CN115067278B - 一种瘀阻脑络证颅内动脉血管延长扩张动脉模型的构建方法 - Google Patents

一种瘀阻脑络证颅内动脉血管延长扩张动脉模型的构建方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种瘀阻脑络证颅内动脉血管延长扩张动脉模型的构建方法，本发明公开了一种颅内动脉延长扩张症(IADE)动物模型的构建方法，属于动物模型构建技术领域，其包括以下步骤：1)通过小鼠枕大池注射2.5mU弹性蛋白酶的手术，构建颅内动脉延长扩张症动物模型；2)小鼠枕大池注射弹性蛋白酶手术2周后，通过血管造影技术，观察小鼠颅底动脉迂曲、延长、扩张的情况。本发明构建的IADE动物模型有利于阐释IADE的病理机制、药物的研发和IADE的防治。

Description

一种瘀阻脑络证颅内动脉血管延长扩张动脉模型的构建方法
技术领域
本发明属于动物模型构建技术领域，尤其涉及一种颅内动脉延长扩张症动物模型的构建方法。
背景技术
颅内动脉延长扩张症(IADE)是一种以椎、基底、大脑中、交通动脉的延长、扩张和弯曲为主要特征，以管壁中膜的内弹力层破坏、肌层萎缩和结缔组织的透明样变为主要病理变化的后循环疑难脑血管病。IADE的致残率和致死率较高，严重影响了患者的生命安全和生活质量，给社会带了沉重的医疗负担。根据Wolters等人的调查显示，IADE在卒中患者中发生率高达3％-17％，患者5年内脑梗死的发生率为17.6％，脑出血的发生率为4.7％，出现并发症后5年内死亡风险高达36.2％。IADE临床报道较多，但目前尚缺乏有效的特异性治疗药物和手段，且用于基础实验研究的动物模型欠缺，因而造成基础研究的困难与滞后。
目前国内对该模型的复制研究尚处于探索阶段，本研究根据相关文献报道，结合摸索的条件，通过小鼠小脑枕大池注射弹性蛋白酶的方法，建立IADE动物模型，探讨本病的发病机制与特点，以期为相关药物防治IADE的实验研究提供可靠的动物模型。
发明内容
本发明所要解决的技术问题：提供一种IADE动物模型的建立方法，解决现有颅内动脉延长扩张症研究模型缺乏的问题。
为解决上述技术问题，本发明提供以下的技术方案：
一种瘀阻脑络证颅内动脉血管延长扩张动脉模型的构建方法，包括以下步骤：通过小鼠枕大池注射弹性蛋白酶手术构建得到颅内动脉延长扩张症动物模型，在其手术2周后，对小鼠脑血管组织造影，分离脑组织后拍照记录图像，用于观察小鼠颅底动脉迂曲、延长、扩张的情况。
优选地，所述小鼠枕大池注射弹性蛋白酶手术的具体步骤如下：
1)小鼠实验室适应饲养后麻醉；
2)剃去颈部鼠毛以备皮，并将小鼠固定在脑立体定位仪上，下层铺无菌单，备皮处碘伏消毒，75％酒精脱碘；
3)沿枕骨下正中线开适当切口，然后沿着颈部白线剪开肌肉层，接着用解剖镊子分离附着在枕骨大孔的肌肉以暴露白色的硬脊膜层；
4)稳持微量注射器，以大脑中线，枕骨大孔的水平线交点为进针点，缓慢刺入枕骨大孔1mm的深度；
5)回抽脑脊液，当有脑脊液被回抽出时，表明进入小脑枕大池的位置正确，当回抽空泡或抽取不到脑脊液时，表明位置进入错误，不可注射，需要重新进针；
6)缓慢注射2.5μL含有25mU的弹性蛋白酶，在拔出注射器的同时，立刻用棉签轻轻按压，防止药液及脑脊液流出；
7)缝合伤口后注射抗生素预防感染；
8)术后注意37℃恒温保暖，每日检查动物伤口及状态，防止动物相互撕咬伤口。
优选地，所述步骤(1)具体为：实验室环境饲养一周，术前禁食禁水8h；按照1mL/min的流量，经小鼠呼吸道进行异氟烷空气麻醉。
优选地，所述步骤(2)中脑立体定位仪的固定参数：前高14-15cm，左右耳锥高15-16cm，左右耳锥宽度5-7cm；小鼠头部与平面平行，与身体呈110-120°，耳椎固定位置为小鼠耳前颞骨处。
优选地，所述步骤(9)中采用6-0可吸收性外科缝线依次进行肌肉层、筋膜层、皮层缝合，碘伏伤口处消毒，外用青霉素G钠预防感染。
优选地，所述脑血管组织造影方法为：造模14天后，小鼠在10％水合氯醛腹腔注射下麻醉，剪开胸腔，先以生理盐水20mL灌注，将血液置换，接着以4％多聚甲醛进行组织固定，最后再用配好的FlowTech MICROFIL血管造影剂3mL进行脑血管组织造影。
优选地，所述分离脑组织后拍照记录图像的方法为：将脑血管组织造影后的小鼠置于4℃冰箱中固定一夜，随后在解剖显微镜下行开颅术和硬脊膜切开术，将大脑半球从皮质表面上部分离，将脑组织沿着大脑血管网仔细地从颅腔内分离出来；然后进行拍照，并用Q-Capture Pro 7软件进行捕获图像，计算基底动脉血管迂曲指数和动脉直径增加百分比。
本发明获得的有益效果：本发明提供一种IADE动物模型的构建方法，从西医角度对颅内动脉延长扩张症提供理论认识，通过小鼠小脑枕大池注射弹性蛋白酶的方法，建立IADE动物模型，本发明操作步骤少，IADE模型稳定，对IADE的模拟程度高，可用于探讨本病的发病机制与特点，以期为药物干预IADE的实验研究提供可靠的动物模型。
附图说明
图1为小鼠脑组织及颅内动脉血管的对比图。
其中，图1A为假手术组，图1B为IADE模型组。
a-大脑前动脉A1段、b-后交通动脉、c-基底动脉、d-椎动脉。
具体实施方式
下面通过对实施例的描述，对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明，以帮助本领域的技术人员对本发明的发明构思、技术方案有更完整、准确和深入的理解。
实施例1：对小鼠进行IADE造模：
1)小鼠实验室适应环境一周，术前禁食禁水8h；按照1mL/min的流量，经小鼠呼吸道进行异氟烷空气麻醉；
2)小动物剃毛器剃去颈部鼠毛以备皮，并将小鼠固定在脑立体定位仪上，参数：前高14-15cm，左右耳锥高15-16cm，左右耳锥宽度5-7cm；小鼠头部与平面平行，与身体呈110-120°，耳椎固定位置为小鼠耳前颞骨处；
3)下层铺无菌单，备皮处碘伏消毒三次，75％酒精脱典2次；
4)沿枕骨下正中线开约1cm长的切口，然后沿着颈部白线剪开肌肉层，接着用解剖镊子分离附着在枕骨大孔的肌肉以暴露白色的硬脊膜层；
5)选用尖头10μL微量注射器，大拇指、食指、中指持微量注射器，无名指与小指依靠脑立体柱，以稳定持针之手，防止震颤及插入过深等；
6)以大脑中线，枕骨大孔的水平线交点为进针点，缓慢刺入枕骨大孔约1mm的深度，有落空感时即刻停止进针；
7)回抽脑脊液，当有脑脊液被回抽出时，说明进入枕大池的位置正确，当回抽空泡或抽取不到时，表明位置进入错误，不可进针，需要重新进针；
8)缓慢注射2.5μL含有25mU的弹性蛋白酶，在拔出注射器的同时，立刻用棉签轻轻按压，防止药液及脑脊液流出；
9)采用6-0可吸收性外科缝线依次进行肌肉层、筋膜层、皮层缝合，碘伏伤口处消毒，外撒青霉素G钠。
10)术后注意37℃恒温保暖，每日检查，防止动物相互撕咬伤口。
11)造模14天后，小鼠在10％水合氯醛腹腔注射下麻醉，剪开胸腔，先以生理盐水20mL灌注，将血液置换，接着以4％多聚甲醛进行组织固定，最后再用配好的FlowTechMICROFIL血管造影剂3mL进行脑血管组织造影。FlowTech MICROFIL血管造影剂为市售，按产品说明书进行造影操作。
12)将小鼠置于4℃冰箱中固定一夜，随后在解剖显微镜下行开颅术和硬脊膜切开术，将大脑半球从皮质表面上部分离，将脑组织沿着大脑血管网仔细地从颅腔内分离出来，然后进行拍照，并用Q-Capture Pro 7软件进行捕获图像，计算血管迂曲指数和动脉直径增加百分比。
对实施例1中制备的颅内动脉延长扩张症小鼠进行体征、舌质观察，以正常小鼠为参照，观察结果如图1所示。
小鼠舌质及颅内动脉血管的变化
按照数字表法将SPF级C57/BL6小鼠随机分为假手术组、造模组，每组15只；假手术组仅在小脑枕大池内注射含有灭活后的2.5mU弹性蛋白酶的磷酸盐缓冲液2.5uL。
颅内动脉血管的观察
如图1所示，图1A：假手术组，颅内血管光滑、正常。图1B：模型组，颅内动脉明显拉长和扭曲。
注射灭活弹性蛋白酶14天后，假手术小鼠颅内动脉血管未见明显延长、扩张和迂曲(图1A)。与假手术组相比，注射弹性蛋白酶14天后，模型组小鼠的大脑前动脉A1段、后交通动脉、基底动脉和椎动脉明显迂曲、伸长和扩张(图1B)。
如表1和表2所示，与假手术组相比，模型组小鼠基底动脉的明显弯曲，实际长度显著增加，平均延长率增加了26％，小鼠基底动脉、双侧大脑前动脉、双侧大脑后动脉最大直径明显增加，差异具有明显统计学意义(P<0.01)。在表1，表2中，模型组与假手术组相比较具有显著差异，**P<0.01。
表1弹性蛋白酶注射后基底动脉的最大弯曲度、延长长度、平均延长率变化(n＝15)
Figure BDA0003700998260000041
注：与假手术组相比较，**P<0.01。
表2弹性蛋白酶注射后基底动脉、大脑前动脉、后交通动脉的最大直径(mm)变化(n＝15)
Figure BDA0003700998260000042
注：与假手术组相比较，**P<0.01。
结合上述体征观察和实验测定结果，可以得出采用本发明方法即可构建出颅内动脉延长扩张症小鼠模型。
弹性蛋白酶注射到小脑延髓池后，其通过破坏中膜弹性纤维层和结缔组织，并诱发炎症反应，激活内源性蛋白酶，进而模拟人类颅内主动脉血管内弹力层破坏、肌层萎缩和结缔组织的透明样变的病理过程。
以上实施例仅为说明本发明的技术思想，不能以此限定本发明的保护范围，凡是按照本发明提出的技术思想，在技术方案基础上所做的任何改动，均落入本发明保护范围之内；本发明未涉及的技术均可通过现有技术加以实现。

Claims (6)

1.一种瘀阻脑络证颅内动脉血管延长扩张动脉模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：通过小鼠枕大池注射弹性蛋白酶手术构建得到颅内动脉延长扩张症动物模型，在其手术2周后，对小鼠脑血管组织造影，分离脑组织后拍照记录图像，用于观察小鼠颅底动脉迂曲、延长、扩张的情况；所述小鼠枕大池注射弹性蛋白酶手术的具体步骤如下：
1)小鼠实验室适应饲养后麻醉；
2)剃去颈部鼠毛以备皮，并将小鼠固定在脑立体定位仪上，下层铺无菌单，备皮处碘伏消毒，75％酒精脱碘；
3)沿枕骨下正中线开适当切口，然后沿着颈部白线剪开肌肉层，接着用解剖镊子分离附着在枕骨大孔的肌肉以暴露白色的硬脊膜层；
4)稳持微量注射器，以大脑中线，枕骨大孔的水平线交点为进针点，缓慢刺入枕骨大孔1mm的深度；
5)回抽脑脊液，当有脑脊液被回抽出时，表明进入小脑枕大池的位置正确，当回抽空泡或抽取不到脑脊液时，表明位置进入错误，不可注射，需要重新进针；
6)缓慢注射2.5μL含有25mU的弹性蛋白酶，在拔出注射器的同时，立刻用棉签轻轻按压，防止药液及脑脊液流出；
7)缝合伤口后注射抗生素预防感染；
8)术后注意37℃恒温保暖，每日检查动物伤口及状态，防止动物相互撕咬伤口。
2.根据权利要求1中所述的一种瘀阻脑络证颅内动脉血管延长扩张动脉模型的构建方法，其特征在于：所述步骤1)具体为：实验室环境饲养一周，术前禁食禁水8h；按照1mL/min的流量，经小鼠呼吸道进行异氟烷空气麻醉。
3.根据权利要求1中所述的一种瘀阻脑络证颅内动脉血管延长扩张动脉模型的构建方法，其特征在于：所述步骤2)中脑立体定位仪的固定参数：前高14-15cm，左右耳锥高15-16cm，左右耳锥宽度5-7cm；小鼠头部与平面平行，与身体呈110-120°，耳椎固定位置为小鼠耳前颞骨处。
4.根据权利要求1中所述的一种瘀阻脑络证颅内动脉血管延长扩张动脉模型的构建方法，其特征在于：所述步骤7)中采用6-0可吸收性外科缝线依次进行肌肉层、筋膜层、皮层缝合，碘伏伤口处消毒，外用青霉素G钠预防感染。
5.根据权利要求1～4中任一项所述一种瘀阻脑络证颅内动脉血管延长扩张动脉模型的构建方法，其特征在于：所述脑血管组织造影方法为：造模14天后，小鼠在10％水合氯醛腹腔注射下麻醉，剪开胸腔，先以生理盐水20mL灌注，将血液置换，接着以4％多聚甲醛进行组织固定，最后再用配好的FlowTechMICROFIL血管造影剂3mL进行脑血管组织造影。
6.根据权利要求5中所述一种瘀阻脑络证颅内动脉血管延长扩张动脉模型的构建方法，其特征在于，所述分离脑组织后拍照记录图像的方法为：将脑血管组织造影后的小鼠置于4℃冰箱中固定一夜，随后在解剖显微镜下行开颅术和硬脊膜切开术，将大脑半球从皮质表面上部分离，将脑组织沿着大脑血管网仔细地从颅腔内分离出来；然后进行拍照，并用Q-Capture Pro7软件进行捕获图像，计算基底动脉血管迂曲指数和动脉直径增加百分比。
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