CN115044091A - 一种抗菌肽改性丝蛋白膜材料的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及蛋白膜材料制备技术领域，且公开了一种抗菌肽改性丝蛋白膜材料的制备方法，采用以下步骤：S1：制备丝蛋白食用膜：（1）、溶液水浴；（2）、透析；（3）、二元体系催化丝胶；（4）、冻干膜制备；（5）、风干膜制备；S2：制备抗菌肽：小分子多肽的提取，通过使用组织捣碎机将组织捣碎，组织捣碎完之后，再经超声波细胞破碎机将细胞完全破坏，再使用乙酸浸提生物菌转化液而获得抗菌肽；S3：将丝蛋白食用膜和抗菌肽进行复合，即可得到抗菌性可食用丝蛋白膜材料。本发明将抗菌肽与丝蛋白膜结合生产出改性材料，极大提高了丝蛋白膜的抗菌性和生物活性。

Description

一种抗菌肽改性丝蛋白膜材料的制备方法
技术领域
本发明涉及蛋白膜材料制备技术领域，具体为一种抗菌肽改性丝蛋白膜材料的制备方法。
背景技术
丝蛋白是一类非生理活性的结构性高分子材料，它来源丰富，许多昆虫如家蚕、柞、蚕等及许多种类的蜘蛛都能够生产大量丝蛋白。丝蛋白通常包含了丝素和丝胶，丝胶蛋白具有较差的生物相容性以及容易引发过敏反应，而丝素蛋白由于其优越的力学性能和相对良好的身体适应性，易降解且降解产物易被人体吸收而不产生炎症反应等优点。
在可食用蛋白膜材料的实际应用中，为了避免由生物材料引发的感染，传统的方法是在蛋白膜材料表面涂抹一层抗生素。
随着抗生素副作用的日益凸显，研发功能相似且副作用少的其他活性物质迫在眉睫。抗菌肽具有广谱抗菌性、热稳定性，作用机理独特，既能起到体内抗病菌感染、促进癌细胞凋亡的作用，还可作为抗病毒化疗剂和医疗器械的抗菌材料。
将抗菌肽分子结合到丝蛋白可食用材料上，可以使丝蛋白材料的抗菌性更强，利用抗菌肽传递系统或抗菌肽与绿色天然提取物联合作用，可以提高抗菌活性和生物活性，是在医用材料的实际应用研究中的新方向。
因此，亟需提出一种将抗菌肽改性丝蛋白膜材料的制备方法。
发明内容
本发明提供了一种抗菌肽改性丝蛋白膜材料的制备方法，具备将抗菌肽与丝蛋白膜结合生产出改性材料，极大提高丝蛋白膜的抗菌性和生物活性的有益效果，解决了上述背景技术中所提到在可食用蛋白膜材料的实际应用中，为了避免由生物材料引发的感染，传统的方法是在蛋白膜材料表面涂抹一层抗生素，但抗生素的副作用明显，不利于人体健康的问题。
本发明提供如下技术方案：一种抗菌肽改性丝蛋白膜材料的制备方法，采用以下步骤：
S1：制备丝蛋白食用膜：
（1）、溶液水浴：将桑蚕生丝以去离子水洗涤后，以碳酸钠进行碱法脱胶，脱胶后获得丝素蛋白溶液并加入食用原材料搅拌混合；
（2）、透析：取出杂质脱胶后获得四角蛋白溶液转移至透析袋（MW8000~14000Da）中透析48h，以去除盐和小分子杂质，并以称重法精确测定丝胶溶液的质量浓度；
（3）、二元体系催化丝胶：在氮气保护下
Figure 10000257425431
置三口烧瓶内进行HRP催化丝素蛋白交联，丝胶质量浓度为1g/L，当瓶内空气被完全排空后，加入12μ/mL酶溶液（体系 PH=7，温度37℃）在1h内逐滴加入0.4%H202继续反应1-8h所得产物标记为样本一；
（4）、冻干膜制备：分别将反应前后的丝素蛋白溶液在-20℃下存储4h，然后在-50℃下冷冻干燥24h，将冻干膜浸入75%乙醇中30min，用去离子水洗涤几次去留残留的乙醇溶液，再次放入冰箱存储并冷冻干燥24h；
（5）、风干膜制备：将反应前后的丝素蛋白溶液以30%的聚乙二醇溶液浓缩至40g/L，加入6%甘油后以流延法在聚四氟乙烯模具中成膜，室温条件下风干，在20℃和65℃相对湿度条件下平衡24h，即可得到样本产物标记为样本二；
S2：制备抗菌肽：小分子多肽的提取，通过使用组织捣碎机将组织捣碎，组织捣碎完之后，再经超声波细胞破碎机将细胞完全破坏，再使用乙酸浸提生物菌转化液而获得抗菌肽；
S3：将丝蛋白食用膜和抗菌肽进行复合：将抗菌肽、有机酸、多种活性肽、免疫球蛋白、菌体蛋白溶于溶液，可制成缓冲液，将所述样本二加入缓冲液中浸泡1-2h后，通过离子水冲洗一次以去除多余的多肽和杂质，然后在无菌室中进行自然干燥，即可得到抗菌性可食用丝蛋白膜材料。
作为本发明所述一种抗菌肽改性丝蛋白膜材料的制备方法的一种可选方案，其中：所述S1步骤中第一步溶液制备离子水洗涤的温度环境为98℃，时间是3-4h，浴比1：50，采用水浴恒温磁力搅拌器进行水浴。
作为本发明所述一种抗菌肽改性丝蛋白膜材料的制备方法的一种可选方案，其中：所述S1步骤中需要用到的原材料采用5A级桑蚕生丝、辣根过氧化物酶、 无水碳酸钠、二水合磷酸氢二钠、十二水合磷酸二氢钠、氯化钠、乙酰丙酮、过氧化氢和丙三醇均为分析纯材料。
作为本发明所述一种抗菌肽改性丝蛋白膜材料的制备方法的一种可选方案，其中：所述S1中的样本一需要分别将15μL反应前后的丝胶溶液与5μL蛋白质上样缓冲液混合，并煮沸10min；
采用丙烯酰胺质量分数为8%的分离胶，16%的浓缩胶，上样10μL，在Mini-PROTEAN电泳系统中以150V电泳约1h；
将凝胶浸入G250考马斯亮蓝溶液中进行染色；最后凝胶浸入去离子水中脱色。
所述S2步骤中的抗菌肽组织的提取原料有鱼类、软体动物、甲壳类动物、植物、地衣芽孢杆菌中的任何一种组织。
作为本发明所述一种抗菌肽改性丝蛋白膜材料的制备方法的一种可选方案，其中：所述二元体系催化丝胶中酪氨酸残基氧化，在酶促反应15min后，进行交联，采用高效液相色谱仪、圆二色谱以进行辨别。
作为本发明所述一种抗菌肽改性丝蛋白膜材料的制备方法的一种可选方案，其中：所述S1步骤中加入所述食用原材料有鱼胶原蛋白粉、纳米珍珠粉、杏仁粉、蜂蜜、维生素和纯净水食品级原料其中一种。
作为本发明所述一种抗菌肽改性丝蛋白膜材料的制备方法的一种可选方案，其中：所述丝蛋白原料中的丝蛋白是丝素蛋白。
作为本发明所述一种抗菌肽改性丝蛋白膜材料的制备方法的一种可选方案，其中：所述S2步骤中所述的生物菌转化液包含有酵母菌、光合菌、蛋白分解菌、丝状菌、双崎杆菌菌群复合而成，然后与PH值在6-7的地下水稀释制成专用生物菌转化液。
作为本发明所述一种抗菌肽改性丝蛋白膜材料的制备方法的一种可选方案，其中：所述抗菌肽改性丝蛋白膜材料在食品包装、卫生用品、医用材料中应用。
本发明具备以下有益效果：
1、该一种抗菌肽改性丝蛋白膜材料的制备方法，通过抗菌肽与丝蛋白食用膜进行改性，提高了抗菌性发挥抗菌活性。抗菌肽具有广谱抗菌性、热稳定性，作用机理独特，既能起到体内抗病菌感染、促进癌细胞凋亡的作用，还可作为抗病毒化疗剂和医疗器械的抗菌材料。再加上，通过在制备丝蛋白食用膜的制备过程当中采用食用原材料，通过水浴、等离子冲洗等去除杂质过程，提高改性丝蛋白食用膜的使用安全性。
2、该一种抗菌肽改性丝蛋白膜材料的制备方法，采用医用领域中保护膜进行实验，丝素膜能吸收创面渗出液并与伤口紧密贴附，皮肤再生情况良好．在丝蛋白丝素膜中加入抗菌肽进行改性，提高抗菌能力，进而提高免疫功能，使得患者创面能更快康复。
3、该一种抗菌肽改性丝蛋白膜材料的制备方法，采用医用领域中细胞培养基质中通过对细胞粘附的丝蛋白膜中加入抗菌肽，提高细胞培养的生长粘附情况，提高生长代谢。
附图说明
图1为本发明流程示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
丝蛋白是一类非生理活性的结构性高分子材料，它来源丰富，许多昆虫如家蚕、柞、蚕等及许多种类的蜘蛛都能够生产大量丝蛋白。丝蛋白通常包含了丝素和丝胶，丝胶蛋白具有较差的生物相容性以及容易引发过敏反应，而丝素蛋白由于其优越的力学性能和相对良好的身体适应性，易降解且降解产物易被人体吸收而不产生炎症反应等优点。
将抗菌肽分子结合到丝蛋白可食用材料上，使丝蛋白材料的抗菌性更久，利用抗菌肽传递系统或抗菌肽与绿色天然提取物联合作用，提高抗菌活性和生物利用度，是在医用材料的实际应用研究中的新方向，但目前还未有成熟的制备方法；
其中现有的丝蛋白膜大部分都是不可食用的，安全性能差，且抗菌性能差。
本发明提供如下技术方案：一种抗菌肽改性丝蛋白膜材料的制备方法，采用以下步骤：
S1：制备丝蛋白食用膜：
（1）、溶液水浴：将桑蚕生丝以去离子水洗涤后，以碳酸钠进行碱法脱胶，脱胶后获得丝素蛋白溶液并加入食用原材料搅拌混合；
（2）、透析：取出杂质脱胶后获得四角蛋白溶液转移至透析袋（MW8000~14000Da）中透析48h，以去除盐和小分子杂质，并以称重法精确测定丝胶溶液的质量浓度；
（3）、二元体系催化丝胶：在氮气保护下
Figure 10000257432960
置三口烧瓶内进行HRP催化丝素蛋白交联，丝胶质量浓度为1g/L，当瓶内空气被完全排空后，加入12μ/mL酶溶液（体系 PH=7，温度37℃）在1h内逐滴加入0.4%H202继续反应1-8h所得产物标记为样本一；
其中：所述二元体系催化丝胶中酪氨酸残基氧化，在酶促反应15min后，进行交联，采用高效液相色谱仪、圆二色谱以进行辨别；
酶促交联方法为丝胶基再生蛋白材料的制备提供了新方法，有利于实现丝素蛋白的资源化再利用。
（4）、冻干膜制备：分别将反应前后的丝素蛋白溶液在-20℃下存储4h，然后在-50℃下冷冻干燥24h，将冻干膜浸入75%乙醇中30min，用去离子水洗涤几次去留残留的乙醇溶液，再次放入冰箱存储并冷冻干燥24h；
（5）、风干膜制备：将反应前后的丝素蛋白溶液以30%的聚乙二醇溶液浓缩至40g/L，加入6%甘油后以流延法在聚四氟乙烯模具中成膜，室温条件下风干，在20℃和65℃相对湿度条件下平衡24h，即可得到样本产物标记为样本二；
S2：制备抗菌肽：小分子多肽的提取，通过使用组织捣碎机将组织捣碎，组织捣碎完之后，再经超声波细胞破碎机将细胞完全破坏，再使用乙酸浸提生物菌转化液而获得抗菌肽；
S3：将丝蛋白食用膜和抗菌肽进行复合：将抗菌肽、有机酸、多种活性肽、免疫球蛋白、菌体蛋白溶于溶液，可制成缓冲液，将所述样本二加入缓冲液中浸泡1-2h后，通过离子水冲洗一次以去除多余的多肽和杂质，然后在无菌室中进行自然干燥，即可得到抗菌性可食用丝蛋白膜材料。
在不造成膜损伤情况下，抗菌肽转至胞内结合胞内大量的阴离子分子或细胞器，进行改性核酸、蛋白质的合成与功能、酶的活性及产生氧化应激反应；
影响核酸、蛋白的合成与功能；两栖动物抗菌肽buforin II以胞内成分为靶点穿透细胞膜，高度依赖与H2A组蛋白N端区域的互补性与DNA和RNA结合；
其中：所述S1步骤中加入所述食用原材料有鱼胶原蛋白粉、纳米珍珠粉、杏仁粉、蜂蜜、维生素和纯净水食品级原料其中一种。
通过抗菌肽与丝蛋白食用膜进行改性，在提高抗菌性发挥抗菌活性，通过在制备丝蛋白食用膜的制备过程当中采用食用原材料，通过水浴、等离子冲洗等去除杂质过程，提高改性丝蛋白食用膜的使用安全性。
实施例2
本实施例是在实施例1的基础上做出的解释说明，具体的，其中：所述S1步骤中第一步溶液制备离子水洗涤的温度环境为98℃，时间是3-4h，浴比1：50，采用水浴恒温磁力搅拌器进行水浴。
实施例3
本实施例是在实施例1的基础上做出的解释说明，具体的其中：所述S1步骤中需要用到的原材料采用5A级桑蚕生丝、辣根过氧化物酶、 无水碳酸钠、二水合磷酸氢二钠、十二水合磷酸二氢钠、氯化钠、乙酰丙酮、过氧化氢和丙三醇均为分析纯材料。
蚕丝蛋白属于纤维蛋白，在一级结构上具有高度重复性，富含疏水性的Gly、a和其他短的侧链氨基酸，形成的二级结构中带有反向片层的结晶区域，往往表现出重要的机械性能，而生物相容性使之更适于加工为组织工程材料．组织工程的目标在于能够在可控（可重复）条件下建立由细胞和生物材料构成的三维空间复合体，从而实现器官再生。
丝素蛋白膜不仅适合充当体外细胞培养基质，而且因具有生物可降解性，通过一种缓慢的降解，与细胞的再生速度相协调，在体内新组织形成过程中保持相对的稳定．同时，作为组织工程支架，必须具备一定的机械强度以抵御体内张力，特别是骨组织的再生。
实施例4
本实施例是在实施例1的基础上做出的解释说明，具体的其中：所述S1中的样本一需要分别将15μL反应前后的丝胶溶液与5μL蛋白质上样缓冲液混合，并煮沸10min；
采用丙烯酰胺质量分数为8%的分离胶，16%的浓缩胶，上样10μL，在Mini-PROTEAN电泳系统中以150V电泳约1h；
将凝胶浸入G250考马斯亮蓝溶液中进行染色；最后凝胶浸入去离子水中脱色。
具体的，其中，所述S2步骤中的抗菌肽组织的提取原料有鱼类、软体动物、甲壳类动物、植物、地衣芽孢杆菌中的任何一种组织。
其中：所述丝蛋白原料中的丝蛋白是丝素蛋白。
其中：所述S2步骤中所述的生物菌转化液包含有酵母菌、光合菌、蛋白分解菌、丝状菌、双崎杆菌菌群复合而成，然后与PH值在6-7的地下水稀释制成专用生物菌转化液。
其中：所述抗菌肽改性丝蛋白膜材料在食品包装、卫生用品、医用材料中应用。
在医用材料中应用举例两方面：
（1）、创面保护膜（包括人造皮肤）：理想的伤口覆盖膜必须刺激性小、能紧贴创面、不发生杂菌感染，同时患者活动时该材料能与身体伸缩相配合．传统的创面覆盖多采用新鲜猪皮，取材不易且贮存困难．丝素蛋白作为外科手术缝合线已有多年历史，因其不会引起宿主明显的免疫排斥反应引起了人们开发丝素创伤膜的兴趣；
动物实验和临床实验结果显示，丝素膜用作伤口保护材料无毒性且无刺
激，同时它的组成与人体皮肤胶原蛋白相似，因此具有良好的生物相容性．人造皮肤一个最重要因子是水的渗透性，加工成的丝膜具有一定机械强度和柔韧性，而且透气透水性好，是制作人工皮肤的优良材料．Moria等u的实验显示，在渗透曲线中丝素膜的渗透值和正常皮肤的水蒸发速率相当吻合；
丝素膜能吸收创面渗出液并与伤口紧密贴附，皮肤再生情况良好．在创面保护膜中改性，提高抗菌能力，进而提高免疫功能，使得患者创面能更快康复。
(2）细胞培养基质：胶原是哺乳动物细胞内外基质的一个主要蛋白，一直以来胶原都是作为体外细胞培养的基质，但它容易受到蛋白感染素的污染，在利用丝素膜培养结肠癌细胞时发现，在同样培养条件下5d内该膜与胶原支持细胞生长的情况相当，从而阐明丝素蛋白可替代胶原充当动物细胞培养基质．支持细胞粘附、平铺、生长和分化是培养基质的基本条件；
丝素膜具有适当的孔隙结构，有大量清晰的相连孔洞，这样的多孔结构为细胞提供了获取营养、气体交换、排泄废物和生长代谢的场所，有利于细胞吸附、保持细胞分化功能．有研究者指出丝素膜表面的亲水性质也可能有助于与带负电的动物细胞相互作用；
再以细胞粘附有关的特殊三肽结构RGD共价修饰丝膜，观察骨组织生长过程，证实造骨细胞在膜上成功粘着和生长，能在体外矿质化，丝膜是诱导骨形成的适合机制，配合抗菌肽，提高细胞培养的生长粘附情况。
需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种抗菌肽改性丝蛋白膜材料的制备方法，其特征在于：采用以下步骤：
S1：制备丝蛋白食用膜：
（1）、溶液水浴：将桑蚕生丝以去离子水洗涤后，以碳酸钠进行碱法脱胶，脱胶后获得丝素蛋白溶液并加入食用原材料搅拌混合；
（2）、透析：取出杂质脱胶后获得四角蛋白溶液转移至透析袋（MW8000~14000Da）中透析48h，以去除盐和小分子杂质，并以称重法精确测定丝胶溶液的质量浓度；
（3）、二元体系催化丝胶：在氮气保护下
Figure 10000157414008
置三口烧瓶内进行HRP催化丝胶蛋白交联，丝胶质量浓度为1g/L，当瓶内空气被完全排空后，加入12μ/mL酶溶液（体系 PH=7，温度37℃）在1h内逐滴加入0.4%H202继续反应1-8h所得产物标记为样本一；
（4）、冻干膜制备：分别将反应前后的丝胶蛋白溶液在-20℃下存储4h，然后在-50℃下冷冻干燥24h，将冻干膜浸入75%乙醇中30min，用去离子水洗涤几次去留残留的乙醇溶液，再次放入冰箱存储并冷冻干燥24h；
（5）、风干膜制备：将反应前后的丝胶蛋白溶液以30%的聚乙二醇溶液浓缩至40g/L，加入6%甘油后以流延法在聚四氟乙烯模具中成膜，室温条件下风干，在20℃和65℃相对湿度条件下平衡24h，即可得到样本产物标记为样本二；
S2：制备抗菌肽：小分子多肽的提取，通过使用组织捣碎机将组织捣碎，组织捣碎完之后，再经超声波细胞破碎机将细胞完全破坏，再使用乙酸浸提生物菌转化液而获得抗菌肽；
S3：将丝蛋白食用膜和抗菌肽进行复合：将抗菌肽、有机酸、多种活性肽、免疫球蛋白、菌体蛋白溶于溶液，可制成缓冲液，将所述样本二加入缓冲液中浸泡1-2h后，通过离子水冲洗一次以去除多余的多肽和杂质，然后在无菌室中进行自然干燥，即可得到抗菌性可食用丝蛋白膜材料。
2.根据权利要求1所述的一种抗菌肽改性丝蛋白膜材料的制备方法，其特征在于：所述S1步骤中第一步溶液制备离子水洗涤的温度环境为98℃，时间是3-4h，浴比1：50，采用水浴恒温磁力搅拌器进行水浴。
3.根据权利要求1所述的一种抗菌肽改性丝蛋白膜材料的制备方法，其特征在于：所述S1步骤中需要用到的原材料采用5A级桑蚕生丝、辣根过氧化物酶、 无水碳酸钠、二水合磷酸氢二钠、十二水合磷酸二氢钠、氯化钠、乙酰丙酮、过氧化氢和丙三醇均为分析纯材料。
4.根据权利要求1所述的一种抗菌肽改性丝蛋白膜材料的制备方法，其特征在于：所述S2步骤中的抗菌肽组织的提取原料有鱼类、软体动物、甲壳类动物、植物、地衣芽孢杆菌中的任何一种组织。
5.根据权利要求1所述的一种抗菌肽改性丝蛋白膜材料的制备方法，其特征在于：所述S1中的样本一需要分别将15μL反应前后的丝胶溶液与5μL蛋白质上样缓冲液混合，并煮沸10min；
采用丙烯酰胺质量分数为8%的分离胶，16%的浓缩胶，上样10μL，在Mini-PROTEAN电泳系统中以150V电泳约1h；
将凝胶浸入G250考马斯亮蓝溶液中进行染色；最后凝胶浸入去离子水中脱色。
6.根据权利要求1所述的一种抗菌肽改性丝蛋白膜材料的制备方法，其特征在于：所述二元体系催化丝胶中酪氨酸残基氧化，在酶促反应15min后，进行交联，采用高效液相色谱仪、圆二色谱以进行辨别。
7.根据权利要求1所述的一种抗菌肽改性丝蛋白膜材料的制备方法，其特征在于：所述S1步骤中加入所述食用原材料有鱼胶原蛋白粉、纳米珍珠粉、杏仁粉、蜂蜜、维生素和纯净水食品级原料其中一种。
8.根据权利要求1所述的一种抗菌肽改性丝蛋白膜材料的制备方法，其特征在于：所述丝蛋白原料中的丝蛋白是丝胶蛋白。
9.根据权利要求1所述的一种抗菌肽改性丝蛋白膜材料的制备方法，其特征在于：所述S2步骤中所述的生物菌转化液包含有酵母菌、光合菌、蛋白分解菌、丝状菌、双崎杆菌菌群复合而成，然后与PH值在6-7的地下水稀释制成专用生物菌转化液。
10.根据权利要求1所述的一种抗菌肽改性丝蛋白膜材料的制备方法，其特征在于：所述抗菌肽改性丝蛋白膜材料在食品包装、卫生用品、医用材料中应用。
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