CN115068478B - 磷酸萘酚喹在制备治疗自身免疫性疾病药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了磷酸萘酚喹在制备治疗自身免疫性疾病药物中的应用。在小鼠类风湿性关节炎模型中证明了磷酸萘酚喹灌胃给药能够显著改善关节红肿、变形等症状，降低抗原特异性抗体水平。在小鼠系统性红斑狼疮模型中证明了萘酚喹灌胃给药可显著降低抗双链DNA抗体及抗核抗体水平。药效药理学研究证实磷酸萘酚喹具有理想的免疫抑制活性，可用于制备治疗自身免疫性疾病药物。进一步提供了磷酸萘酚喹治疗和辅助治疗类风湿性关节炎及系统性红斑狼疮的药物用途。本发明所述药物为由治疗有效量的磷酸萘酚喹作为活性成分与药用辅料组成的药物组合物。本发明具有良好的临床应用前景和较大的社会效益。
Description
技术领域
本发明涉及药物的新适应症，具体涉及抗疟药磷酸萘酚喹在制备治疗新适应症药中的应用，尤其涉及磷酸萘酚喹在制备治疗自身免疫性疾病药物中的应用。
背景技术
类风湿性关节炎(Rheumatoid arthritis，RA)是一种慢性、进行性、全身性和高致残性的自身免疫性疾病，以原发性炎性滑膜炎、软骨破坏和骨侵蚀为特征。常见临床表现为关节僵直、肿胀、疼痛，随疾病进展会引起关节的软骨及骨组织的破坏，最终导致关节畸形及活动能力障碍。RA病情错综复杂，临床上仍以药物治疗为主，目标为控制疾病症状、减缓疾病进展、阻止骨关节损坏、降低病残率、改善预后、提高患者的生活质量(参见文献「1」)。现有RA治疗药物主要包括非甾体抗炎药、糖皮质激素、改善病情抗风湿药、生物制剂和小分子抑制剂。然而临床治疗存在相当一部分患者对目前的治疗手段响应度低或无反应，因此寻找新的治疗手段仍是RA治疗的迫切诉求。
系统性红斑狼疮(Systemic lupus erythematosus，SLE)是一种以致病性自身抗体和免疫复合物形成并介导器官组织损伤的慢性自身免疫性疾病。临床上存在多系统受累的表现，血清中存在以抗核抗体为代表的多种自身抗体。因SLE发病机制复杂，药物研发困难。目前用于治疗SLE的药物主要包括非甾体抗炎药、皮质激素类、抗疟药、免疫调节剂和生物制剂(参见文献[2])。
羟氯喹和氯喹等抗疟药物在临床上被广泛用于治疗类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮和其他炎症性风湿病。羟氯喹是目前治疗自身免疫性疾病最常用的抗疟药，可降低系统性红斑狼疮患者疾病活动度、降低发生器官损伤和血栓的风险，改善血脂情况，提高生存率，可改善RA患者的代谢水平，减少心血管事件的发生。[3]磷酸萘酚喹与奎宁、氯喹和羟氯喹同属喹啉类衍生物，适用于恶性疟疾。磷酸萘酚喹具有如下的结构式：
目前尚未有磷酸萘酚喹治疗类风湿性关节炎及系统性红斑狼疮的应用和报道。本发明人运用胶原诱导的小鼠关节炎模型，研究发现磷酸萘酚喹可显著改善实验小鼠关节炎临床评分，降低其血清胶原特异性抗体水平，抑制淋巴细胞增殖。运用佐剂诱导的大鼠关节炎模型，发现磷酸萘酚喹给药可显著降低实验大鼠关节炎临床评分，改善其足肿胀情况。在小鼠自发性系统性红斑狼疮实验模型中，磷酸萘酚喹灌胃给药可显著降低模型小鼠血清中抗dsDNA抗体及抗核抗体水平，可以开发为治疗和辅助治疗类风湿性关节炎及系统性红斑狼疮的治疗药物，有重要意义。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于进一步研发磷酸萘酚喹在医学上的新用途，尤其是在用于制备治疗或辅助治疗类风湿性关节炎及系统性红斑狼疮药物中的新用途。
本发明提供了磷酸萘酚喹在制备治疗自身免疫性疾病药物中的应用。
本发明在小鼠类风湿性关节炎模型中证明了磷酸萘酚喹灌胃给药能够显著改善关节红肿、变形等症状，降低抗原特异性抗体水平。在小鼠系统性红斑狼疮模型中证明了萘酚喹灌胃给药可显著降低抗双链DNA抗体及抗核抗体水平。药效药理学研究证实磷酸萘酚喹具有理想的免疫抑制活性，可用于制备治疗自身免疫性疾病药物。
本发明运用胶原诱导的小鼠关节炎模型，研究发现磷酸萘酚喹可显著改善实验小鼠关节炎临床评分，降低其血清胶原特异性抗体水平，抑制淋巴细胞增殖。运用佐剂诱导的大鼠关节炎模型，发现磷酸萘酚喹给药可显著降低实验大鼠关节炎临床评分，改善其足肿胀情况。在小鼠自发性系统性红斑狼疮实验模型中，磷酸萘酚喹灌胃给药可显著降低模型小鼠血清中抗双链DNA抗体及抗核抗体水平。可以开发为治疗和辅助治疗类风湿性关节炎及系统性红斑狼疮的治疗药物，本发明通过磷酸萘酚喹灌胃给药显著改善牛Ⅱ型胶原诱导的小鼠关节炎的实验，证明了磷酸萘酚喹可改善关节炎临床评分，降低血清致病性抗体水平，可用于制备治疗或辅助治疗类风湿性关节炎及系统性红斑狼疮的药物。
因此，本发明还提供了磷酸萘酚喹在制备用于改善关节炎疾病指征、降低狼疮致病性抗体水平的药物中的用途。
本发明提供了磷酸萘酚喹在制备治疗自身免疫性疾病药物中的应用，所述药物为由治疗有效量的磷酸萘酚喹作为活性成分与药用辅料组成的药物组合物。
本发明提供了磷酸萘酚喹在制备治疗或辅助治疗类风湿关节炎和系统性红斑狼疮药物中的应用。
本发明提供了磷酸萘酚喹在制备治疗或辅助治疗类风湿关节炎和系统性红斑狼疮药物中的应用。
本发明所述药物为治疗有效量的磷酸萘酚喹作为活性成分与药用辅料组成的药物组合物。
所述药物组合物为片剂、胶囊剂、冲剂、口服液体制剂、或静脉或肌肉注射剂剂型。
此外，本发明还提供了一种治疗或辅助治疗类风湿关节炎和系统性红斑狼疮的方法，该方法包括向有此需要的受试者提供治疗有效量的磷酸萘酚喹。
此外，本发明还提供了一种于改善关节炎疾病指征、降低狼疮致病性抗体水平的方法，该方法包括向有此需要的受试者提供治疗有效量的磷酸萘酚喹。
如本文中所使用的，术语“治疗有效量”是指该数量具有治疗性的效果而可用于预防或治疗本文所述的特定疾病、病症或病状。例如，“治疗有效量”可指在接受治疗的个体上提供治疗性或所欲功效所需的数量。如本领域技术人员所知，治疗有效量会因为施用途径、赋形剂的使用以及与其他疗法共用时的可能性而有所变化。
本发明提供了磷酸萘酚喹在制备治疗自身免疫性疾病药物中的应用。通过磷酸萘酚喹在小鼠类风湿性关节炎模型中的实验，证明了磷酸萘酚喹灌胃给药能够显著改善关节红肿、变形等症状，降低抗原特异性抗体水平。在小鼠系统性红斑狼疮模型中证明了萘酚喹灌胃给药可显著降低抗双链DNA抗体及抗核抗体水平。药效药理学研究证实磷酸萘酚喹具有理想的免疫抑制活性，可用于制备治疗自身免疫性疾病药物。
本发明运用胶原诱导的小鼠关节炎模型，研究发现磷酸萘酚喹可显著改善实验小鼠关节炎临床评分，降低其血清胶原特异性抗体水平，抑制淋巴细胞增殖。运用佐剂诱导的大鼠关节炎模型，发现磷酸萘酚喹给药可显著降低实验大鼠关节炎临床评分，改善其足肿胀情况。在小鼠自发性系统性红斑狼疮实验模型中，磷酸萘酚喹灌胃给药可显著降低模型小鼠血清中抗dsDNA抗体及抗核抗体水平，进一步提供了磷酸萘酚喹治疗和辅助治疗类风湿性关节炎及系统性红斑狼疮的药物用途，具有良好的临床应用前景和较大的社会效益。
附图说明
图1、表明磷酸萘酚喹灌胃给药显著改善牛Ⅱ型胶原诱导的小鼠关节炎临床评分的结果示意图。
图2、表明磷酸萘酚喹灌胃给药抑制关节炎小鼠双侧后足肿胀的结果示意图。
图3、表明磷酸萘酚喹灌胃给药抑制关节炎小鼠脾脏淋巴结淋巴细胞增殖的结果示意图。
图4、表明磷酸萘酚喹灌胃给药降低关节炎小鼠血清中胶原特异性抗体水平的结果示意图。
图5、表明磷酸萘酚喹灌胃给药改善关节炎小鼠足肿胀抑制其骨侵蚀的代表性图片。
图6、表明磷酸萘酚喹灌胃给药可显著抑制Toll样受体信号介导关节炎小鼠脾脏纯化B细胞活化的结果示意图。
图7、表明磷酸萘酚喹灌胃给药显著改善佐剂诱导的大鼠关节炎疾病指征的结果示意图。
图8、表明磷酸萘酚喹灌胃给药显著降低自发性系统性红斑狼疮实验小鼠血清致病性抗体水平的结果示意图。
具体实施方式
实施例1.磷酸萘酚喹体外抑制丝裂原诱导的小鼠全脾淋巴细胞增殖反应
1.主要实验材料及来源
(1)实验动物：SPF级BALB/c小鼠，雌性，约6-8周龄，购自北京华阜康生物科技股份有限公司，合格证编号为110322211100631475。
(2)主要实验药物：
磷酸萘酚喹，淡黄色粉末，元素分析(C24H34ClN3O9P2)，由上海医药工业有限公司提供；硫酸羟氯喹，白色粉末，元素分析(C18H26ClN3O·H2SO4)，由中西三维药业提供或购自Sigma；氯喹，白色粉末，元素分析(C18H26ClN3)，购自Sigma。
(3)试剂：
RPMI 1640培养液购买自GibcoBRL公司；胎牛血清购买自Hyclone公司；细菌脂多糖(Lipopolysaccharides，LPS)购自Sigma公司；刀豆蛋白A(Concanavalin A,ConA)购自Sigma公司；硫酸羟氯喹由中西三维药业提供或购自Sigma公司；噻唑蓝(Thiazolyl BlueTetrazolium Bromide，MTT)购自Sigma公司，二甲亚砜(Dimethyl sulfoxide，DMSO)购自国药集团；3H-胸腺嘧啶核苷(3H-Thymidine，3H-TdR)，闪烁液购自Perkin Elmer公司。
2.实验方法
将BALB/c小鼠脱颈处死，无菌取出脾脏，制备全脾淋巴细胞，将细胞调至所需要的浓度。化合物浓度从250μM起始，4倍梯度稀释10个浓度：250,62.5,15.625,3.906,0.977,0.244,0.061,0.015,0.004,0.001μM。
(1)非特异性细胞毒性检测：
小鼠脾脏淋巴细胞悬液8×105/孔接种于96孔板中，加入上述10个浓度梯度的化合物，另设相应的细胞对照(即不含化合物的脾脏淋巴细胞培养体系)及RPMI 1640培养液本底对照(空白培养液对照)，37℃，5％CO2培养箱中培养48小时。培养终点前4个小时加入20μl浓度为5mg/ml的MTT溶液，反应至培养终点(即前述48小时)，吸弃上清，每孔加入200μlDMSO溶解结晶，得到小鼠脾脏淋巴细胞悬液，于酶标仪(Spectra Max 190，MolecularDevices)570nM处测定吸光度值。
(2)淋巴细胞增殖检测：
小鼠脾脏淋巴细胞悬液5×105/孔接种于96孔板中，加入ConA(终浓度1μg/ml)或LPS(终浓度10μg/ml)及上述10个浓度梯度的化合物，并设相应的无ConA、LPS细胞对照孔以及刺激无药物对照孔，37℃，5％CO2培养箱中培养48小时。培养结束前8小时加入3H-胸腺嘧啶核苷，继续培养至实验结束(即前述48小时)。将细胞用细胞收集仪收集至玻璃纤维膜上，加入闪烁液5ml后于Beta记数仪(2450Microplate Counter，PerkinElmer)(型号)读取每分钟放射性计数值。
3.实验结果
ConA和LPS作为丝裂原可分别刺激T、B淋巴细胞发生增殖和分化，这一过程与体内淋巴细胞的活化过程相似，因此，丝裂原诱导的淋巴细胞增殖常被用来作为评价淋巴细胞功能的指标。如表1所示，磷酸萘酚喹对ConA诱导的T细胞活化增殖以及LPS诱导的B细胞活化增殖均具有显著的抑制活性，且生物活性选择指数(selection index,SI)优于氯喹和羟氯喹。
表1.磷酸萘酚喹体外抑制丝裂原诱导的小鼠全脾淋巴细胞增殖反应
注：CC50，细胞存活率为50％时的化合物浓度；IC50，细胞增殖降低50％时的化合物浓度；SI＝CC50/IC50
以上结果说明，磷酸萘酚喹可显著抑制丝裂原诱导的脾脏淋巴细胞活化，尤其对B细胞活化增殖的抑制活性非常优异，且免疫抑制活性高于氯喹和硫酸羟氯喹。
实施例2.磷酸萘酚喹抑制LPS诱导的巨噬细胞炎症因子产生
1.主要实验材料及来源
(1)细胞：小鼠巨噬细胞系RAW264.7，购自美国ATCC公司。
(2)主要实验药物：磷酸萘酚喹，淡黄色粉末，元素分析(C24H34ClN3O9P2)，由上海医药工业有限公司提供；硫酸羟氯喹，白色粉末，元素分析(C18H26ClN3O·H2SO4)，由中西三维药业提供；氯喹，白色粉末，元素分析(C18H26ClN3)，购自Sigma。
(3)试剂：
DMEM高糖培养基购自GibcoBRL公司；胎牛血清购买自Hyclone公司；LPS购自Sigma-Aldrich公司；TNF-α及IL-6ELISA试剂盒购自美国BD公司；小鼠IL-1β细胞因子ELISA检测试剂盒购自Invitrogen公司；MTT购自Sigma公司，DMSO购自国药集团。
2.实验方法
(1)非特异性细胞毒性检测：
RAW264.7细胞1×105/孔接种于96孔板中，37℃，5％CO2培养箱中贴壁6小时。化合物250μM起始，4倍梯度稀释10个浓度：。细胞贴壁后加入梯度稀释的化合物(化合物浓度从250μM起始，4倍梯度稀释10个浓度：250,62.5,15.625,3.906,0.977,0.244,0.061,0.015,0.004,0.001μM)，另设相应的溶媒对照(细胞对照)及培养液本底对照(空白对照)。37℃，5％CO2培养箱中培养48小时。结束培养前15min加入20μl 5mg/ml MTT，至培养结束，吸弃上清，加入200μl DMSO溶解结晶，于酶标仪(Spectra Max 190，Molecular Devices)570nM处测定吸光度值。
(2)细胞因子产生水平检测：
RAW264.7细胞1×105/孔接种于96孔板中，37℃，5％CO2培养箱中贴壁6小时。化合物250μM起始，4倍梯度稀释10个浓度250,62.5,15.625,3.906,0.977,0.244,0.061,0.015,0.004,0.001μM。细胞贴壁后加入刺激剂LPS(终浓度10μg/ml)及上述浓度梯度稀释的化合物，另设相应的刺激对照及细胞对照(不加刺激)，培养结束后收集细胞培养上清，ELISA法检测TNF-α、IL-1β及IL-6的含量。
3.实验结果
LPS是一种重要的生物性致炎因子，可通过激活核因子κB(Nuclear factorkappa-B，NF-κB)诱导炎症因子的大量释放，因此采用由LPS诱导的巨噬细胞RAW264.7体系，评价化合物对炎症因子产生的影响。如表2所示，磷酸萘酚喹、硫酸羟氯喹和氯喹均可显著抑制LPS诱导IL-1β的产生，但对TNF-α和IL-6的产生无明显影响。
表2.磷酸萘酚喹对LPS诱导RAW264.7细胞产生炎症因子的影响
注：CC50，细胞存活率为50％时的化合物浓度；IC50，细胞因子分泌降低50％时的化合物浓度；SI＝CC50/IC50
以上结果表明，磷酸萘酚喹对LPS诱导的小鼠巨噬细胞系RAW264.7细胞炎症因子的分泌有选择性抑制作用
实施例3.磷酸萘酚喹体外抑制TLRs-L刺激小鼠全脾淋巴细胞增殖及抗体和细胞因子分泌
1.主要实验材料及来源
(1)实验动物：SPF级BALB/C小鼠，雌性，约6-8周龄，购自北京华阜康生物科技股份有限公司，合格证编号为110322211100631475。
(2)主要实验药物：磷酸萘酚喹，淡黄色粉末，元素分析(C24H34ClN3O9P2)，由上海医药工业有限公司提供；硫酸羟氯喹，白色粉末，元素分析(C18H26ClN3O·H2SO4)，由中西三维药业提供。
(3)试剂：
RPMI 1640培养液购买自GibcoBRL公司；胎牛血清购买自Hyclone公司；TLR 4、7、9激动剂(TLRs Ligand，TLRs-L)购自Invivogen；小鼠IL-6、TNF-α、IL-10细胞因子ELISA检测试剂盒购自BD公司；小鼠IL-1β细胞因子ELISA检测试剂盒购自Invitrogen公司；抗体检测试剂盒购自Invitrogen公司。
2.实验方法
将BALB/c小鼠脱颈处死，无菌取出脾脏，制备全脾淋巴细胞，将细胞调至5×106个/ml。硫酸羟氯喹30μM起始，3倍梯度稀释3个浓度：30，10，3μM；磷酸萘酚喹10μM起始，3倍梯度稀释3个浓度：10，3，1μM。
(1)淋巴细胞增殖检测：
小鼠脾脏淋巴细胞悬液100μl/孔接种于96孔板中，加入刺激剂TLR4-L(终浓度10μg/ml)、TLR7-L(终浓度5μg/ml)或TLR9-L(终浓度1μM)及上述浓度梯度稀释的化合物，另设相应的刺激对照及细胞对照(不加刺激)。37℃，5％CO2培养箱中培养48小时。培养结束前8小时加入3H-TdR，继续培养至实验结束。将细胞用细胞收集仪收集至玻璃纤维膜上，加入5ml闪烁液后于Beta记数仪(2450Microplate Counter，PerkinElmer)读取每分钟放射性计数值。
(2)细胞因子检测
小鼠脾脏淋巴细胞100μl/孔接种于96孔板中，加入刺激剂TLR4-L(终浓度10μg/ml)、TLR7-L(终浓度5μg/ml)或TLR9-L(终浓度1μM)及上述浓度梯度稀释的化合物，另设相应的刺激对照及细胞对照(不加刺激)。37℃，5％CO2培养箱中培养48小时。培养结束后收集细胞培养上清用ELISA法检测IL-1β、IL-6、IL-10的含量。
(3)抗体水平检测
小鼠脾脏淋巴细胞100μl/孔接种于96孔板中，加入刺激剂TLR4-L(终浓度10μg/ml)、TLR7-L(终浓度5μg/ml)或TLR9-L(终浓度1μM)及上述浓度梯度稀释的化合物，另设相应的刺激对照及细胞对照(不加刺激)。37℃，5％CO2培养箱中培养120小时。培养结束后收集细胞培养上清用ELISA法检测IgG、IgM的含量。
3.实验结果
Toll样受体(Toll-like receptor，TLR)属于模式识别受体家族，表达于多种免疫细胞，可识别多种病原体相关分子模式，介导抗原提呈细胞的分化成熟，在炎症、免疫细胞调控、存活和增殖方面发挥着关键作用。如表3、4所示，TLRs-L可介导脾脏淋巴细胞增殖活化，磷酸萘酚喹作用可显著抑制特定TLRs-L介导的增殖、细胞因子和抗体分泌。
表3.磷酸萘酚喹对TLRs-L刺激小鼠全脾淋巴细胞增殖及抗体分泌的影响
注：CC50，细胞存活率为50％时的化合物浓度；IC50，细胞增殖、抗体分泌降低50％时的化合物浓度；SI＝CC50/IC50
表4.磷酸萘酚喹对TLRs-L刺激小鼠全脾淋巴细胞分泌细胞因子的影响
注：CC50，细胞存活率为50％时的化合物浓度；IC50，细胞因子分泌降低50％时的化合物浓度；SI＝CC50/IC50
以上结果表明，磷酸萘酚喹可抑制特定TLR信号诱导的脾脏淋巴细胞活化。
实施例4.磷酸萘酚喹体外抑制TLRs激动剂刺激小鼠纯化B细胞活化
1.主要实验材料及来源
(1)实验动物：SPF级BALB/C小鼠，雌性，约6-8周龄，购自北京华阜康生物科技股份有限公司，合格证编号为110322211102061763。
(2)主要实验药物：磷酸萘酚喹，淡黄色粉末，元素分析(C24H34ClN3O9P2)，由上海医药工业有限公司提供；硫酸羟氯喹，白色粉末，元素分析(C18H26ClN3O·H2SO4)，由中西三维药业提供。
(3)试剂：
RPMI 1640培养液购买自GibcoBRL公司；胎牛血清购买自Hyclone公司；PE-CD19：购自BD；Anti-PE Beads：购自Miltenyi；TLRs-L购自Invivogen；小鼠IL-6抗体检测试剂盒购自Invitrogen公司；MTT购自Sigma公司，DMSO购自国药集团。
2.实验方法
(1)纯化B细胞制备：
将BALB/c小鼠脱颈处死，无菌取出脾脏，制备脾脏细胞，将细胞调至1×108个/ml。2.4G 2(终浓度10μg/ml)封闭20min，PE-CD19(终浓度5μg/ml)孵育20min，MACS buffer洗，4℃300G离心10min，每1×108个细胞加入100μl Anti-PE beads和900μl MACS buffer孵育15min，MACS buffer洗，4℃300G离心10min，弃上清，每1×108个细胞加入500μl MACSbuffer重悬，使用MACS柱分离，磁性标记的细胞保留在柱上，将MACS柱从磁场中移除后洗脱。
(2)非特异性细胞毒性检测：
硫酸羟氯喹8μM起始，2倍梯度稀释3个浓度：8，4，2μM，磷酸萘酚喹0.5μM起始，2倍梯度稀释3个浓度：0.5，0.25，0.125μM。小鼠纯化B细胞1×106/孔接种于96孔板中，加入梯度稀释的化合物，另设相应的空白对照及细胞对照。37℃，5％CO2培养箱中培养48小时。结束培养前4小时加入MTT溶液，至培养结束，吸弃上清，每孔加入200μl DMSO溶解结晶，于酶标仪(Spectra Max 190，Molecular Devices)570nm处测定吸光度值。
(3)B细胞增殖检测：
硫酸羟氯喹8μM起始，2倍梯度稀释3个浓度：8，4，2μM，磷酸萘酚喹0.5μM起始，2倍梯度稀释3个浓度：0.5，0.25，0.125μM。小鼠纯化B细胞悬液4×105/孔接种于96孔板中，加入刺激剂TLR4-L(终浓度10μg/ml)、TLR7-L(终浓度5μg/ml)或TLR9-L(终浓度1μM)及梯度稀释的化合物，另设相应的刺激对照及细胞对照(不加刺激)，37℃，5％CO2培养箱中培养48小时培养结束前8小时加入3H-TdR，继续培养至实验结束。将细胞用细胞收集仪收集至玻璃纤维膜上，加入5ml闪烁液后于Beta记数仪(2450Microplate Counter，PerkinElmer)读取每分钟放射性计数值。
(4)细胞因子检测
小鼠纯化B细胞悬液4×105/孔接种于96孔板中，硫酸羟氯喹8μM起始，2倍梯度稀释3个浓度：8，4，2μM，磷酸萘酚喹0.5μM起始，2倍梯度稀释3个浓度：0.5，0.25，0.125μM。加入刺激剂TLR4-L(终浓度10μg/ml)、TLR7-L(终浓度5μg/ml)或TLR9-L(终浓度1μM)及梯度稀释的化合物，另设相应的刺激对照及细胞对照(不加刺激)，37℃，5％CO2培养箱中培养48小时培养结束后收集细胞培养上清用ELISA法检测TNF-α、IL-1β、IL-6的含量。
(5)抗体水平检测
小鼠纯化B细胞悬液4×105/孔接种于96孔板中，硫酸羟氯喹8μM起始，2倍梯度稀释3个浓度：8，4，2μM，磷酸萘酚喹0.5μM起始，2倍梯度稀释3个浓度：0.5，0.25，0.125μM。加入刺激剂TLR4-L(终浓度10μg/ml)、TLR7-L(终浓度5μg/ml)或TLR9-L(终浓度1μM)及梯度稀释的化合物，另设相应的刺激对照及细胞对照(不加刺激)，37℃，5％CO2培养箱中培养120小时培养结束后收集细胞培养上清用ELISA法检测IgG、IgM的含量。
3.实验结果
如表5所示，硫酸羟氯喹及磷酸萘酚喹均可抑制特定TLR信号诱导的小鼠脾脏纯化B细胞的增殖、炎症因子和抗体的产生，磷酸萘酚喹的抑制效应优于硫酸羟氯喹。
表5.磷酸萘酚喹体外抑制TLRs-L刺激小鼠纯化B细胞活化
注：CC50，细胞存活率为50％时的化合物浓度；IC50，细胞因子分泌降低50％时的化合物浓度；SI＝CC50/IC50
实施例5.磷酸萘酚喹灌胃给药显著改善牛Ⅱ型胶原诱导的小鼠关节炎1.主要实验材料及来源
(1)动物：SPF级DBA/1小鼠，雄性，70只，约4周龄，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，合格证编号为110011211101563086。
(2)主要实验药物：磷酸萘酚喹，淡黄色粉末，元素分析(C24H34ClN3O9P2)，由上海医药工业有限公司提供；硫酸羟氯喹，白色粉末，元素分析(C18H26ClN3O·H2SO4)，由中西三维药业提供。地塞米松，购自辰欣药业。
(3)试剂：
牛II型胶原(货号：20021)购自Chondrex.Inc.；乙酸(冰醋酸)(货号：10000218)购自国药集团化学试剂有限公司；弗氏完全佐剂及弗氏不完全佐剂，LPS，ConA购自Sigma公司；RPMI 1640培养液购买自GibcoBRL公司；胎牛血清购买自Hyclone公司；LPS购自Sigma公司；ConA购自Sigma公司，Purified NA/LE Hamster Anti-Mouse CD3e购自BD公司；HRP-兔抗小鼠IgG(H+L)、IgG1、IgG2a、IgG2b均购自Invitrogen公司。
2.实验方法
(1)实验分组：正常组，模型组，阳性药地塞米松1mg/kg组，磷酸萘酚喹(25、50、100mg/kg)组，硫酸羟氯喹100mg/kg组。
(2)模型构建：将二型胶原(TypeⅡCollagen，CⅡ)10mg溶胀于2.5ml 0.1mol/L冰醋酸配制成4mg/ml CⅡ溶液，与等体积CFA充分乳化，于小鼠尾根部皮下注射50μl。21天后，将4mg/ml CⅡ溶液与等体积IFA充分乳化，于小鼠尾根部皮下注射50μl强化免疫。
(3)指标检测：
1)关节炎评分：通过观察小鼠四肢关节病变情况，对关节炎的发病严重程度进行评分，可检测到的关节炎伴一个或几个手指红斑为1分，踝关节到足中中度红肿为2分，踝关节到手指严重红肿为3分，严重肿胀伴强直为4分。评分同时，测量双侧后足厚度；
2)3H-TdR掺入法检测各组淋巴细胞增殖情况：3H-TdR掺入法检测各组淋巴细胞增殖情况：分离各组小鼠脾脏淋巴结，制备淋巴细胞悬液，每孔接种于96孔板，分别加入ConA(终浓度5μg/ml)、LPS(终浓度10μg/ml)，37℃，5％CO2培养箱中培养48小时，结束培养前8小时每孔加入25μl 3H-TdR；Anti-CD3(终浓度5μg/ml，预孵育过夜)，37℃，5％CO2培养箱中培养72小时；CⅡ(终浓度10μg/ml)37℃，5％CO2培养箱中培养96小时，结束培养前8小时每孔加入25μl 3H-TdR。每组设置相应的细胞空白对照，培养至实验结束，将细胞用细胞收集仪收集至玻璃纤维膜上，加入5ml闪烁液后于Beta记数仪(2450Microplate Counter，PerkinElmer)读取每分钟放射性计数值。
3)ELISA检测血清中抗CII抗体水平：96孔酶标板每孔加入50μl CⅡ溶液(终浓度50μg/ml)包被过夜，洗液(1L PBS+500μl Tween 20)每孔200μl洗板4次；每孔加入100μl1％BSA封闭1小时，洗液每孔200μl洗板4次；每孔加入50μl稀释后的各组小鼠血清样品，孵育2小时，洗液每孔200μl洗板4次；加入辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase,HRP)偶联的IgG二抗孵育1小时，洗液每孔200μl洗板5次；加入50μl四甲基联苯胺(Tetramethylbenzidine，TMB)底物，视显色情况每孔加入30μl1 M硫酸溶液终止显色；酶标仪(Spectra Max 190，Molecular Devices)450nm/570nm处读取吸光度值。
4)微计算机断层扫描技术(Micro-CT)进行骨形态学分析：通过显微CT技术进行三维重建，由专业分析软件进行骨形态学分析；
3.实验结果
(1)磷酸萘酚喹灌胃给药显著改善关节炎小鼠临床评分和足肿胀。
如图1所示，模型组小鼠出现严重的关节病变，磷酸萘酚喹给药可显著降低模型小鼠关节炎评分，且治疗效果优于相同剂量的硫酸羟氯喹。(注：*P值<0.05,**P值<0.01,***P值<0.001,磷酸萘酚喹100mg/kg与模型组相比；#P值<0.05，##P值<0.01,###P值<0.001，磷酸萘酚喹50mg/kg与模型组相比。)
如图2所示，磷酸萘酚喹给药可改善关节炎小鼠足肿胀情况。(注：*P值<0.05,**P值<0.01,***P值<0.001地塞米松对照组与模型组相比；#P值<0.05，##P值<0.01,###P值<0.001，正常组与模型组相比；§P值<0.05，§§P值<0.01，§§§P值<0.001，磷酸萘酚喹25mg/kg与模型组相比。)
(2)磷酸萘酚喹灌胃给药显著抑制关节炎小鼠脾脏及淋巴结淋巴细胞增殖。
如图3所示，实验终点取小鼠脾脏淋巴结制备单细胞悬液，使用不同刺激剂刺激其增殖，结果显示磷酸萘酚喹给药可显著抑制关节炎小鼠脾脏及淋巴结淋巴细胞增殖。(注：*P值<0.05,**P值<0.01,***P值<0.001,与模型组相比。)
(3)磷酸萘酚喹灌胃给药显著降低关节炎小鼠胶原特异性抗体水平。
如图4所示，实验终点摘眼球取血，分离血清，使用ELISA法检测实验小鼠血清中胶原特异性抗体水平，结果显示磷酸萘酚喹给药可降低关节炎小鼠血清中的胶原特异性抗体水平。(注：*P值<0.05,**P值<0.01,***P值<0.001,与模型组相比。)
(4)磷酸萘酚喹灌胃给药显著改善关节炎小鼠关节处骨侵蚀导致的骨损伤
实验终点对各组小鼠后肢进行拍照记录，分离左后肢，进行Micro-CT扫描分析，如图5所示，模型组小鼠表现出明显的关节肿胀变形，出现严重的骨侵蚀，磷酸萘酚喹给药抑制了模型小鼠的骨损伤，表现出一定的骨保护作用。
实施例6.磷酸萘酚喹灌胃给药显著抑制TLRs-L诱导关节炎小鼠脾脏纯化B细胞的活化
1.主要实验材料及来源
(1)动物：SPF级DBA/1小鼠，雄性，70只，约4周龄，购自北京华阜康生物科技股份有限公司，合格证编号为110322211101922685。
(2)主要实验药物：磷酸萘酚喹，淡黄色粉末，元素分析(C24H34ClN3O9P2)，由上海医药工业有限公司提供；硫酸羟氯喹，白色粉末，元素分析(C18H26ClN3O·H2SO4)，由中西三维药业提供。
(3)试剂：
牛II型胶原(货号：20021)购自Chondrex.Inc.；乙酸(冰醋酸)(货号：10000218)购自国药集团化学试剂有限公司；弗氏完全佐剂及弗氏不完全佐剂购自Sigma公司；RPMI1640培养液购买自GibcoBRL公司；胎牛血清购买自Hyclone公司；Rat Anti-Mouse CD16/CD32(2.4G 2)，PE Rat Anti-Mouse CD19，小鼠IL-6ELISA检测试剂盒购自BD公司；Anti-PEBeads，MACS柱，MACS buffer购自Miltenyi公司；TLRs-L购自Invivogen；抗体检测试剂盒购自Invitrogen公司；流式检测抗体均购自BD公司。3H-TdR及闪烁液购自PerkinElmer公司。
2.实验方法
(1)实验分组：正常组，模型组，阳性药甲氨蝶呤1mg/kg组，磷酸萘酚喹(50、100mg/kg)组，硫酸羟氯喹100mg/kg组。
(2)模型构建：同实施例5。
(3)指标检测：实验终点取各组小鼠脾脏，纯化脾脏B细胞，纯化方法同实施例4。使用不同TLRs-L刺激，3H-TDR掺入法检测增殖情况，ELISA法检测IL-6和抗体分泌水平，流式细胞术检测CD80、CD86、CD69的表达：
1)B细胞增殖检测：
各组小鼠纯化B细胞悬液4×105/孔接种于96孔板中，加入刺激剂TLR4-L(终浓度10μg/ml)、TLR7-L(终浓度5μg/ml)或TLR9-L(终浓度1μM)，各组另设相应的空白对照。37℃，5％CO2培养箱中培养48小时，培养结束前8小时加入3H-TdR，继续培养至实验结束。将细胞用细胞收集仪收集至玻璃纤维膜上，加入5ml闪烁液后于Beta记数仪(2450 MicroplateCounter，PerkinElmer)读取每分钟放射性计数值。
2)细胞因子检测：
各组小鼠纯化B细胞悬液4×105/孔接种于96孔板中，加入刺激剂TLR4-L(终浓度10μg/ml)、TLR7-L(终浓度5μg/ml)或TLR9-L(终浓度1μM)，各组另设相应的空白对照。37℃，5％CO2培养箱中培养48小时培养结束后收集细胞培养上清ELISA法检测IL-6的含量。
3)抗体水平检测：
小鼠纯化B细胞悬液4×105/孔接种于96孔板中，加入刺激剂TLR4-L(终浓度10μg/ml)、TLR7-L(终浓度5μg/ml)或TLR9-L(终浓度1μM)，各组另设相应的空白对照。37℃，5％CO2培养箱中培养120小时,培养结束后收集细胞培养上清用ELISA法检测IgG、IgM的含量。
4)流式细胞术检测CD86、CD80、CD69的表达：
各组小鼠纯化B细胞悬液4×105/孔接种于96孔板中，加入刺激剂TLR4-L(终浓度10μg/ml)、TLR7-L(终浓度5μg/ml)或TLR9-L(终浓度1μM)，各组另设相应的空白对照。37℃，5％CO2培养箱中培养48小时，收集细胞至4mlFACS洗液(配方)中，4℃500G离心6min；每管加入5μl 2.4G 2封闭20min，每10min震荡一次；每管加入10μl流式抗体染料孵育20min，每10min震荡一次；每管加入4ml FACS洗液，4℃500G离心6min；每管加入300μl FACS洗液重悬细胞，流式细胞仪(LSR FORTESSA，BD)检测CD86、CD80、CD69的表达。
3.实验结果
如图6所示，磷酸萘酚喹给药可显著抑制TLRs信号介导的B细胞活化、细胞因子分泌及抗体产生，提示其可能通过阻断TLRs信号抑制RA中病理性B细胞的免疫反应。(注：*P值<0.05,**P值<0.01,***P值<0.001,与模型组相比。)实施例7.磷酸萘酚喹灌胃给药显著改善佐剂诱导的大鼠关节炎疾病指征
1.主要实验材料及来源
(1)动物：SD大鼠，雄性，38只，约150g，购自北京华阜康生物科技股份有限公司，合格证编号为110322211101936668。
(2)主要实验药物：
磷酸萘酚喹，淡黄色粉末，元素分析(C24H34ClN3O9P2)，由上海医药工业有限公司提供；硫酸羟氯喹，白色粉末，元素分析(C18H26ClN3O·H2SO4)，由中西三维药业提供；注射用甲氨蝶呤，购自辅仁药业。
(3)试剂：
卡介苗购自DIFCO公司；羊毛脂购自国药集团化学试剂有限公司；石蜡油购自国药集团化学试剂有限公司。
2.实验方法
(1)实验分组：正常组，模型组，阳性药甲氨蝶呤1mg/kg组，磷酸萘酚喹(25、50、100mg/kg)组，硫酸羟氯喹100mg/kg组。
(2)模型构建：适量羊毛脂及石蜡油灭菌置于冰上备用，卡介苗一瓶(100mg)+PBS1.5ml，玻璃匀浆器研磨，至无颗粒状态，充分研磨后加入3.5ml PBS，置于冰上备用，灭菌羊毛脂56℃水浴加热至液态，石蜡油675ul、羊毛脂225ul与研磨充分的含卡介苗PBS 900ul分装至乳化管，充分乳化，于大鼠左后足足垫皮内注射0.1ml。
(3)指标检测：
1)关节炎评分：通过观察大鼠继发足关节病变情况，对关节炎的发病严重程度进行评分，可检测到的关节炎伴一个或几个手指红斑为1分，踝关节到足中中度红肿为2分，踝关节到手指严重红肿为3分，严重肿胀伴强直为4分。评分同时，测量双侧后足厚度；
2)模型动物关节病理分析：骨关节组织通过H&E染色分析；
3)微计算机断层扫描技术(Micro-CT)进行骨形态学分析：通过显微CT技术进行三维重建，由专业分析软件进行骨形态学分析；
3.实验结果
如图7所示，造模组大鼠继发足踝关节及及足趾关节出现严重的肿胀变形情况，磷酸萘酚喹给药可改善实验大鼠的关节炎临床评分，抑制其足肿胀程度，且治疗效果优于同等剂量的硫酸羟氯喹。(注：*P值<0.05,**P值<0.01,***P值<0.001,与模型组相比。)
实施例8.磷酸萘酚喹灌胃给药显著降低自发性系统性红斑狼疮实验小鼠
1.主要实验材料及来源
(1)动物：SPF级MRL/lpr小鼠，雌性，约6-8周龄，购自上海灵畅生物科技有限公司，合格证编号为20180003016877。
(2)主要实验药物：
磷酸萘酚喹，淡黄色粉末，元素分析(C24H34ClN3O9P2)，由上海医药工业有限公司提供；硫酸羟氯喹，白色粉末，元素分析(C18H26ClN3O·H2SO4)，由中西三维药业提供；泼尼松，购自上海金穗生物科技有限公司。
(3)试剂：
考马斯亮蓝染色液购自BIO-RAD公司；肌酐检测试剂盒购自Abcam公司；小鼠抗核抗体(antinuclear antibody，ANA)试剂盒购自Alpha Diagnostic International公司；HRP标记山羊抗小鼠IgG(H+L)购自Beyotime公司；小牛胸腺DNA购自Sigma公司。
2.实验方法
(1)实验分组：正常组，模型组，阳性药泼尼松1mg/kg组，磷酸萘酚喹(25、50mg/kg)组，硫酸羟氯喹100mg/kg组。
(2)蛋白尿及尿肌酐测定：小鼠称重后取尿20μl/只，考马斯亮蓝测定尿样蛋白含量，肌酐试剂盒测定尿肌酐水平
(3)抗双链DNA抗体的检测：
96孔酶标板每孔加入50μl双链DNA溶液(终浓度50μg/ml)包被过夜，洗液(1L PBS+500μl Tween 20)每孔200μl洗板4次；每孔加入100μl 1％BSA封闭1小时，洗液每孔200μl洗板4次；每孔加入50μl稀释后的各组小鼠血清样品，孵育2小时，洗液每孔200μl洗板4次；加入辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase,HRP)偶联的IgG(H+L)二抗孵育1小时，洗液每孔200μl洗板5次；加入50μl四甲基联苯胺(Tetramethylbenzidine，TMB)底物，视显色情况每孔加入30μl 1M硫酸溶液终止显色；酶标仪(Spectra Max 190，Molecular Devices)450nm/570nm处读取吸光度值。
3.实验结果
实验终点摘眼球取血，使用ELISA法检测实验小鼠血清中抗dsDNA抗体水平，使用抗核抗体试剂盒检测抗核抗体水平，如图8所示磷酸萘酚喹给药显著降低了实验小鼠血清中抗dsDNA抗体和抗核抗体水平。(注：*P值<0.05,**P值<0.01,***P值<0.001,与模型组相比。)
以上结果说明磷酸萘酚喹给药可显著改善关节炎小鼠疾病指征，降低血清胶原特异性抗体水平，抑制淋巴细胞增殖；显著改善关节炎大鼠临床评分，抑制继发足肿胀；降低狼疮模型小鼠血清中致病性抗体水平；抑制TLRs信号介导的B细胞活化，从而发挥对自身免疫性疾病的治疗作用，可以开发为自身免疫性疾病的治疗药物。
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Claims (6)
1.磷酸萘酚喹作为唯一活性成分在制备治疗类风湿关节炎药物中的应用。
2.磷酸萘酚喹作为唯一活性成分在制备治疗系统性红斑狼疮药物中的应用。
3.根据权利要求1或2中任一项所述的应用，其特征在于，所述药物为治疗有效量的磷酸萘酚喹作为唯一活性成分与药用辅料组成的药物组合物。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述药物组合物为口服剂型或注射剂剂型。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述口服剂型为片剂、胶囊剂、冲剂或口服液体制剂。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述注射剂剂型为静脉注射剂或肌肉注射剂。
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