CN115044672A - 可溶性cd58在胰腺癌诊断和预后中的应用 - Google Patents

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Abstract

本申请涉及可溶性CD58在胰腺癌诊断和预后中的应用。具体而言，涉及靶向可溶性CD58(sCD58)的试剂在制备用于胰腺癌诊断或预后的检测装置中的用途。sCD58单独或其他标志物联用时，具有区分非PDAC群体和PDAC群体的鉴别能力。当sCD58、TGF‑β1、CA199联用时，显著提升了胰腺癌诊断的敏感性。

Description

可溶性CD58在胰腺癌诊断和预后中的应用
技术领域
本发明涉及生物、医学、临床诊断领域。具体而言，涉及可溶性CD58在胰腺癌诊断和预后中的应用。
背景技术
胰腺导管腺癌(Pancreatic ductal adenocarcinoma，PDAC)是最具侵袭性和难治性的恶性肿瘤之一，约占所有胰腺癌的90％。PDAC患者的死亡率几乎等于其发病率，术后5年生存率仅为9％。PDAC预后不良的主要原因包括：缺乏特异性的肿瘤标志物和早期筛查方法导致诊断和筛查困难；胰腺癌对放疗和化疗反应差，易出现耐药；发生远处转移早，多数患者在初诊时已失去了手术机会。尽管通过包括手术和辅助化疗在内的一系列综合治疗可能提供延长患者生存期的机会，但PDAC患者的生存预后在大多数情况下仍不理想。
NCCN指南明确建议对任何分期的PDAC患者均应该考虑化疗，但化疗的疗效目前依然不尽如人意。PDAC有着特殊的肿瘤免疫微环境(Tumor immune microenvironment,TIME)，其显著特点是大量的免疫细胞浸润以及高度的免疫抑制状态，所以近年靶向免疫微环境联合化疗的免疫化疗成为了PDAC研究的潜在突破点之一。
现有技术中已报道CD58在胰腺炎和胰腺癌组织中的表达情况。在Oncomine中分析Logsdon的数据集发现，与正常胰腺组织相比，胰腺炎中的CD58表达显著上调。Badea和Segara的数据显示，与正常胰腺组织相比，PDAC组织中CD58表达水平显著升高。在GEPIA中，来自TCGA和GTEx的数据也表明相较于正常胰腺组织，PDAC组织中CD58的转录水平显著升高。
然而，上述现有技术中需要对受试者进行癌组织的活检操作。患者依从性差，并且不利于对胰腺癌的早期诊断。因而，寻找更为便捷的胰腺癌鉴定标志物，具有重要的临床意义。
发明内容
鉴于本领域的上述需求，根据一些实施方案，提供了靶向可溶性CD58的试剂在制备检测装置中的用途，所述检测装置用于胰腺癌的诊断或预后，所述靶向可溶性CD58的试剂能够确定受试者样本中可溶性CD58的表达水平，所述表达水平是核酸水平或蛋白水平。
在一些实施方案中，所述检测装置是选自以下任一项或其组合：试剂盒、芯片、试纸、孔板。
在一些实施方案中，所述胰腺癌是胰腺导管腺癌。
在另一些实施方案中，所述检测装置还包含靶向TGF-β1的试剂，所述靶向TGF-β1的试剂能够确定受试者样本中TGF-β1的表达水平(所述表达水平是核酸水平或蛋白水平)。
在另一些实施方案中，所述检测装置还包含靶向常规肿瘤标志物的试剂，所述靶向常规肿瘤标志物的试剂能够确定受试者样本中常规肿瘤标志物的表达水平，所述常规肿瘤标志物选自以下任一项或其组合：CA199、CEA、CA125(优选地，CA199)，所述表达水平是核酸水平或蛋白水平。
在一些实施方案中，所述样本选自以下的任一项：全血、血浆、血清、肿瘤组织的分泌上清。
在一些实施方案中，相较于对照样本，可溶性CD58在受试者样本中的表达水平更高，指示选自以下的任一项或组合：所述受试者患有胰腺导管腺癌、所述受试者患胰腺导管腺癌的风险提高、所述受试者的预后不佳、所述受试者预后不佳的风险提高。
在一些实施方案中，所述对照样本来自未患胰腺导管腺癌的个体。
在一些具体的实施方案中，所述对照样本来自以下的任一项或其组合：胰腺低度恶性肿瘤的个体、胰腺良性疾病的个体、健康个体。
在另一些实施方案中，相较于对照样本，TGF-β1在受试者样本中的表达水平更高，指示选自以下的任一项或组合：所述受试者患有胰腺导管腺癌、所述受试者患胰腺导管腺癌的风险提高、所述受试者的预后不佳、所述受试者预后不佳的风险提高。
在一些实施方案中，所述对照样本来自未患胰腺导管腺癌的个体。
在一些具体的实施方案中，所述对照样本来自以下的任一项或其组合：胰腺低度恶性肿瘤的个体、胰腺良性疾病的个体、健康个体。
在另一些实施方案中，相较于对照样本，CA199在受试者样本中的表达水平更高，指示选自以下的任一项或组合：所述受试者患有胰腺导管腺癌、所述受试者患胰腺导管腺癌的风险提高、所述受试者的预后不佳、所述受试者预后不佳的风险提高。
在一些实施方案中，所述对照样本来自未患胰腺导管腺癌的个体。
在一些具体的实施方案中，所述对照样本来自以下的任一项或其组合：胰腺低度恶性肿瘤的个体、胰腺良性疾病的个体、健康个体。
在一些实施方案中，当在核酸水平确定表达水平时，所述试剂是探针或引物对。
在一些实施方案中，当在蛋白水平确定表达水平时，所述试剂是选自以下任一项：抗体、抗原结合片段、质谱鉴定试剂。
在一些具体的实施方案中，抗体是多克隆抗体或单克隆抗体。
在一些具体的实施方案中，所述抗体源自：鼠、兔、马、禽、羊、骆驼科、犬、牛、灵长类、重组抗体。
在一些具体的实施方案中，所述抗原结合片段选自以下的任一项或其组合：Fv、Fab、Fab’、F(ab’)2、单域抗体、单链Fab、双抗体、线性抗体、scFv、多特异性抗体。
在另一些实施方案中，所述质谱鉴定试剂包含质谱鉴定参数。
在一些实施方案中，所述预后是指选自以下的任一项或其组合：预后受试者的结局、预后受试者的治疗效果、预后受试者的生存。
在一些实施方案中，所述生存选自：总体生存、无瘤生存、一年生存、两年生存、五年生存；优选总体生存。
在一些实施方案中，所述胰腺导管腺癌的分期选自以下的任一项或组合：IIA、IIB、III、IV期。
附图说明
图1：七种胰腺癌细胞系中，验证TGF-β1和CD58在转录水平上的相关性(Spearman相关，P＝0.0161)。
图2：流式细胞术检测胰腺癌细胞表面mCD58的表达水平。
图3：ELISA检测胰腺癌细胞上清中sCD58的含量。
图4：胰腺癌细胞上清中TGF-β1(ng/l/106细胞)和sCD58(ng/ml/106细胞)含量的相关性(Spearman相关，P＝0.0029)。
图5：胰腺癌细胞上清中TGF-β1(ng/l/106细胞)和细胞表面mCD58的表达水平(MFI)。均值±SD，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。
图6A和图6B：流式细胞术检测共培养后胰腺癌细胞表面mCD58的表达。
图7：ELISA检测共培养后培养液中sCD58的含量(ng/ml)。
图8A和图8B：Western blot检测rTGF-β1和SB431542分别刺激和阻滞TGF-β/smad2/3信号通路激活的蛋白验证和CD58的蛋白表达。
图9A和图9B：流式细胞术检测rTGF-β1和SB431542分别刺激和阻滞TGF-β/smad2/3信号通路后，PDAC细胞膜表面mCD58(跨膜+GPI亚型)的表达(MFI)。
图10：ELISA检测rTGF-β1和SB431542分别刺激和阻滞TGF-β/smad2/3信号通路后，培养液上清中sCD58的含量(ng/ml)。平均值±SD，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。
图11A和图11B：PDAC患者血清中sCD58和TGF-β1的含量(Mann-Whitney检验)。
图12：PDAC中I期和II期患者血清sCD58和TGF-β1的含量差异对比(Kruskal-Wallis H检验)。
图13A至图13E：临床常用肿瘤标志物在PDAC患者血清中的水平，包括CA199、CEA、CA125、CA153以及AFP(Mann-Whitney检验)。所用检验均为非参数非配对Wilcoxon秩和检验，该换算并不影响最终的检验结果。肿瘤标志物存在部分缺失值，每种指标的例数已标记于统计图中括号内。n.s.不显著，*P<0.05，***P<0.001，****P<0.0001。
图14A和图14B：sCD58和TGF-β1在PDAC、胰腺导管内乳头状粘液腺瘤(IPMN)、胰腺实性假乳头状瘤(SPT)、胰腺神经内分泌瘤(pNET)、胰腺浆液性囊腺瘤、胰腺黏液性囊腺瘤、胰腺假性囊肿以及慢性胰腺炎患者血清中的含量差异(非参数Wilcoxon秩和检验)。
图15：所有PDAC患者血清中sCD58和TGF-β1的散点图和相关性分析(n＝131)。
图16：所有胰腺疾病患者血清中sCD58和TGF-β1的散点图和相关性分析(n＝344)。
图17：所有纳入的整个患者群体血清中sCD58和TGF-β1的散点图和相关性分析(n＝405)。
图18：所有入组样本血清中sCD58和TGF-β1的散点图和相关性分析(N＝537)。
图19A至图19C：sCD58、TGF-β1、CA199指标在正常人群鉴别PDAC的能力比较。
图20A至图20C：根据Youden指数最大值分别确定sCD58、TGF-β1、lgCA199+1的最佳Cutoff值。相关病例数已标记于图中括号内。
图21A至图21C：sCD58、TGF-β1、lgCA199+1分别和联合绘制ROC曲线图。
图22：sCD58、TGF-β1、CA199指标在非PDAC群体中鉴别PDAC的能力比较。二联模型Y＝0.020585×sCD58(ng/ml)+0.008258×TGF-β1(pg/ml)；三联模型Y＝0.019021×sCD58(ng/ml)+0.008389×TGF-β1(pg/ml)+0.000875×CA199(U/ml)。
图23A和图23B：sCD58和TGF-β1的血清含量与胰腺癌患者预后的关联。
具体实施方式
术语
本申请所用术语“肿瘤微环境”是指：除肿瘤细胞外，癌灶中还存在间质成分，其由细胞和非细胞组分构成(包括上皮细胞、脂肪细胞、成纤维细胞、平滑肌细胞、血管内皮细胞、免疫细胞以及细胞外基质和丰富的信号分子)，它们共同形成肿瘤所在的微环境。
CD58又称淋巴细胞功能相关抗原-3(Lymphocyte function associatedantigen-3，LFA-3)。CD58是一种高度糖基化的细胞粘附分子。CD58有两种亚型来源于不同的mRNA剪接：I型跨膜和糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定的形式。跨膜亚型具有一个胞外域，有6个N-连接糖基化位点依次连接到一个疏水跨膜区和一个12个氨基酸的胞浆段。GPI锚定亚型通过无跨膜区和胞浆结构域的GPI尾锚定在细胞膜的外侧。两种亚型在细胞内的定位不同：GPI锚定亚型位于脂筏，而跨膜亚型位于非筏微区。
CD58应作做广泛的解读，是指CD58基因在各阶段中的各种形式的分子，例如但不限于CD58基因在扩增、复制、转录、剪接、加工、翻译、修饰过程中所产生的分子，例如cDNA、mRNA、前体蛋白、成熟蛋白、天然变体、修饰形式、及其片段。作为一个示例，CD58是CD58的亚型，例如但不限于可溶性CD58、GPI锚定亚型、或跨膜亚型。作为一个示例，CD58是人可溶性CD58。
在本申请上下文中，可溶性CD58(sCD58)是一种可溶性蛋白或多肽，它源自跨膜亚型CD58和/或GPI亚型CD58经酶水解的胞外域。应当知晓的是，受切割位点和水解酶类型的影响，sCD58的氨基酸序列不严格一致，氨基端或羧基端可以存在截短。sCD58脱落释放至细胞外，而能够在人血清、尿液、胸腔积液等体液以及体外细胞培养上清中被检测到。
TGF-β1应作做广泛的解读，是指TGF-β1基因在各阶段中的各种形式的分子，例如但不限于TGF-β1基因在扩增、复制、转录、剪接、加工、翻译、修饰过程中所产生的分子，例如cDNA、mRNA、前体蛋白、成熟蛋白、天然变体、修饰形式、及其片段。作为一个示例，TGF-β1是人TGF-β1。
CA199应作做广泛的解读，是指CA199基因在各阶段中的各种形式的分子，例如但不限于CA199基因在扩增、复制、转录、剪接、加工、翻译、修饰过程中所产生的分子，例如cDNA、mRNA、前体蛋白、成熟蛋白、天然变体、修饰形式、及其片段。作为一个示例，CA199是人CA199。
在本说明书的上下文中，预后是指预测胰腺癌的可能病程和结局。预后涉及选自以下的内容：判断疾病的特定后果(如康复、某种症状、体征、并发症)；提供时间线索(如预测某段时间内发生某种结局的可能性)。当从疾病演进过程的角度考虑时，预后包括例如缓解率、复发率、病残率。当从疾病终极状态的角度考虑时，预后包括例如治愈率、生存率、病死率。当从预后时间考虑时，预后包括例如近期病死率、远期病死率(参见刘振华主编的《肿瘤预后学》)。
靶向试剂
在本申请中，靶标是指本申请的靶向试剂所针对的客体；其可以是核酸(基因、mRNA等)，也可以是蛋白(前体、同种型)。作为一个示例，靶标是抗原(如，但不限于sCD58、TGF-β1、CA199或其表位)作为靶标。
靶向试剂是指能够在蛋白或核酸水平确定靶标是否存在或确定靶标水平的试剂。
在一些实施方案中，靶向试剂是靶向sCD58的试剂，是指能够确定sCD58是否存在(定性)或确定sCD58水平(定量)的试剂。在具体的示例中，所述确定是在蛋白水平上的确定。
在一些实施方案中，靶向试剂是靶向TGF-β1的试剂，是指能够确定TGF-β1是否存在(定性)或确定TGF-β1水平(定量)的试剂。在具体的示例中，所述确定是在蛋白水平上的确定。
在一些实施方案中，靶向试剂是靶向CA199的试剂，是指能够确定CA199是否存在(定性)或确定CA199水平(定量)的试剂。在具体的示例中，所述确定是在蛋白水平上的确定。
在一些实施方案中，靶向试剂是靶向其他生物标志物(如常规肿瘤标志物)的试剂，是指能够确定生物标志物是否存在(定性)或确定生物标志物水平(定量)的试剂。
在一些实施方案中，当在蛋白水平确定靶标是否存在或确定靶标水平时，靶向靶标的试剂是抗-靶标的抗体或其抗原结合片段。
“抗原”是指能够由抗原结合蛋白(例如抗体)所特异性识别或结合的分子或分子部分。抗原可具有一个或多个表位。“表位”指能够与抗体或其抗原结合片段特异性结合的抗原上的区域。表位可以由连续氨基酸串(线性表位)形成；或包含非连续氨基酸(构象表位)。
“能够特异性结合”、“特异性结合”或“结合”是指相比其他抗原或表位，抗体能够以更高的亲和力结合至靶标抗原或其表位。通常地，抗体以约1×10-7M或更小(例如约1×10-8M或更小)的平衡解离常数(KD)结合抗原或其表位。可使用已知的方法来测量KD，例如通过
Figure BDA0003641837200000081
表面等离子体共振测定法所测量的。
“抗体”以最广义使用，并且涵盖各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体，多克隆抗体；单特异性抗体，多特异性抗体；全长抗体和抗体片段，只要它们展现出期望的抗原结合活性即可。
“抗体片段”或“抗原结合片段”指不同于完整抗体的分子，其包含完整抗体的部分，所述部分与完整抗体所结合的抗原(如sCD58)相结合。抗体片段的示例包括但不限于Fv、Fab、Fab’、F(ab’)2、单域抗体、单链Fab(scFab)、双抗体、线性抗体、scFv；以及由抗体片段形成的多特异性抗体。
技术人员理解，本申请的技术效果不依赖与特定的抗体株，只要是能够靶向靶标(如sCD58)的抗体或其抗原结合片段都能够实施本申请的技术方案，可以是市售抗体或实验室制备的抗体。
在具体的实施方案中，任何检测和/或定量蛋白的试剂都可用于本申请的技术方案。例如，在一些实施方案中，所述靶向试剂是质谱鉴定试剂(也涉及质谱鉴定靶标所用的定量参数)。比如，可以采用液质联用的方式定性/定量蛋白或多肽。技术人员理解，根据质谱仪的具体类型，可以自行调整仪器的鉴定模式。
作为一个示例，当采用质谱鉴定试剂时，使用非数据依赖性的采集方法和平行反应监测。非数据依赖性的采集方法将质谱整个全扫描范围分为若干个窗口，高速、循环地对每个窗口中的所有离子进行选择、碎裂、检测，从而无遗漏、无差异地获得样本中所有离子的全部碎片信息。平行反应监测是一种基于二级质谱信号的靶标质谱定量分析技术，相较于传统的选择反应监测技术，不需要预先设计靶标蛋白的母离子/子离子配对信息，节约实验设计和操作时间；且选择性更高，灵敏度更佳，重现性更好，在复杂背景中的抗干扰能力更强。相较于免疫方法，不再受制于商业化抗体，克服了基于免疫方法对抗体特异性和滴度的限制。平行反应监测技术能够同时对多种蛋白质进行定性和定量分析。
标签肽是指能够代表某一个蛋白的肽段，其特征在于存在且特异性仅存在于某蛋白质氨基酸序列中。在一些实施方案中，本申请的鉴定试剂能够识别、或结合、或搜索、或监测、或靶向到这样的标签肽(如sCD58中的序列)。
尽管具体示例中将基于特定的某段序列对蛋白进行了鉴定和定量，但是这不意味着靶标中其他位置的肽片段不能使用，只要这样的片段能将不同的蛋白彼此区分开，就适用于本申请。在本申请的教导下，技术人员根据常规技术结合所用鉴定方法的操作要求，便可确定片段的位置或长度。
在一些实施方案中，当在核酸(如RNA)水平确定靶标是否存在或确定靶标水平时，靶向靶标的试剂是引物(对)或探针的形式，其识别并结合靶标核酸的一段或全长序列。
引物是指在核苷酸聚合作用起始时，促进合成的一种具有特定核苷酸序列的分子。引物通常是人工合成的两段核苷酸序列，一个引物与靶标区域(或模板、靶标序列)的一端互补，另一个引物与靶标区域的另一端互补，其功能是作为核苷酸聚合作用的起始点，从而核酸聚合酶能够顺着其3’端开始合成新的核苷酸链。
引物可以是DNA引物或RNA引物。在本申请具体的示例中，优选RNA引物。应当理解的是，RNA引物所对应的DNA引物仍落入本申请的范围。由于引物通常以一对的形式出现，因此称为引物对。引物对中的一个引物特异于靶序列的上游，作为正向引物；另一个引物特异于靶序列的下游，作为反向引物。
当给定靶标序列时，技术人员根据教科书和核苷酸序列互补原理(例如《分子克隆实验指南》2017；P450“使用Primer3 Plus设计PCR引物”；第13章“标记的DNA探针、RNA探针和寡核苷酸探针的制备”)，知晓引物扩增靶向序列的原理、知晓探针结合靶向序列的原理，也清楚引物和探针的设计原则。现有技术中有多种引物/探针的设计软件，例如PrimerPremier、Oligo7、BeaconDesigner等。当技术人员知晓靶标序列时，可以涉及并获得特异性的引物或探针的序列信息和结构信息。因此，本申请的技术方案不限于特定的引物对或探针序列。作为一个示例，引物/探针的长度不超过50个nt，例如但不限于1、2、3、5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、42、44、46、48、50个nt。
应当理解，尽管具体示例中采用特定的鉴定方式及其对应的靶向试剂，但是本申请技术效果的实现并不依赖于特定方式(例如质谱操作步骤、质谱仪型号、质谱方法中设定的参数、质谱鉴定中所识别的特定肽段序列、色谱柱型号、供应商、抗体株、抗体靶向的表位)，这是因为本申请技术方案的核心在于发现了可溶性CD58在样本中的存在量与疾病之间的关系，因此任何能够确定蛋白含量的手段都是可用的。
根据本申请的一种或多种靶向试剂能够在以下样本中实现对靶标表达水平的确定：全血、血浆、血清、肿瘤组织的分泌上清。
根据本申请的一种或多种靶向试剂可以以缀合物或标记的形式存在，以获得可检测/可定量的信号。当与合适的标记或可检测的生物分子(或化学物质)一起使用时，靶向试剂尤其可用于体外和体内诊断和预后应用。
用于免疫分析的标记是本领域技术人员已知的，并且包括酶、放射性同位素、荧光、发光、颗粒(如胶乳、磁颗粒)、显色物质(例如胶体金)。
靶向试剂的用途
在一些实施方案中，提供了根据本申请的一种或多种靶向试剂用于制备检测装置的用途。
在一些实施方案中，提供了根据本申请的靶向可溶性CD58的试剂在制备检测装置中的用途，其中所述检测装置用于胰腺癌的诊断或预后。
在一些实施方案中，靶向可溶性CD58的试剂和靶向TGF-β1的试剂联合用于制备检测装置。
在一些实施方案中，靶向可溶性CD58的试剂、靶向TGF-β1的试剂和靶向常规肿瘤标志物的试剂联合用于制备检测装置。
在一些实施方案中，常规肿瘤标志物选自以下任一项或其组合：CA199、CEA、CA125。
在一些具体的实施方案中，常规肿瘤标志物是CA199。
在一些实施方案中，所述检测装置用于胰腺癌的诊断。
在另一些实施方案中，所述检测装置用于胰腺癌的预后。
“诊断”和“预后”是不同的概念(参见《肿瘤学》王林，天津科学技术出版社，2006)。
癌症生物标志物可分为2种类型：1)预后型和2)诊断型。
诊断型生物标志物：用于识别受试者是否具有特定疾病的状况、用于明确受试者所患疾病的具体性质。例如，在肿瘤领域中，用以判断受试者所患肿瘤的具体类型(比如，良性或恶性的区分)。
预后型生物标志物：在明确诊断后，进一步评估某一特定疾病对受试者临床结局的影响。
在一些具体的实施方案中，非胰腺导管腺癌群体包括以下的任一项或其组合：胰腺低度恶性肿瘤的个体、胰腺良性疾病的个体、健康个体。
在一些具体的实施方案中，所述预后是指选自以下的任一项或其组合：预后受试者的结局、预后受试者的治疗效果、预后受试者的生存。在一些具体的实施方案中，所述生存选自：总体生存、无瘤生存、一年生存、两年生存、五年生存。
在本申请上下文中，胰腺癌根据WHO分类(2010版)，按照组织起源，胰腺肿瘤可分为：上皮性肿瘤、间叶性肿瘤、生殖细胞性肿瘤、继发性肿瘤；其中，上皮性肿瘤分为外分泌肿瘤和内分泌肿瘤。
在一些实施方案中，外分泌肿瘤分为：
-良性肿瘤：腺泡细胞囊腺瘤、浆液性囊腺瘤；
-癌前病变：胰腺上皮内肿瘤3级(PanIN-3)、导管内乳头状黏液性肿瘤伴轻-中度非典型增生、导管内乳头状黏液性肿瘤伴重度非典型增生、导管内管状乳头状肿瘤、黏液性囊性肿瘤伴轻度-中度不典型增生、黏液性囊性肿瘤伴高度不典型增生；
-恶性肿瘤：导管腺癌、腺鳞癌、胶样癌(黏液性非囊性癌)、肝样腺癌、髓样癌、印戒细胞癌、未分化癌、未分化癌伴破骨样巨细胞、腺泡细胞癌、腺泡细胞囊腺癌、导管内乳头状黏液性肿瘤伴有间质浸润、混合性腺泡-导管癌、混合性腺泡-内分泌癌、混合性腺泡-内分泌-导管癌、混合性导管-内分泌癌、黏液性囊性肿瘤伴浸润性癌、胰腺母细胞瘤、浆液性囊腺癌、实性-假乳头状肿瘤。
在一些实施方案中，内分泌肿瘤分为：
-胰腺神经内分泌微腺瘤；
-非功能性神经内分泌瘤：NET，G1、NET，G2；
-神经内分泌癌NEC：小细胞NEC、大细胞NEC；
-5-羟色胺生成性神经内分泌瘤；
-胃泌素瘤；
-胰高血糖素瘤；
-胰岛素瘤；
-生长抑素瘤；
-肠道血管活性肽瘤。
在一些实施方案中，胰腺癌分期可采用AJCC第八版的TNM分期，根据胰腺肿瘤大小、有无淋巴结转移、有无肝、肺等远处转移等因素，分成I期(A、B)、II期(A、B)、III期、IV期。在一些实施方案中，先进行TNM分期，再根据TNM分期确定临床分期。
TNM分期：
Figure BDA0003641837200000121
临床分期：
IA：T1N0M0；
IB：T2N0M0；
IIA：T3N0M0；
IIB：T1至3N1M0；
III：T任意N2M0、或T4N任意M0；
IV：T任意N任意M1。
在一些具体的实施方案中，本申请的靶向试剂、检测装置尤其适用于：区分非胰腺导管腺癌群体和胰腺导管腺癌群体；或者对胰腺导管腺癌的受试者进行预后。
在一些具体的实施方案中，本申请的靶向试剂、检测装置尤其适用于II期和以上的胰腺导管腺癌。
检测装置
技术人员知晓，检测装置可以体现为任何已知的或将来的形式，例如但不限于试剂盒、试纸、孔板、或芯片的形式。
在一些实施方案中，检测装置包含至少一个容器，容器中分别包含本申请的一种或多种靶向试剂。
当检测装置是试剂(或试剂盒)的形式时，其包含本申请的一种或多种靶向试剂。靶向试剂可制备成液体或冻干粉的形式。
当检测装置是芯片、孔板、试纸(如条、卡)的形式时，在固相载体上结合或包被有本申请的一种或多种靶向试剂。
作为一个示例，抗体(或抗原结合片段)结合样本中的靶标(如sCD58)，从而实现对靶标(如sCD58)的可视化、量化、分选、和/或富集。当靶向试剂和靶标的结合基于抗原-抗体相互作用时，所述检测装置可以是现有技术中任何适当的形式，包括但不限于ELISA检测试剂、免疫比浊检测试剂、磁颗粒检测试剂、化学发光检测试剂、放射免疫检测试剂、免疫荧光检测试剂。
例如，在ELISA中，当靶向试剂用酶标记时，试剂盒将包括酶所需的底物和辅因子(例如，可检测的发色团或荧光团的底物)。此外，可以包括其他添加剂，如稳定剂、缓冲剂等。这种试剂盒可以包含一个或多个容器(如瓶、管等)。一个容器含有结合至不溶性或部分可溶性载体的靶向试剂；第二容器可含有冻干形式或溶液中可溶性的可检测标记的二抗。可以提供标签或包装插页描述预后或诊断用途。
作为又一个示例，当采用质谱鉴定试剂时，鉴定试剂作广泛理解，不能仅解释为实体存在的化学、生物试剂。质谱鉴定试剂也包含质谱鉴定参数。当检测装置制备成适用于质谱鉴定时，还任选包含选自以下的任一项或其组合：色谱柱、胰蛋白酶、流动相、洗脱相、载剂等试剂或组件。
诊断或预后方法
在一些实施方案中，提供了一种胰腺癌的诊断或预后方法，其包括步骤：
1)提供来自受试者/对照的样本；
2)使样本接触有效量的本申请的一种或多种靶向试剂；
3)确定样本中靶标的表达水平；
4)任选地，将样本中靶标的表达水平和对照中靶标的表达水平进行比较；
5)根据步骤4)的比较结果，判定受试者是否患有胰腺癌、患胰腺癌的风险、对胰腺癌受试者进行预后预测。
有效量是指足以确定靶标表达水平的量。这样的量是技术人员根据检测装置的类型、检测原理、样本类型、样本量、检测标记(如底物、荧光类型)、靶向试剂的剂型等因素而确定的。
受试者可以是已患有、已治疗的、未患有、疑似患有、易感于胰腺癌的受试者。
“患有”应当做最广泛地理解，包括：已经患有；或者在设定的显著水平处，患有所述疾病的概率统计学上显著高于对照。上下文将能够暗示“患有”的具体含义。
“样本”可以是可以从受试者获取的任意样本。这样的样本必须允许确定本申请的生物标志物的表达水平。因此，样本的性质将因此取决于肿瘤/癌症的性质。
在一些实施方案中，生物样本包括血液、血浆、血清、淋巴液、间质液、组织液、肿瘤组织的分泌上清。
优选地，生物样本是生物流体，如人的血液、血浆、血清。
参照样本、对照样本、对照可互换使用。在一个实施方案中，对照来自健康和/或无目标疾病的个体。
受试者样本中靶标的表达水平相对于对照样本中靶标的表达水平(可称为“对照水平”或“参照水平”)进行比较或测量。“对照水平”是指在对照样本中测量的单独的基线水平；对照样本通常为无疾病或无癌症个体的样本、健康个体的样本、或者虽然患有其他疾病但未患胰腺导管腺癌的个体的样本。
例如，对照水平可以是采取各种形式的预定值。对照水平可以是单个截断值，如中位数或平均值，可以是参考区间。对照水平可以根据患者的特定亚群而变化。因此，例如，同样的癌症，老年人可能具有与年轻人不同参考区间；以及同样的癌症，女性可能具有与男性不同的参考水平。“对照水平”也可以是体外培养样本中靶标的水平，其可以被操纵以模拟癌细胞，或者可以进行操纵以产生参考水平的表达水平。另一方面，预定值可以被设定，例如，将测试的群平均(或不平均)分成组，如低风险组、中等风险组、高风险组；或者按照疾病的分期进行分组。
显然，未患导管腺癌的群与患有导管腺癌的群具有不同的靶标表达水平的范围。所选择的预定值可以考虑群体的类别。本领域普通技术人员可以选择合适的范围和类别。“升高”、“增加”、“提高”、“高于”是指，在设定的统计学显著水平上，相对于所选择的对照水平是高的。
在一些实施方案中，受试者样本中靶标的表达水平是对照样本中靶标的表达水平的1倍以上，例如但不限于至少1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70倍、以及更高。
在一些实施方案中，受试者样本中靶标的表达水平相对于对照样本中靶标的表达水平，存在统计学上的显著差异，p设置为例如0.5、0.1、0.05、0.01、0.005、0.001、0.0005、0.0001、甚至更低。例如，当两个个体或群测量的表述水平，所得p值小于特定p值水平时，则认为两个个体或群存在统计学上的显著差异。
实施例
材料：对于免疫组化染色和Western blot实验，所用CD58抗体为abcam公司的货号ab196648(EP15041)，免疫原为CD58蛋白胞外段。对于胰腺癌细胞表面CD58的流式细胞术，针对膜型CD58(GPI+跨膜)的抗体为Biolegend公司的货号330917(TS2/9)。检测细胞培养液上清和血清中的sCD58，所用CD58抗体是货号MM-1518H1(EPR24012-147)，免疫原为CD58蛋白胞外段29-215aa。
实施例1.PDAC细胞膜表面CD58、上清可溶性CD58与TGF-β1的关系
对七种PDAC细胞系(即HPNE、Panc-1、AsPC-1、BxPC-3、Mia Paca-2、SW1990以及CFPAC-1)利用qRT-PCR在mRNA水平上检测TGF-β1和CD58的表达，发现两者呈显著正相关(P＝0.0161，图1)。从一定程度上证实了生物信息学分析中两者的相关性。然而，在TGF-β/smad2/3激活后，却检测到细胞膜上CD58(文中简称mCD58，跨膜+GPI亚型)在蛋白表达水平的降低。
除了细胞膜上表达的CD58外，发现血清、尿液和体外细胞培养上清液中还存在一种可溶性CD58(sCD58)。利用流式细胞术和ELISA分别检测了PDAC细胞系的膜表面CD58(mCD58)的平均荧光强度(MFI)和培养液上清中sCD58的含量(ng/ml/106细胞)。结果发现，相比于永生化正常胰腺导管上皮细胞HPNE，PDAC细胞系中mCD58均显著升高(图2)，sCD58在Panc-1和SW1990细胞上清中显著升高(图3)。发现上清中的sCD58与TGF-β1呈显著正相关(P＝0.0029，图4)。同时，发现细胞膜表面的mCD58与上清中的TGF-β1具有负相关的倾向(图5)。
与TAM间接共培养后，检测了PDAC细胞膜表面mCD58的表达和上清中的sCD58的含量，发现mCD58表达显著降低(图6A和图6B)，而sCD58含量明显升高(图7)。这种膜表面成分降低，而上清可溶性成分升高的现象，本申请首次将其称之为“表达分离”(Expressionalseparation，ES)。
为进一步明确该现象，利用具有生物学活性的重组人TGF-β1和SB431542(TGF-β/smad2/3通路阻滞剂)加入共培养体系的培养基中，分别刺激和阻滞PDAC细胞内TGF-β/smad2/3信号通路(图8A和图8B)。观察细胞膜表面mCD58的表达和培养液上清中sCD58的含量。结果发现，利用SB431542阻滞TGF-β/smad2/3信号通路后，PDAC细胞膜表面mCD58明显升高(图9A和图9B)，而培养液上清中sCD58的含量显著降低(图10)，即抑制了CD58的“表达分离”。
利用rTGF-β1刺激TGF-β/smad2/3信号通路后，PDAC细胞膜表面mCD58明显降低(图9A和图9B)，而培养液上清中sCD58的含量显著升高(图10)，即促进了CD58的“表达分离”。
发现转化生长因子TGF-β1能够促进胰腺癌细胞上清中sCD58的产生，同时伴随着膜型mCD58的降低。这提示，TGF-β1通过Smad2/3信号通路诱导“CD58表达分离”(即mCD58表达减少，sCD58产生增多)，mCD58表达减少可以降低PDAC肿瘤细胞与T/NK细胞之间的黏附识别，促进免疫逃逸；而局部高浓度的sCD58积聚则可能抑制PDAC细胞和T/NK细胞之间的免疫应答过程，在微环境中发挥免疫抑制功能。
实施例2.胰腺癌患者血清中的sCD58表达水平
结合实施例1的发现，发明人进一步验证肿瘤组织内积聚的高浓度sCD58是否通过肿瘤微环境新生血管释放入血(全血、血浆、血清)。
收集患者外周血血样，累计入组537例外周血血清样本。疾病类型包括：PDAC、非PDAC(胰腺低度恶性肿瘤、胰腺良性疾病、其他恶性肿瘤、以及健康对照)。
1.通过ELISA检测发现，sCD58存在于人血清中。在健康对照组，sCD58血清含量在277.04至363.59ng/ml之间，TGF-β1血清含量于833.57至1101.84pg/ml之间。在PDAC患者组，sCD58血清含量于224.49至405.52ng/ml之间，TGF-β1血清含量于726.49至1276.54pg/ml之间。
通过对PDAC患者和健康对照组血清比较，发现PDAC患者血清中sCD58和TGF-β1的含量均高于健康对照组(图11A和图11B)。血清sCD58在PDAC患者组和健康对照组分别为331.09ng/ml和318.01ng/ml；血清TGF-β1在PDAC患者组和健康对照组分别为，955.82pg/ml和1040.16pg/ml。
2.为了探究血清中sCD58和TGF-β1是否在PDAC的早期就已经升高，对PDAC患者临床病理分期中I期和II期(AJCC分期第八版)分别与健康对照血清进行对比。
结果表明，sCD58在I期中血清水平和健康对照组未见明显统计学差异，而在II期患者血清中sCD58出现升高；TGF-β1在I期中血清水平就显著上升，而在II期患者血清中TGF-β1依然维持在较高水平(图12)。此外，还比较了临床常用肿瘤标志物(包括CA199、CEA、CA125、CA153以及AFP)在PDAC患者血清中的水平。结果显示，PDAC患者血清中CA199、CEA以及CA125均显著升高，CA153未见明显统计学差异，而AFP明显降低(图13A至图13E)。
实施例3.sCD58和TGF-β1在胰腺低度恶性肿瘤和胰腺良性疾病中的表达
随后，比较了sCD58和TGF-β1在胰腺低度恶性肿瘤和胰腺良性疾病患者血清中含量的差异。
结果显示，sCD58在下列疾病中均显著降低：胰腺导管内乳头状粘液腺瘤(IPMN)、胰腺实性假乳头状瘤(SPT)、胰腺神经内分泌瘤(pNET)、胰腺浆液性囊腺瘤、胰腺黏液性囊腺瘤以及胰腺假性囊肿；而慢性胰腺炎患者血清sCD58和健康对照未见明显统计学差异(图14A)。
TGF-β1在下列疾病中均显著降低：IPMN、SPT、pNET、胰腺浆液性囊腺瘤、胰腺黏液性囊腺瘤以及慢性胰腺炎；而胰腺假性囊肿患者血清sCD58和健康对照未见明显统计学差异(图14B)。
实施例4.血清中sCD58和TGF-β1的相关性
为了进一步探究人血清中sCD58和TGF-β1的相关性，首先在131例PDAC患者血清中利用sCD58和TGF-β1含量绘制散点图，并进行相关性拟合分析。结果发现sCD58和TGF-β1显著正相关(P＝0.0039，R2＝0.0627，图15)。
为进一步扩大样本量，将所有胰腺疾病患者血清中sCD58和TGF-β1含量均纳入分析。结果显示，两者间相关性进一步增强(P<0.0001，R2＝0.1685，图16)。
更近一步地，将所有的整个患者群体均纳入分析。结果表明，两者间相关性进一步增强(P<0.0001，R2＝0.2854，图17)。最后，将健康对照组人群也均纳入分析。发现血清中sCD58和TGF-β1含量依然极具相关性(P<0.0001，R2＝0.2695，图18)。
实施例5.sCD58、TGF-β1以及CA199在PDAC中的单独或联合诊断
1.sCD58、TGF-β1在胰腺癌患者的临床诊断
为了明确sCD58和TGF-β1在胰腺癌患者的临床诊断中是否具有诊断价值，利用纳入的131例胰腺癌血清与匹配的132例健康对照组(根据年龄及性别因素按区间匹配)血清进行受试者工作特征曲线绘制和分析(Receiver operating characteristic curve，ROC曲线)。
结果显示sCD58、TGF-β1以及CA199曲线下面积(AUC)分别为0.633、0.7104、0.8720，均具有统计学差异(图19A至图19C)，包括其他肿瘤标志物的AUC值和置信区间归纳于表1。
表1.不同肿瘤标志物从正常人群中鉴别PDAC的诊断特点比较(PDAC vs正常)
Figure BDA0003641837200000191
2.sCD58和TGF-β1在鉴别PDAC和非PDAC患者的能力
随后，测试了sCD58和TGF-β1分别在鉴别PDAC和非PDAC患者的能力，非PDAC组中纳入胰腺低度恶性肿瘤、胰腺良性疾病以及正常对照组的血清样本。
按照Youden指数最大值所对应截断值为最佳Cutoff值，sCD58、TGF-β1、lgCA199+1的最佳Cutoff值分别为298.7ng/ml、991.7pg/ml、2.578U/ml(图20A至图20C)。结果显示，sCD58、TGF-β1、CA199三者的AUC值分别为0.7848、0.7977、0.8343(图21A至图21C)。其中，包括其他肿瘤标志物的AUC值、置信区间、敏感度以及特异性归纳于表2。
表2.不同肿瘤标志物从非PDAC人群中鉴别PDAC的诊断特点比较(PDAC vs非PDAC)
Figure BDA0003641837200000201
这些结果提示，作为单独指标，就从非PDAC人群中区分出PDAC患者的鉴别能力而言，sCD58和TGF-β1优于临床常用的肿瘤标志物CA125、CEA以及CA153。虽仍劣于CA199，但仍具有较大诊断价值，可作为CA199良好替代性指标。
3.sCD58+TGF-β1+CA199联用
通过二元Logistic回归拟合，分别生成sCD58+TGF-β1二联模型和sCD58+TGF-β1+CA199三联模型，并绘制ROC曲线图。
结果显示，sCD58+TGF-β1+CA199三联模型AUC为0.8731，优于二联模型和CA199单独诊断(图22)。对于诊断特异性和敏感性，CA199诊断胰腺癌的特点在于特异性很好(>90％)，而敏感性不高(70％左右)，而sCD58+TGF-β1+CA199三联模型能够将敏感性提高至90％(表3)。
表3.联合模型与CA199诊断特征比较(PDAC vs非PDAC)
Figure BDA0003641837200000202
实施例6.sCD58和TGF-β1的血清含量与PDAC患者临床病理学特点相关性
收集131例PDAC患者人口统计学和临床病理学特点(共15种)，利用SPSS软件，分别分析血清sCD58和TGF-β1与PDAC患者年龄、性别、吸烟史、饮酒史、糖尿病病史、高血压病史、肿瘤位置、分化程度、肿瘤大小、淋巴结转移、远处转移、TNM分期(AJCC第八版)、神经浸润、血管浸润以及与临床标志物CA199的相关性。
统计学相关性分析结果发现，PDAC患者血清sCD58的水平与肿瘤大小(P＝0.041)、血管浸润(P＝0.029)具有显著相关性，而与其他13种人口统计学和临床病理学特点未见明显相关性。
表4.血清sCD58与PDAC患者临床病理特征的关系(N＝131)
Figure BDA0003641837200000211
Figure BDA0003641837200000221
实施例7.sCD58和TGF-β1的血清含量对胰腺癌患者预后的影响
收集92例PDAC患者的完整随访数据。其中，死亡68例，24例存活。
通过X-tile软件获得生存时间最佳Cutoff值，324.0ng/ml。生存分析结果显示，血清中sCD58含量高低和胰腺癌患者总体生存时间(OS)虽然没有统计学差异，但具有一定趋势(图23A)。而TGF-β1血清含量高低对胰腺癌患者生存预后的影响未见明显差异(图23B)。
CA199以粘蛋白结合形式由胆汁和胆囊粘膜分泌，经胆汁排泄。因而，有报道慢性胰腺炎和良性胆道梗阻患者的血清CA199水平升高程度与早期胰腺癌患者相似。CA199不具有肿瘤类型特异性，其升高可在许多恶性肿瘤中观察到，包括起源于结直肠、胃、肺、乳腺和肝脏的恶性肿瘤。因此，CA199在其他疾病中假阳性率较高，使得诊断的总体准确性降低，在其他疾病中假阳性率较高。据文献报道，CA199在胰腺癌诊断中的中位敏感性为79％，中位特异性为82％。目前的研究发现，单一分子缺乏准确癌症检测的敏感性和特异性，因此本领域正试图将CA199与其他生物标志物结合，以提高CA199的诊断性能。发明人通过二元Logistic回归分析建立sCD58+TGF-β1+CA199三联模型，显著提高了CA199的在PDAC中的诊断敏感性(90.0％)，AUC为0.8731，具有较大临床诊断价值。

Claims (10)

1.靶向可溶性CD58的试剂在制备检测装置中的用途，其中：
所述检测装置用于胰腺癌的诊断或预后；
所述靶向可溶性CD58的试剂能够确定受试者样本中可溶性CD58的表达水平；
所述表达水平是核酸水平或蛋白水平；
所述检测装置是选自以下任一项或其组合：试剂盒、芯片、试纸、孔板；
优选地，所述胰腺癌是胰腺导管腺癌。
2.根据权利要求1所述的用途，其中：
所述检测装置还包含靶向TGF-β1的试剂，
所述靶向TGF-β1的试剂能够确定受试者样本中TGF-β1的表达水平；
所述表达水平是核酸水平或蛋白水平。
3.根据权利要求1或2所述的用途，其中：
所述检测装置还包含靶向常规肿瘤标志物的试剂，
所述靶向常规肿瘤标志物的试剂能够确定受试者样本中常规肿瘤标志物的表达水平；
所述常规肿瘤标志物选自以下任一项或其组合：CA199、CEA、CA125；优选地，CA199；
所述表达水平是核酸水平或蛋白水平。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的用途，其中：
所述样本选自以下的任一项：全血、血浆、血清、肿瘤组织的分泌上清。
5.根据权利要求1至3中任一项所述的用途，其中：
相较于对照样本，可溶性CD58在受试者样本中的表达水平更高，指示选自以下的任一项或组合：所述受试者患有胰腺导管腺癌、所述受试者患胰腺导管腺癌的风险提高、所述受试者的预后不佳、所述受试者预后不佳的风险提高；
所述对照样本来自未患胰腺导管腺癌的个体；
优选地，所述对照样本来自以下的任一项或其组合：胰腺低度恶性肿瘤的个体、胰腺良性疾病的个体、健康个体。
6.根据权利要求2或5所述的用途，其中：
相较于对照样本，TGF-β1在受试者样本中的表达水平更高，指示选自以下的任一项或组合：所述受试者患有胰腺导管腺癌、所述受试者患胰腺导管腺癌的风险提高、所述受试者的预后不佳、所述受试者预后不佳的风险提高；
所述对照样本来自未患胰腺导管腺癌的个体；
优选地，所述对照样本来自以下的任一项或其组合：胰腺低度恶性肿瘤的个体、胰腺良性疾病的个体、健康个体。
7.根据权利要求3、5至6中任一项所述的用途，其中：
相较于对照样本，CA199在受试者样本中的表达水平更高，指示选自以下的任一项或组合：所述受试者患有胰腺导管腺癌、所述受试者患胰腺导管腺癌的风险提高、所述受试者的预后不佳、所述受试者预后不佳的风险提高；
所述对照样本来自未患胰腺导管腺癌的个体；
优选地，所述对照样本来自以下的任一项或其组合：胰腺低度恶性肿瘤的个体、胰腺良性疾病的个体、健康个体。
8.根据权利要求1至3中任一项所述的用途，其中：
当在核酸水平确定表达水平时，所述试剂是探针或引物对；
当在蛋白水平确定表达水平时，所述试剂是选自以下任一项：抗体、抗原结合片段、质谱鉴定试剂；
所述抗体是多克隆抗体或单克隆抗体；
所述质谱鉴定试剂包含质谱鉴定参数；
所述抗体源自：鼠、兔、马、禽、羊、骆驼科、犬、牛、灵长类、重组抗体；
所述抗原结合片段选自以下的任一项或其组合：Fv、Fab、Fab’、F(ab’)2、单域抗体、单链Fab、双抗体、线性抗体、scFv、多特异性抗体。
9.根据权利要求1至3中任一项所述的用途，其中：
所述预后是指选自以下的任一项或其组合：预后受试者的结局、预后受试者的治疗效果、预后受试者的生存；
所述生存选自：总体生存、无瘤生存、一年生存、两年生存、五年生存；优选总体生存。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的用途，其中：
所述胰腺导管腺癌的分期选自以下的任一项或组合：IIA、IIB、III、IV期。
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