CN115054605A - G9a抑制剂在制备治疗葡萄膜黑色素瘤的药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了G9a抑制剂在制备治疗葡萄膜黑色素瘤的药物中的应用，所述G9a抑制剂选自化合物Ⅰ及其盐酸盐、化合物Ⅱ及其盐酸盐的任意一种或任意两种以上的组合，所述化合物Ⅰ是UNC0631，分子式为C₃₇H₆₁N₇O₂，所述化合物Ⅱ是BIX01294，分子式为C₂₈H₃₈N₆O₂，在体外和体内水平上验证了G9a抑制剂可有效杀伤葡萄膜黑色素瘤细胞，有效抑制其增殖，可将肿瘤细胞周期阻滞在G1期，S期细胞比例减少，诱导肿瘤凋亡，降低其迁移能力，且药物作用随着浓度的升高而增加。本发明为葡萄膜黑色素瘤的临床治疗提供新的治疗药物，提高了目前针对葡萄膜黑色素瘤疾病的治疗效果。

Description

G9a抑制剂在制备治疗葡萄膜黑色素瘤的药物中的应用

技术领域

本发明涉及医学领域，具体涉及G9a抑制剂在制备治疗葡萄膜黑色素瘤药物中的应用。

背景技术

葡萄膜黑色素瘤(uveal melanoma,UM)是成人最常见的眼内恶性肿瘤，约占全身黑色素瘤的5％。UM起源于眼葡萄膜层的黑色素细胞，90％累及脉络膜，10％局限于睫状体或虹膜。UM患者的常见临床表现包括视力下降、视野丧失、虹膜颜色改变等，但约30％患者无明显症状，易贻误最佳诊疗时机。尽管巩膜敷贴放疗等局部治疗手段提高了眼内UM患者的保眼率，但发生巩膜或眼眶浸润的患者仍不得不接受眼球摘除术，甚至眶内容物剜除术，且约50％患者会发生远处转移，其中90％转移至肝脏。一旦出现肝转移，UM患者的生存时间明显缩短，中位无进展生存期和总体生存期分别仅为3.3个月和10.2个月。可见，UM是转移率、死亡率极高的临床难题。

UM具有独特的基因突变背景，约93％发生鸟嘌呤核苷酸结合蛋白(q)α亚基(Guanine nucleotide-binding protein G(q)subunit alpha,GNAQ)或鸟嘌呤核苷酸结合蛋白(11)α亚基(Guanine nucleotide-binding protein G(11)subunit alpha,GNA11)突变。上述基因突变导致G蛋白下游信号通路异常激活，包括PKC/MAPK/MEK/ERK、PI3K/Akt/mTOR和Trio/Rho/Rac/YAP等。研究者也开发了大量针对Gαq下游信号通路的抑制剂，如MEK抑制剂、PI3K/mTOR通路抑制剂、Yes相关蛋白抑制剂、血管内皮生长因子/受体抑制剂、酪氨酸激酶受体c-KIT抑制剂等。

目前报道的靶向GNAQ/GNA11编码蛋白Gαq的抑制剂仅有YM-254890和FR900359，这两者均为环状缩酚酸肽。YM-254890分离自肉杆菌属培养基，可抑制Gαq信号传导，如ADP诱导的血小板聚集和细胞内Ca离子的移动。将Gαq的晶体结构与GDP和YM-254890形成复合物，YM-254890可通过变构稳定作用，使Gαq与GDP结合，将Gαq锁定在失活状态。FR900359分离自紫金牛属植物，它的作用机制与YM-254890非常相似，能够特异性靶向Gαq，抑制其向下游传导信号。

在肿瘤研究中，多个靶向表观遗传调控分子的药物已展示出抑制肿瘤生长、增强肿瘤细胞对化疗和免疫治疗敏感性等作用。在UM治疗研究中，该类药物主要有HDAC抑制剂、DNA甲基化转移酶(DNAmethyltransferase,DNMT)抑制剂、组蛋白甲基转移酶和去甲基化酶的抑制剂等。其中，HDAC抑制剂在UM临床前研究和临床试验中显示出良好的杀伤效果，例如丙戊酸(valproic acid)、伏立诺他(vorinostat)、曲古菌素A(trichostatinA)、帕比司他(panobinostat)、丁酸钠(sodiumbutyrate)、JSL-1等。

但是，目前针对上述突变的靶向药物疗效均不理想：靶向GNAQ/GNA11编码蛋白Gαq的抑制剂YM-254890、FR900359分子结构复杂，难以进入临床应用；针对Gαq下游信号通路的抑制剂，如MEK抑制剂、PI3K/mTOR抑制剂、YAP抑制剂等，容易产生耐药，无法长久有效控制UM进展。靶向降解GNAQ mRNA的小干扰RNA联合腺病毒H101虽可显著杀伤UM细胞，但其体内治疗可行性有待进一步研究验证。

因此，亟需一种改善UM治疗效果，提高患者生存率的治疗新靶点和新的关键信号通路。

发明内容

本发明的目的是克服现有靶点和抑制剂针对UM治疗效果的不佳，导致患者生存率低的问题。

为了达到上述目的，本发明提供了G9a抑制剂在制备治疗葡萄膜黑色素瘤的药物中的应用。

较佳地，所述G9a抑制剂选自化合物(Ⅰ)和/或其盐酸盐、化合物(Ⅱ)和/或其盐酸盐的任意一种或任意两种以上的组合；

较佳地，所述G9a抑制剂能够阻断葡萄膜黑色素瘤细胞中RhoA信号通路的激活。

较佳地，所述G9a抑制剂能够杀伤葡萄膜黑色素瘤细胞。

较佳地，所述G9a抑制剂能够抑制葡萄膜黑色素瘤细胞的增殖。

较佳地，所述葡萄膜黑色素瘤可表征为G9a基因过表达。

较佳地，所述药物的作用随着浓度的升高而增加。

本发明的有益效果：

本发明首次发现了G9a抑制剂(如，UNC0631和BIX01294)的新用途：其可以抑制葡萄膜黑色素瘤细胞的生长，可将肿瘤细胞周期阻滞在G1期，使得S期细胞比例减少，进而实现诱导肿瘤凋亡，降低肿瘤细胞的迁移能力，可用于制备治疗葡萄膜黑色素瘤的药物。

本发明还证实了：

1)在体外实验上，G9a抑制剂对葡萄膜黑色素瘤细胞能够发挥显著的治疗作用；

2)经过体内实验，借助于小鼠眼内成瘤和皮下成瘤模型，进一步验证了G9a抑制剂可在体内抑制葡萄膜黑色素瘤细胞的增殖，为临床制备治疗葡萄膜黑色素瘤药物提供新的靶点策略。

附图说明

图1为高通量药筛技术(HTS)筛选得到的可有效杀伤UM细胞的G9a抑制剂的HTS结果图。

图2为UM组织内G9a的高表达情况示意图，标尺＝100μm。

图3为Western blot实验和流式细胞技术检测G9a抑制剂对UM细胞生长、细胞周期以及转移能力的结果图。

图4为染色质免疫共沉淀技术和Western blot实验检测G9a抑制剂对RhoA信号通路影响的结果图。

图5为正常对照组和眼部黑色素瘤组织芯片RhoA-GTP染色结果图及Kaplan-Meier生存曲线图，标尺＝100μm。

图6为对正常组织和UM细胞敲减G9a和使用G9a抑制剂处理后，Western blot实验、Realtime-PCR检测细胞中ARHGAP29表达的变化示意图。

图7为小鼠体内实验验证敲减G9a和使用G9a抑制剂对瘤体生长的影响示意图。

具体实施方式

G9a是一种含有经典SET结构域的组蛋白甲基转移酶，可以催化组蛋白H3第9位赖氨酸和P53的赖氨酸373的甲基化，具有多种生物学功能，包括细胞分化、基因转录和胚胎发育等。G9a在多种癌症中表达升高，被认为是一个具有广泛前景的新型抗肿瘤靶点，但是目前尚没有研究者针对G9a在葡萄膜黑色素瘤中开展研究。

基于前述，由于UM具有独特的基因突变背景，但是目前针对这些突变的靶向药物疗效均不理想。本发明筛选出G9a抑制剂，并进行了体内和体外实验进行验证，均发现G9a抑制剂对于UM具有较好的治疗效果。

以下结合附图和实施例对本发明的技术方案做进一步的说明。实施例中未注明具体技术或者条件的，均是按照本领域内的常用技术手段或者产品说明书方法所进行的，实验中所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1

高通量药筛技术HTS大规模筛选：筛选可有效杀伤UM细胞的G9a抑制剂。

运用高通量药筛技术(High Throughput Screen,HTS)和3541种化合物(本领域常用的药物筛选库，分别是selleck库、LOPAC库和一个天然产物的库三个库加起来的总和)对6株UM细胞系(3株GNAQ/11突变型细胞系92.1、OMM2.3、OMM1，3株GNAQ/11野生型细胞系Mel285、Mel290、MUM2B)进行细胞活力筛选，其中，GNAQ/11为GNAQ基因或者GNA11基因的简称。初筛药物浓度为2μM，药物作用时间为72h，72h后，采用CellTiter-Glo LuminescentCell Viability Assay试剂盒检测细胞活力，并与DMSO对照组对比，判断细胞存活率，计算杀伤效率，对表观遗传靶点药物进行有效统计。图1的A表示HTS库中表观遗传靶点药物及其杀伤作用示意图，根据图1的A发现，UM细胞经过72小时化合物处理，发现UNC0631和BIX01294可有效杀伤UM细胞(下划线标识出)。

其中，UNC0631的分子式为C₃₇H₆₁N₇O₂，CAS号为1320288-19-4，购自MedChemExpress，分子结构式如式Ⅰ所示，记为化合物(Ⅰ)；BIX01294的分子式为C₂₈H₃₈N₆O₂，CAS号为935693-62-2，购自MedChemExpress，分子结构式如式Ⅱ所示，记为化合物(Ⅱ)：

根据药物筛选结果可以想到的是，用作G9a抑制剂的其他种类化合物及其盐酸盐也能够产生和本发明同样的效果，也可以有效杀伤UM细胞。

图1的B表示对HTS的结果绘制log₂ ^FC曲线，圆点指示G9a抑制剂BIX01294和UNC0631。图1的C表示候选化合物对6株细胞的IC₅₀，并将比值取以log₁₀为底的对数，此值小于0说明对突变型细胞更有效，大于0说明野生型细胞更有效。

由此可见，图1的A显示前3种细胞为GNAQ/11突变型，后3种细胞为GNAQ/11野生型，前3种细胞活力低于后3种，由此可见，G9a抑制剂对前3种即GNAQ/11突变型细胞更为敏感，杀伤作用更强。根据图1的C发现，UNC0631和BIX01294的log₁₀值分别为-0.569和-0.656，均小于0。由此可见，GNAQ/11突变型细胞对G9a抑制剂更为敏感。

实施例2

组织芯片免疫荧光染色实验和Westernblot实验：肿瘤组织内G9a表达水平平较对照组织高的验证。

选取眼部黑色素瘤组织以及正常对照组织进行组织芯片免疫荧光染色，以此验证G9a的表达情况。图2的A表示组织芯片G9a的染色结果，红色代表G9a，蓝色代表DAPI，对组织芯片G9a表达量进行统计得到图2的B，图2的C表示Kaplan-Meier生存曲线绘制的G9a高/低表达组患者无复发生存期(recurrence free survival,RFS)示意图，图2的D表示小提琴图绘制的不同临床T分期患者G9a的表达水平示意图，图2的E表示使用Western Blot检测1例对照脉络膜组织(Ctrl)、2例结膜黑色素瘤(Conjunctival melanoma,CM)、9例UM中G9a、H3K9me2表达水平，图2的F表示使用Western Blot检测对照正常人皮肤黑色素细胞系PIG1和6株UM细胞(3株GNAQ/11突变型细胞系即92.1、OMM2.3、OMM1和3株GNAQ/11野生型细胞系即Mel285、Mel290、MUM2B)中G9a、H3K9me2表达水平。

由此可见，眼部黑色素瘤组织中G9a表达水平显著高于正常对照组织，高表达G9a组的无复发生存期显著低于低表达组，且G9a表达水平随着患者临床T分期进展而升高。WesternBlot检测发现部分UM患者G9a及其下游H3K9me2表达量相较于对照脉络膜组织、结膜黑色素瘤组织显著升高，且UM细胞的G9a、H3K9me2表达水平显著高于对照细胞PIG1。说明G9a抑制剂可有效杀伤UM细胞，且对GNAQ/11突变型细胞系具有特异性杀伤作用，患者瘤组织高表达G9a水平预示更短的RFS。

实施例3

WesternBlot实验和Transwell实验：不同浓度G9a抑制剂对UM细胞生长、转移的影响。

使用G9a抑制剂UNC0631、BIX01294处理3株UM细胞(92.1、OMM2.3、Mel290)，处理结束后利用WesternBlot实验检测细胞周期相关蛋白c-Myc、Cyclin D1、凋亡相关蛋白Bax、下游靶点的表达量H3K9me1、H3K9me2的表达量。图3的A表示WesternBlot检测后相关蛋白修饰表达水平，图3的B表示流式细胞技术检测不同浓度的UNC0631(0μM、3μM、5μM、10μM)处理后OMM2.3的细胞周期分布(从上到下依次为G2期、S期、G0/G1)，图3的C表示流式细胞技术检测不同浓度的UNC0631(从左到右依次为0μM、3μM、5μM、10μM)处理后OMM2.3的凋亡细胞比例，图3的D表示Transwell实验检测对照组和UNC0631处理组对MUM2B和Mel290处理后细胞迁移能力。

由此可见，UNC0631处理后下调c-Myc、Cyclin D1、Bax的表达量，同时H3K9me1、H3K9me2表达量也显著下降。流式细胞技术表明UNC0631处理可将细胞周期阻滞在G1期，使得S期细胞比例减少，与此同时，也会升高细胞的凋亡水平，并且随着UNC0631浓度的升高凋亡细胞的比例越多。Transwell实验表明，UNC0631处理后UM细胞的体外迁移能力下降。说明使用G9a抑制剂处理UM细胞，可以抑制UM细胞的增殖、阻滞细胞周期、诱导细胞凋亡、降低细胞迁移能力。

实施例4

G9a抑制剂的作用机理研究：G9a抑制剂可阻断UM细胞中RhoA信号通路激活。

为了探究G9a抑制剂杀伤UM细胞的作用机制及其调控的信号通路和关键的下游分子，本申请开展了G9a染色质免疫共沉淀(ChIP-seq)，图4的A表示ChIP-seq结果显示的G9a在基因组DNA上的结合峰分布情况，其中TSS(Transcription start site)为转录起始位点，图4的B表示对ChIP-seq结果中G9a结合基因进行KEGG通路富集分析，图4的C表示与G9a结合的DNA各区段比例的饼图，发现G9a可与Rap1、Hippo等信号通路基因结合，提示可能存在转录调控关系，根据有关文献报道，RhoA信号通路的激活可能与UM的发生机理相关。故本申请借助RhoA检测试剂盒进行相关信号通路的检测，图4的D表示利用活化RhoA检测试剂盒检测不同浓度UNC0631(0μM、1μM、2μM)处理前后UM细胞中RhoA的激活水平，其中GTPγS处理为阳性对照组，图4的E表示WesternBlot检测UM细胞(OMM2.3和OMM1)分别用UNC0631和BIX01294处理后Akt、YAP、ERK的磷酸化水平。

另外，使用组织芯片对正常对照组和眼部黑色素瘤组进行RhoA-GTP(激活型RhoA)免疫荧光染色，绿色代表RhoA-GTP，蓝色代表DAPI，图5的A表示组织芯片染色结果图，图5的B表示组织芯片RhoA-GTP表达量的统计图，图5的C表示Kaplan-Meier生存曲线绘制RhoA-GTP高表达组和低表达组的RFS图，图5的D表示不同临床T分期的患者RhoA-GTP表达水平的小提琴图。

由此可见，UNC0631处理后直接证明了G9a抑制剂可抑制细胞内RhoA信号通路的激活，Western Blot表明G9a抑制剂处理后，以GAPDH作为内参，p-Akt/Akt、p-YAP/YAP、p-ERK/ERK比例随着G9a抑制剂的加入均逐渐下降，而总Akt、YAP、ERK表达水平不受影响。说明p-Akt、p-YAP、p-ERK等Gαq下游信号通路的激活受到抑制。

由此可见，G9a抑制剂可调控UM细胞RhoA信号通路，该通路的异常激活可能与UM进展和患者不良预后密切相关。

实施例5

G9a抑制剂的作用机理中相关基因的研究：G9a抑制剂可调控UM细胞中RhoA活性相关基因ARHGAP29的表达。

为了进一步研究G9a抑制剂调控RhoA活性的分子机制，对ChIP-seq的结果进行深入分析，图6的A表示ChIP-seq的图谱，G9a可结合于ARHGAP29基因2号外显子附近区域，图6的B、C表示敲减G9a和G9a抑制剂(UNC0631和BIX01294)处理UM细胞(OMM2.3和OMM1)后，Realtime-PCR检测结果图，图6的D、E表示WesternBlot检测敲减G9a和G9a抑制剂(UNC0631和BIX01294)处理后，UM细胞中ARHGAP29mRNA的表达水平，图6的F、G表示Western Blot检测对照组细胞(PIG1)、GNAQ/11突变型细胞系(92.1、OMM2.3、OMM1)、GNAQ/11野生型细胞系(Mel285、Mel290、MUM2B)ARHGAP29蛋白表达水平，图6的H表示正常对照组脉络膜组织和UM组织中ARHGAP29mRNA的Realtime-PCR的对比图(P＜0.001)。其中敲减是先给细胞转染Cas9过表达质粒，运用抗性基因puromycin进行筛选，获得稳定表达Cas9蛋白的细胞，再给细胞转染sgRNA质粒，并用另一个抗性基因Blasticidin进行筛选，获得同时表达Cas9和sgRNA的细胞，从而达到特异性敲减的效果。

如图6所示，由此可见，在UM细胞中，敲减G9a和G9a抑制剂处理均可显著上调ARHGAP29mRNA和蛋白的表达，正常对照组和GNAQ/11WT细胞均有较高水平的ARHGAP29蛋白表达，而GNAQ/11突变型UM细胞中几乎不表达该蛋白，且UM组织中的ARHGAP29mRNA水平显著低于正常对照组脉络膜组织。故，ARHGAP29在GNAQ/11突变型UM细胞中显著低表达，相关文献提示与RhoA信号通路异常激活相关，而G9a抑制剂可以上调ARHGAP29表达水平，可能由此来调控RhoA信号通路的活性进一步证实了G9a抑制剂用于制备治疗葡萄膜黑色素瘤药物的药效药理。

实施例6

小鼠体内实验进一步验证：敲减G9a和使用G9a抑制剂均可抑制UM细胞体内增殖。

为了进一步研究G9a抑制剂的抗肿瘤效果，本实验开展了葡萄膜黑色素瘤的裸鼠体内实验，观察G9a抑制剂的体内抗肿瘤作用。第一种模型使用显微注射法分别将5×10⁵个正常对照组细胞和敲减G9a组OMM2.3细胞注射入裸鼠的眼内脉络膜下腔，待肿瘤细胞生长21天后取出眼球，并切片进行HE染色。第二种模型将1×10⁶个92.1细胞注射入裸鼠皮下，待瘤体长至20mm³时给予实验组腹腔注射UNC0631(5mg/kg，每日1次)，对照组给予相同体积的溶剂，每隔3日用游标卡尺测量瘤体体积。图7的A表示第一种模型取出带瘤体的眼球外观照和HE染色结果，图7的B表示对眼球内肿瘤质量进行统计的图，图7的C表示第二种模型的瘤体体积生长曲线，对照组和实验组的体积增长曲线具有显著性差异(P＜0.05)，图7的D表示UNC0631处理21天后取出瘤体的大体观。

如图7所示，由此可见，借助小鼠眼内成瘤和皮下成瘤模型，经过G9a抑制剂UNC0631的处理后，均可抑制体内UM细胞的增殖，体内实验结果进一步说明了G9a抑制剂在临床制备治疗葡萄膜黑色素瘤药物中具有较大的应用前景。

综上所述，G9a抑制剂UNC0631和BIX01294可以抑制葡萄膜黑色素瘤细胞的生长，进一步探究其机理发现：G9a抑制剂可以上调ARHGAP29的蛋白表达水平来阻断RhoA信号通路的激活，进一步通过体内实验，借助眼内成瘤和皮下成瘤模型，验证了G9a抑制剂可在体内抑制UM细胞的增殖。并且药物作用效果随着浓度的升高而增加，本发明G9a抑制剂包含但不限于上述UNC0631和BIX01294，G9a抑制剂的其他种类化合物及其盐酸盐也能够出现本发明所呈现的效果。本发明为葡萄膜黑色素瘤的临床治疗提供新的治疗药物，提高了目前针对葡萄膜黑色素瘤疾病的治疗效果。

尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细介绍，但应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后，对于本发明的多种修改和替代都将是显而易见的。因此，本发明的保护范围应由所附的权利要求来限定。

Claims (7)

1.G9a抑制剂在制备治疗葡萄膜黑色素瘤的药物中的应用。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述G9a抑制剂选自化合物(Ⅰ)和/或其盐酸盐、化合物(Ⅱ)和/或其盐酸盐的任意一种或任意两种以上的组合；

3.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述G9a抑制剂能够阻断葡萄膜黑色素瘤细胞中RhoA信号通路的激活。

4.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述G9a抑制剂能够杀伤葡萄膜黑色素瘤细胞。

5.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述G9a抑制剂能够抑制葡萄膜黑色素瘤细胞的增殖。

6.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述葡萄膜黑色素瘤可表征为G9a基因过表达。

7.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述药物的作用随着浓度的升高而增加。

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