CN115040567A - 牡丹中多酚的提取方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种牡丹中多酚的提取方法及其应用。本发明对牡丹三个形态学部位(花、叶、根)的多酚进行提取、分析，并考察其清除DPPH(1,1‑二苯基‑2‑三硝基苯肼)自由基的能力，以及抑菌能力，从而全面认识和评价牡丹不同部位多酚的抗氧化潜能和抑菌潜能力，可以进一步为其作为天然的抑菌剂和抗氧化剂进行进一步的开发和利用提供科学依据。
Description
技术领域
本发明涉及有效成分提取技术领域，具体涉及一种牡丹中多酚的提取方法及其应用。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
植物体内的次生代谢物即为植物多酚，植物多酚的狭义定义是指单宁；广义定义上还包括小分子酚类化合物，如花青素、黄酮、酚酸等。植物多酚的邻位酚羟基容易被氧化，这种独特结构使其具有强大的捕捉自由基的能力，是国际公认的、目前已知的物质中最强的自由基清除剂、天然抗氧化剂，被广泛应用到药品、食品、化妆品行业。另外，多酚还具有抑菌的广谱性。
牡丹活性成分极其丰富，具有极高的利用价值。牡丹花内还含有丰富的酚类物质，可以在抗氧化反应中清除由各种途径引发的自由基，从而实现其高效的抗氧化能力。牡丹的副产物之一——牡丹叶，牡丹叶中含有丰富的多糖、多酚以及其他多种活性成分，且多酚含量较高，具有抗氧化、杀菌或与细菌结合抑制其活性等特征，开发利用价值高。牡丹的根皮经过干燥，是我国一种常用的中草药，即丹皮，丹皮含有丹皮酚、芍药酚等活性物质，其中丹皮酚的含量最高。实验研究证实，丹皮中的酚类物质对清除DPPH自由基效果明显。目前还很少见有针对牡丹不同部位进行多酚提取的相关报道。
发明内容
针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种牡丹中多酚的提取方法及其应用。本发明对牡丹三个形态学部位(花、叶、根)的多酚进行提取、分析，并考察其清除DPPH(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼)自由基的能力，以及抑菌能力，从而全面认识和评价牡丹不同部位多酚的抗氧化潜能和抑菌潜能力，可以进一步为其作为天然的抑菌剂和抗氧化剂进行进一步的开发和利用提供科学依据。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一方面，提供一种从牡丹中提取多酚的方法，包括以下步骤：
(1)将牡丹花用体积浓度为75％的乙醇进行提取，提取温度60℃、提取时间50min，提取得到牡丹花多酚；
(2)将牡丹叶用体积浓度为65％的乙醇进行提取，提取温度50℃、提取时间45min，提取得到牡丹叶多酚；
(3)将牡丹根皮用体积浓度为65％的乙醇进行提取，提取温度50℃、提取时间60min，提取得到牡丹根皮多酚。
优选的，步骤(1)中，牡丹花与体积浓度为75％的乙醇的料液比为1:50。
优选的，步骤(2)中，牡丹叶与体积浓度为65％的乙醇的料液比为1:40。
优选的，步骤(3)中，牡丹根皮与体积浓度为65％的乙醇的料液比为1:40。
本发明的第二方面，提供上述方法提取得到的牡丹多酚。
进一步的，所述牡丹多酚包括：牡丹花多酚、牡丹叶多酚和牡丹根皮多酚。
本发明的第三方面，提供上述牡丹多酚在制备抗氧化剂中的应用。
本发明的第四方面，提供上述牡丹多酚在制备抑菌剂中的应用。
优选的，所述抑菌剂对枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌具有抑菌活性。
本发明的有益效果：
本发明选用的实验材料是衰败期的牡丹，探究牡丹三个形态学部位(花、叶、根皮)多酚提取的最优条件、抗氧化能力强弱以及抑菌性。实验得到能将牡丹花多酚完美提取出来的组合方案为提取温度60℃、提取时间50min、乙醇浓度75％，能将牡丹叶多酚完美提取出来的组合方案为提取温度50℃、提取时间45min、乙醇浓度65％，能将牡丹根皮多酚完美提取出来的组合方案为提取温度50℃、提取时间60min、乙醇浓度65％，并且在溶液浓度0.5mg/mL时，牡丹叶多酚和牡丹根皮多酚的还原性强于Vc，牡丹花多酚的还原性较小于Vc，三者都可作为安全的、无任何毒害作用的天然抗氧化剂来代替人工合成的抗氧化剂应用于食品和化妆行业，提高牡丹的经济附加值。牡丹花、叶、根三部位多酚在各自合适的浓度范围内对枯草杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌均有较好的抑菌效果。总之，牡丹多酚具有广谱的抑菌性。
附图说明
图1：料液比对牡丹各部位多酚提取率的影响；每一料液比对应的三个柱状图自左至右依次为花瓣、叶子、根皮。
图2：提取温度对牡丹不同部位多酚得率的影响。
图3：提取时间对牡丹不同部位多酚得率的影响。
图4：乙醇浓度对牡丹不同部位多酚得率的影响。
图5：牡丹花多酚对DPPH的清除率。
图6：牡丹叶多酚对DPPH的清除率。
图7：牡丹根皮多酚对DPPH的清除率。
图8：0.5mg/mL的牡丹花、叶、根多酚溶液及Vc溶液对DPPH自由基的清除率。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
术语说明：
本发明中的“料液比”是指物料质量(g)与提取溶剂体积(ml)之间的比例。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。
本发明实施例中所用的试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。其中，部分试验材料的来源如下：
实施例1：牡丹不同部位多酚的提取
1、试验方法：
1.1原料预处理
将牡丹于清水中清洗干净，滤纸擦干，分为花瓣、叶子、根皮三个部分，在鼓风干燥箱中干燥三天，之后在高速万能粉碎机中粉碎，盛出装瓶备用。
1.2多酚含量测定
福林酚法测定多酚含量：用蒸馏水溶解0.01g焦性没食子酸，之后转移到干净、无杂质的100mL容量瓶中，定容。分别取没食子酸溶液0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL至洁净试管容中，依次加入1mL配置好的Folin-Ciocalteu溶液以及4mL质量分数为7.5％Na2CO3溶液，充分震荡混合均匀后暗处理1.5h。空白对照溶液是不含没食子酸的溶液，用紫外可见分光光度计测765nm下吸光值。根据所测得的数据可以做出一条标准曲线即y＝0.2876x+0.0749R2＝为0.9962，x为没食子酸的浓度(mg/mL)，y为没食子酸的吸光值。
将牡丹花瓣、叶子、根皮三个不同部位分别在不同条件下测定的多酚的OD值，代入没食子酸标准曲线，能够得到相应部位、相应条件多酚的没食子酸浓度(mg/mL)。总多酚的得率(mg/g)＝(总多酚浓度×提取液定容后体积)/牡丹特定部位粉末质量。
1.3单因素试验
由于料液比、提取时间(min)、提取温度(℃)、乙醇浓度(％)等单因素都会对牡丹花瓣、叶子、根皮中的总多酚提取产生影响。因此，在进行正交试验之前要先进行单因素试验来确定合适的因素及实验范围，如表1所示。
表1：单因素试验设计
1.4正交试验
按照L9(34)正交表进行牡丹不同部位总多酚提取正交试验。正交设计方案如表2、表3、表4。
表2：牡丹花多酚提取因素与水平表
表3：牡丹叶多酚提取因素与水平表
表4：牡丹根皮多酚提取因素与水平表
2、试验结果：
2.1单因素试验结果
(1)料液比对牡丹各部位多酚提取率的影响
取0.25g各部位干粉，在不同的料液比和50摄氏度的温度下、以及0.5h时间的条件下以浓度60％的乙醇作为溶剂进行提取，探究在不同料液比的条件下对每克干粉中的多酚得率的影响，得出结果如图1，从图中可以看出，牡丹花瓣在料液比分别为1:20、1:30、1:40三者之中具有较为明显的差异(p<0.05)，而在料液比分别为1:50、1:60之间时，差异并不明显，相对来说差异较小，考虑到时间和原材料的节约，在料液比1:50时认为多酚已经能够较好的溶解，因此后续实验采用1:50的料液比对牡丹花瓣进行浸提；牡丹叶在料液比1:40、1:50、1:60三者之间时无显著性差异，而在料液比1:20、1:30之间时具有显著性差异，且考虑到时间和原材料的节约，在料液比1:40时认为多酚已经能够较好的溶解，因此后续实验采用1:40的料液比对牡丹叶进行浸提；牡丹根皮在料液比1:40、1:50、1:60三者之间时无显著性差异，而在料液比1:20、1:30、1:40之间时具有显著性差异，且考虑到时间和原材料的节约，在料液比1:40时认为多酚已经能够较好的溶解，因此后续实验采用1:40的料液比对牡丹根皮进行浸提。
(2)提取温度对牡丹各部位多酚提取率的影响
取0.25g牡丹花瓣干粉，固定料液比1:50、浓度60％的乙醇不变，分别在30℃、40℃、50℃、60℃、70℃条件下水浴锅恒温加热0.5h，以此来探究提取温度对牡丹花瓣中多酚得率的影响。相关结果如图2，可以得出以下结论，60℃时牡丹花得率能达到最大峰值。温度过高会导致提取率下降，原因可能是多酚成分被破坏，其他组分的溶解度增加，考虑到减小多酚提取的损失，因此后续实验采用60℃作为牡丹花的提取温度。
取0.25g牡丹叶干粉，保持乙醇的质量分数为60％、料液比1:40不变，分别在30℃、40℃、50℃、60℃、70℃条件下水浴加热0.5h，探究摄取温度对牡丹叶中多酚得率的影响，相关结果如图2所示，可以得出以下结论，温度升高时，牡丹叶中多酚得率明显增加，在50℃左右能够达到相对较高的提取率。60℃与70℃相差不大，且与50℃时相比，二者均有所下降。温度过高会导致提取率下降，原因可能是部分多酚成分被破坏，其他组分的溶解度增加，考虑到减小多酚提取的损失，因此后续实验采用50℃作为牡丹叶的提取温度。
取0.25g牡丹根皮干粉，保持乙醇的质量分数为60％、料液比1:40不变，分别在30℃、40℃、50℃、60℃、70℃条件下水浴加热0.5h，探究提取温度对牡丹根皮中多酚得率的影响。结果如图2，提取温度在30摄氏度到50摄氏度之间时，牡丹根皮多酚得率呈现爬坡式上升，上升趋向明显。50摄氏度之后，多酚得率逐渐平缓，并且60℃、70℃与50℃相比多酚得率略有下降，原因可能是部分多酚成分被破坏，其他组分的溶解度增加，考虑到减小多酚提取的损失，因此后续实验采用50℃作为牡丹根皮的提取温度。
(3)提取时间对牡丹各部位多酚提取率的影响
取0.25g牡丹花干粉，固定料液比1:50、乙醇浓度60％，60℃分别水浴加热15min、45min、60min、75min，探究提取时间对牡丹花瓣中多酚得率的影响。结果如图3所示，可以得出相应的结论，在15分钟到60分钟这段时间内，多酚得率呈现爬坡式增加，总体来说增加速度较快，具有明显趋向；时间在60分钟左右时，多酚得率最大；60分钟后多酚得率开始呈现下降趋势，这说明提取时间太长会导致部分多酚的成分遭到一定的破坏，因此后续实验采用60min作为牡丹花的浸提时间。
取0.25g牡丹叶干粉，固定料液比1:40、乙醇浓度60％，50℃分别水浴加热15min、45min、60min、75min，探究提取时间对牡丹叶中多酚得率的影响。结果如图3，得出相关的结论是，15到45分钟之间的时候牡丹叶多酚得率急速增加，45分钟到60分钟之间时牡丹叶多酚得率呈现急速下降趋势，具有明显趋向，60分钟之后下降速度放缓。总的来说，45分钟时多酚的溶出率达到最大值。多酚得率在45分钟后下降的原因是提取时间过长多酚可能遭到破坏，因此后续实验采用45min作为牡丹叶的浸提时间。
取0.25g牡丹根皮干粉，固定料液比1:40、乙醇浓度60％，60℃分别水浴加热15min、45min、60min、75min，探究提取时间对牡丹根皮中多酚得率的影响。结果如图3，15到45分钟之间的时候牡丹根皮多酚得率急速增加，45分钟之后牡丹叶多酚得率呈现急速下降趋势，具有明显趋向，说明提取时间过长多酚可能遭到破坏，因此后续实验采用45min作为牡丹根皮的浸提时间。
(4)乙醇浓度对牡丹各部位多酚提取率的影响
酚类化合物的提取通常采用传统的乙醇浸提法，乙醇的质量分数会影响酚类化合物的浸出效果。取牡丹花干粉0.25g，固定料液比1:50、温度60℃的水浴加热60min,将乙醇浓度设置为五个梯度，分别为15％、35％、55％、75％、95％，用于探究乙醇浓度对牡丹花瓣多酚得率的影响。结果如图4所示，得出的相关结论是，乙醇浓度在15％、35％和55％时，牡丹花花瓣的多酚得率增加速度缓慢，不具有明显趋向；在55％到75％之间时，牡丹花花瓣的多酚得率大幅度上升，具有明显趋向，且在质量分数为75％左右时牡丹花多酚得率可以达到相对较高的提取率。超过75％后，多酚得率大幅度下降。分析原因可能是乙醇质量分数过高造成其他一些木质素、脂类、生物碱等物质的溶出，进而影响酚类物质的溶出。因此后续实验采用75％乙醇作为牡丹花的提取条件。
取0.25g牡丹叶干粉，固定料液比1:40、50℃水浴加热45min，将乙醇浓度设置为五个梯度，梯度设置分别为15％、35％、55％、75％、95％，用于探究乙醇浓度对牡丹叶中多酚得率的影响。结果如图4所示，得出的相关结论是，随着乙醇浓度的不断增加，牡丹叶中的多酚得率也随之不断增加，具有明显趋向，在乙醇浓度为15～35％之间的时候牡丹叶内的多酚得率呈现相对比较明显的增加，在乙醇浓度为35％～55％之间时，牡丹叶内的多酚得率增加速度放缓，不具有明显趋向，在乙醇浓度55％～75％之间时，牡丹叶中的多酚得率产生大幅度下降，在乙醇浓度为75％～95％之间的时候牡丹叶中的多酚得率下降趋势放缓，总的来说，在55％左右的乙醇浓度时候，牡丹叶中的多酚得率可以达到相对较高的提取率。分析原因可能是乙醇质量分数过高造成其他一些脂类物质的溶出，进而影响酚类物质的溶出。因此后续实验采用55％乙醇作为牡丹叶的提取条件。
取0.25g牡丹根皮干粉，固定料液比1:40、60℃水浴加热45min，乙醇浓度设置五个梯度，分别为15％、35％、55％、75％、95％，将用来探究乙醇浓度对于牡丹根皮中多酚得率的影响。结果如图4所示，得出结论为，随着乙醇浓度的不断增加，牡丹根皮中多酚得率呈现爬坡式增加后急速下降的趋势，在乙醇浓度为15％～75％之间时，牡丹根皮中多酚得率呈现爬坡式增加，总体来说增加速度较快；在75％～95％的乙醇浓度时，牡丹根皮中的多酚得率呈现急速下降趋势，不断下降。总的来说，在75％的乙醇浓度时，牡丹根皮中的多酚得率将呈现较高的提取率。分析原因可能是过高的乙醇浓造成其他一些脂类物质的溶出，进而影响酚类物质的溶出。因此后续实验采用75％乙醇作为牡丹根皮的提取条件。
2.2正交试验结果
将牡丹花多酚提取的正交实验结果记录与表中，见表5，观察图表，由表中相关数据经过直接分析可以得知，第四号实验组合条件A2B1C2的试验结果相对来说效果最优。通过极差的计算结果可以看出，牡丹花多酚得率被乙醇浓度、提取温度和提取的时间影响，且作用效果依次降低。从三个相关因素的各水平之和K1、K2、K3可以得出以下结论，牡丹花多酚提取的最佳试验组合为A2B3C3。由于本次极差分析得出的最佳试验组合并未在以下九组正交试验范围之内，因此还需要进行相关的验证对此组合进行验证试验，证明实验结论。
表5：牡丹花多酚提取正交试验结果
牡丹叶多酚提取正交试验结果，见表6，由表直接分析可知，第五号试验组合条件A2B2C3的试验结果最好。通过极差的计算结果可以看出，牡丹叶多酚得率被的提取温度、乙醇浓度、提取时间影响，且作用效果依次降低。从三个因素各水平之和K1、K2、K3可以得出，牡丹叶多酚提取最佳试验组合为A2B2C3即提取温度50℃、提取时间45min、乙醇浓度65％时，试验效果最好。
表6：牡丹叶多酚提取正交试验结果
牡丹根皮多酚提取正交试验结果，见表7，由表直接分析可知，第六号试验组合条件A2B3C1的试验结果最好。通过极差的计算结果可以看出，牡丹根皮多酚得率被乙醇浓度、提取时间、提取温度影响，且作用效果依次降低。从三个因素各水平之和K1、K2、K3可以得出，牡丹根皮多酚提取最佳试验组合为A2B3C1即提取温度50℃、提取时间60min、乙醇浓度65％时，试验效果最好。
表7：牡丹根皮多酚提取正交试验结果
2.3验证试验
牡丹花多酚提取验证试验：按A2B3C3即提取温度60℃、提取时间70min、乙醇浓度80％组合进行验证试验，测得多酚得率为15.65639mg，原四号组合A2B1C2测得多酚得率为16.91368mg，因此最后能够确定最优组合方案为A2B1C2即提取温度60℃、提取时间50min、乙醇浓度75％。
实验得到能将牡丹花多酚完美提取出来的组合方案为：提取温度60℃、提取时间50min、乙醇浓度75％。
能将牡丹叶多酚完美提取出来的组合方案为：提取温度50℃、提取时间45min、乙醇浓度65％。
能将牡丹根皮多酚完美提取出来的组合方案为：提取温度50℃、提取时间60min、乙醇浓度65％。
实施例2：牡丹中多酚抗氧化测定
1、试验方法：
DPPH自由基清除实验是常规的体外评估抗氧化性能的方法。利用DPPH自由基的结构特征和理化性质，待测样品会使DPPH溶液颜色变浅，自由基的清除强度可以从吸光度的减小程度间接评价。
取各1g的牡丹花、牡丹叶和牡丹根皮干粉，在实施例1得到的最优提取条件下各自进行浸提、过滤，这一步骤重复两次，合并两次滤液，再于旋转蒸发仪中蒸发至干得多酚结晶体，将其配成不同浓度的多酚溶液。设置样品组：将不同浓度的待测样品溶液与DPPH溶液在同一个洁净试管内等量混匀，然后将混合溶液进行避光半小时，后用紫外可见分光光度计测517nm下的OD值；设置空白对照：同样的操作方法，测DPPH溶液与无水乙醇等量混合后的吸光度；设置阳性对照：以及测0.5mg/mLVc溶液与DPPH溶液等量混合后的吸光度。
样品对DPPH自由基的清除率(％)＝[(A0－A)/A0]×100％式中，A为样品组吸光度；A0为空白对照组吸光度。清除率越大代表多酚的抗氧性越强。
2、试验结果：
试验结果如图5-图8所示。结果表明：当牡丹花多酚、牡丹叶多酚、牡丹根皮多酚浓度均处于0.5mg/mL时，牡丹叶多酚对DPPH自由基的清除率最大，为97.81％左右；其次是牡丹根皮多酚，为95.45％左右；最小的是牡丹花多酚，为93.37％左右。根据相关数据得出直接分析为，同浓度0.5mg/mL的Vc溶液对DPPH自由基的清除率相对较低，为94.50％左右。由此可见，牡丹叶多酚和牡丹根皮多酚完全可以作为天然的抗氧化剂和自由基清除剂进行进一步的开发和利用，牡丹花多酚也具有一定的天然抗氧化剂的潜力。
实施例3：牡丹中多酚抑菌能力考察
1、试验方法：
用无菌镊子将直径5.5mm的无菌滤纸片贴到含菌平板上，每个平板贴三个滤纸片，每板形成三次平行实验。用移液枪吸取牡丹不同部位不同浓度的多酚溶液(按实施例1优化后的最优条件制备)，各8uL到滤纸片上，37℃恒温箱培养24h。
2、试验结果：
试验结果见表8。
表8：牡丹各部位多酚抑菌能力比较
注：抑菌圈直径mm。
根据表8，以抑菌圈直径大小为判断依据，牡丹花、叶、根三部位多酚能够较好的抑制枯草芽孢杆菌的生长，并且对其生长的抑制作用具有一定的浓度依赖性。牡丹花多酚溶液在实验浓度为0.8mg/mL时，抑制枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌生长的能力由大到小逐次降低；牡丹叶多酚溶液在实验浓度0.8mg/mL时，相对于金黄色葡萄球菌和大肠杆菌，牡丹叶多酚能够非常好的抑制枯草芽孢杆菌的生长；牡丹根皮多酚溶液在实验浓度为0.8mg/mL时，抑制枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌生长的能力由大到小逐次降低。
以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种从牡丹中提取多酚的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将牡丹花用体积浓度为75％的乙醇进行提取，提取温度60℃、提取时间50min，提取得到牡丹花多酚；
(2)将牡丹叶用体积浓度为65％的乙醇进行提取，提取温度50℃、提取时间45min，提取得到牡丹叶多酚；
(3)将牡丹根皮用体积浓度为65％的乙醇进行提取，提取温度50℃、提取时间60min，提取得到牡丹根皮多酚。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，牡丹花与体积浓度为75％的乙醇的料液比为1:50。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，牡丹叶与体积浓度为65％的乙醇的料液比为1:40。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，牡丹根皮与体积浓度为65％的乙醇的料液比为1:40。
5.利用权利要求1-4任一项所述的方法提取得到的牡丹多酚。
6.根据权利要求5所述的牡丹多酚，其特征在于，所述牡丹多酚包括：牡丹花多酚、牡丹叶多酚和牡丹根皮多酚。
7.权利要求5或6所述的牡丹多酚在制备抗氧化剂中的应用。
8.权利要求5或6所述的牡丹多酚在制备抑菌剂中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述抑菌剂对枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌具有抑菌活性。
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| CN202210570935.8A CN115040567A (zh) | 2022-05-24 | 2022-05-24 | 牡丹中多酚的提取方法及其应用 |
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| CN106063828A (zh) * | 2016-06-20 | 2016-11-02 | 武汉市农业科学技术研究院林业果树科学研究所 | 一种油用牡丹叶片多酚的提取方法 |
| CN106349044A (zh) * | 2016-08-31 | 2017-01-25 | 李健 | 一种牡丹酚的提取方法 |
| CN106578016A (zh) * | 2016-12-06 | 2017-04-26 | 江南大学 | 一种从牡丹球中提取生物保鲜剂的方法及其应用 |
| CN108452035A (zh) * | 2018-06-04 | 2018-08-28 | 郑州师范学院 | 一种牡丹花瓣多酚的提取方法 |
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