH)、先天性角化不良(也称为Zinzzer-Engman-Cole综合征)、Hoyeraal-Hreidarsson综合征(其中一些病例是先天性角化不良的严重变型)以及Prader-Willi综合征(PWS)。
本文所使用的术语“衍生物(derivative)”是指在结构上与可被称为“母体”化合物的另一物质(即“原始”物质)相关的化学物质。“衍生物”可在一个或多个步骤中从结构上相关的母体化合物制成。衍生物的一般物理性质和化学性质也与母体化合物相似。
术语“功能性衍生物”和“模拟物(mimetic)”在本文中可互换使用，并且是指具有与实体或分子的生物活性基本上相似的生物活性(特别是功能性生物活性)的化合物，正因如此该化合物是所述实体或分子的功能性衍生物。术语功能性衍生物旨在包括分子的片段、变体、类似物或化学衍生物。在一些实施方式中，钙调蛋白抑制剂的功能性衍生物和功能性类似物(例如，TFP、A-3、W-7、A-7、W-5和CGS-9343的功能性类似物)可使用本文所公开的测定法针对它们的生物活性进行评估，其中抑制钙调蛋白的衍生物和类似物将被认为是此类钙调蛋白抑制剂的功能性衍生物或功能性类似物。
本文所使用的术语“类似物”是指保留与分子或化学品或多肽相同或基本上相似的生物学功能(即，抑制钙调蛋白)和/或结构的试剂，如此该试剂是所述分子或化学品或多肽的类似物。类似物的实例包括肽模拟物(肽类似物)、肽核酸(核酸类似物)、有机或无机小化合物和有机或无机大化合物，以及本文中多肽或核酸的衍生物和变体。
当用于定义抑制剂(例如p90S6k抑制剂、或p70S6K抑制剂、或Chk2抑制剂、或钙调蛋白抑制剂)的衍生物或类似物的生物活性相比于抑制剂(所述衍生物或类似物是该抑制剂的衍生物或类似物)的生物活性时，术语“基本上相似(substantially similar)”意味着具体衍生物或类似物通过一个或多个基团或元素(包括元素组的取代、删除或添加)在化学结构上与初始母体抑制剂不同，其净效果是保留在初始母体抑制剂中发现的关于抑制激酶或其它RSK、Chk2活性和/或表达的生物活性的至少部分。功能性衍生物或类似物的此种对生物活性的抑制可由本领域普通技术人员使用本领域熟知的测定法(例如测量底物的磷酸化的体外激酶测定法)进行评估。
术语“组织”旨在包括完整的细胞、血液、血液制剂(如血浆和血清)、骨骼、关节、肌肉、平滑肌以及器官。
术语“受试者”包括接受预防性或治疗性治疗的人和其它哺乳动物受试者。术语“受试者”和“个体”在本文中可互换使用，并且是指向其提供根据本发明的细胞的治疗(包括预防性治疗)的动物(例如人)。本发明的“非人动物”包括哺乳动物(如大鼠、小鼠、兔、绵羊、猫、狗、牛、猪和非人灵长类动物)。
在本文中可互换使用的术语“参比样品”或“参比水平”是指条件的阴性对照。例如，在治疗的上下文中，参比水平是如果受试者未进行治疗的水平。在一些实施方式中，在诊断的上下中的参比水平是正常健康受试者中存在的水平。术语“正常健康受试者”是指没有任何疾病或障碍的症状、或未被鉴定为患有任何疾病或障碍、或未在进行任何药物治疗的受试者，或者由医生基于体检鉴定为健康的受试者。在一些实施方式中，本文所使用的参比水平或样品是指在受试者接受治疗之前的时间点测量的水平。
关于疾病或障碍的治疗可互换使用的术语“治疗(treat/treatment/treating)是指预防疾病的发展、或改变疾病的进程(例如，但不限于减缓疾病的进展)、或逆转疾病的症状或降低受试者中的一种或多种症状和/或一种或多种生化标志物、预防一种或多种症状恶化或进展、促进恢复或改善处于该疾病风险的受试者的预后、以及减缓或降低现有疾病的进展。术语治疗涵盖降低或缓解与不适当的核糖体蛋白功能相关的病症、疾病或障碍的至少一种不良作用或症状。如在本文中关于核糖体蛋白障碍所使用的，术语治疗用于指使核糖体蛋白障碍的症状和/或生化标志物降低至少10％(例如使受试者CD34+细胞中的p21和/或p53的水平降低，或者使血红蛋白回到正常水平，或者使颅面畸形恢复或预防)。例如但不限于，使受试者CD34+细胞中的p21和/或p53的水平降低10％(仅作为说明性的实例)将被认为是通过本文所公开的方法的有效治疗。
如本文所使用的，术语“治疗”包括预防进展和/或降低或逆转与核糖体蛋白障碍或核糖体病(例如DBA)相关的病症、疾病或障碍的至少一种不良作用或症状。因此，在一些实施方式中，就完全或部分预防核糖体蛋白障碍或核糖体病的疾病或体征或症状而言，治疗可以是预防性的。例如，对于已知具有核糖体蛋白突变、或者可替代地具有低表达水平的特定核糖体蛋白的受试者，可对其进行预防性治疗，以预防与核糖体蛋白中此种突变和/或核糖体蛋白中减少的水平相关的一种或多种症状的发作。在一些实施方式中，可向已接受与核糖体蛋白障碍相关的疾病的先前治疗的受试者给予预防性治疗。例如，对于已接受用于DBA治疗的皮质类固醇或输血和/或其它先前治疗以稳定其DBA的受试者，可对其进行预防性治疗(例如用本文所公开的钙调蛋白抑制剂和/或钙通道阻滞剂)。
如本文所用的，术语“预防(prevent/preventing/prevention)”是指避免或延迟疾病或障碍的一种或多种症状或可测量标志物的表现。症状或标志物表现的延迟是相对于对照或具有相似的发展出该疾病或障碍的可能性或易感性的未经治疗的受试者中表现此种症状或标志物的时间的延迟。相对于对照或具有相似的发展出该疾病或障碍的可能性或易感性的未经治疗的受试者中出现的那些症状或标志物而言，或者相对于基于受该疾病或障碍影响的群体的组织学或统计学测量可能出现的症状或标志物而言，术语“预防”不仅包括症状或标志物的完全避免或预防，还包括此类症状或标志物中任何一种的降低的严重性或程度。“降低的严重性”意味着使症状或可测量的疾病标志物的严重性或程度相对于对照或参比降低至少10％，例如，至少15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或甚至100％(即没有症状或可测量标志物)。
术语“预防性(prophylactic)”或“治疗性”治疗是指将一种或多种主题组合物给予宿主。如果在不想要的病症(例如，宿主动物的疾病或其它不想要的状态)的临床表现之前进行给予，则所述治疗是预防性的(即，它使宿主免于发展出不想要的病症)；而如果在不想要的病症表现之后进行给予，则所述治疗是治疗性的(即，它旨在缩小、减轻或维持现有的不想要的病症或来自其的副作用)。
如本文所使用的，提及RNAi分子(例如siRNA或miRNA)的活性的“基因沉默(genesilencing/gene silenced)”是指使细胞中的靶基因(例如p90S6k基因或p70S6K基因)的mRNA水平减少了在miRNA或RNA干扰分子不存在的情况下的细胞中发现的mRNA水平的至少约5％、约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％、约99％、约100％。在一个优选的实施方式中，mRNA水平减少了至少约70％、约80％、约90％、约95％、约99％、约100％。
如本文所使用的，术语“RNAi”是指干扰RNA的任何类型，包括但不限于siRNAi、shRNAi、内源性微小RNA以及人工微小RNA。例如，RNAi包括先前被鉴定为siRNA的序列，而不管该RNA的下游加工机制(即，虽然认为siRNA具有引起mRNA裂解的体内加工的特定方法，但是可将此类序列并入本文所述的侧翼序列的上下文中的载体中)。术语“RNAi”不仅可包括基因沉默RNAi分子，而且还包括激活基因表达的RNAi效应分子。仅仅作为实例，在一些实施方式中，用来抑制或基因沉默的RNAi试剂可用于本文所公开的方法、试剂盒和组合物中以抑制RSK(p70S6K和p90S6K)基因。
如本文所使用的，“siRNA”是指形成双链RNA的核酸，当所述siRNA在同一细胞中作为靶基因存在或表达时，该双链RNA具有降低或抑制基因或靶基因表达的能力。双链RNA(siRNA)可由互补链形成。在一个实施方式中，siRNA是指可形成双链siRNA的核酸。siRNA的序列可对应于全长靶基因或其亚序列(subsequence)。通常而言，siRNA的长度为至少约15个-50个核苷酸(例如，双链siRNA的每个互补序列的长度为约15个-50个核苷酸，而且双链siRNA的长度为约15个-50个碱基对，优选为约19个-30个碱基核苷酸，优选长度为约20个-25个核苷酸；例如长度为20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、或30个核苷酸)。
如本文所使用的，“shRNA”或“小发夹RNA”(也称为茎环)是siRNA的一种类型。在一个实施方式中，这些shRNA由如下组成：短的(例如约19个-约25个核苷酸)反义链，然后是约5个-约9个核苷酸的核苷酸环和类似的有义链。可替代地，所述有义链可在所述核苷酸环结构之前，所述反义链可在所述核苷酸环结构之后。
本文可互换使用的术语“微小RNA”或“miRNA”是内源性RNA，已知其中一些在转录后水平上调控蛋白质编码基因的表达。内源性微小RNA是基因组中天然存在的小RNA，其能够调节mRNA的生产利用。术语人工微小RNA包括除内源性微小RNA以外的能够调节mRNA的生产利用的任何类型的RNA序列。微小RNA序列已在以下的出版物中得以描述：例如Lim等，Genes&Development,17,p.991-1008(2003)；Lim等，Science 299,1540(2003)；Lee和Ambros Science,294,862(2001)；Lau等，Science 294,858-861(2001)；Lagos-Quintana等，Current Biology,12,735-739(2002)；Lagos Quintana等，Science 294,853-857(2001)；以及Lagos-Quintana等，RNA,9,175-179(2003)，通过引用的方式将它们并入。多个微小RNA也可并入前体分子中。此外，出于通过miRNA和/或RNAi途径调节内源基因的表达的目的，可将miRNA样茎环作为递送人工miRNA和短干扰RNA(siRNA)的载剂在细胞中表达。
如本文所使用的，“双链RNA”或“dsRNA”是指由两条链组成的RNA分子。双链分子包括由其折回至自身以形成双链结构的单链RNA分子组成的那些双链分子。例如，产生单链miRNA的祖分子(称为pre-miRNA；Bartel等，2004.Cell 116:281-297)的茎环结构包含dsRNA分子。
本文所使用的术语“基因”可为基因组基因，所述基因组基因包含转录和/或翻译调控序列、和/或编码区、和/或非翻译序列(例如，内含子、5’-非翻译序列和3’-非翻译序列以及调控序列)。基因的编码区可为编码氨基酸序列或功能性RNA(例如tRNA、rRNA、催化性RNA、siRNA、miRNA和反义RNA)的核苷酸序列。基因也可为对应于编码区(例如外显子和miRNA，任选地包含与其连接的5’-非翻译序列或3’-非翻译序列)的mRNA或cDNA。基因也可为在体外产生的经扩增的核酸分子，所述核酸分子包含编码区的全部或部分和/或与其连接的5’-非翻译序列或3’-非翻译序列。
如本文所使用的术语“基因产物”是指包括转录自基因的RNA，或由基因编码或翻译自RNA的多肽。
本文使用的术语“下降(lower)”、“降低(reduced/reduction)”、或“减少(decrease)”、“下调(down-regulate)”或“抑制(inhibit)”通常都意味着减少统计学显著的量。然而，为避免任何疑义，“下降(lower)”、“降低(reduced/reduction)”、或“减少(decrease)”或“抑制(inhibit)”意味着相对于参比水平至少10％的，例如至少约20％、或至少约30％、或至少约40％、或至少约50％、或至少约60％、或至少约70％、或至少约80％、或至少约90％、或上至并包括减少100％的减少(即相对于参比样品的缺乏水平)、或相对于参比水平在10％到100％之间的任意减少。当在基因或蛋白质(例如钙调蛋白)的活性或表达水平的上下文中使用“减少”或“抑制”时，其是指在细胞、细胞提取物或细胞上清液中蛋白质或核酸水平或活性的降低。例如，此种减少可归因于降低的RNA稳定性、转录或翻译，增加的蛋白质降解或RNA干扰。在一些实施方式中，如本文所公开的为小分子的钙调蛋白抑制剂可减少钙调蛋白的活性或表达。优选地，该减少为在对照条件下活性或表达水平的至少约5％、至少约10％、至少约25％、至少约50％、至少约75％、至少约80％、或甚至至少约90％。提及钙调蛋白在本文中所使用的术语“水平”是指钙调蛋白的表达或活性。
本文所使用的术语“上调(up-regulate)”、“增加(increase)”或“活化/激活(activate)”通常都意味着以统计学显著的量的增加；为避免任何疑义，术语“上调”、“增加”或“更高”意味着相对于参比水平至少10％的，例如至少约20％、或至少约30％、或至少约40％、或至少约50％、或至少约60％、或至少约70％、或至少约80％、或至少约90％的增加、或100％的增加或更多的增加、或相对于参比水平在10％到100％之间的任意增加；或相对于参比水平大于100％的增加，例如，至少约2倍、或至少约3倍、或至少约4倍、或至少约5倍的增加、或至少约10倍的增加、或在2倍和10倍之间的任意增加、或是更大的增加。当在基因或蛋白质的表达或活性的上下文中使用“增加”时，其指的是在细胞、细胞提取物或细胞上清液中蛋白质或核酸的水平或活性的正向变化。例如，这种增加可归因于增加的RNA稳定性、转录或翻译，或减少的蛋白质降解。优选地，该增加为比对照条件下的活性或表达水平增加至少5％、至少约10％、至少约25％、至少约50％、至少约75％、至少约80％、至少约100％、至少约200％、或甚至约500％或更多。
术语“显著不同于(significantly different than)”、“统计学显著(statistically significant)”和类似的短语是指数据或其它测量值之间的比较，其中两个比较个体或组之间的差异对受训练的观测者而言是明显或合理不同的，或是统计学显著的(如果该短语包括术语“统计学”或者如果存在统计学检验的某些指征(例如p值)，或者如果数据在分析时通过本领域已知的标准统计学检验产生统计学差异)。
“药物组合物”是指适用于给予至哺乳动物受试者的化学或生物组合物。可对此类组合物进行特别地配制，以用于通过多种途径中的一种或多种进行给予，所述多种途径包括但不限于：口服、肠胃外、静脉内、动脉内、皮下、鼻内、舌下、脊柱内、脑室内等。
术语“有效量”与术语“治疗有效量”可互换使用，并且是指处于实现期望的治疗结果(例如降低或阻止核糖体障碍或核糖体病的至少一种症状(例如受试者CD34+细胞中高水平的p53和/或p21的症状))所需的时间段和剂量下的药物组合物的至少一种试剂(例如，钙调蛋白抑制剂和/或钙通道阻滞剂)的量。例如，将使用本文所公开的方法的有效量认为是足够使核糖体障碍或核糖体病的症状降低至少10％的量。本文所使用的有效量还将包括足够预防或延迟疾病症状的发展、改变症状疾病的进程(例如但不限于，减缓疾病症状的进展)、或逆转疾病的症状的量。因此，本文所使用的术语“有效量”或“治疗有效量”是指为减轻核糖体障碍或核糖体病(例如DBA)的至少一种症状的药物组合物的治疗性试剂(例如，本文所公开的RSK p90和p70S6K的抑制剂和特定Chk2抑制剂和钙调蛋白抑制剂)的量。换句话说，本文所公开的抑制剂的“治疗有效量”是对例如核糖体障碍或核糖体病的症状发挥有益作用的钙调蛋白抑制剂或钙通道阻滞剂的量。作为单一剂量或多剂量给予个体的剂量将根据各种因素而变化，所述因素包括抑制剂的药代动力学性质、给药途径、受试者的状况和特征(性别、年龄、体重、健康、大小)、症状程度、并行治疗、治疗频率和期望效果。治疗有效量也是其中治疗性试剂的任何有毒或有害作用被治疗有益效果超过的量。各个个体案例中的有效量可由技术人员根据本领域已建立的方法凭经验确定，而无需过度的实验。一般而言，短语“治疗有效的”和“对治疗、预防或抑制有效的”旨在对本文所公开的抑制剂进行限定，所述抑制剂将实现使核糖体蛋白疾病或障碍或核糖体病的至少一种症状的严重性降低的目标。
本文使用的短语“药学上可接受的”是指在合理的医学判断范围内适于用于与人类和动物的组织相接触而没有过多的毒性、刺激、过敏反应或其它问题或并发症的、与合理的利益/风险比相称的那些化合物、材料、组合物和/或剂型。
本文所使用的术语“药学上可接受的载体(pharmaceutically acceptablecarrier)”意味着参与将主题试剂由身体的一个器官或部位运载或运输至身体的另一个器官或部位的药学上可接受的材料、组合物或载剂，如液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、溶剂或封装材料。在与制剂中的其它成分相容的意义上而言，每种载体都必须是“可接受的”。例如载体不会减少试剂对治疗的影响。换言之，载体是药学上不活泼的。术语“生理学上可耐受的载体”和“生物相容的递送载剂”可互换使用。
术语“给予/给药(administered)”和“受试(subjected)”在疾病或障碍的治疗的上下文中可互换使用。两个术语均指通过给药方法(如肠胃外给药或全身给药)用有效剂量的包含本发明抑制剂的药物组合物对受试者进行处理。
如本文所使用的，术语“烷基”意味着具有碳原子链的直链或支链的饱和脂肪族原子团。通常使用Cx烷基和Cx-Cy烷基，其中X和Y表示链中的碳原子数。例如，C1-C6烷基包括具有1个碳至6个碳的链的烷基(例如，甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、仲丁基、异丁基、叔丁基、戊基、新戊基、己基等)。连同另一个原子团表示的烷基(例如，如在芳基烷基中)意味着具有指定原子数的直链或支链的饱和烷基二价原子团，或者当没有指定原子时意味着是键。例如(C6-C10)芳基(C0-C3)烷基包括苯基、苄基、苯乙基、1-苯乙基、3-苯丙基等。烷基的主链可任选地插入一个或多个杂原子(如N、O或S)。
在优选的实施方式中，直链或支链烷基在其主链中具有30个以下的碳原子(例如，对于直链为C1-C30，对于支链为C3-C30)，并且更优选20个以下。同样地，优选的环烷基在其环结构中具有3个-10个碳原子，并且更优选在环结构中具有5个、6个或7个碳。在整个申请文件、实施例和权利要求中使用的术语“烷基”(或“低级烷基”)旨在包括“未取代的烷基”和“取代的烷基”，其中后者是指具有一个或多个取代基(在烃主链的一个或多个碳上取代氢)的烷基部分。
除非碳原子数另有说明，本文所使用的“低级烷基”意味着如上所定义的但在其主链结构中具有1个-10个碳、更优选1个-6个碳原子的烷基基团。同样地，“低级烯基”和“低级炔基”具有类似的链长。在整个申请中，优选的烷基基团是低级烷基。在优选的实施方式中，本文中认定为烷基的取代基是低级烷基。
取代的烷基的取代基可包括卤素、羟基、硝基、硫醇、氨基、叠氮基、亚氨基、酰胺基(amido)、磷酰基(包括膦酸酯/盐和亚膦酸酯/盐)、磺酰基(包括硫酸酯/盐、磺酰氨基、氨磺酰基和磺酸酯/盐)和甲硅烷基基团，以及醚、烷基硫醇、羰基(包括酮、醛、羧酸酯/盐和酯)、-CF3、-CN等。
如本文所使用的，术语“烯基”是指具有至少一个碳碳双键的直链、支链或环状的不饱和烃基原子团。通常使用Cx烯基和Cx-Cy烯基，其中X和Y表示链中的碳原子数。例如，C2-C6烯基包括具有1个-6个碳的链和至少一个双键的烯基(例如乙烯基、烯丙基、丙烯基、异丙烯基、1-丁烯基、2-丁烯基、3-丁烯基、2-甲基烯丙基、1-己烯基、2-己烯基、3-己烯基等)。连同另一个原子团表示的烯基(例如，如在芳基烯基中)是指具有指定原子数的直链或支链烯基二价原子团。烯基的主链可任选地插入一个或多个杂原子(如N、O或S)。
如本文所使用的，术语“炔基”是指具有至少一个碳碳三键的不饱和烃基原子团。通常使用Cx炔基和Cx-Cy炔基，其中X和Y表示链中的碳原子数。例如，C2-C6炔基包括具有1个-6个碳的链和至少一个三键的炔基(例如，乙炔基、1-丙炔基、2-丙炔基、1-丁炔基、异戊炔基、1,3-己二炔基、正己炔基、3-戊炔基、1-己烯-3-炔基等)。连同另一个原子团表示的炔基(例如，如在芳基炔基中)意味着具有指定原子数的直链或支链炔基二价原子团。炔基的主链可任选地插入一个或多个杂原子(如N、O或S)。
如本文所使用的，术语“卤素(halogen)”或“卤代/卤素(halo)”是指选自氟、氯、溴和碘的原子。术语“卤素放射性同位素”或“卤代同位素”是指选自氟、氯、溴和碘的原子的放射性核素。
作为单独的基团或大基团的部分，“卤素取代部分”或“卤代部分”意味着被一个或多个“卤素”原子取代的本文所述的脂肪族、脂环族或芳香族部分，正如此类术语在本申请中所定义的。
如本文所使用的，术语“卤代烷基”是指被一个或多个“卤素”原子取代的烷基。例如，卤素取代的烷基包括卤代烷基、二卤代烷基、三卤代烷基、全卤代烷基等(例如卤素取代的(C1-C3)烷基包括氯甲基、二氯甲基、二氟甲基、三氟甲基(-CF3)、2,2,2-三氟乙基、全氟乙基、2,2,2-三氟-1,1-二氯乙基等)。
术语“芳基”是指芳香族5元-8元单环、8元-12元稠合双环或11元-14元稠合三环环系。通常使用Cx芳基和Cx-Cy芳基，其中X和Y表示环系中的碳原子数。在一些实施方式中，每个环的1个、2个、3个或4个氢原子可被取代基取代。
术语“杂芳基”是指具有杂原子的芳香族5元-8元单环、8元-12元稠合双环或11元-14元稠合三环环系：如果是单环，具有1个-3个杂原子；如果是双环，具有1个-6个杂原子；或者如果是三环，具有1个-9个杂原子；所述杂原子选自O、N或S(例如，如果是单环、双环或三环，则分别为碳原子和1个-3个N、O或S杂原子、1个-6个N、O或S杂原子或1个-9个N、O或S杂原子)。通常使用Cx杂芳基和Cx-Cy杂芳基，其中X和Y表示环系中的碳原子数。在一些实施方式中，每个环的1个、2个、3个或4个氢原子可被取代基取代。
示例性的芳基基团或杂芳基基团包括但不限于：吡啶基、嘧啶基、呋喃基、噻吩基、咪唑基、噻唑基、吡唑基、哒嗪基、吡嗪基、三嗪基、四唑基、吲哚基、苄基、苯基、萘基、蒽基、甘菊环基(azulenyl)、芴基、茚满基、茚基、萘基、苯基、四氢萘基、苯并咪唑基、苯并呋喃基、苯并硫代呋喃基(benzothiofuranyl)、苯并噻吩基、苯并噁唑基、苯并噁唑啉基、苯并噻唑基、苯并三唑基、苯并四唑基、苯并异噁唑基、苯并异噻唑基、苯并咪唑啉基、咔唑基、4aH-咔唑基、咔啉基、色满基(chromanyl)、色烯基(chromenyl)、噌啉基(cinnolinyl)、十氢喹啉基(decahydroquinolinyl)、2H,6H-1,5,2-二噻嗪基、二氢呋喃[2,3b]四氢呋喃、呋喃基、呋吖基(furazanyl)、咪唑烷基、咪唑啉基、咪唑基、1H-吲唑基、吲哚烯基(indolenyl)、吲哚啉基、吲哚嗪基、吲哚基、3H-吲哚基、靛红酰基(isatinoyl)、异苯并呋喃基、异色满基、异吲唑基、异吲哚啉基、异吲哚基、异喹啉基、异噻唑基、异噁唑基、亚甲基二氧基苯基、吗啉基、萘啶基、八氢异喹啉基、噁二唑基、1,2,3-噁二唑基、1,2,4-噁二唑基、1,2,5-噁二唑基、1,3,4-噁二唑基、噁唑烷基、噁唑基、羟吲哚基、嘧啶基、菲啶基、菲咯啉基、吩嗪基、吩噻嗪基、吩噁噻基(phenoxathinyl)、吩噁嗪基、酞嗪基、哌嗪基、哌啶基、哌啶酮基、4-哌啶酮基、胡椒基、喋啶基、嘌呤基、吡喃基、吡嗪基、吡唑烷基、吡唑啉基、吡唑基、哒嗪基、吡啶并噁唑、吡啶并咪唑、吡啶并噻唑、吡啶基(pyridinyl/pyridyl)、嘧啶基、吡咯烷基、吡咯啉基、2H-吡咯基、吡咯基、喹唑啉基、喹啉基、4H-喹嗪基、喹喔啉基、奎宁环基、四氢呋喃基、四氢异喹啉基、四氢喹啉基、四唑基、6H-1,2,5-噻二嗪基、1,2,3-噻二唑基、1,2,4-噻二唑基、1,2,5-噻二唑基、1,3,4-噻二唑基、噻蒽基、噻唑基、噻吩基、噻吩并噻唑基、噻吩并噁唑基、噻吩并咪唑基、噻吩基和呫吨基等。
示例性杂芳基包括但不限于源自如下的杂芳基：苯并[b]呋喃、苯并[b]噻吩、苯并咪唑、咪唑并[4,5-c]吡啶、喹唑啉、噻吩并[2,3-c]吡啶、噻吩并[3,2-b]吡啶、噻吩并[2,3-b]吡啶、吲哚嗪、咪唑并[1,2a]吡啶、喹啉、异喹啉、酞嗪、喹喔啉、萘啶、喹嗪、吲哚、异吲哚、吲唑、吲哚啉、苯并噁唑、苯并吡唑、苯并噻唑、咪唑并[1,5-a]吡啶、吡唑并[1,5-a]吡啶、咪唑并[1,2-a]嘧啶、咪唑并[1,2-c]嘧啶、咪唑并[1,5-a]嘧啶、咪唑并[1,5-c]嘧啶、吡咯并[2,3-b]吡啶、吡咯并[2,3c]吡啶、吡咯并[3,2-c]吡啶、吡咯并[3,2-b]吡啶、吡咯并[2,3-d]嘧啶、吡咯并[3,2-d]嘧啶、吡咯并[2,3-b]吡嗪、吡唑并[1,5-a]吡啶、吡咯并[1,2-b]哒嗪、吡咯并[1,2-c]嘧啶、吡咯并[1,2-a]嘧啶、吡咯并[1,2-a]吡嗪、三唑并[1,5-a]吡啶、蝶啶、嘌呤、咔唑、吖啶、吩嗪、吩噻嗪(phenothiazene)、吩噁嗪、1,2-二氢吡咯并[3,2,1-hi]吲哚、吲哚嗪、吡啶并[1,2-a]吲哚、2-(1H)-吡啶酮、苯并咪唑基、苯并呋喃基、苯并硫代呋喃基、苯并噻吩基、苯并噁唑基、苯并噁唑啉基、苯并噻唑基、苯并三唑基、苯并四唑基、苯并异噁唑基、苯并异噻唑基、苯并咪唑啉基、咔唑基、4aH-咔唑基、咔啉基、色满基、色烯基、噌啉基、十氢喹啉基、2H,6H-1,5,2-二噻嗪基、二氢呋喃并[2,3b]四氢呋喃、呋喃基、呋吖基、咪唑烷基、咪唑啉基、咪唑基、1H-吲唑基、吲哚烯基、吲哚啉基、吲哚嗪基、吲哚基、3H-吲哚基、靛红酰基、异苯并呋喃基、异色满基、异吲唑基、异吲哚啉基、异吲哚基、异喹啉基、异噻唑基、异噁唑基、亚甲基二氧基苯基、吗啉基、萘啶基、八氢异喹啉基、噁二唑基、1,2,3-噁二唑基、1,2,4-噁二唑基、1,2,5-噁二唑基、1,3,4-噁二唑基、噁唑烷基、噁唑基、氧杂环庚烷基(oxepanyl)、氧杂环丁烷基(oxetanyl)、羟吲哚基、嘧啶基、菲啶基、菲咯啉基、吩嗪基、吩噻嗪基、吩噁噻基、吩噁嗪基、酞嗪基、哌嗪基、哌啶基、哌啶酮基、4-哌啶酮基、胡椒基、喋啶基、嘌呤基、吡喃基、吡嗪基、吡唑烷基、吡唑啉基、吡唑基、哒嗪基、吡啶并噁唑、吡啶并咪唑、吡啶并噻唑、吡啶基(pyridinyl/pyridyl)、嘧啶基、吡咯烷基、吡咯啉基、2H-吡咯基、吡咯基、喹唑啉基、喹啉基、4H-喹嗪基、喹喔啉基、奎宁环基、四氢呋喃基、四氢异喹啉基、四氢喹啉基、四唑基、6H-1,2,5-噻二嗪基、1,2,3-噻二唑基、1,2,4-噻二唑基、1,2,5-噻二唑基、1,3,4-噻二唑基、噻蒽基、噻唑基、噻吩基、噻吩并噻唑基、噻吩并噁唑基、噻吩并咪唑基、噻吩基和呫吨基等。一些示例性杂芳基基团包括但不限于：吡啶基、呋喃基(furyl/furanyl)、咪唑基、苯并咪唑基、嘧啶基、噻吩基(thiophenyl/thienyl)、哒嗪基、吡嗪基、喹啉基、吲哚基、噻唑基、萘啶基、2-氨基-4-氧代-3,4-二氢蝶啶-6-基、四氢异喹啉基等。
芳基和杂芳基可任选地在一个或多个位置被一个或多个取代基取代，所述取代基例如卤素、烷基、芳烷基、烯基、炔基、环烷基、羟基、氨基、硝基、巯基、亚氨基、酰胺基、磷酸酯/盐、膦酸酯/盐、亚膦酸酯/盐、羰基、羧基、甲硅烷基、醚、烷硫基、磺酰基、酮、醛、酯、杂环基、芳香族或杂芳族部分、-CF3、-CN等。
术语“环基”或“环烷基”是指具有3个-12个碳(例如3个-8个碳，以及例如3个-6个碳)的饱和和部分不饱和的环状烃基。通常使用Cx环基和Cx-Cy环基，其中X和Y表示环系中的碳原子数。环烷基基团可另外任选地被例如1个、2个、3个或4个取代基取代。C3-C10环基包括环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环己烯基、2,5-环己二烯基、环庚基、环辛基、双环[2.2.2]辛基、金刚烷-1-基、十氢萘基、氧代环己基、二氧代环己基、硫代环己基、2-氧代双环[2.2.1]庚-1-基等。
术语“杂环基”是指具有杂原子的非芳香族5元-8元单环、8元-12元双环或11元-14元三环环系：如果是单环，具有1个-3个杂原子；如果是双环，具有1个-6个杂原子；或者如果是三环，具有1个-9个杂原子；所述杂原子选自O、N或S(例如，如果是单环、双环或三环，则分别为碳原子与1个-3个N、O或S的杂原子，1个-6个N、O或S的杂原子或1个-9个N、O或S的杂原子)。通常使用Cx杂环基和Cx-Cy杂环基，其中X和Y表示环系中的碳原子数。在一些实施方式中，各个环的1个、2个或3个氢原子可被取代基取代。示例性杂环基基团包括但不限于：哌嗪基、吡咯烷基、二噁烷基、吗啉基、四氢呋喃基、哌啶基、4-吗啉基、4-哌嗪基、吡咯烷基、全氢吡咯嗪基、1,4-二氮杂全氢乙二酮基(1,4-diazaperhydroepinyl)、1,3-二噁烷基，1,4-二噁烷基等。
术语“双环”和“三环”是指通过单键稠合、桥接或连接的多环组装体。
如本文所使用的，术语“稠合环”是指当两个环共有的环原子彼此直接键合时与另一个环结合形成具有双环结构的化合物的环。常见稠合环的非排它性实例包括：十氢化萘、萘、蒽、菲、吲哚、呋喃、苯并呋喃、喹啉等。具有稠合环系的化合物可以是饱和的、部分饱和的、环基、杂环基、芳香族的、杂芳族的等。
术语“氰基”意味着原子团-CN。
术语“杂原子”是指不是碳原子的原子。杂原子的具体实例包括但不限于：氮、氧、硫和卤素。“杂原子部分”包括其中连接该部分的原子不是碳的部分。杂原子部分的实例包括-N＝、-NRN-、-N+(O-)＝、-O-、-S-或-S(O)2-、-OS(O)2-以及-SS-，其中RN是H或另外的取代基。
术语“羟基”意味着原子团-OH。
术语“硝基”意味着原子团-NO2。
如本文所使用的，术语“芳香族”意味着其中组成原子构成不饱和环系的部分，所述环系中的所有原子都是sp2杂化的并且π电子的总数等于4n+2。芳香环可为环原子仅为碳原子的那种(例如芳基)或可包含碳原子和非碳原子(例如杂芳基)。
如本文所使用的，术语“取代”是指用取代基对取代部分上的一个或多个(通常是1个、2个、3个、4个或5个)氢原子进行的独立的替换，所述取代基独立地选自于在以下“取代基”定义中列出的取代基的组或另外规定。一般而言，非氢取代基可以是可与指定被取代的给定部分的原子键合的任何取代基。取代基的实例包括但不限于：酰基、酰氨基(acylamino)、酰氧基、醛、脂环族、脂肪族、链烷磺酰氨基、链烷磺酰基、烷芳基、烯基、烷氧基、烷氧基羰基、烷基、烷基氨基、烷基氨甲酰基(arylcarbamoyl)、亚烷基(alkylene)、次烷基(alkylidene)、烷硫基、炔基、酰胺基、胺基、氨基、氨基、氨基烷基、芳烷基、芳烷基磺酰胺基、芳烃磺酰氨基、芳烃磺酰基、芳香族、芳基、芳基氨基、芳基氨甲酰基、芳氧基、叠氮基、氨甲酰基、羰基、羰基化合物(carbonyls)(包括酮、羧基、羧酸酯/盐)、CF3、氰基(CN)、环烷基、环亚烷基、酯、醚、卤代烷基、卤素、卤素、杂芳基、杂环基、羟基、羟基、羟烷基、亚氨基、亚氨基酮、酮、巯基、硝基、氧杂烷基、氧代、氧代烷基、磷酰基(包括膦酸酯/盐和亚膦酸酯/盐)、甲硅烷基、磺酰胺基、磺酰基(包括硫酸酯/盐、氨磺酰基和磺酸酯/盐)、硫醇和脲基部分；其各自也可任选地被取代或未被取代。在某些情况下，两个取代基连同它们连接的碳可形成环。
本文所使用的术语“烷氧基(alkoxyl/alkoxy)”是指具有与其连接的氧原子团的如上所定义的烷基基团。代表性的烷氧基基团包括甲氧基、乙氧基、丙氧基、叔丁氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、异丁氧基等。“醚”是通过氧共价连接的两种烃。因此，使此烷基成为醚的烷基的取代基是烷氧基或类似于烷氧基，例如所述烷氧基可由-O-烷基、-O-烯基和-O-炔基之一表示。芳氧基可由-O-芳基或O-杂芳基表示，其中芳基和杂芳基如下定义。烷氧基和芳氧基基团的烷基可如上文所述地进行取代。
如本文所使用的，术语“烷基芳基”是指被芳基基团取代的烷基基团。术语“烷基杂芳基”是指被杂芳基取代的烷基基团。
“烷硫基(alkylthio)”是指具有与其连接的硫原子团的如上所定义的烷基基团。在优选的实施方式中，“烷硫基”部分由-S-烷基、-S-烯基和-S-炔基之一表示。代表性的烷硫基基团包括甲硫基、乙硫基等。术语“烷硫基”还涵盖环烷基基团、烯烃基团和环烯烃基团和炔烃基团。“芳基硫基”是指芳基或杂芳基基团。
术语“酰基”是指烷基羰基、环烷基羰基、芳基羰基、杂环基羰基或杂芳基羰基取代基，其中任何一个可进一步被取代基取代。示例性的酰基基团包括但不限于：(C1-C6)烷酰基(例如甲酰基、乙酰基、丙酰基、丁酰基、戊酰基、己酰基、叔丁基乙酰基等)；(C3-C6)环烷基羰基(例如环丙基羰基、环丁基羰基、环戊基羰基、环己基羰基等)；杂环基羰基(如吡咯烷基羰基、吡咯烷-2-酮-5-羰基、哌啶基羰基、哌嗪基羰基、四氢呋喃基羰基等)；芳酰基(如苯甲酰基)和杂芳酰基(如噻吩基-2-羰基、噻吩基-3-羰基、呋喃基-2-羰基、呋喃基-3-羰基、1H-吡咯甲酰基-2-羰基、1H-吡咯甲酰基-3-羰基、苯并[b]噻吩基-2-羰基等)。另外，酰基基团的烷基、环烷基、杂环、芳基和杂芳基部分可以是各自定义中描述的基团中的任一种。
术语“烷基氨基”意味着具有至少一个与氮连接的直链或支链的不饱和脂肪族、环基或杂环基原子团的氮部分。术语“烷基氨基”包括“烯基氨基”、“炔基氨基”、“环基氨基”和“杂环基氨基”。术语“芳基氨基”意味着具有至少一个与氮连接的芳基原子团的氮部分。例如，-NH芳基和-N(芳基)2。术语“杂芳基氨基”意味着具有至少一个与氮连接的杂芳基原子团的氮部分。例如，-NH杂芳基和-N(杂芳基)2。任选地，两个取代基连同氮也可形成环。除非另有说明，本文所述的含有氨基部分的化合物可包括其经保护的衍生物。对于氨基部分而言合适的保护基包括乙酰基、叔丁氧基羰基、苄氧基羰基等。
术语“单烷基氨基或二烷基氨基”分别意味着-NH(烷基)或-N(烷基)(烷基)，例如-NHCH3、-N(CH3)2等。例如，代表性的氨基基团包括-NHCH3、-N(CH3)2、-NH(C1-C10烷基)、-N(C1-C10烷基)2等。
关于本文提供的所有定义，应当指出的是，所述定义应当解释为开放式的，就此而言，可包括超出所指定的取代基以外的其它取代基。因此，C1烷基表示存在一个碳原子但并未表示该碳原子上是何种取代基。因此，C1烷基包括甲基(即-CH3)以及-CRaRbRc，其中Ra、Rb和Rc可各自独立地为氢或者其中碳的α位原子为杂原子或氰基的任何其它取代基。因此，CF3、CH2OH和CH2CN均为C1烷基。
除非另有说明，本文描绘的结构意图包括仅区别于一个或多个富含同位素的原子的存在的化合物。例如，除了用氘或氚替换氢原子或用富含13C-或14C-的碳替换碳原子之外，具有本发明结构的化合物均在本发明的范围内。
如本文所使用的，“药学上可接受的盐”旨在涵盖以其盐的形式利用的本文所述的任何化合物，特别是该盐赋予该化合物相比于该化合物的游离形式或该化合物的不同的盐形式而言的改善的药代动力学性质。药学上可接受的盐形式也可最初赋予化合物其先前并不具有的期望的药代动力学性质，并且甚至可积极地影响该化合物关于其体内治疗活性的药效学。可有利地被影响的药代动力学性质的实例是化合物跨细胞膜运输的方式，其反过来可直接和积极地影响化合物的吸收、分布、生物转化和排泄。尽管药物组合物的给药途径是重要的而且各种解剖学、生理学和病理学因素可很大程度上影响生物利用度，但是化合物的溶解性通常取决于该化合物所利用的其具体盐形式的特性。本领域技术人员将意识到，化合物的水性溶液将提供化合物向被治疗的受试者体内的最快速的吸收，而脂质溶液和悬浮液以及固体剂型将导致化合物的吸收没那么快速。
药学上可接受的盐包括：源自无机酸的盐，所述无机酸如硫酸、氨基磺酸、磷酸、硝酸等；以及由有机酸制备的盐，所述有机酸如乙酸、丙酸、琥珀酸、乙醇酸、硬脂酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、抗坏血酸、棕榈酸、马来酸、羟基马来酸、苯乙酸、谷氨酸、苯甲酸、水杨酸、磺胺酸(sulfanilic)、2-乙酰氧基苯甲酸、富马酸、甲苯磺酸、甲磺酸、乙烷二磺酸、草酸、异硫羰酸(isothionic)等。参见，例如，Berge等，“Pharmaceutical Salts”，J.Pharm.Sci.66:1-19(1977)，以引用的方式将其整体内容并入本文。示例性盐还包括氢溴酸盐、盐酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、磷酸盐、硝酸盐、乙酸盐、琥珀酸盐、戊酸盐、油酸盐、棕榈酸盐、硬脂酸盐、月桂酸盐、苯甲酸盐、乳酸盐、磷酸盐、甲苯磺酸盐、柠檬酸盐、马来酸盐、富马酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、萘甲酸盐(napthylate)、甲磺酸盐、葡庚糖酸盐、乳糖醛酸盐、月桂基磺酸盐等。能够与本公开的化合物形成盐的合适的酸包括：无机酸，如盐酸、氢溴酸、高氯酸、硝酸、硫氰酸、硫酸、磷酸等；以及有机酸，如1,2-乙二磺酸、2-羟乙基磺酸、2-萘磺酸、3-苯丙酸、4-甲基双环[2.2.2]辛-2-烯-1-羧酸、4,4’-亚甲基双(3-羟基-2-烯-1-羧酸)、乙酸、氨茴酸、苯磺酸、苯甲酸、樟脑磺酸、肉桂酸、柠檬酸、环戊基丙酸、乙磺酸、甲酸、富马酸、葡庚糖酸、葡糖酸、谷氨酸、乙醇酸、庚酸、羟基萘甲酸、乳酸、月桂基硫酸、马来酸、苹果酸、丙二酸、扁桃酸、甲磺酸、己二烯二酸、萘磺酸、邻-(4-羟基苯甲酰基)苯甲酸、草酸、对氯苯磺酸、丙酸、对甲苯磺酸、丙酮酸、水杨酸、硬脂酸、琥珀酸、磺胺酸、酒石酸、叔丁基乙酸、三氟乙酸、三甲基乙酸等。能够与本公开的化合物形成盐的合适的碱包括：无机碱，如氢氧化钠、氢氧化铵、碳酸钠、氢氧化钙、氢氧化钾等；以及有机碱，如单烷基胺、二烷基胺和三烷基胺，以及芳基胺(例如三乙胺、二异丙胺、甲胺、二甲胺、N-甲基葡糖胺、吡啶、甲基吡啶、二环己胺、N,N’-二苄基乙二胺等)以及任选取代的乙醇-胺(例如，乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺等)。
本文所使用的短语“肠胃外给予/给药(parenteral administration/administered parenterally)”意味着除肠内给予和局部给予以外的给予模式(通常通过注射)，并且包括(但不限于)静脉内、肌内、动脉内、鞘内、心室内、囊内、眶内、心脏内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、被膜下、蛛网膜下、脊柱内、脑内脊髓和胸骨内注射、输注和其它注射或输注技术，但不限于此。本文所使用的短语“全身给予/给药(systemicadministration/administered systemically)”和“外周给予/给药(peripheraladministration/administered peripherally)”意味着给予药物组合物，使其进入动物系统并因此进行代谢和其它类似过程(例如，皮下给予)，所述组合物包含至少一种本文所公开的抑制剂(例如特定的CHK2抑制剂和CAM抑制剂、或p70S6K或p90S6K的抑制剂)。
术语“统计学显著(statistically significant)”或“显著地(significantly)”是指统计显著性，并且通常意味着正常以下两个标准差(2SD)或者减弱的活性(例如对p70S6K活性、p90S6k活性、Chk2活性、钙调蛋白活性的抑制)。该术语表示存在差异的统计证明。它被定义为当无效假设实际上是真时作出否决该无效假设的决定的可能性。通常利用p值来作出决定。
术语“任选的”或“任选地”意味着随后描述的事件、情况或取代基可发生或可不发生，并且该描述包括事件或情况发生的实例以及其不发生的实例。
冠词“一/一个(a/an)”在本文中用于指一个或超过一个(即，至少一个)该冠词的语法对象。作为示例，“要素/元素(an element)”意味着一个要素/元素或超过一个要素/元素。因此，除非上下文中明确地另有所指，在本申请文件和所附权利要求中，单数形式“一/一个(a/an)”和“该/所述(the)”包括复数的所指物。因此，例如，提及药物组合物包含“试剂(an agent)”时，其包括提及两种以上试剂。
如本文所使用的，术语“包含/包括(comprising)”意味着除已存在的确定要素外，还可存在其它要素。“包含/包括”的使用表示含有而非限制。术语“由…组成(consistingof)”是指本文所述的组合物、方法及其各自的组成部分，排除没有在实施方式描述中叙述的任何要素。本文所使用的术语“基本上由…组成(consisting essentially of)”是指给定的实施方式所需的那些要素。该术语允许存在实质上不影响本发明实施方式的基础特征和新颖性特征或起作用的特征的要素。
除非上下文中明确地另有所指，本申请文件和所附权利要求中所使用的单数术语“一/一个(a/an)”和“该/所述(the)”包括复数的所指物。因此，例如，提及“所述方法/该方法(the method)”时，其包括一种或多种本文中所述的方法和/或步骤类型和/或本领域技术人员阅读本公开等后将变得显而易见的方法和/或步骤类型。
除了在操作实施例中或另有指示的地方，本文所使用的表示成分的量或反应条件的全部数值在所有情况下都应该被理解为被术语“约”修饰。当与百分比相连使用时术语“约”可意味着±1％。下文(包括实施例)将对本发明进行进一步详细说明，但本发明的保护范围不应限制于此。
通过实施例对本发明进行进一步说明，所述实施例不应解释为限制性的。以引用的方式将本申请中引用的所有参考文献的内容以及附图和表格并入本文。为了描述和公开的目的，通过引用的方式将所标明的所有专利以及其它出版物明确并入本文，例如，此类出版物中描述的可与本发明一起使用的方法学。这些出版物仅仅由于它们的公开早于本申请的申请日而提供。在这一方面不应当视作承认本发明人没有权利借助于先前的发明或因为任何其它原因而将此类公开的内容提前。所有关于这些文件的日期的声明或这些文件的内容的表述是基于申请人可得的信息，并且不构成关于这些文件的日期或这些文件的内容的正确性的任何承认。
如本文所使用的，“rps6”是指核糖体蛋白S6(rpS6)，其是被认为参与了调控翻译的40S核糖体亚基的组成部分。虽然rpS6的真正功能目前正处于研究中，但研究已表明其参与细胞大小、细胞增殖以及葡萄糖稳态的调控。研究表明，p70核糖体蛋白S6激酶(S6K1和S6K2)和p90核糖体蛋白S6激酶(RSK)均使rpS6磷酸化，并且S6K1和S6K2主导这一功能。Genebank登录号NM_001010(参见例如Magnuson B1等，(2012).“Regulation and functionof ribosomal protein S6 kinase(S6K)within mTOR signaling networks”.Biochemical Journal 441(1):1–21)。
P90S6K和P70S6K
核糖体s6激酶(rsk)是蛋白激酶家族。rsk有两个亚家族：1)p90rsk(在本文中称为p90S6K，也称为MAPK活化蛋白激酶-1(MAPKAP-K1))；和2)p70rsk(本文中称为p70S6K，也称为S6-H1激酶或简单称为S6激酶)。就核糖体蛋白s6(其是翻译机制的一部分)对rsk进行了命名，但鉴定出了几种其它底物(包括其它核糖体蛋白)。
p90S6K的细胞溶质底物包括蛋白磷酸酶1；糖原合成酶激酶3(GSK3)；L1 CAM(神经细胞粘着分子)；Son of Sevenless(Ras交换因子)；和Myt1(cdc2抑制剂)；以及其它(Morten和Steen Gammeltoft.1999.Role and regulation of 90 kDa ribosomalS6 kinase(RSK)in signal transduction.Molecular and Cellular Endocrinology 151(1-2):65-77)。在某些实施方式中，使用此类底物和磷酸化监测的测定法(例如体外测定法)对p90S6K的活性进行评估。RSK是丝氨酸/苏氨酸激酶并且由MAPK/ERK途径激活。
在丝氨酸1134和1161处SOS1(Sonless of Sevenless)的RSK(p90S6K)磷酸化产生14-3-3对接位点。磷酸化SOS1和14-3-3的这种相互作用负调控Ras-MAPK途径。p90rsk还调控转录因子，所述转录因子包括cAMP反应元件结合蛋白(CREB)；雌激素受体-α(ERα)；IκBα/NF-κB；和c-Fos(Morten和Steen Gammeltoft，同上)。90kDa核糖体S6激酶(RSK)存在数种亚型、变体，即RSK1、RSK2、RSK3和RSK4(这些亚型的突变是本领域熟知的，参见例如Lara等，‘A review of the p90-RSK family members:Common functions and isoformspecificity’,Cancer Research 73(17),9月1日,2013,OF1-8)。p90S6K人蛋白序列包括例如在以下Genebank登录号中发现的那些序列：Q15418.2(GI:20178306)；NP_066958.2(GI:19923570)；NP_001305865.1(GI:974576789)；NP_001305867.1(GI:974576791)；NP_002944.2(GI:20149547)；XP_005246023.1(GI:530361302)。在某些实施方式中，p90S6K抑制剂通过直接结合至p90S6K并抑制其激酶活性而直接抑制p90S6K。
p70S6激酶(p70S6K)
人中的核糖体蛋白S6激酶β-1(S6K1，也称为p70S6激酶(p70S6K))由RPS6KB1基因编码。该激酶是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，在PI3激酶途径中作用于PIP3和磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1的下游(Chung J,Grammer TC,Lemon KP,Kazlauskas A,Blenis J.(1994).“PDGF-and insulin-dependent pp70S6k activation mediated byphosphatidylinositol-3-OH kinase”.Nature 370(6484):71–75；Chung J,Kuo CJ,Crabtree GR,Blenis J.(1992).“Rapamycin-FKBP specifically blocks growth-dependent activation of and signaling by the 70kd S6 protein kinases.”Cell 69(7):1227–1236)。已知mTOR在苏氨酸389处使p70S6K磷酸化并且与在各种情境下的自噬抑制相关。在某些实施方式中，mTor抑制剂是p70S6K抑制剂。在可替代的实施方式中，p70S6K抑制剂通过直接结合至p70S6K并抑制其激酶活性而直接抑制p70S6K。
p70S6K的底物包括核糖体蛋白S6以及其它。S6的磷酸化在核糖体处诱导蛋白质合成。在某些实施方式中，使用此类底物和磷酸化监测的测定法(例如体外测定法)对p70S6K的活性进行评估。p70S6K人蛋白序列包括例如在如下Genebank登录号中发现的那些序列：NP_001258971.1；NP_001258972.1；NP_001258973.1；NP_001258989.1；NP_003152.1。参比mRNA序列包括例如NM_001272042；NM_001272043；NM_001272044；NM_001272060；NM_003161。
p90S6K抑制剂和p70S6K抑制剂
本文提供了用于治疗患有核糖体障碍或核糖体病的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者给予有效量的核糖体s6激酶RSK(p90S6k)抑制剂以在所述受试者中的红系细胞、红系分化细胞或CD34+细胞的至少一种中减少p90S6K的活性并减少活性p53。
p90S6K的任何抑制剂均可在本发明的方法中使用。一些已知的p90S6K抑制剂包括例如在如下文献中所描述的那些抑制剂：Shiliang Li等，“Identification ofInhibitors against p90 Ribosomal S6 Kinase 2(RSK2)through Structure-BasedVirtual Screening with the Inhibitor-Constrained Refined Homology Model”J.Chem.Inf.Model.,2011,51(11),第2939–2947页，通过引用的方式将其整体并入本文。抑制剂的非限制性实例在以下专利和出版物中公开：US7605241、PCT./US2006/000709。许多是可商购获得的，例如：Kempferol，化学名：3,5,7-三羟基-2-(4-羟基苯基)-4H-1-苯并吡喃-4-酮；和BRD739，化学名：1-[(2-苯基乙基)氨基]-3H-萘并[1,2,3-de]喹啉-2,7-二酮；PF 4708671，化学名：2-[[4-(5-乙基嘧啶-4-基)哌嗪-1-基]甲基]-5-(三氟甲基)-1H-苯并[d]咪唑)；以及SL 0101-1，化学名：3-[(3,4-二-O-乙酰基-6-脱氧-α-L-吡喃甘露糖基)氧基]-5,7-二氢-2-(4-羟基苯基)-4H-1苯并吡喃-4-酮，它们可从Tocris Bioscience(Avonmouth，Bristol，BS11 9QD，英国)获得；以及FMK RSK抑制剂(p90 RSK特异性)，其描述于TL Nguyen等，“Targeting RSK:an overview of small molecule inhibitors”Anticancer Agents Med.Chem.2008,8(7),710-716，并且可从例如荷兰格罗宁根(Groningen)的Axon Medchem BV获得。
在某些实施方式中，所述p90S6K抑制剂是BI-D1870或BI-D1870(BI)的衍生物或类似物。BI的分子式(MF)为C18H19FN4O2，并且是在体外和体内的p90核糖体S6激酶(RSK)亚型的各自强效且特异性的抑制剂。因此，其在体外抑制RSK1、RSK2、RSK3和RSK4(IC50值分别为31nM、24nM、18nM和15nM)(可从荷兰格罗宁根的Axon Medchem BV获得)。BI-D1870(BI)具有以下结构：
在某些实施方式中，所述p90S6k抑制剂是SL0101(SL)或SL0101(SL)的衍生物或类似物，其中，SL0101(SL)具有以下结构：
SL是核糖体S6激酶(RSK)的选择性抑制剂，并且对RSK2具有选择性(对于RSK2，IC50＝89nM)。SL不抑制上游激酶(如MEK、Raf和PKC)。
还提供了治疗患有核糖体障碍或核糖体病的受试者的方法，所述方法包括给予有效量的RSK(p70S6K)抑制剂。p70S6K的任何抑制剂均可在本发明的方法中使用。一些已知的p70S6K抑制剂包括例如在如下中描述的那些：Upul Bandaragea等，“4-(Benzimidazol-2-yl)-1,2,5-oxadiazol-3-ylamine derivatives:Potent and selective p70S6 kinaseinhibitors”Bioorganic&Medicinal Chemistry Letters 19(17)，2009年9月1日，第5191–5194页；以及雷帕霉素及其衍生物等，例如描述于Sandrine Faivre等，“Currentdevelopment of mTOR inhibitors as anticancer agents”Nature Reviews DrugDiscovery 5,671-688(2006年8月)；各自通过引用的方式将其整体并入本文。许多是可商购获得的，例如PF 4708671(MF C19H21F3N6)RSK抑制剂(p70RSK特异性，可从荷兰格罗宁根的Axon Medchem BV获得)；以及DG2(MF C16H17BrN6O)RSK抑制剂(p70核糖体S6激酶1特异性)。
在某些实施方式中，所述p70S6k抑制剂是PF-4708671(PF)或PF-4708671(PF)的衍生物或类似物，其中，PF-4708671(PF)具有以下结构：
化合物抑制本文所鉴定的靶蛋白(例如，p70S6K、p90SK)的能力可通过测量抑制剂激酶活性相比于不存在相应的抑制剂时蛋白质的活性而言的减少来进行评估。
其它抑制剂
还提供了治疗患有核糖体障碍或核糖体病的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者给予有效量的Chk2抑制剂，以在所述受试者中的红系细胞、红系分化细胞或CD34+细胞的至少一种中减少活性p53，其中，所述Chk2抑制剂包括选自于由CCT和III所组成的组中的化合物或其衍生物，其中，CCT和III具有以下结构：
检查点激酶(checkpoint kinases，Chks)(例如Chk1和Chk2)是丝氨酸/苏氨酸激酶，该激酶参与对细胞周期的控制。它们是延迟正常细胞和受损细胞中细胞周期进展的必要组成部分并且可在所有的三个细胞周期检查点处起作用。
如本文所使用的，“CCT”是指CCT 241533二盐酸盐，可从Tocris biosciences(同上)获得。CCT是一种强效的Chk2抑制剂(IC50＝3nM)。显示对Chk1的选择性比对Chk2和一组84个的其它激酶>63倍。CCT抑制响应于HT29细胞中依托泊苷诱导的DNA损伤的Chk2的活化，并阻断电离辐射诱导的小鼠胸腺细胞的细胞凋亡。
吩噻嗪化合物
还提供了治疗患有核糖体障碍或核糖体病的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者给予有效量的钙调蛋白抑制剂，以在所述受试者中的红系细胞、红系分化细胞或CD34+细胞的至少一种中减少活性p53，其中，所述钙调蛋白抑制剂是吩噻嗪化合物或吩噻嗪化合物的衍生物或类似物，其中，所述吩噻嗪化合物选自于由具有以下结构的ACV-1-235(ACV)、JJM-II-221E(221E)和DB1026(PerSucc)所组成的组：
还提供了治疗患有核糖体障碍或核糖体病的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者给予有效量的钙调蛋白抑制剂，以在所述受试者中的红系细胞、红系分化细胞或CD34+细胞的至少一种中减少活性p53，其中，所述钙调蛋白抑制剂是吩噻嗪化合物、或吩噻嗪化合物的衍生物或类似物，并且其中，所述吩噻嗪化合物选自于由具有以下结构的DB-4-083(083)、DB-4-084(084)、DB-4-088-2(088-2)、DB-4-088-3(088-3)、DB-4-086(086)、DB-4-087-2(087-2)、DB-4-087-3(087-3)、DB-4-089(089)所组成的组：
DB-4-083:
DB-4-084:
DB-4-086:
DB-4-087-2:
DB-4-088-2:
DB-4-089:
DB-4-088-3:
DB-4-087-3:
在某些实施方式中，用于治疗核糖体障碍和核糖体病(例如DBA)的吩噻嗪化合物是式(I)化合物及其异构体和药学上可接受的盐：
其中：
X为O或S；
R1为H、烷基、烯基、炔基、环基、杂环基、酰基、芳基、杂芳基、烷基杂芳基或烷基芳基；
R各自独立地为H、卤素、烷基、烷基、烯基、炔基、卤代烷基、CN、OH、NH2、烷基氨基、二烷基氨基、CO2H、酰基、SH、硫代烷氧基、SO2H或SO3H。
在某些实施方式中，式(I)化合物中的X为S。在一些其它实施方式中，式(I)化合物中的X为O。
式(I)化合物中的R1基团可选自于由如下所组成的组：H、烷基、环基、杂环基、酰基、芳基、杂芳基、烷基杂芳基或烷基芳基。任选地，可用1个、2个、3个或4个取代基取代R1基团的烷基、环基、杂环基、酰基、芳基、杂芳基、烷基杂芳基和烷基芳基。
在一些实施方式中，R1是C1-C6烷基。R1基团的示例性烷基包括但不限于：甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、仲丁基、异丁基、戊基和己基。在一些实施方式中，R1是异丙基。
在又一些其它实施方式中，R1是任选取代的烷基芳基(例如可被任选取代的C1-C6烷基芳基)。对R1基团的烷基芳基而言，示例性芳基包括C1-C6烷基苯基。在一些实施方式中，R1是苄基。
在另外的其它实施方式中，R1是杂环基，任选地被1个、2个、3个或4个取代基取代。R1基团的示例性杂环基包括但不限于任选取代的哌啶基。在一些实施方式中，R1是4-哌啶基，任选地在N原子上取代。例如，R1是N-甲基哌啶-4-基。
在式(I)化合物中，R基团可以是相同的或不同的，并且独立地选自于由如下所组成的组：H、卤素、烷基、卤代烷基、CN、OH、NH2、烷基氨基、二烷基氨基、CO2H、酰基、SH、硫代烷氧基、SO2H和SO3H。在一些实施方式中，R各自独立地为H、卤素、C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、OH、C1-C6烷氧基、NH2、NO2、C1-C6烷基氨基、二(C1-C6烷基)氨基、CN或CO2H。
在一些进一步的实施方式中，R各自独立地为H、Cl、F、Br、甲基、三氟甲基、OH、NH2、NO2、CN或CO2H.
在式(I)化合物的一些实施方式中，R1是烷基、杂环基或烷基芳基，其各自可为任选取代的；并且R各自为H、卤素、烷基或卤代烷基。
在一些实施方式中，用于治疗核糖体障碍和核糖体病(例如，DBA)的吩噻嗪化合物是式II的化合物及其异构体和药学上可接受的盐：
其中：
R21各自独立地选自于由如下所组成的组：H、卤素、烷基、卤代烷基、CN、OH、NH2、烷基氨基、二烷基氨基、CO2H、酰基、SH、硫代烷氧基、SO2H和SO3H。
在式(II)化合物中，R21可以是全部相同的、全部不同的或两个相同而一个不同的。在一些实施方式中，R21各自独立地为H、卤素、C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、OH、C1-C6烷氧基、NH2、NO2、C1-C6烷基氨基、二(C1-C6烷基)氨基、CN或CO2H。例如，R21各自独立地可为H、Cl、F、Br、甲基、三氟甲基、OH、NH2、NO2、CN或CO2H。
在一个实施方式中，用于治疗核糖体障碍和核糖体病(例如DBA)的吩噻嗪化合物是具有如下结构的化合物：
还提供了治疗患有核糖体障碍或核糖体病的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者给予有效量的钙通道阻滞剂BAPTA-AM或其衍生物或类似物，以减少至少一种CD34+细胞中的活性p53，其中，BAPTA-AM具有以下结构：
p90S6K和p70S6K和rbs6的RNAi抑制剂
如本文所讨论的，本发明人发现rsk蛋白p90S6K和p70S6K的抑制和rps6的抑制剂可在本文所公开的用于治疗核糖体蛋白障碍和核糖体病的方法中使用。在一些实施方式中，所述抑制剂不是小分子化合物，而是蛋白质抑制剂，并且在一些实施方式中，所述抑制剂是对p90S6K和p70S6K的功能或来自其基因的p90S6K和p70S6K的表达进行抑制的任何核酸。在一些实施方式中，p90S6K和p70S6K的抑制剂是基因沉默试剂。
人p90S6K(还称为以下别名：HU-1、MAPKAPK1A、RSK、RSK1、p90Rsk、90kDa核糖体蛋白S6激酶、1MAP激酶活化蛋白激酶、1aMAPK活化蛋白激酶、1aMAPKAP激酶)由以下核酸序列编码：1号染色体，NC_000001.11(26529758..26575029)。一种智人(homo sapiens)核糖体蛋白S6激酶A2(RPS6KA2)变体(即转录物变体1)是mRNA Genebank NM_021135.5(其在本文中为SEQ ID NO：1，并具有SEQ ID NO：2的氨基酸)。p90S6K基因的抑制可根据技术人员通常已知的方法通过基因沉默RNAi分子来进行。例如，可容易地使用特异性靶向人p90S6K的基因沉默siRNA寡核苷酸双链体来敲低p90S6K的表达。使用siRNA可成功地靶向p90S6K mRNA；基于靶mRNA的已知序列，本领域技术人员可容易地制备其它siRNA分子。因此，为避免任何疑义，本领域普通技术人员可将核酸抑制剂(例如RNAi(RNA沉默)试剂)设计为如下的SEQID NO：1的核酸序列：
SEQ ID NO：1编码以下氨基酸序列，即SEQ ID NO：2：
人p70S6K也称为以下别名：p70S6KA、P70(S6K)-α、P70-α、P70-S6K、PS6K、S6K、S6K-β-1、S6K1、STK14A以及RPS6KB1；并且由以下编码：例如智人核糖体蛋白S6激酶B1(RPS6KB1)，转录变体1，mRNA登录号：NM_001272060.1GI:440546415核酸序列(SEQ ID NO：3)，且具有(SEQ ID NO：4)的氨基酸。p70S6K基因的抑制可根据技术人员通常已知的方法通过基因沉默RNAi分子来进行。例如，可容易地使用特异性靶向人p70S6K的基因沉默siRNA寡核苷酸双链体来敲低p70S6K的表达。使用siRNA可成功地靶向p70S6K mRNA；并且基于靶mRNA的已知序列，本领域技术人员可容易地制备其它siRNA分子。因此，为避免任何疑义，本领域普通技术人员可将核酸抑制剂(例如RNAi(RNA沉默)试剂)设计为如下的NM_001272060核酸序列：
SEQ ID NO：3编码如下的SEQ ID NO：4：
在某些实施方式中，rps6被抑制。rps6基因的抑制可根据技术人员通常已知的方法通过基因沉默RNAi分子来进行。例如，可容易地使用特异性靶向人rps6的基因沉默siRNA寡核苷酸双链体(GenBank号No：NM_001010.2)来敲低rps6的表达。使用siRNA可成功地靶向rps6mRNA；并且基于靶mRNA的已知序列，本领域技术人员可容易地制备其它siRNA分子。因此，为避免任何疑义，本领域普通技术人员可将核酸抑制剂(例如RNAi(RNA沉默)试剂)设计为如下的SEQ ID NO：5的核酸序列：
当然，本领域技术人员将想到可靶向此类示例性核酸序列的其它变体。
本领域技术人员将理解的是，p90S6K和p70S6K或rps6的抑制剂可以是抑制p90S6K和p70S6K的功能的任何试剂(如抗体、基因沉默RNAi分子等)。针对p90S6K、p70S6K和rps6的商业的中和抗体及抗体片段被涵盖在内，以用于本文所公开的方法和组合物中。
本领域技术人员能够测试某种化合物是否作为p90S6K和p70S6K抑制剂起作用。用于某些化合物的p90S6K和p70S6K活性的测试系统是本领域熟知的。例如，此类测试系统描述于如下中：Roux等，‘Phosphorylation of p90 Ribosomal S6 Kinase(RSK)RegulatesExtracellular Signal-Regulated Kinase Docking and RSK Activity’Mol CellBiol.2003年7月；23(14):4796–4804；以及Sapkota等，‘BI-D1870 is a specificinhibitor of the p90 RSK(ribosomal S6kinase)isoforms in vitro and in vivo’Biochem J.2007年1月1日；401(Pt 1):29–38。同样参见Masuda-Robens等，‘Assays formonitoring p70 S6 kinase and RSK activation’.Methods Enzymol.2001；333:45-55。本领域还有可获得的商业测定法：例如p70S6K活性试剂盒-ADI-EKS-470-Enzo LifeSciences(Farmingdale,NY)；以及来自Abcam(Cambridge,MA)的p70S6K活性试剂盒(ab139438)。
另外，如本文所述的，以下能力是用于监测p90S6K抑制剂和p70S6K抑制剂的活性的手段：在Rps29-/-斑马鱼胚胎中挽救形态学缺陷、造血缺陷或内皮缺陷中的至少一种；和/或在已通过siRNA敲低RPS19的A549肺癌细胞系中阻止p53的功能和核内积聚；或者在已通过siRNA敲低RPS19的CD34+细胞中降低p21的水平或增加红系细胞标志物。
在一些实施方式中，本文所公开的特定钙调蛋白抑制剂(例如，图24或图33的吩噻嗪衍生物；或图32的PerSucc、或221E、或ACV；或式I化合物和式II化合物及其类似物或衍生物)可由本领域普通技术人员使用熟知的测定法进行评估，例如，对钙调蛋白的抑制可尤其使用以下的体外测定法来确定，所述体外测定对肌球蛋白轻链激酶(MLCK)的钙调蛋白依赖性活化进行测量。活化的MLCK使鸡砂囊肌球蛋白轻链磷酸化。如果钙调蛋白被抑制，则肌球蛋白轻链磷酸化的速率降低。为了测试这一点，进行以下实验(根据ltoh等，Biochem.Pharm.1986,35:217-220)。反应混合物(0.2ml)含有20mM Tris-HCl(pH 7.5)、0.05mM[γ-32P]ATP(1μCi/测定管)、5mM MgCl2、10μM肌球蛋白轻链、24nM钙调蛋白和0.1mMCaCl2。来自鸡砂囊的MLCK(具体活性：4.5摩尔/min/mg)的浓度为0.1μg/ml。在30℃下进行孵育4分钟。通过加入1ml的20％三氯乙酸终止反应。然后，向反应混合物中加入0.1ml的牛血清白蛋白(1mg/ml)。然后，将样品离心10分钟，将沉淀重悬于5％三氯乙酸中。将最终沉淀溶解于2ml的1N NaOH中，并在液体闪烁计数器中测量放射性。可如ltoh等，JPharmacol.Exp.Ther.1984,230,p737中所描述的，对经胰蛋白酶处理的MLCK进行制备。通过加入ATP引发反应，并在潜在抑制剂的存在下或者在它们的溶剂的存在下(作为对照)进行反应。在上述测定法中将对不同浓度的化合物进行测试。导致激酶活性减少50％的化合物浓度将是IC50浓度。
在一些实施方式中，相对于在不存在抑制剂的情况下的活性水平而言，本文所公开的p90S6K和p70S6K抑制剂、rps6或特定Chk2抑制剂和Cam抑制剂可使指定RSK、rps6、Chk2或Cam的活性抑制或减少至少约10％，例如至少约15％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、95％、99％或甚至100％。在某些实施方式中，相比于在不存在抑制剂的情况下的表达而言，本文所公开的抑制剂可使各自蛋白质的表达减少约至少10％、至少约15％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、95％、99％或甚至100％。
p90S6K和p70S6K或Chk2或Cam或rps6的表达包括从编码蛋白的基因转录的各自RNA的量、和/或通过翻译由基因转录的RNA而获得的蛋白质的量。例如，相比于不存在抑制剂的情况下的参比水平而言，本文所公开的p90S6K和p70S6K抑制剂可使p90S6K、p70S6K、Chk2或Cam或rps6的表达抑制至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、95％、99％或甚至100％。
此外，还可通过测量相比于阴性对照(例如不存在抑制剂的实验条件)的生物激酶活性的抑制或减少，来评估化合物抑制p90S6K和p70S6K的能力。因此，相比于不存在抑制剂的情况下的参比水平而言，本文所公开的p90S6K和p70S6K抑制剂可使p90S6K和p70S6K的生物激酶活性抑制至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、95％、99％或甚至100％。
在一些实施方式中，抑制剂抑制p90S6K或p70S6K、rps6或Chk2或Cam的能力通过如下来评估：如本文的实施例中所证明的，相比于没有用此类抑制剂处理的参比条件，在Rps29-/-斑马鱼胚胎中挽救形态缺陷、造血缺陷或内皮缺陷中的至少一种；和/或在已通过siRNA敲低RPS19的A549肺癌细胞系中阻止p53的功能及核内积聚；或者在已通过siRNA敲低RPS19的CD34+细胞中使p21的水平降低或使红系细胞标志物增加。
待给予的抑制剂的剂量可由本领域普通技术人员根据如下来确定：疾病的临床严重性；患者的年龄和体重；患者暴露于可能促进牛皮癣发作的条件；以及本领域通常理解的其它药代动力学因素(如肝和肾代谢)。Freireich等“Quantitative Comparison ofToxicity of Anticancer Agents in Mouse,Rat,Hamster,Dog,Monkey and Man,”CancerChemother.Rep.50:219-244(1966)描述了基于mg/m3表面积的各种大小和物种的动物用剂量与人用剂量的相互关系。可对剂量方案进行调整以优化治疗反应。剂量能够以日为基础分开和给予，或者剂量可根据治疗形势按比例降低。
通常地，这些药物将口服给予，并且它们能够以常规丸剂形式或液体形式给予。如果以丸剂形式给予，它们能够以常规制剂(含有赋形剂、填充剂、防腐剂和在丸剂形式的药物制剂中使用的其它典型成分)进行给予。通常地，药物以常规的药学上可接受的制剂(通常包括载体)进行给予。本领域已知的常规的药学上可接受的载体可包括醇(例如乙醇)、血清蛋白、人血清白蛋白、脂质体、缓冲剂(如磷酸盐)、水、无菌盐水或其它盐类、电解质、甘油、羟甲基纤维素、丙二醇、聚乙二醇、聚氧乙烯山梨醇酐、其它表面活性剂、植物油和常规的抗细菌剂或抗真菌剂(如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等)。在本发明范围内的药学上可接受的载体满足以下工业标准：无菌性、等渗性、稳定性和非致热原性。
药学上可接受的制剂还可处于本领域已知的丸剂、片剂或锭剂形式，并且可包括赋形剂或其它成分以为了更好的稳定性或可接受性。对于片剂，随同本文所公开的抑制剂和其它成分一起的赋形剂可为：惰性稀释剂，如碳酸钙、碳酸钠或碳酸氢钠、乳糖或磷酸钙；或粘合剂，如淀粉、明胶或阿拉伯胶；或润滑剂，如硬脂酸镁、硬脂酸或滑石。
药物还可处于常规制剂中以液体形式给予，所述常规制剂可包括防腐剂、稳定剂、着色剂、矫味剂和其它通常可接受的药学成分。通常，当药物以液体形式进行给予时，它们将处于水性溶液中。所述水性溶液可含有缓冲剂，并且可含有醇(如乙醇)或其它药学上可耐受的化合物。
可替代地，药物可通过本领域熟知的数种途径之一通过注射进行给予。然而，一般而言优选口服给予药物。
根据疾病的严重性、待给予的总剂量和主治医生的判断，药物可每天给予一次至多达每天给予至少五次。在某些情况下，药物不需要以日为基础进行给予，而是可每隔一天、每三天或根据其它此类时间表进行给予。然而，一般而言优选每天给予药物。
在一些实施方式中，本文所公开的抑制剂的前药也落入本发明的范围内。如本文所使用的，“前药”是指可经一些化学过程或生理过程(例如，酶促过程和代谢水解)转化为功能活性抑制剂的化合物，所述功能活性抑制剂例如rps6抑制剂；p90S6k抑制剂或p70S6k抑制剂；或RSk p90抑制剂SL或B1；p70s6K抑制剂PF；Cam抑制剂，TF和FLU；Ca2+螯合剂BABTA；chk2抑制剂CCT和III以及抑制剂PerSuc、221E和ACV；或者，例如图33的抑制剂，或式I化合物或式II化合物。
因此，术语“前药”还指药学上可接受的生物活性化合物的前体。前药在给予受试者时可以是非活性的，即酯，但在体内转化为活性化合物，例如，通过水解为游离羧酸或游离羟基。所述前药化合物经常提供生物体内的缓释作用、组织相容性或可溶性的优点。术语“前药”也意在包括任何共价结合的载体，当将该前药给予受试者时，所述载体在体内释放活性化合物。活性化合物的前药可通过以如下方式修饰活性化合物中存在的官能团而制备：通过常规操作或体内方式将所述修饰物裂解为母体活性化合物。前药包括其中的羟基、氨基或巯基与任意基团结合的化合物，以使得当将所述活性化合物的前药给予受试者时，其裂解并各自形成游离羟基、游离氨基或游离巯基。前药的实例包括但不仅限于：活性化合物中醇的乙酸酯、甲酸酯和苯甲酸酯衍生物，或活性化合物中胺官能团的乙酰胺、甲酰胺和苯甲酰胺衍生物等。参见：Jucker编著，Progress in Drug Research 4:221-294(1962)中的Harper，“Drug Latentiation”；E.B.Roche编著，Design of BiopharmaceuticalProperties through Prodrugs and Analogs，APHA Acad.Pharm.Sci.40(1977)的Morozowich等，“Application of Physical Organic Principles to Prodrug Design”；Bioreversible Carriers in Drug in Drug Design，Theory and Application，E.B.Roche编著，APHA Acad.Pharm.Sci.(1987)；Design of Prodrugs，H.Bundgaard，Elsevier(1985)；Wang等“Prodrug approaches to the improved delivery of peptidedrug”in Curr.Pharm.Design.5(4):265-287(1999)；Pauletti等(1997)Improvement inpeptide bioavailability：Peptidomimetics and Prodrug Strategies，Adv.Drug.Delivery Rev.27:235-256；Mizen等(1998)“The Use of Esters as Prodrugsfor Oral Delivery of(3-Lactam)antibiotics,”Pharm.Biotech.ll,:345-365；Gaignault等(1996)“Designing Prodrugs and Bioprecursors I.Carrier Prodrugs,”Pract.Med.Chem.671-696；Transport Processes in Pharmaceutical Systems，G.L.Amidon，P.I.Lee与E.M.Topp等编著，Marcell Dekker，第185-218页(2000)中的Asgharnejad，“Improving Oral Drug Transport”；Balant等，“Prodrugs for theimprovement of drug absorption via different routes of administration”，Eur.J.Drug Metab.Pharmacokinet.，15(2)：143-53(1990)；Balimane与Sinko，“Involvement of multiple transporters in the oral absorption of nucleosideanalogues”，Adv.Drug Delivery Rev.，39(1-3)：183-209(1999)；Browne，“Fosphenytoin(Cerebyx)”，Clin.Neuropharmacol.20(1)：1-12(1997)；Bundgaard，“Bioreversiblederivatization of drugs—principle and applicability to improve thetherapeutic effects of drugs”，Arch.Pharm.Chemi 86(1)：1-39(1979)；Bundgaard H.“Improved drug delivery by the prodrug approach”，Controlled Drug Delivery 17：179-96(1987)；Bundgaard H.“Prodrugs as a means to improve the delivery ofpeptide drugs”,Arfv.Drug Delivery Rev.8(1)：1-38(1992)；Fleisher等“Improvedoral drug delivery：solubility limitations overcome by the use of prodrugs”，Arfv.Drug Delivery Rev.19(2)：115-130(1996)；Fleisher等“Design of prodrugs forimproved gastrointestinal absorption by intestinal enzyme targeting”，MethodsEnzymol.112(Drug Enzyme Targeting，Pt.A)：360-81，(1985)；Farquhar D等，“Biologically Reversible Phosphate-Protective Groups”，Pharm.Sci.，72(3)：324-325(1983)；Freeman S等，“Bioreversible Protection for the Phospho Group：Chemical Stability and Bioactivation of Di(4-acetoxy-benzyl)Methylphosphonatewith Carboxyesterase,”Chem.Soc.，Chem.Commun.，875-877(1991)；Friis与Bundgaard，“Prodrugs of phosphates and phosphonates：Novel lipophilic alphaacyloxyalkylester derivatives of phosphate-or phosphonate containing drugs masking thenegative charges of these groups”，Eur.J.Pharm.Sci.4：49-59(1996)；Gangwar等，“Pro-drug，molecular structure and percutaneous delivery”，Des.Biopharm.Prop.Prodrugs Analogs，[Symp.]Meeting Date 1976，409-21.(1977)；Nathwani与Wood，“Penicillins：a current review of their clinical pharmacologyand therapeutic use”，Drugs 45(6)：866-94(1993)；Sinhababu与Thakker，“Prodrugs ofanticancer agents”，Adv.Drug Delivery Rev.19(2)：241-273(1996)；Stella等，“Prodrugs.Do they have advantages in clinical practice？”，Drugs 29(5)：455-73(1985)；Tan等“Development and optimization of anti-HIV nucleoside analogs andprodrugs：A review of their cellular pharmacology，structure-activityrelationships and pharmacokinetics”，Adv.Drug Delivery Rev.39(1-3)：117-151(1999)；Taylor，“Improved passive oral drug delivery via prodrugs”，Adv.DrugDelivery Rev.，19(2)：131-148(1996)；Valentino与Borchardt，“Prodrug strategies toenhance the intestinal absorption of peptides”，Drug Discovery Today 2(4)：148-155(1997)；Wiebe与Knaus，“Concepts for the design of anti-HIV nucleosideprodrugs for treating cephalic HIV infection”，Adv.Drug Delivery Rev.：39(l-3):63-80(1999)；Waller等，“Prodrugs”，Br.J.Clin.Pharmac.28：497-507(1989)，以引用的方式将上述文献的全部内容整体并入本文。
本文所公开的抑制剂还包括其药学上可接受的盐。如本文所使用的，术语“药学上可接受的盐”是指本文所公开的抑制剂的常规的无毒的盐或季铵盐，例如，来自非毒性有机酸或无机酸的盐。这些盐可在给药载剂中或在来自生产工序的剂型中原位制备，或通过独立地将处于其游离碱或酸形式的抑制剂与合适的有机或无机酸或碱进行反应，并在随后的纯化期间将这样形成的盐进行分离而制备。传统上无毒的盐包括：源自无机酸的盐，所述无机酸如硫酸、氨基磺酸、磷酸、硝酸等；以及由有机酸制备的盐，所述有机酸如乙酸、丙酸、琥珀酸、乙醇酸、硬脂酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、抗坏血酸、棕榈酸、马来酸、羟基马来酸、苯乙酸、谷氨酸、苯甲酸、水杨酸、磺胺酸、2-乙酰氧基苯甲酸、富马酸、甲苯磺酸、甲磺酸、乙烷二磺酸、草酸、异硫羰酸等。参见，例如，Berge等，“Pharmaceutical Salts”，J.PHarm.Sci.66:1-19(1977)，以引用的方式将其整体内容并入本文。
在本文所述方面的一些实施方式中，代表性的药学上可接受的盐包括氢溴酸盐、盐酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、磷酸盐、硝酸盐、乙酸盐、琥珀酸盐、戊酸盐、油酸盐、棕榈酸盐、硬脂酸盐、月桂酸盐、苯甲酸盐、乳酸盐、磷酸盐、甲苯磺酸盐、柠檬酸盐、马来酸盐、富马酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、萘甲酸盐、甲磺酸盐、葡庚糖酸盐、乳糖醛酸盐和月桂基磺酸盐等。
对核糖体障碍和核糖体病的治疗
在一些实施方式中，本文所公开的抑制剂可用于治疗与核糖体蛋白或核糖体病相关的各种疾病和障碍。例如，所述抑制剂可用于对具有一种或多种核糖体蛋白突变或具有减少的核糖体蛋白水平的受试者进行治疗。
在一些实施方式中，本文所公开的抑制剂可在对患有核糖体障碍(如DiamondBlackfan贫血(DBA))的受试者进行治疗的方法中使用。存在各种类型的Diamond Blackfan贫血，例如，其中受试者具有DBA1、DBA2、DBA3、DBA4、DBA5、DBA6、DBA7或DBA8。DiamondBlackfan贫血(DBA，也称为Blackfan-Diamond贫血和遗传性幼红细胞减少症)是一种先天性红系细胞再生障碍，通常出现在婴儿期。DBA患者的红细胞计数较低(贫血)。DBA患者的其余血细胞(血小板和白细胞)是正常的。这与Shwachman-Bodian-Diamond综合征(其中骨髓缺陷主要导致嗜中性粒细胞减少症)和Fanconi贫血相反(其中所有细胞系均受到影响而导致全血细胞减少症)。还可发生多种其它先天性异常。Diamond Blackfan贫血的特征在于在骨髓中具有减少的红系祖细胞的贫血(红细胞计数较低)。这通常发生在新生儿时期。约47％受影响的个体还具有多种先天性异常(包括颅面畸形、拇指或上肢异常、心脏缺陷、泌尿生殖器畸形以及腭裂)。有时会观察到出生体重低以及全身性生长延迟。DBA患者具有发展出白血病和其它恶性肿瘤的中度风险。
通常而言，DBA诊断通过血细胞计数和骨髓活检进行。基于贫血、网织红细胞(未成熟红细胞)计数低和骨髓中红系细胞前体减少而作出DBA的诊断。支持对DBA的诊断的特征包括：存在先天性异常、巨红细胞症、胎儿血红蛋白升高和红细胞中腺苷脱氨酶水平升高。大多数患者在出生头两年被诊断出来。然而，一些受轻度影响的个体只有在受更严重影响的家庭成员被鉴定出来之后才得到关注。约20％-25％的DBA患者可用针对RPS19基因突变的基因测试进行鉴定。大约10％-25％的DBA案例有家族病史，并且大多数家系表明是常染色体显性遗传模式。
因此，在一些实施方式中，本文所公开的抑制剂可在对具有核糖体蛋白19(RPS19)突变的受试者进行治疗的方法中使用。DBA患者的表型表明造血干细胞缺陷特异性地影响红系祖细胞群。RPS19蛋白参与核糖体的产生。疾病特征可与RPS19突变的性质有关。该疾病的特征在于显性遗传，并因此由RPS19蛋白功能的部分丧失而出现。
在可替代的实施方式中，本文所公开的抑制剂可在对具有核糖体蛋白突变的受试者进行治疗的方法中使用，所述核糖体蛋白来自(但不限于)以下中的至少一种：RPS7、RPS10、RPS19、RPS24、PRS26、RPS17、PRS27L RPS29.RPL35A、PRL5和PPL11。例如，RPS19突变或变异引起DBA1；而RPS24突变或变异引起DBA3；RPS17突变或变异引起DBA4；RPS34A突变或变异引起DBA5；RPL5突变或变异引起DBA6；RPL11突变或变异引起DBA7；而RPS7突变或变异引起DBA8。
在一些实施方式中，患有核糖体障碍的受试者具有核糖体蛋白突变，所述核糖体蛋白选自于由如下所组成的组：rPL2A、rPL2B、rPL3、rpL4A、rPL4B、rPL7A、rPL7B、rPL10、rPL11、rPL16A、rPL17A、rPL17B、rPL18A、rPL18B、Rpl19A、rPL19、rPL25、rPL29、rpL31A、rpL31B、rPL36A、rPL40A、rPS1A、rPS6A、rPS6B、rPS14A、rPS15、rPS19、rPS23B、rPS25A、rPS26B、rPS29、rPS29B和rPS31。
在本发明所有方面的一些实施方式中，所述方法进一步包括给予另一种治疗性试剂以治疗核糖体蛋白缺陷，所述治疗性试剂选自于由如下所组成的组：皮质类固醇、输血和骨髓移植以及本领域普通技术人员已知的其它治疗。皮质类固醇可用于治疗DBA中的贫血。输血也可用于治疗DBA中的严重贫血。可能出现缓解期，在此期间不需要输血和类固醇治疗。骨髓移植(BMT)可治愈DBA的血液病方面，输血患者中可能出现不良事件(DiamondBlackfan Anemia Foundation；Pospisilova D等，(2007).“Successful treatment of aDiamond–Blackfan anemia patient with amino acid leucine.”.Haematologica 92(5):e66.)
在本发明所有方面的一些实施方式中，向受试者给予抑制剂增加了受试者中的CD71+红系细胞的数量和/或增加了受试者中的血红蛋白的水平。
在本发明所有方面的一些实施方式中，本文所公开的方法和抑制剂可用于治疗患有核糖体障碍(例如具有颅面畸形和/或巨红细胞性贫血的症状的DBA)的受试者。
在另一实施方式中，本文所公开的抑制剂可在对患有核糖体障碍(如脊髓发育不良，例如但不限于5q-脊髓发育不良)的受试者进行治疗的方法中使用。脊髓发育不良或骨髓增生异常综合征(myelodysplastic syndromes(MDS)，以前称为白血病前期(preleukemia))是血液病(血液相关)医学病症的不同集合，该病症涉及髓系类别的血细胞的无效生成(或发育不良)并且其中骨髓不能正常发挥功能且产生数量不足的正常血细胞。
患有MDS的患者经常发展出严重贫血并且需要频繁输血。在大多数情况下，疾病恶化并且患者发展出由进行性骨髓衰竭引起的血细胞减少症(低的血细胞计数)。在大约三分之一患有MDS的患者中，疾病通常在数月至数年内转化成急性髓性白血病(AML)。
骨髓增生异常综合征是骨髓中所有的干细胞障碍。在MDS中，造血(血液生成)是无序且无效的。血液形成细胞的数量和质量不可逆地下降，进一步损害血液生成。
MDS影响任何类型、并偶尔地所有类型的血细胞(包括红细胞、血小板和白细胞)的生成(血细胞减少症)。约50％的小儿脊髓发育不良可分类为五种类型的MDS：难治性贫血、环形铁粒幼红细胞增多性难治性贫血、难治性贫血伴原始细胞增多、难治性贫血伴转化型原始细胞增多以及慢性粒单核细胞白血病。剩余的50％通常存在单独或组合的血细胞减少症(如贫血)、白细胞减少症和/或血小板减少症(低的血小板计数)。尽管是慢性的，MDS在约30％的患者中发展成急性髓性白血病(AML)。
诊断为MDS的中位年龄是60岁至75岁；少数患者小于50岁；MDS诊断在儿童中是很罕见的。男性通常比女性略更受影响。体征和症状是非特异性的且一般与血液细胞减少症有关，包括但不限于：
(a)贫血(RBC计数低或血红蛋白降低)-慢性疲劳、呼吸短促、感觉冰冷、时而胸痛；
(b)嗜中性粒细胞减少症(嗜中性粒细胞计数低)-对感染的易感性增加；
(c)血小板减少症(血小板计数低)-对出血和瘀斑(瘀伤)的易感性增加，以及皮下出血导致紫癜或瘀点[5]。
许多个体是无症状的，而血液细胞减少症或其它问题作为常规血细胞计数的一部分而得以鉴定出来：嗜中性粒细胞减少症、贫血和血小板减少症(白细胞和红细胞以及血小板各自的细胞计数低)；脾肿大或少有的肝肿大；细胞内颗粒异常、核形状和大小异常；和/或染色体异常，包括染色体易位和染色体数目异常。
尽管存在发展出急性髓性白血病的一些风险，但约50％的死亡是作为出血或感染的结果而发生。众所周知，作为脊髓发育不良的结果而发生的白血病对治疗具有抗性。
5q-脊髓发育不良(也称为5号染色体长臂缺失综合征、5号染色体长臂单体症或5q-综合征)是由人5号染色体长臂(q臂，带5q31.1)部分丢失引起的罕见障碍。5q-脊髓发育不良的特征在于巨红细胞性贫血(通常为血小板增多症、幼红细胞减少症、巨核细胞增生伴核分叶(nuclear hypolobation))以及单独的5号染色体中间缺失。5q-综合征主要见于高龄女性。
患有5q-脊髓发育不良的一些受试者具有减少的Rps14表达。miR-145和miR-146基因座的缺失与升高的血小板计数和巨核细胞发育不良(与5q-综合征相关)相关。5q-脊髓发育不良影响骨髓细胞，从而引起可导致急性髓性白血病的骨髓增生异常综合征和治疗抵抗性的贫血。骨髓的检查显示了巨核细胞中的特征性变化。它们比平时更多、更小且单核更多。在骨髓中可能伴有红系细胞再生障碍。因此，在一些实施方式中，患有5q-脊髓发育不良的受试者可具有发育不良的骨髓。患有5q-脊髓发育不良的受试者可用来那度胺(Lenalidomide)进行治疗(Bennett J等(2006).“Lenalidomide in the myelodysplasticsyndrome with chromosome 5q deletion”.N.Engl.J.Med.355(14):1456–65；Raza等(2008),“Phase 2study of lenalidomide in transfusion-dependent,low-risk,andintermediate-1 risk myelodysplastic syndromes with karyotypes other thandeletion 5q”.Blood 111(1):86–93.)
在本发明所有方面的一些实施方式中，本文公开的方法和抑制剂可用于治疗患有核糖体病(例如Shwachman-Diamond综合征)的受试者，例如，其中所述受试者具有Sbds突变。在一些实施方式中，患有Shwachman-Diamond综合征的受试者具有选自于胰功能不全、骨髓功能障碍、骨骼畸形的一种或多种症状。
在另一实施方式中，本文所公开的抑制剂可在对患有核糖体病(例如TreacherCollins综合征)的受试者进行治疗的方法中使用，例如，其中所述受试者具有TCOF1突变(核仁)。Treacher-Collins综合征是导致面部结构问题的一种通过家族传递下来(世袭)的病症。Treacher-Collins综合症是由一种被称为treacle的缺陷蛋白质引起的。该病症通过家族传递下来(遗传)。该病症的严重程度可因世代而异和因人而异。Treacher-Collins综合征的症状包括(但不限于)以下中的至少一种：耳朵外部异常或几乎完全缺失、听力损失、下颌非常小(小颌畸形)、嘴非常大、下眼睑缺陷(缺损)、头发沿至面颊、腭裂。因此，患有Treacher Collins综合征的受试者具有一种或多种颅面畸形。尽管患有Treacher Collins综合症的儿童通常将表现出正常的智力，但可在对婴儿进行可揭示多种问题的检查的基础上作出诊断，所述检查包括：(a)眼睛形状异常；(b)颧骨扁平；(c)面部裂痕；(d)下颌小；(e)低位耳；(f)耳朵异常形成；(g)耳道异常；(h)听力损失；(i)眼睛缺陷(延伸到下眼睑的缺损)；(j)下眼睑睫毛减少；(k)基因测试可帮助鉴定与该病症相关的基因变化。对TreacherCollins综合症的诊断还依赖于临床和放射照相术检查结果，而且Treacher Collins综合症中存在可通过严格的临床观察来检测的一系列典型症状。具有相似特征的疾病的广谱性使得有时难以诊断TCS。作为区分疾病的综合性和基于阶段的方法，开发了OMENS分类。这一首字母缩略词描述了五种不同的异形表现，即O：眼窝不对称；M：下颌骨发育不全；E：耳廓畸形；N：神经发育；以及S：软组织疾病。
对给予包含抑制剂的药物组合物的受试者的选择
在一些实施方式中，适合于或适用于用包含本文所公开的抑制剂的组合物治疗的受试者可基于如下进行选择：与来自正常受试者的flk1表达水平和造血细胞的正常水平的对照参比相比，造血细胞水平减少和CD34+细胞中flk1的表达减少。此外，适合于或适用于用包含本文所公开的抑制剂的组合物治疗的受试者可基于如下进行选择：与对照参比p21表达的水平相比，CD34+细胞中p21表达的水平增加。在一些实施方式中，适合于或适用于用包含本文所公开的抑制剂的组合物治疗的受试者可基于如下进行选择：与对照参比CD71+和GPA表达水平(例如在来自未患有核糖体障碍或核糖体病的正常受试者的样品中)相比，CD34+细胞中血型糖蛋白A(GPA)表达减少和CD71+表达减少。在一些实施方式中，正常参比水平是基于来自正常组织样品的细胞、或对照细胞系、或来自未患有核糖体障碍或核糖体病的正常受试者的样品中的造血细胞水平、flk1表达水平、CD71+表达水平、GPA表达水平、p21表达水平，其中，所述组织样品是来自组织匹配和物种匹配且年龄匹配的生物样品的生物组织样品。
在一些实施方式中，flk1表达水平、CD71+表达、GPA表达和p21表达水平在包含造血细胞或红系细胞或红系分化细胞的生物样品中进行测量。在一些实施方式中，从受试者获得的生物样品包括癌细胞，并且可以是如下的生物样品：血清血浆、血液或组织样品。在可替代的实施方式中，所述生物样品包括：例如血液；血浆；血清；尿液；脊髓液；胸膜液；乳头抽吸物；淋巴液；呼吸道、内部和泌尿生殖道以及皮肤的外部分泌物；胆汁；眼泪；汗液；唾液；器官；乳细胞和原发性腹水细胞；活检组织样品；体外或离体培养的活检组织样品。
包含抑制剂的药物组合物
本发明的另一方面涉及用于治疗疾病或障碍的药物组合物，所述疾病或障碍与核糖体蛋白或功能障碍相关、或者其中受试者具有核糖体病(例如DBA、脊髓发育不良(例如但不限于5q-脊髓发育不良)、Shwachman-Diamond综合征和Treacher Collins综合征)。在一些实施方式中，本发明的药物组合物包含治疗有效量的本文所公开的抑制剂中的至少一种。在一个实施方式中，所述抑制剂是例如但不限于：rps6的抑制剂；RSk p90抑制剂SL或B1；p70s6K抑制剂PF；Cam抑制剂，TF和FLU；Ca2+螯合剂BABTA；chk2抑制剂CCT和III，和抑制剂PerSuc、221E和ACV；或者例如图33的抑制剂，或式I化合物或式II化合物。
本文所公开的抑制剂能够以约0.001mg/kg体重-10mg/kg体重、或约0.005mg/kg体重-8mg/kg体重、或约0.01mg/kg体重-6mg/kg体重、或约0.1mg/kg体重-0.2mg/kg体重、或约1mg/kg体重-2mg/kg体重的量使用。在一些实施方式中，抑制剂能够以约0.1μg/kg体重-1000μg/kg体重、或约1μg/kg体重-100μg/kg体重、或约10μg/kg体重-50μg/kg体重的量使用。在一些实施方式中，本文所公开的抑制剂能够以约0.001mg/ml或0.1mg/ml的浓度或0.1mg/ml以上的浓度使用。在一些实施方式中，药物组合物包含处于约0.01μM-300μM、或约0.1μM-150μM、或约1μM至50μM、或约1μM-25μM的浓度的至少一种抑制剂。取决于所采用的剂型以及所利用的给药途径，剂量可在此范围内变化。
取决于给药途径，通过在动物模型(如小鼠)中确定抑制剂的药代动力学和生物利用度并分析特异于抑制剂的剂量-反应关系，本领域技术人员可相应地确定和调节给至受试者(如人受试者)的本文所公开的抑制剂的有效剂量。
可在细胞培养或实验动物中通过标准药学程序测定毒性和疗效，例如测定LD50(使50％的群体致死的剂量)和ED50(对50％的群体在治疗上有效的剂量)。毒性作用和治疗作用之间的剂量比为治疗指数，可以用LD50/ED50的比值来表示。优选显示出治疗指数大的组合物。
可将从细胞培养测定法和动物研究获得的数据用于得出人用剂量的范围。治疗有效剂量可由本领域普通技术人员例如使用细胞培养测定法来确定。可在动物模型中得出达到循环血浆浓度范围的剂量，所述范围包括通过实施例中描述的方法在细胞培养中测定的IC50(即，达到症状的半最大抑制的治疗剂浓度)。通过测量相比于未进行治疗而言的抑制剂的疗程中血红蛋白的水平，可在动物模型中确定抑制剂的有效剂量。在一些实施方式中，如果该剂量使血红蛋白水平、红细胞数量相比于对照(例如不存在抑制剂的情况)增加和/或使CD34+细胞中p21的表达相比于对照(例如不存在抑制剂的情况)降低至少约15％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、95％、99％或甚至100％，则认为包含抑制剂的剂量是有效的。在一些实施方式中，给予受试者的抑制剂的治疗有效量取决于普通技术人员已知的因素，包括抑制剂的生物利用度和生物活性(例如抑制剂在体内的稳定性和半衰期)、抑制剂的化学性质(例如分子量、疏水性和溶解性)；给药途径和频率、给药时间(例如餐前或餐后)等。此外，应当理解的是，提供治疗或预防益处的包含本文所公开的抑制剂的药物组合物的具体剂量可取决于多种因素，包括受试者的身体状况(例如年龄、性别、体重)、受试者的病史(例如正在服用的药物、其它疾病或障碍)以及受试者的临床状况(例如健康状况、疾病阶段)。包含抑制剂的药物组合物的精确剂量可通过技术人员(例如药理学家和医师)已知的方法来确定。
根据本发明，本文所公开的抑制剂可在给予其它治疗方案或试剂(例如多种药物方案)之前、同时或连续地以治疗有效量预防性或治疗性地给予受试者。在一些实施方式中，抑制剂与其它治疗性试剂同时给予，其可在相同的组合物或不同的组合物中进行给予。其它治疗性试剂或方案包括但不限于类固醇、皮质类固醇、输血和骨髓移植。
根据本发明的药物组合物的活性成分(例如p90S6K抑制剂；p60S6K抑制剂；RSkp90抑制剂SL、或B1、或Sk；p70s6K抑制剂，PF；Cam抑制剂，TF或FLU；Ca2+螯合剂BABTA；chk2抑制剂，CCT或III，和抑制剂PerSuc、或221E或ACV；或者例如图33的抑制剂，或式I化合物和式II化合物)可通过本领域技术人员已知的任何途径给予至个体。给药途径包括皮内、经皮(例如于缓释剂中)、肌内、腹膜内、静脉内、皮下、口服、口部、鼻部、直肠、硬膜外、局部、鞘内、直肠、颅内、气管内和鞘内和鼻内途径。可使用任何其它治疗有效的给药途径，例如通过上皮或内皮组织吸收或全身给药。另外，根据本发明的抑制剂可与生物活性剂的其它组成部分(例如药学上可接受的表面活性剂、赋形剂、载体、稀释剂和载剂)一起给予。
对于肠胃外(例如静脉内、皮下、肌内)给药，可将抑制剂与药学上可接受的肠胃外载剂(例如水、盐水、葡萄糖溶液)和添加剂联合配制成溶液剂、悬浮剂、乳剂或冻干粉末，所述添加剂维持等渗性(例如甘露醇)或化学稳定性(例如防腐剂和缓冲剂)。所述制剂通过常用的技术进行灭菌。
在一些实施方式中，给药途径是通过皮下途径给药。肌内给药是另一种可替代的给药途径。在一些实施方式中，包含抑制剂的药物组合物可作为适于全身递送的制剂进行给予。在一些实施方式中，组合物可作为适于递送至特定器官(例如但不限于肝脏)的制剂进行给予。在一些实施方式中，包含本文所公开的抑制剂的药物组合物可作为适于不通过血脑屏障的制剂进行给予。
可替代地，在一些实施方式中，药物组合物可并入凝胶、海绵或其它可渗透基质(例如，形成微丸或圆盘)且放置于肝脏内皮附近以进行持续的、局部释放。包含抑制剂的组合物能够以单剂量或多剂量进行给予，所述多剂量在不同时间进行给予。
确切的给药途径以及最佳剂量可针对各种具体的情况(主要基于疾病或障碍的性质以及该疾病的阶段)通过标准临床技术来确定。优选地，将根据本发明的药剂局部或全身施用到椎间盘或其它结缔组织中，特别地，通过口服、静脉内、肠胃外、经表皮、皮下、通过吸入或支气管肺泡灌洗经肺内、肌内、颅内、局部施用到椎间盘或其它结缔组织中。
如本文所公开的，为了核糖体疾病或障碍或核糖体病的治疗性治疗或预防(例如预防性治疗)，可向受试者给予药物组合物，所述药物组合物包含有效量的至少一种抑制剂。
在一些实施方式中，将本发明的组合物配制用于核糖体疾病和/或核糖体病(例如DBA、脊髓发育不良(例如但不限于5q-脊髓发育不良)、Shwachman-Diamond综合征和Treacher Collins综合征)，所述组合物包含本文所公开的抑制剂。在一个实施方式中，本文所公开的抑制剂是其衍生物、类似物、前药或药学上可接受的盐。
在一些实施方式中，包含至少一种本文所公开的抑制剂的药物组合物进一步包含第二治疗性试剂。在一个实施方式中，所述第二治疗性试剂是皮质类固醇。在一些实施方式中，所述第二治疗性试剂是本文所公开的钙通道阻滞剂。
在预防性应用中，可将包含抑制剂的药物组合物(或药剂)以足够消除或降低风险或延迟疾病的发作的量给予至受试者，所述受试者对核糖体疾病或障碍和/或核糖体病易感，或者在其它方面处于核糖体疾病或障碍和/或核糖体病的风险中。在一个实施方式中，本文所公开的本发明的药物组合物包含rps6抑制剂；RSk p90抑制剂，例如SL或B1；或p70s6K抑制剂，例如PF；或Cam抑制剂，TF或FLU；或Ca2+螯合剂BABTA；或chk2抑制剂，CCT或III；或以下抑制剂中的一种：PerSuc、221E或ACV、DB-4-088-2(088-2)；DB-4-088-3(088-3)；DB-4-086(086)；DB-4-087-2(087-2)；DB-4-087-3(087-3)；DB-4-089(089)，或式I化合物或式II化合物；或rps6抑制剂；或它们的对映异构体、前药、衍生物或药学上可接受的盐。
在治疗性应用中，根据本文提供的本发明，当向患有核糖体疾病或障碍和/或核糖体病的受试者给予有效量或有效剂量的包含本文所公开的抑制剂的药物组合物时，此种核糖体疾病的症状的至少一种可得到延迟或抑制。在一些实施方式中，向患有核糖体疾病或障碍和/或核糖体病的受试者给予有效量或有效剂量的包含抑制剂的药物组合物可抑制或延迟面部畸形的进展和/或与核糖体疾病或核糖体病相关的其它症状。在进一步的实施方式中，用有效剂量的包含抑制剂的药物组合物对受试者进行治疗可预防或延迟受试者中核糖体疾病或核糖体病的症状。
在一些实施方式中，本发明还提供了用于实施本文所述的治疗性和预防性方法的组合物，所述组合物包含本文所讨论的抑制剂。在一些实施方式中，可对抑制剂与另一种治疗性试剂的组合调整为适于组合成药物组合物，其中每种治疗剂可靶向不同的症状、不同的疾病或不同的障碍。在进一步的实施方式中，抑制剂和另一种治疗剂可一起混合在本文所公开的药物组合物中。在其它实施方式中，当组合在药物组合物中时，抑制剂和另一种治疗剂能够以不同的制剂存在。例如，在一个实施方式中，所述抑制剂可存在于液体制剂中，而另一种治疗剂可冻干成粉末。本文所公开的药物组合物中不同活性成分的制剂可通过各种因素(如药物的物理性质和化学性质、生物利用度、给药途径、以及药物是持续释放还是突然释放)相应地进行优化，所述活性成分例如rps6抑制剂；p90S6K抑制剂或p70S6K抑制剂；RSk p90抑制剂SL、B1；p70s6K抑制剂PF；Cam抑制剂，TF和FLU；Ca2+螯合剂BABTA；chk2抑制剂CCT和III，和抑制剂PerSuc、221E和ACV；或图33的抑制剂化合物，或式I化合物或式II化合物。本发明的治疗性组合物和预防性组合物可进一步包含生理学上可耐受的载体以及本文所公开的抑制剂(rps6的抑制剂；p90S6K抑制剂或p70S6K抑制剂；RSk p90抑制剂SL、B1；p70s6K抑制剂PF；Cam抑制剂，TF和FLU；Ca2+螯合剂BABTA；chk2抑制剂CCT和III，和抑制剂PerSuc、221E和ACV，或式I化合物或式II化合物)或它们的衍生物、对映体、前药或药学上可接受的盐。在另外的实施方式中，当组合在本文所公开的本发明的药物组合物中时，抑制剂和另一种治疗剂可采用不同的生理学上可耐受的载体。
在一些实施方式中，本文所公开的药物组合物包含抑制剂以及其它治疗剂和药学上可接受的赋形剂。用于本发明的抑制剂及其制剂的合适的载体描述于由Oslo等编著的Remington’s Pharmaceutical Sciences，第16版，1980，Mack Publishing Co.中。通常而言，在制剂中使用适量的药学上可接受的盐以赋予该制剂等渗性。载体的实例包括缓冲剂(如盐水、林格氏溶液和葡萄糖溶液)。进一步的载体包括持续释放制剂，如固体疏水性聚合物的半渗透性基质(该基质处于成型制品的形式，例如脂质体、薄膜或微粒)。对本领域技术人员而言将显而易见的是，取决于例如待给予抑制剂的浓度和给药途径，某些载体可以是更优选的。
在一些实施方式中，还可通过使用增加抑制剂在受试者内的半衰期的缀合程序，例如通过如WO 92/13095(以引用的方式将其整体并入本文)中所述的将抑制剂连接至聚乙二醇，来改善根据本发明的抑制剂的生物利用度。
在一些实施方式中，根据本发明的抑制剂的生物利用度还可通过将抑制剂包封在生物相容的递送载剂中来增强，所述生物相容的递送载剂增加抑制剂在人体内的半衰期。示例性的生物相容的递送载剂包括聚合物载剂(如基于PEG的载剂、或基于脂质体的载剂)。
在一些实施方式中，抑制剂可作为活性成分溶解于或分散在生理学上可耐受的载体中，以增加抑制剂在受试者内的半衰期。
药物组合物的制备在本领域中是容易理解的，并且并不需要基于制剂进行限制，所述药物组合物含有溶解或分散于其中的活性成分(例如rps6抑制剂；p90S6K抑制剂或p70S6K抑制剂；RSk p90抑制剂SL或B1；p70s6K抑制剂PF；Cam抑制剂，TF和FLU；Ca2+螯合剂BABTA；chk2抑制剂CCT和III，以及抑制剂PerSuc、221E和ACV；或者例如图33的抑制剂；或式I化合物或式II化合物)。通常将此类组合物制备成可注射的液体溶液或悬浮液，然而，也可制备适用于在使用前溶解或悬浮在液体中的固体形式。制剂也可是乳化的或者作为脂质体组合物存在。在一些实施方式中，抑制剂可与赋形剂混合，所述赋形剂是药学上可接受的且与活性成分相容，并处于适于在本文所述的治疗性方法中使用的量。另外，如果需要，包含抑制剂的组合物可含有少量的增强活性成分的效力的辅助物质(如润湿剂或乳化剂、pH缓冲试剂等)。
生理学上可耐受的载体(即生理学上可接受的载体)是本领域熟知的。对药学上可接受的载体的选择可由技术人员通过给药方式来完成。例如，如果口服给予组合物，则可将其配制成包衣片剂、液体剂、囊片等。示例性的液体载体是无菌的水性溶液(除活性成分和水以外不含任何物质，或者含有缓冲剂(如处于生理pH值的磷酸钠)、生理盐水或两者(如磷酸盐缓冲盐水)。更进一步，水性载体可含有多于一种的缓冲盐以及诸如氯化钠和氯化钾的盐、葡萄糖、聚乙二醇和其它溶质。对于局部施用，载体可以处于例如但不限于以下形式：膏剂、霜剂、凝胶、糊剂、泡沫、气溶胶、栓剂、垫片或凝胶棒。在一些实施方式中，将组合物制备成可注射剂，作为液体溶液或悬浮液；也可制备成适用于在注射前溶解或悬浮在液体载剂中的固体形式。如上所述，所述制剂还可以是乳化的或包封在脂质体或微粒(如聚交酯、聚乙交酯或共聚物)中以增强辅助效果(参见Langer,Science 249,1527(1990)和Hanes,Advanced Drug Delivery Reviews 28,97-119(1997))。本文所公开的抑制剂能够以积存注射或植入制剂的形式进行给予，其能够以允许活性成分持续释放或脉冲释放的方式进行配制。
如本文所使用的，“本文所公开的抑制剂”包括例如rps6抑制剂；p90S6K抑制剂或p70S6K抑制剂；RSk p90抑制剂SL或B1；p70s6K抑制剂PF；Cam抑制剂，TF和氟奋乃静(FLU)；Ca2+螯合剂BABTA；chk2抑制剂CCT和III，和抑制剂PerSuc、221E和ACV；以及DB-4-083、DB-4-084、DB-4-088-2、DB-4-088-3、DB-4-086、DB-4-087-2、DB-4-087-3、DB-4-089，式I化合物和式II化合物，以及它们的衍生物和类似物(对于结构，参见例如图5、图31、图32和图33)。
适用于其它给药模式的其它制剂包括口服制剂、鼻内制剂和肺部制剂、栓剂和经皮施用。对于栓剂，粘合剂和载体包括例如聚亚烷基二醇或甘油三酯；此类栓剂可由含有处于0.5％-10％、优选1％-2％范围内的活性成分的混合物形成。口服制剂包括赋形剂，如药用级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素和碳酸镁。这些组合物采用溶液剂、混悬剂、片剂、丸剂、胶囊剂、持续释放剂或散剂的形式，并含有10％-95％、优选25％-70％的活性成分。
考虑到本领域的一般知识和技术，技术人员将能够确定给予包含本文所公开的至少一种LSF抑制剂的药物组合物的合适方式。
治疗方案
本发明的另一方面涉及用于疾病或障碍的治疗性和预防性治疗的方法，其中对p53活化的抑制对于核糖体障碍或核糖体病的治疗或预防而言是期望的。所述方法包括向有需要的受试者给予药物组合物，所述药物组合物包含治疗有效量的至少一种抑制剂，所述抑制剂选自诸如以下的化合物以及本文所公开的类似物和变体中的任意一种或组合：rps6、p90S6K或p70S6K的小分子或蛋白质抑制剂；p90S6K抑制剂SL和B1；p70s6K抑制剂PF；Cam抑制剂，TF和FLU；Ca2+螯合剂BABTA；chk2抑制剂CCT和III，和抑制剂PerSuc、221E和ACV；和图33的化合物和式I化合物和式II化合物。
在一个实施方式中，通过本发明的方法和组合物用本文所公开的抑制剂对Diamond-Blackfan贫血(DBA)进行治疗或预防。
用于治疗核糖体疾病或障碍或与核糖体病相关的障碍的、包含本文所公开的抑制剂的药物组合物的有效剂量取决于许多不同的因素，包括给药方式、受试者的生理状态、受试者是人还是动物、给予的其它药剂以及治疗是预防性还是治疗性的。取决于受试者的临床状况，本领域技术人员(例如医师)可随着时间相应地调整本发明药物组合物的剂量和频率。
在治疗性应用中，直至疾病的进展得到降低或终止，或者直至受试者显示疾病症状的部分或完全缓解，在相对短的间隔内的相对高的剂量有时是需要的。此后，可向受试者给予预防性方案。例如，可用处于治疗性方案中的有效剂量的本文所公开的抑制剂对患有DBA的受试者进行治疗，以相应地将p21水平和/或p53水平减少至正常水平，然后给予维持剂量(例如预防性地)。在一些实施方式中，可在用皮质类固醇治疗之前、同时、连续地和/或当受试者经历辅助治疗(例如输血和/或骨髓移植)时，向受试者给予本文所公开的抑制剂。在一些实施方式中，例如选择其它治疗性程序或外科手术(例如输血和/或骨髓移植)的DBA受试者可用本文所公开的抑制剂进行治疗。例如，本发明的药物组合物可在治疗性程序之前、期间或之后给予。给药途径可随治疗性程序或外科手术而变化，并且可由技术人员确定。在另一实施方式中，本发明的组合物和方法可用作辅助疗法。
在一些实施方式中，受试者是人；而在可替代的实施方式中，受试者是非人哺乳动物。需要对治疗剂量加以调整以对安全性和功效进行优化。抑制剂的量取决于疾病的阶段以及物种。
在一些实施方式中，可将抑制剂以药物组合物给予至受试者，所述药物组合物包含如下量的抑制剂：约0.001mg/kg体重-10mg/kg体重、或约0.005mg/kg体重-8mg/kg体重、或约0.01mg/kg体重-6mg/kg体重、或约0.1mg/kg体重-0.2mg/kg体重、或约1mg/kg体重-2mg/kg体重。在一些实施方式中，能够以如下的量使用抑制剂：约0.1μg/kg体重-1000μg/kg体重、或约1μg/kg体重-100μg/kg体重、或约10μg/kg体重-50μg/kg体重。在一些实施方式中，抑制剂能够以约0.001mg/ml或0.1mg/ml的浓度或0.1mg/ml以上的浓度进行给予。在可替代的实施方式中，药物组合物包含处于如下浓度的至少一种抑制剂：约0.01μM-300μM、或约0.1μM-150μM、或约1μM-50μM、或约1μM-25μM。
在一些实施方式中，可根据所述方法以有效剂量将本文所公开的抑制剂给予至受试者，以使从受试者获得的红系细胞群中的CD71+细胞的水平相比于不存在抑制剂的情况增加至少约1％、至少约2％、至少约3％、至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％或超过50％。
在另一实施方式中，可根据本文所公开的方法以有效剂量将本文所公开的抑制剂给予至受试者，以使存在于从受试者获得的红系细胞群中的CD34+细胞中的p21表达的水平相比于不存在抑制剂的情况减少至少约1％、至少约2％、至少约3％、至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约98％、至少约99％或超过99％。
一般而言，有效剂量和给药时间表可基于例如治疗结果(如受试者的贫血症状是否降低、和/或与核糖体蛋白障碍(如DBA)相关的症状中至少一种是否降低)进行调整。根据本文提供的教导，治疗效力可通过如下来进行监测：从受试者获得生物样品(例如血清样品)并使用本领域熟知的方法以及下文中公开的诊断方法来测定针对DBA的生物标志物的水平(如红系细胞群中CD71+细胞的百分比和/或CD34+细胞中p21的水平)。
在一些实施方式中，能够以对于获得期望结果有效的单剂量、分剂量或持续释放形式给予日剂量，所述日剂量以包含抑制剂的大剂量(bolus)组合物的形式给予受试者。能够以相同于、少于或大于给予个体的初始或先前剂量的剂量进行第二给予或后续给予。可在疾病发作期间或之前给予第二给予或后续给予。以低于实现期望治疗效果所需要的水平的剂量开始，然后逐渐增加剂量直至期望的效果得以实现，这一点也在本领域技术范围内。
包含本文所公开的至少一种抑制剂的药物组合物可通过肠胃外、局部、静脉内、口服、皮下、腹膜内、鼻内或肌内的方式进行给予，以用于预防性和/或治疗性治疗。例如，对癌症(例如HCC)的治疗而言，包含至少一种LSF抑制剂的药物组合物可进行全身注射(例如通过静脉内注射或者通过注射或施用至相关位点(如通过直接注射到肿瘤中、或者在外科手术中暴露该位点时直接施用至该位点))。本文所公开的抑制剂的其它给药途径是肌内(i.m.)、静脉内(i.v.)、皮下(s.c.)或口服，但其它途径可同样有效。肌内注射最通常在手臂或腿部肌肉中进行。在一些方法中，本文所公开的抑制剂可作为持续释放组合物或装置(例如MedipadTM装置)进行给予。
在一些实施方式中，本文所公开的抑制剂可任选地与其它试剂(如输血、骨髓移植等)组合给予，所述试剂在治疗核糖体蛋白疾病和障碍方面至少是部分有效的。在其它实施方式中，本发明的抑制剂可以在给予另一种治疗剂之前、同时或之后给予，所述另一种治疗剂靶向另一种疾病或障碍或者不同的症状。
在各种实施方式中，抑制剂可以是前药，其中所述前药由第二试剂活化。因此，在此类实施方式中，可在给予包含本文所公开的抑制剂的药物组合物的同一时刻、同时或之前或之后给予此种的第二试剂，所述第二试剂将抑制剂的前药活化成其活性形式。
在一些实施方式中，本文所公开的抑制剂经常作为药物组合物进行给予，所述药物组合物包含活性治疗性试剂和多种其它药学上可接受的组成部分，所述活性治疗性试剂例如为：rps6抑制剂；p90S6K抑制剂或p70S6K抑制剂；RSk p90抑制剂SL和B1；p70s6K抑制剂PF；Cam抑制剂，TF和FLU；Ca2+螯合剂BABTA；chk2抑制剂CCT和III，和抑制剂PerSuc、221E和ACV；以及图33和式I和式II的抑制剂。参见Remington’s Pharmaceutical Science(第15版,Mack Publishing Company,Easton,Pa.,1980)。组合物的制剂取决于预期的治疗性应用和给药模式。取决于期望的制剂，组合物还可包含药学上可接受的、无毒的载体或稀释剂，所述载体或稀释剂定义为通常用于配制动物或人给药用的药物组合物的载剂。为了不影响组合的生物活性，对稀释剂进行选择。此类稀释剂的实例为蒸馏水、磷酸盐缓冲生理盐水、林格氏溶液、葡萄糖溶液和Hank溶液。另外，药物组合物或制剂还可包含其它载体、佐剂，或无毒的、非治疗性、非免疫原性稳定剂等。然而，一些适合给予动物的试剂可能不一定用于人用组合物中。
对于肠胃外给药，可在生理学上可接受的稀释剂与药学上可接受的载体中，将本文所公开的抑制剂作为可注射剂量的物质的悬浮液或溶液进行给予，所述载体可以是无菌液体(如水、油、盐水、甘油、或乙醇)。此外，组合物中可存在辅助物质，如润湿剂或乳化剂、表面活性剂、pH缓冲物质等。药物组合物的其它组成部分为石油、动物、植物或合成来源的那些，例如花生油、大豆油和矿物油。一般而言，二醇类(如丙二醇或聚乙二醇)是优选的液体载体，特别是对于可注射的溶液剂而言。
局部施用可在经皮递送或皮内递送中产生。通过将试剂与霍乱毒素或其去毒衍生物或亚类或其它类似的细菌毒素共同给药可促进局部给药(参见Glenn等，Nature 391,851(1998))。可通过将所述组成部分用作混合物或连接分子(获得自化学交联或作为融合蛋白的表达)来实现共同给药。
其它给药模式包括全身递送。在一些实施方式中，本文所公开的至少一种抑制剂可进行全身注射(例如通过静脉内注射或通过注射或施用至相关位点(如在外科手术中暴露该位点时直接施用至该位点))。在一些实施方式中，对于全身给药，本发明的药物组合物可配制成片剂并口服使用。在各种实施方式中，本发明的药物组合物可进一步包含非活性成分，即对于治疗疾病、障碍或症状没有治疗价值的成分(如生理学上可接受的载体)。
在各种实施方式中，在特别考虑之列的是通过添加聚合物对抑制剂进行修饰，例如使用共价连接至聚合物。在其它实施方式中，抑制剂可与生物相容的聚合物混合或包封在生物相容的聚合物中。
在另一方面，可生物降解的或可吸收的聚合物可提供本文所公开的抑制剂的延长释放(一般是局部的)。对治疗性试剂而言，增加的半衰期或延长释放的潜在益处是显而易见的。局部释放的潜在益处在于如下能力：相对于更广泛的全身给药，在更长的时间内实现更高的局部剂量或浓度，且有潜力避免全身给药可发生的可能的不期望的副作用。
适用于递送本文所公开的抑制剂或其变体或片段或衍生物的生物可吸收的聚合物基质可选自于在文献中广泛描述的多种合成的生物可吸收的聚合物。此类可在数周或数月内释放蛋白质的合成的生物可吸收的、生物相容的聚合物可包括例如：多羟基酸(例如聚交酯、聚乙交酯以及它们的共聚物)、聚酐、聚原酸酯、聚乙二醇和聚对苯二甲酸丁二醇酯的分段型嵌段共聚物(POLYACTIVETM)、酪氨酸衍生物聚合物或聚(酯-酰胺)。用例如在美国专利No.4,968,317和No.5,618,563(以引用的方式将其整体并入本文)等中；在由S.W.Shalaby编著的“Biomedical Polymers”,Carl Hanser Verlag,Munich,Vienna,NewYork,1994中，以及在上述出版物中引用的许多参考文献中，对于制造药物递送材料和植入物的合适的生物可吸收的聚合物进行了讨论。应当选择的具体生物可吸收的聚合物将取决于正在进行治疗的具体患者。
本发明的方法还用于对正在向受试者给予的疗程进行监测。该方法可用于对有症状的受试者上的治疗性治疗和无症状的受试者上的预防性治疗两者进行监测。
如果相比于参比水平或不存在抑制剂的情况，使从受试者获得的生物样品中存在的CD34+细胞中的p21的表达水平减少了至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约98％、约99％或约100％，则认为给予受试者的治疗是有效的。在此类实施方式中，所述参比水平是从处于先前时间点的受试者(例如尚未给予抑制剂的受试者)获得的生物样品中存在的CD34+细胞中的p21的测量值。基于治疗结果，本领域技术人员可相应地调整使用本文所公开的方法和组合物的给药的剂量和频率。
可使用任何免疫测定法来确定生物样品中CD34+细胞中的p21表达的水平，例如本领域公知的并且涵盖在内以用于本发明中的ELISA或免疫组织化学方法。
试剂盒
本发明的另一方面涉及试剂盒，所述试剂盒包含一种或多种本文所公开的抑制剂(例如rps6抑制剂；p90S6K抑制剂或p70S6K抑制剂；RSk p90抑制剂SL或B1；p70s6K抑制剂PF；Cam抑制剂，TF和FLU；Ca2+螯合剂BABTA；chk2抑制剂CCT和III，和抑制剂PerSuc、221E和ACV；以及图33、和式I和式II的化合物)以及实施本文所公开的方法的说明书。
在一些实施方式中，试剂盒可任选地额外包含用于测量来自受试者的生物样品(如，例如血液样品)中p21表达水平的试剂或药剂，例如以鉴定用本文所公开的抑制剂进行治疗的功效。此类药剂在本领域中是熟知的，并且包括但不限于特异性结合p21蛋白和/或mRNA等的经标记的抗体。在一些实施方式中，所述经标记的抗体是经荧光标记的、或者是用磁珠等标记的。在一些实施方式中，本文所公开的试剂盒可进一步包含至少一种或多种试剂，所述试剂用于在高通量测定法中对来自受试者的生物样品进行性能分析和注释。
在一些实施方式中，所述试剂盒可进一步包含用于向有需要的受试者(例如患有核糖体疾病或障碍(例如DBA))给予包含抑制剂的组合物的说明书以及针对剂量的说明书等。
除了上述组成部分之外，所述试剂盒还可包含信息材料。所述信息材料可以是描述性的、说明性的、营销性的或者是涉及本文所述的方法和/或所述组成部分用于本文所述的测定法、方法和系统的用途的其它材料。
在一些实施方式中，包含本文所公开的抑制剂的试剂盒和方法可由服务提供商执行，例如，研究人员或医师可将生物样品寄送至诊断实验室服务提供商，以测量来自受试者的生物样品中存在的红系细胞群中CD71+细胞的水平和/或CD34+细胞中p21表达的水平。在此类实施方式中，在进行此类测量之后，服务提供商可向研究人员或医师提供抑制剂功效的报告和/或报告受试者是否适用于或适合于根据本文所公开的方法和组合物用抑制剂进行治疗。
在可替代的实施方式中，服务提供商可向研究人员提供来自受试者的生物学样品中存在的红系细胞群中CD71+细胞的水平和/或CD34+细胞中p21、p53表达的水平的原始数据，并将分析留给研究人员或医师进行。在一些实施方式中，通过电子手段(例如在安全的网站上上传的或通过电子邮件或其它电子通信手段寄送的)将报告传送或寄送至研究人员。在一些实施方式中，研究人员可通过任何手段(例如，通过邮件、快件等)将样品寄送给服务提供商，或者可替代地，服务提供商可提供从研究人员处收集样品并将其运输至服务提供商的诊断实验室的服务。在一些实施方式中，研究人员可将待分析的样品存放在服务提供商诊断实验室的位置处。在可替代的实施方式中，服务提供商提供随行(stop-by)服务(其中服务提供商将员工派送到研究人员的实验室)，并且还提供用于进行该测定法的试剂盒、设备、试剂，以在研究人员的实验室中对来自本文所公开的受试者的生物样品中存在的红系细胞群中的CD71+细胞的水平和/或CD34+细胞中p21表达的水平进行测量，并且对结果进行分析以及向研究人员提供各个受试者的报告，并使医师做出恰当的治疗建议和剂量，以根据本文所公开的方法用包含抑制剂的组合物给予受试者。
以下编号的段落代表本发明的实施方式：
段落1.一种治疗患有核糖体障碍或核糖体病的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者给予有效量的核糖体s6激酶RSK(p90S6k)抑制剂，以在所述受试者中的红系细胞、红系分化细胞或CD34+细胞的至少一种中减少p90S6K的活性和减少活性p53。
段落2.如段落1所述的方法，其中，所述p90S6k抑制剂对选自于由RSK1、RSK2和RSK3所组成的组中的变体进行抑制。
段落3.如段落1所述的方法，其中，所述p90S6k抑制剂选择性地抑制RSK2。
段落4.如段落1所述的方法，其中，所述p90S6k抑制剂为核酸、小分子化合物或蛋白质。
段落5.如段落1所述的方法，其中，所述p90S6k抑制剂为SL0101(SL)或SL0101(SL)的衍生物或类似物，其中，SL0101(SL)具有以下结构：
段落6.如段落1所述的方法，其中，所述p90S6k抑制剂为BI-D1870(BI)或BI-D1870(BI)的衍生物或类似物，其中，BI-D1870(BI)具有以下结构：
段落7.一种治疗患有核糖体障碍或核糖体病的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者给予有效量的RSK(p70S6k)抑制剂，以在所述受试者中的红系细胞、红系分化细胞或CD34+细胞的至少一种中减少p70S6K的活性和减少活性p53。
段落8.如段落7所述的方法，其中，所述p70S6K抑制剂为核酸、小分子化合物或蛋白质。
段落9.如段落7所述的方法，其中，所述p70S6K抑制剂为PF-4708671(PF)或PF-4708671(PF)的衍生物或类似物，其中，PF-4708671(PF)具有以下结构：
段落10.一种治疗患有核糖体障碍或核糖体病的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者给予有效量的Chk2抑制剂，以在所述受试者中的红系细胞、红系分化细胞或CD34+细胞的至少一种中减少活性p53，其中，所述Chk2抑制剂包括选自于由CCT和III所组成的组中的化合物或其衍生物，其中，CCT和III具有以下结构：
段落11.一种治疗患有核糖体障碍或核糖体病的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者给予有效量的钙调蛋白抑制剂，以在所述受试者中的红系细胞、红系分化细胞或CD34+细胞的至少一种中减少活性p53，其中所述钙调蛋白抑制剂是吩噻嗪化合物或吩噻嗪化合物的衍生物或类似物，其中所述吩噻嗪化合物选自于由具有以下结构的ACV-1-235(ACV)、JJM-II-221E(221E)和DB1026(PerSucc)所组成的组：
段落12.一种治疗患有核糖体障碍或核糖体病的受试者的方法，所述方法包括给予有效量的吩噻嗪化合物或吩噻嗪化合物的衍生物或类似物，其中，所述吩噻嗪化合物选自于由具有以下结构的DB-4-083(083)、DB-4-084(084)、DB-4-088-2(088-2)、DB-4-088-3(088-3)、DB-4-086(086)、DB-4-087-2(087-2)、DB-4-087-3(087-3)、DB-4-089(089)
所组成的组：
段落13.一种治疗患有核糖体障碍或核糖体病的受试者的方法，所述方法包括给予有效量的组合物，所述组合物包含吩噻嗪化合物或吩噻嗪化合物的衍生物或类似物，其中，所述吩噻嗪化合物为式(I)化合物及其异构体和药学上可接受的盐：
其中：
X为O或S；
R1为H、烷基、烯基、炔基、环基、杂环基、酰基、芳基、杂芳基、烷基杂芳基或烷基芳基；
R各自独立地为H、卤素、烷基、烷基、烯基、炔基、卤代烷基、CN、OH、NH2、烷基氨基、二烷基氨基、CO2H、酰基、SH、硫代烷氧基、SO2H或SO3H。
段落14.一种治疗患有核糖体障碍或核糖体病的受试者的方法，所述方法包括给予有效量的组合物，所述组合物包含吩噻嗪化合物或吩噻嗪化合物的衍生物或类似物，其中，所述吩噻嗪化合物为式(II)化合物及其异构体和药学上可接受的盐：
其中：
R21各自独立地选自于由如下所组成的组：H、卤素、烷基、卤代烷基、CN、OH、NH2、烷基氨基、二烷基氨基、CO2H、酰基、SH、硫代烷氧基、SO2H和SO3H。
段落15.一种治疗患有核糖体障碍或核糖体病的受试者的方法，所述方法包括给予有效量的组合物，所述组合物包含吩噻嗪化合物或吩噻嗪化合物的衍生物或类似物，其中，所述吩噻嗪化合物为具有如下结构的化合物：
段落16.一种治疗患有核糖体障碍或核糖体病的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者给予有效量的钙通道阻滞剂BAPTA-AM或其衍生物或类似物，以在至少一种CD34+细胞中减少活性p53，其中，BAPTA-AM具有以下结构：
段落17.如段落1-16中任一段所述的方法，其中，所述患有核糖体障碍的受试者具有Diamond Blackfan贫血(DBA)或遗传性幼红细胞减少症。
段落18.如段落17所述的方法，其中，所述受试者具有DBA1、DBA2、DBA3、DBA4、DBA5、DBA6、DBA7或DBA8。
段落19.如段落1-16中任一段所述的方法，其中，所述受试者具有核糖体蛋白19(RPS19)突变。
段落20.如段落1-16中任一段所述的方法，其中，所述受试者具有核糖体蛋白突变，所述核糖体蛋白选自于：RPS7、RPS10、RPS19、RPS24、PRS26、RPS17、PRS27LRPS29.RPL35A、PRL5和PPL11。
段落21.如段落1-16中任一段所述的方法，其中，所述受试者具有核糖体蛋白突变，所述核糖体蛋白选自于由如下所组成的组：rPL2A、rPL2B、rPL3、rpL4A、rPL4B、rPL7A、rPL7B、rPL10、rPL11、rPL16A、rPL17A、rPL17B、rPL18A、rPL18B、Rpl19A、rPL19、rPL25、rPL29、rpL31A、rpL31B、rPL36A、rPL40A、rPS1A、rPS6A、rPS6B、rPS14A、rPS15、rPS19、rPS23B、rPS25A、rPS26B、rPS29、rPS29B以及rPS31。
段落22.如段落1-16中任一段所述的方法，其中，向所述受试者给予另一种治疗性试剂以治疗所述核糖体蛋白的缺陷，所述治疗性试剂选自于由皮质类固醇、输血所组成的组。
段落23.如段落1-16中任一段所述的方法，其中，所述有效量增加所述受试者中的CD71+红系细胞的数量。
段落24.如段落1-16中任一段所述的方法，其中，所述有效量增加所述受试者中的血红蛋白水平。
段落25.如段落1-16中任一段所述的方法，其中，所述受试者具有颅面畸形或巨红细胞性贫血的症状。
段落26.如段落1-16中任一段所述的方法，其中，所述核糖体病是脊髓发育不良。
段落27.如段落1-16中任一段所述的方法，其中，所述脊髓发育不良是5q-脊髓发育不良。
段落28.如段落1-16中任一段所述的方法，其中，所述受试者具有Rps14突变或者Rps14的表达减少。
段落29.如段落1-16中任一段所述的方法，其中，所述受试者具有骨髓发育不良的症状。
段落30.如段落1-16中任一段所述的方法，其中，所述核糖体病是Shwachman–Diamond综合征。
段落31.如段落1-16中任一段所述的方法，其中，所述受试者具有Sbds突变。
段落32.如段落1-16中任一段所述的方法，其中，所述受试者具有选自如下的症状：胰功能不全、骨髓功能障碍、骨骼畸形。
段落33.如段落1-16中任一段所述的方法，其中，所述核糖体病是TreacherCollins综合征。
段落34.如段落1-16中任一段所述的方法，其中，所述受试者具有TCOF1(核仁)突变。
段落35.如段落1-16中任一段所述的方法，其中，所述受试者具有颅面缺损的症状。
应当理解的是，上面的详细描述和以下实施例仅是说明性的，而不应视为是对本发明的范围进行的限制。在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可对所公开的实施方式进行各种改变和修改，这些改变和修改对于本领域技术人员而言是显而易见的。此外，为了描述和公开的目的，通过引用的方式将所标明的所有专利以及其它出版物明确并入本文，例如，此类出版物中描述的可与本发明一起使用的方法学。这些出版物仅仅由于它们的公开早于本申请的申请日而提供。在这一方面不应当视作承认本发明人没有权利借助于先前的发明或因为任何其它原因而将此类公开提前。所有关于这些文件的日期的声明或这些文件的内容的表述是基于申请人可得的信息，并且不构成关于这些文件的日期或这些文件的内容的正确性的任何承认。本文引用的所有参考文献、专利和出版物均通过引用的方式将其整体并入。
实施例
尽管可在本发明的实践或测试中使用任何已知的方法、装置和材料，但是本文对这一方面的方法、装置和材料进行了描述。
本文提出的实施例涉及用于治疗核糖体障碍或核糖体病(例如但不限于DBA)的方法和组合物，所述方法和组合物包含至少一种本文所公开的抑制剂。在整个申请中，引用了各种出版物。将所有出版物的公开内容和那些出版物中引用的那些参考文献的以整体引用的方式并入本申请，以便更全面地对本发明所属领域的状态进行描述。以下实施例并非旨在将权利要求的范围限制于本发明，而是旨在作为某些实施方式的示例。技术人员想到的示例性方法中的任何改变都旨在落入本发明的范围内。
材料和方法
胚胎操作和化学处理
将鱼维持在经批准的实验室条件下。对AB野生株和hi2903(核糖体蛋白S29(rps29)的第一个内含子中的插入突变体)进行研究。用稀释在E3中的化学品处理胚胎。为了筛选，将来自ICCB Biomol Known Bioactive、Sigma和Lopac文库的化学品从文库储液以1:300的稀释度进行测试。化合物在两个独立的实验(各自20个胚胎)中进行测试，因此就每个化学品而言对大约10个突变体胚胎进行评分。将化合物稀释在DMSO或水中，并以5μg/mL-50μg/mL的剂量针对原位杂交和联苯胺染色进行测试。
如所述的进行整体原位杂交(ISH)(Thisse和Thisse，2008)。从经消化的质粒合成反义探针。如先前所述的进行邻联茴香胺(Paffett-Lugassy与Zon，2005)。
细胞培养和感染
用先前描述的靶向RPS19的慢病毒shRNA(Dutt等，2011)感染A549和CD34+细胞。除非另有说明，在感染后一天加入药物，并在感染后3天-6天收集细胞用于分析。
流式细胞术和免疫荧光
对于基于流式细胞术的蛋白质水平测量，将细胞在2％多聚甲醛中于37℃下固定15分钟，并加入甲醇在4℃下孵育过夜。将细胞在经1:100稀释的p21一抗(Cell Signaling12D1)中孵育1小时，然后在缀合二抗和经1:50稀释的p53-缀合抗体(Cell Signaling1C12)中孵育1小时。如先前所述的进行免疫荧光染色(Dutt等，2011)。
实施例1
核糖体蛋白突变在患有Diamond Blackfan贫血(DBA)的患者中是常见的，所述患者具有红细胞再生障碍和颅面畸形。本发明人先前已经描述了斑马鱼的rps29突变体(rps29是小亚基中的核糖体蛋白)。Rps29-/-胚胎具有头部形态缺陷以及减少的造血干细胞、血红蛋白和内皮细胞标志物的染色。与DBA的其它模型一致，敲低p53近乎完全挽救了rps29突变体表型。为了鉴定出可挽救rps29突变体表型的化学品，本发明人进行了体内化学筛选。发现抑制剂挽救形态、内皮细胞和血红蛋白表型。
斑马鱼RPS29突变体具有p53-依赖性造血表型
已将斑马鱼工作集中于rps29突变体(Amsterdam等，2004)。本发明人先前报道了Rps29突变体胚胎最初具有造血缺陷和内皮缺陷(Burns等，2009)。Rps29-/-胚胎在动脉特化方面具有缺陷，导致受精后24小时(hpf)的节间血管中减少的flk1表达以及减少的造血干细胞。因为rps29-/-胚胎具有较少的血红蛋白，原始红细胞生成尤其受到影响，而原始骨髓细胞生成未受影响。正如通过头部形态变化和TUNEL染色所见到的，rps29突变体胚胎具有增加的细胞凋亡。微阵列分析证明了在突变体胚胎中p53及其靶标的活化。当p53突变杂交进入rps29突变体的背景时，所有的造血和细胞凋亡表型都得到挽救。在本文中，本发明人证明了p53活化在rps29突变体表型中的关键作用。rps29突变体的这一特性描述和p53依赖性机制的鉴定最近发表于Journal of Experimental Hematology(Taylor等，2012；以引用的方式将其整体并入本文)。
化学筛选发现特定Chk2抑制剂挽救rps29-/-缺陷
进行筛选以鉴定出可挽救rps29-/-突变体胚胎的内皮缺陷和形态缺陷的化学品(图5)。具体而言，我们对CaM依赖性激酶挽救rps29-/-突变体胚胎的能力进行了评估。令人惊奇的是，在大量的CaM依赖性激酶中，仅仅Chk2抑制剂挽救良好，然后通过体外激酶筛选(参见图12和图13)，我们随后通过RSK和p70s6k的抑制确定了，Chk2抑制剂CCT和III是有效的。对Rps29+/-鱼进行杂交，并收集处于蕾状期(bud stage)(10hpf)的胚胎用于处理。从蕾状期至23hpf，用已知生物活性的化合物对胚胎进行处理。在对头部形态的挽救进行评分后，将胚胎固定在24hpf进行原位杂交并对Hb表达挽救进行监测。
Chk2抑制剂CCT挽救Hb：
Chk2抑制剂III挽救Hb：
已知其它萘磺酰胺(包括A-7和W-5)抑制钙调蛋白并且先前证明了也救脉管系统缺陷。
实施例2
特定吩噻嗪衍生物增加rps29-/-胚胎中的血红蛋白
进行联苯胺测定法。对于药物处理，对rps29+/-进行杂交，并对处于50％外包(大约受精后5小时(hpf))的胚胎进行收集和处理。如先前所述的在40hpf进行联苯胺染色(Paffett-Lugassy和Zon，2005)。图25示出了在化合物ACV和PerSucc的rps29-/-斑马鱼中，Hb表达的明显挽救、血红蛋白挽救。0对照中Hb水平差异的原因在于这些是不同的实验，而且在不同的鱼群(clutches)中Hb存在变化。
实施例3
新的吩噻嗪衍生物改善多种DBA模型中的红系细胞缺陷
我们先前演示了具有rps29基因(其编码核糖体蛋白S29)突变的斑马鱼胚胎模型DBA(Taylor,A.M.等)。存在具有RPS29突变的患者的子集，我们先前确定了RPS29是DBA致病基因(Mirabello,L.等)。与核糖体蛋白功能障碍的其它动物模型一致，rps29-/-斑马鱼中的p53敲低挽救了红系细胞缺陷。为了找到可挽救DBA表型的新的化合物，我们在我们的斑马鱼DBA模型中进行了体内化学筛选，并发现钙调蛋白(CaM)抑制剂阻断p53活性并挽救了红系细胞缺陷。将CaM抑制剂施用至RPS19缺陷的人CD34+细胞，减轻了对红系分化的阻断。此外，将FDA批准的CaM抑制剂三氟拉嗪(TFP)注射至DBA诱导型小鼠模型中(Jaako,P等)，显着增加了红细胞的数量和Hb的水平，并降低了骨髓中p53的活性。TFP属于FDA批准的称为吩噻嗪类的抗精神病药家族。这些药物很容易穿过血脑屏障(BBB)，并且它们的长期使用与运动障碍和锥体外系反应相关(Kennedy,P.F.等)，使得它们不适于儿童使用。为了克服这一限制，我们使用了新的吩噻嗪衍生物文库，这些衍生物将可能不会穿过BBB(图33)。首先，我们将化合物在rps29-/-斑马鱼胚胎中进行测试，以确定是否有任何化合物可改善红系细胞缺陷(图34)。我们查看了斑马鱼中的Hb挽救。每孔用20个胚胎对24孔板进行接种，并且在50％外包时用药物处理胚胎。然后将胚胎针对血红蛋白(Hb)进行染色并固定在4％PFA中。对8种化合物进行了测试，而三种(图中方框中：088-2、088-3和089)能够在比阳性对照吩噻嗪(氟奋乃静[Flu])更低的浓度下增加Hb(图35)。
已充分确定了CNS活性小分子可在斑马鱼中具有直接的神经性作用(例如受损的自发活动(Giacomini,N.J.等；和Boehmler,W.等))。由于斑马鱼的BBB的功能被证明与人的相似，斑马鱼是研究BBB通透性渗透性的优异的体内模型(Jeong,J.Y.等)。为了测试这些化合物的BBB通透性，我们使用高通量行为测试测定法筛选将影响斑马鱼游泳(由此说明BBB渗透)的化合物。该测定法包括在96孔板的每个孔中放入一只受精后6天(dpf)的斑马鱼，向每个孔中加入药物并使用自动分析成像软件记录运动1小时-2小时(Rihel,J.等)。最初使用商业吩噻嗪类测试该测定法，我们能够在统计学上确定与DMSO处理相比药物是否在斑马鱼幼体中增加或减少运动(数据未示出)。这允许我们使用行为以高通量方式作为遍及BBB的间接参数。我们测试了四种新的衍生物以及商业吩噻嗪(Flu)和chk2抑制剂(作为对照，其应当不影响行为)。在选定的衍生物中，三种(083、088-3和089)使行为改变，而089甚至在最高剂量下是有毒的。然而一种药物088-2没有影响游泳行为，表明其未进入斑马鱼的大脑(图36-图39)。
接下来，我们在我们的DBA原代人体外分化模型中测试了三种衍生物。为此，我们将CD34+外周血单核细胞培养扩增2天，并用含有RPS19shRNA的慢病毒诱导核糖体蛋白缺乏(图40)。3天后，将细胞置于含有或不含新的衍生物的红系分化培养基中并培养5天。然后通过针对转铁蛋白受体CD71+的流式细胞术分析对红系分化进行评估。结果表明，相比于经DMSO处理，088-2和089均增加了红系前体细胞的百分比(图41)。另外，相比于经DMSO处理，新的衍生物增加了红系细胞的绝对数量(图41)。这些结果表明，新的衍生物088-2在rps29-/-斑马鱼胚胎和DBA人体外模型中均改善了红系细胞缺陷。不同于母体吩噻嗪化合物，088-2不会引起斑马鱼的行为改变，这表明该化合物不会进入大脑。总结化合物活性的表见于图43。
参考文献
本申请文件和实施例中的本文引用的所有参考文献均以引用的方式整体并入本文。
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Claims (35)

1.一种治疗患有核糖体障碍或核糖体病的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者给予有效量的组合物，以在所述受试者中的红系细胞、红系分化细胞或CD34+细胞的至少一种中减少p90S6K的活性和减少活性p53，所述组合物包含核糖体s6激酶RSK(p90S6k)抑制剂。
2.如权利要求1所述的方法，其中，所述p90S6k抑制剂抑制选自于由RSK1、RSK2和RSK3所组成的组中的变体。
3.如权利要求1所述的方法，其中，所述p90S6k抑制剂选择性地抑制RSK2。
4.如权利要求1所述的方法，其中，所述p90S6k抑制剂为核酸、小分子化合物或蛋白质。
5.如权利要求1所述的方法，其中，所述p90S6k抑制剂为SL0101(SL)或SL0101(SL)的衍生物或类似物，其中，SL0101(SL)具有以下结构：
6.如权利要求1所述的方法，其中，所述p90S6k抑制剂为BI-D1870(BI)或BI-D1870(BI)的衍生物或类似物，其中，BI-D1870(BI)具有以下结构：
7.一种治疗患有核糖体障碍或核糖体病的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者给予有效量的组合物，以在所述受试者中的红系细胞、红系分化细胞或CD34+细胞的至少一种中减少p70S6K的活性和减少活性p53，所述组合物包含RSK(p70S6k)抑制剂。
8.如权利要求7所述的方法，其中，所述p70S6K抑制剂为核酸、小分子化合物或蛋白质。
9.如权利要求7所述的方法，其中，所述p70S6K抑制剂为PF-4708671(PF)或PF-4708671(PF)的衍生物或类似物，其中，PF-4708671(PF)具有以下结构：
10.一种治疗患有核糖体障碍或核糖体病的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者给予有效量的组合物，以在所述受试者中的红系细胞、红系分化细胞或CD34+细胞的至少一种中减少活性p53，所述组合物包含Chk2抑制剂，其中，所述Chk2抑制剂包括选自于由CCT和III所组成的组中的化合物或其衍生物，其中，CCT和III具有以下结构：
11.一种治疗患有核糖体障碍或核糖体病的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者给予有效量的组合物，以在所述受试者中的红系细胞、红系分化细胞或CD34+细胞的至少一种中减少活性p53，所述组合物包含钙调蛋白抑制剂，其中，所述钙调蛋白抑制剂是吩噻嗪化合物或所述吩噻嗪化合物的衍生物或类似物，其中，所述吩噻嗪化合物选自于由具有以下结构的ACV-1-235(ACV)、JJM-II-221E(221E)和DB1026(PerSucc)所组成的组：
12.一种治疗患有核糖体障碍或核糖体病的受试者的方法，所述方法包括给予有效量的组合物，所述组合物包含吩噻嗪化合物或所述吩噻嗪化合物的衍生物或类似物，其中，所述吩噻嗪化合物选自于由具有以下结构的DB-4-083(083)、DB-4-084(084)、DB-4-088-2(088-2)、DB-4-088-3(088-3)、DB-4-086(086)、DB-4-087-2(087-2)、DB-4-087-3(087-3)、DB-4-089(089)所组成的组：
13.一种治疗患有核糖体障碍或核糖体病的受试者的方法，所述方法包括给予有效量的组合物，所述组合物包含吩噻嗪化合物或所述吩噻嗪化合物的衍生物或类似物，其中，所述吩噻嗪化合物为式(I)化合物及其异构体和药学上可接受的盐：
其中：
X为O或S；
R1为H、烷基、烯基、炔基、环基、杂环基、酰基、芳基、杂芳基、烷基杂芳基或烷基芳基；
R各自独立地为H、卤素、烷基、烷基、烯基、炔基、卤代烷基、CN、OH、NH2、烷基氨基、二烷基氨基、CO2H、酰基、SH、硫代烷氧基、SO2H或SO3H。
14.一种治疗患有核糖体障碍或核糖体病的受试者的方法，所述方法包括给予有效量的组合物，所述组合物包含吩噻嗪化合物或所述吩噻嗪化合物的衍生物或类似物，其中，所述吩噻嗪化合物为式(II)化合物及其异构体和药学上可接受的盐：
其中：
R21各自独立地选自于由如下所组成的组：H、卤素、烷基、卤代烷基、CN、OH、NH2、烷基氨基、二烷基氨基、CO2H、酰基、SH、硫代烷氧基、SO2H和SO3H。
15.一种治疗患有核糖体障碍或核糖体病的受试者的方法，所述方法包括给予有效量的组合物，所述组合物包含吩噻嗪化合物或所述吩噻嗪化合物的衍生物或类似物，其中，所述吩噻嗪化合物为具有如下结构的化合物：
16.一种治疗患有核糖体障碍或核糖体病的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者给予有效量的钙通道阻滞剂BAPTA-AM或其衍生物或类似物，以在至少一种CD34+细胞中减少活性p53，其中，BAPTA-AM具有以下结构：
17.如权利要求1-16中任一项所述的方法，其中，所述患有核糖体障碍的受试者具有Diamond Blackfan贫血(DBA)或遗传性幼红细胞减少症。
18.如权利要求17所述的方法，其中，所述受试者具有DBA1、DBA2、DBA3、DBA4、DBA5、DBA6、DBA7或DBA8。
19.如权利要求1-16中任一项所述的方法，其中，所述受试者具有核糖体蛋白19(RPS19)突变。
20.如权利要求1-16中任一项所述的方法，其中，所述受试者具有核糖体蛋白突变，所述核糖体蛋白选自于：RPS7、RPS10、RPS19、RPS24、PRS26、RPS17、PRS27L RPS29.RPL35A、PRL5和PPL11。
21.如权利要求1-16中任一项所述的方法，其中，所述受试者具有核糖体蛋白突变，所述核糖体蛋白选自于由如下所组成的组：rPL2A、rPL2B、rPL3、rpL4A、rPL4B、rPL7A、rPL7B、rPL10、rPL11、rPL16A、rPL17A、rPL17B、rPL18A、rPL18B、Rpl19A、rPL19、rPL25、rPL29、rpL31A、rpL31B、rPL36A、rPL40A、rPS1A、rPS6A、rPS6B、rPS14A、rPS15、rPS19、rPS23B、rPS25A、rPS26B、rPS29、rPS29B以及rPS31。
22.如权利要求1-16中任一项所述的方法，其中，向所述受试者给予另一种治疗性试剂以治疗所述核糖体蛋白的缺陷，所述治疗性试剂选自于由皮质类固醇、输血所组成的组。
23.如权利要求1-16中任一项所述的方法，其中，所述有效量增加所述受试者中的CD71+红系细胞的数量。
24.如权利要求1-16中任一项所述的方法，其中，所述有效量增加所述受试者中的血红蛋白水平。
25.如权利要求1-16中任一项所述的方法，其中，所述受试者具有颅面畸形或巨红细胞性贫血的症状。
26.如权利要求1-16中任一项所述的方法，其中，所述核糖体病是脊髓发育不良。
27.如权利要求1-16中任一项所述的方法，其中，所述脊髓发育不良是5q-脊髓发育不良。
28.如权利要求1-16中任一项所述的方法，其中，所述受试者具有Rps14突变或者Rps14表达减少。
29.如权利要求1-16中任一项所述的方法，其中，所述受试者具有骨髓发育不良的症状。
30.如权利要求1-16中任一项所述的方法，其中，所述核糖体病是Shwachman–Diamond综合征。
31.如权利要求1-16中任一项所述的方法，其中，所述受试者具有Sbds突变。
32.如权利要求1-16中任一项所述的方法，其中，所述受试者具有选自如下的症状：胰功能不全、骨髓功能障碍、骨骼畸形。
33.如权利要求1-16中任一项所述的方法，其中，所述核糖体病是Treacher Collins综合征。
34.如权利要求1-16中任一项所述的方法，其中，所述受试者具有TCOF1(核仁)突变。
35.如权利要求1-16中任一项所述的方法，其中，所述受试者具有颅面缺损的症状。
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