CN115038453A - 具有改变的icd stat信号转导的cd122 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及修饰的人CD122，其中修饰的人CD122包括一个或多个STAT3结合基序。在一些实施方式中，修饰的人CD122是修饰的正交人CD122，其可以选择性地被同源正交IL2激活。结合至同源IL2配体后，修饰的人CD122能够刺激稳健且持续的STAT3和STAT5信号转导。

Description

具有改变的ICD STAT信号转导的CD122
相关申请
本申请要求2020年1月14日提交的美国临时申请号62/961，157的优先权和权益。所述临时申请的全文通过引用纳入本文用于所有目的。
附图简要说明
图1提供了与细胞膜相关联的正交CD122(IL2Rb)多肽的示意图(左)和本发明的工程改造受体的代表性实施方式的一个构造，其中包含STAT3基序YRHQ的正交CD122肽的胞内结构域通过甘氨酸-甘氨酸接头被添加至其羧基末端(右)。
图2提供了FACS研究的结果，确证了指示的正交CD122的高效转导和表达(hoRb，中间图)和包括其他STAT3基序的正交CD122(右图)在3F8细胞中被高效地诱导和表达。
图3提供了FACS研究的结果，评估了用指示的正交CD122(hoRb)转导的3F8 T细胞克隆的相对百分比，和包含其他STAT3基序的正交CD122在对正交配体的反应中具有升高的CD26和CD122表达。
图4提供了在CD4+T细胞(左上)、CD8+T细胞(右上)中评估磷酸STAT3(pSTAT3)水平的结果，所述细胞被工程改造以表达正交hoRb受体构建体，其包含对wtIL2反应的IL2wtIL2Rb ICD(黑色方块)，对给予正交配体STK-009反应的wt IL2R ICD(灰色圆圈)和对给予正交配体STK-009反应的添加了STAT3基序的IL2 wtIL2Rb ICD；和CD4+T细胞(左下)、CD8+T细胞(右下)中的磷酸STAT5(phospho)(pSTAT5)水平，所述细胞被工程改造以表达正交hoRb受体构建体，其包含对wtIL2反应的IL2 wtIL2Rb ICD(黑色方块)，对给予正交配体STK-009反应的wt IL2R ICD(灰色圆圈)和对给予正交配体STK-009反应的添加了STAT3基序的IL2 wtIL2Rb ICD。
图5提供了在CD4+T细胞(左上)、CD8+T细胞(右上)中评估pERK信号转导水平的结果，所述细胞被工程改造以表达正交hoRb受体构建体，其包含对wtIL2反应的IL2 wtIL2RbICD(黑色方块)，对给予正交配体STK-009反应的wt IL2R ICD(灰色圆圈)和对给予正交配体STK-009反应的添加了STAT3基序的IL2 wtIL2Rb ICD；和CD4+T细胞(左下)、CD8+T细胞(右下)中的pS6K(pSTAT5)水平，所述细胞被工程改造以表达正交hoRb受体构建体，其包含对wtIL2反应的IL2 wtIL2Rb ICD(黑色方块)，对给予正交配体STK-009反应的wt IL2R ICD(灰色圆圈)和对给予正交配体STK-009反应的添加了STAT3基序的IL2 wtIL2Rb ICD。
图6提供了CD19CAR T细胞构建体的细胞毒性评估的评估结果的图示，其包含具有其他STAT3信号转导基序的正交CD122(hoRb)受体，相比包含具有野生型CD122胞内结构域的正交CD122(hoRb)的CD19 CAR T细胞构建体，在10∶1至0.1∶1的多种效应物：靶标(E：T；CART：Raji肿瘤细胞)比率下，证明了相对于包含具有野生型CD122胞内结构域的正交CD122(hoRb)的CD19 CAR T细胞，表达具有表达STAT3基序的胞内结构域(ICD)的hoRb的CD19 CART细胞构建体针对Raji肿瘤细胞具有改进的细胞毒性。
发明背景
受控操纵细胞的分化、发育和增殖，特别是工程改造的免疫细胞，具有重大的临床意义。T细胞已被工程改造用于治疗应用，例如识别和杀死癌细胞、细胞内病原体和参与自身免疫的细胞。通过选择性地激活和扩增提供特定的功能的工程改造T细胞，并引导为选择性攻击癌细胞，促进工程改造细胞疗法在癌症治疗方面的应用。在一些过继免疫疗法的例子中，从对象的血液中分离出T细胞，离体处理，并重新输注进对象体内。因此，需要能够选择性地激活靶向工程改造细胞群的组合物和方法。
制造细胞治疗产品的挑战是，这种“活的药物”需要密切控制其环境以保持活力和功能。在实践中，分离的细胞，无论是来自患者(自体)还是来自单一供体来源(同种异体)，在离开对象或受控的培养条件后，开始迅速失去功能。在离开对象或受控培养条件时，成功地维持分离细胞的健康和功能，使分离细胞恢复功能，以重新插入细胞产品制造工作流程或患者体内。
此外，工程改造T细胞疗法的临床应用的挑战是选择性地刺激这些工程改造细胞，以最大化其治疗效果。提供工程改造T细胞产品的持续维持激活的典型手段是全身给予细胞因子，例如IL2。然而，IL2的全身给予与工程改造细胞群体之外非特异性刺激作用有关，特别是在高剂量下，与人对象的显著毒性有关。此外，IL2在体内的寿命很短，需要经常给予IL2以维持工程改造T细胞处于激活状态。虽然来自初始群体的初始给予的工程改造的细胞在工程改造细胞产品给予后的几个月或甚至几年都可以检测到，单这些工程改造细胞中有相当一部分会陷入静息状态，需要重新激活它们以表现出显著的治疗效果。因此，基于细胞的疗法的挑战是将所需的可调节的行为赋予转移的细胞，其不受内源性信号转导通路的影响，不影响非靶向内源细胞，并且在工程改造细胞群给予对象之后可以选择性地受控。
CD122是中等亲和力和高亲和力IL2受体复合物的组分。CD122包含天然STAT5识别基序。结合IL2之后，受体激活JAK(激酶)，其磷酸化(phorphorylate)CD122的胞内结构域中的某些酪氨酸。磷酸化的CD122招募并磷酸化STAT5(STAT5A和/或STAT5B)。然后磷酸化的STAT5被二聚体化并转位入核中以激活靶基因的转录，其在多个通路中发挥重要作用，从先天到获得免疫到细胞增殖、分化和存活。Basham等，Nucleic Acids Res.2008年6月；36(11)：3802-3818。
最近，已经开发了涉及用重组CD122转化的T细胞的细胞疗法。Sockolosky，等(Science(2018)359∶1037-1042)和Garcia，等(美国专利申请公开US2018/0228841A1公开于2018年8月16日)描述了正交IL2/CD122配体/受体系统以促进选择性刺激工程改造以表达正交CD122的细胞。表达正交(orthogonal)CD122的工程改造T细胞与对应的正交配体接触，使得这种正交CD122(“区交(orthologonal)IL2”)能够特异性激活这种工程改造T细胞。特别是这种正交IL2受体配体复合物提供了细胞的混合群体，特别是T细胞的混合群体中工程改造以表达正交受体的细胞的选择性扩增。
对非工程改造的中等亲和力(CD122/CD132)IL2受体复合物或高亲和力(CD25/CD122/CD132)IL2受体复合物具有减弱的亲和力的正交IL2也用于选择性靶向对于表现出CD25高表达的细胞的区交IL2的激活，例如在自身免疫疾病的治疗中。区交IL2对于天然野生型CD122胞外结构域(ECD)具有显著减弱的亲和力，但是保留了对CD25的ECD的结合，也可以，通过干扰高亲和力IL2受体复合物形成，用作野生型IL2的竞争性拮抗剂，由此能被用于治疗自身免疫疾病或移植物抗宿主(GVH)疾病。
发明概述
本发明涉及修饰的人CD122，它保留了如天然人CD122中的STAT5基序，但已被工程改造以包含一个或多个STAT3结合基序。在一些实施方式中，STAT3结合基序的存在使得修饰的CD122更稳定，这促进了在结合至同源IL2配体后持续和强大的STAT3和STAT5信号转导。在一些实施方式中，修饰的人CD122是修饰的区交人CD122，其可以选择性地被同源区交IL2激活。因此本发明还提供了用于选择性激活免疫细胞的组合物和方法，所述免疫细胞已经被工程改造以表达修饰的区交人CD122以促进稳定和持续的IL-2介导的信号转导。本文所述方法可用于有效地治疗需要IL2疗法的患者，而不会导致与标准IL2疗法相关联的显著的不良反应。
本申请通过引用WO2019/104092和US2018-0228842A1)的公开将其全文纳入。
在一些实施方式中，本公开提供了一种编码修饰的人CD122的多核苷酸，其中修饰的人CD122包含一个或多个STAT3结合基序。在一些实施方式中，修饰的人CD122包括融合至一个或多个STAT3结合基序的正交人CD122或天然人CD122。在一些实施方式中，正交人CD122是相对于天然人CD122在选自R41、R42、Q70、K71、T73、T74、V75、S132、H133、Y134、F135、E136和Q214的至少一个或多个残基处修饰的。在一些实施方式中，正交人CD122是相对于天然人CD122在H133和Y134处修饰的。在一些实施方式中，人CD122连接至两个或三个STAT3结合基序。
在一些实施方式中，修饰的人CD122包括与SEQ ID NO：1有至少90％同一性的序列，其中所述修饰的人CD122结合至天然IL2多肽或正交IL2多肽。在一些实施方式中，一个或多个STAT3结合基序包括YX1X2Q的序列，其中X1和X2是任何氨基酸。在一些实施方式中，X1选自下组：L、R、F、M，X2选自下组：R、K、H和P。在一些实施方式中，STAT3识别基序选自下组：YLRQ(SEQ ID NO：11)、YLKQ(SEQ ID NO：12)、YRHQ(SEQ ID NO：13)、YLRQ(SEQ ID NO：14)、YFKQ(SEQ ID NO：15)、YLPQ(SEQ ID NO：16)、YMPQ(SEQ ID NO：17)和YDKPH(SEQ IDNO：18)。
在一些实施方式中，一个或多个STAT3结合基序被融合至所述天然人CD122或正交人CD122的胞内结构域的C-末端，任选地通过接头。在一些实施方式中，至少一个STAT3结合基序位于对应于天然人CD122的355位和364位之间，其中所述至少一个STAT3识别基序替换天然人CD122的YFTY、YDPY或YSEE的氨基酸序列。在一些实施方式中，接头包括二核苷酸(GG)n，其中n为1至10。
在一些实施方式中，修饰的人CD122相对于天然人CD122在选自R41、R42、Q70、K71、T73、T74、V75、S132、H133、Y134、F135、E136和Q214的至少一个或多个残基处被进一步修饰。
在一些实施方式中，修饰的CD122包括含有接头和至少一个STAT3结合基序的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列选自下组：GGYLRQ(SEQ ID NO：3)、GGYLKQ(SEQ ID NO：4)、GGYRHQ(SEQ ID NO：5)、GGYLRQ(SEQ ID NO：6)、GGYFKQ(SEQ ID NO：7)、GGYLPQ(SEQ ID NO：8)、GGYMPQ(SEQ ID NO：9)和GGYDKPH(SEQ ID NO：10)。
本文还提供了包括上述任何一个实施方式的多核苷酸的表达载体。
本文还提供了包括上述任何一个实施方式的多核苷酸的表达载体。在一些实施方式中，细胞进一步表达嵌合抗原受体(CAR)，其中所述细胞是人免疫细胞。在一些实施方式中，CAR选自下组：CD19 CAR和BCMA CAR。
本文还提供了一种用于选择性激活细胞内受体的试剂盒，所述试剂盒包括：(a)表达由本文公开的多核苷酸编码的修饰的人CD122的细胞，和(b)人IL2多肽。在一些实施方式中，修饰的人CD122包括SEQ ID NO：1编码的天然人CD122，其中所述人IL2多肽是SEQ IDNO：2编码的天然人IL2多肽。在一些实施方式中，修饰的人CD122包括正交人CD122，其中所述人IL2多肽是正交人IL2多肽，其中所述正交人IL2多肽相较于天然人CD122优先结合至所述修饰的人CD122。
在一些实施方式中，正交人IL2多肽包含至少一个氨基酸取代，其由除了相对于天然人CD122残基T51、R81的位置处的天然人IL2多肽的氨基酸之外的氨基酸取代，或相对于天然人CD122 M23的位置处包含丙氨酸，相对于天然人CD122E15、H16、L19和D20的每个位置处包含氨基酸取代。
在一些实施方式中，正交人IL2多肽对应于天然人IL2选自以下的位置包含一个或多个氨基酸取代：[E15D、E15T、E15A、E15S]、[H16N、H16Q]、[L19V、L19I、L19A]、[D20L、D20M]、[Q22S、Q22T、Q22E、Q22K、Q22E]、[M23A、M23W、M23H、M23Y、M23F、M23Q、M23Y]、[G27K、G27S]、[R81D、R81Y]、[N88E、N88Q]、[T51I]。
在一些实施方式中，修饰的人CD122由哺乳动物细胞表达。在一些实施方式中，哺乳动物细胞是免疫细胞。在一些实施方式中，免疫细胞是T细胞。在一些实施方式中，T细胞是嵌合抗原受体(CAR)-T细胞。
还提供了一种刺激免疫细胞的方法，所述免疫细胞表达包含一个或多个STAT3结合基序的修饰的人CD122，所述方法包括将所述免疫细胞与人IL2多肽接触。在一些实施方式中，离体进行刺激。在一些实施方式中，其中在体内进行刺激。在一些实施方式中，修饰的人CD122包括融合至一个或多个STAT3结合基序的正交人CD122或天然人CD122。在一些实施方式中，至少一个STAT3结合基序位于对应于天然人CD122的381位和390位之间，其中所述至少一个STAT3结合基序替换天然人CD122的YFTY、YDPY或YSEE的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述方法包括将表达包含一个或多个STAT3结合基序的修饰的人CD122的免疫细胞引入个体，并将人IL2多肽给予个体，从而激活个体中的免疫反应。在一些实施方式中，修饰的人CD122包括正交人CD122，其中所述人IL2多肽是正交人IL2多肽，其中所述正交人IL2多肽相较于天然人CD122优先结合至并激活所述修饰的人CD122。在一些实施方式中，一个或多个STAT3结合基序包括YX1X2Q的序列，其中X1和X2是任何氨基酸。在一些实施方式中，X1选自下组：L、R、F和M，X2选自下组：R、K、H和P。在一些实施方式中，正交人CD122包括选自下组的序列：GGYLRQ(SEQ ID NO：2)、GGYLKQ(SEQ ID NO：3)、GGYRHQ(SEQ ID NO：4)、GGYLRQ(SEQ IDNO：5)、GGYFKQ(SEQ ID NO：6)、GGYLPQ(SEQ ID NO：7)、GGYMPQ(SEQ ID NO：8)和GGYDKPH(SEQ ID NO：9)。在一些实施方式中，免疫细胞是T细胞。在一些实施方式中，T细胞是CAR-T细胞。在一些实施方式中，免疫细胞是CD8+T细胞，其中所述个体有癌症。在一些实施方式中，免疫细胞是Treg细胞，其中所述个体有自身免疫疾病。在一些实施方式中，个体具有病毒、细菌或真菌感染。
具体实施方式
定义
为了使本发明更容易被理解，下文以及整个说明书中对某些术语和短语进行了定义。本文提供的定义是非限制性的，应根据本领域技术人员的知识阅读。
在描述本发明的方法和组合物之前，应理解，本发明不限于所述的方法或组合物，因为它们当然可能变化。还应理解，本文中使用的术语仅意在描述特定实施方式，并不旨在进行限制。
提供数值范围时，也应视作具体公开了该范围的上限和下限之间以下限单位十分之一为间隔的各中间数值，除非上下文另有明确说明。本发明还包括设定范围内任何设定数值或中间数值和该设定范围内任何其它设定数值或中间数值之间的较小范围。取决于设定范围内任何明确排除的限值，所述范围可独立地包含或排除这些较小范围的上下限，本发明也包括这些较小范围不包含限值、包含任一或两个限值的各范围。设定范围包含一个或两个限值时，本发明也包括排除所述限值之一个或两个的范围。
除非另有说明，本文所用的所有科技术语与本发明所属领域普通技术人员所理解的通常含义相同。虽然也可采用与本文所述类似或等同的任何方法和材料实施或测试本发明，但在此描述一些潜在和优选的方法和材料。本文提及的所有出版物均通过引用纳入本文，以公开和描述与所引用出版物相关的方法和/或材料。
应注意，本文和所附权利要求书所用的单数形式″一个″、″一种″和″所述″包括复数含义，除非上下文另有明确说明。因此，例如，提到″细胞″包括多个这样的细胞，提到″所述肽″包括本领域技术人员已知的一或多个肽及其等同物，例如多肽，等等。
提供本文讨论的出版物仅针对其在本申请提交日之前的公开。本文中所有内容均不应解释为承认本发明不能凭借在先发明而先于这些出版物。此外，所提供的出版日期可能与实际公开日期不同，这可能需要单独确认。
除非另有说明，份数是重量份数，分子量是重均分子量，温度是摄氏度(℃)，压力是大气压或接近大气压。使用标准缩写，包括下述：bp＝碱基对；kb＝千碱基；p1＝皮升；s或sec＝秒；min＝分钟；h或hr＝小时；aa＝氨基酸；kb＝千碱基；nt＝核苷酸；pg＝皮克；ng＝纳克；μg＝微克；mg＝毫克；g＝克；kg＝千克；dl或dL＝分升；μl或μL＝微升；ml或mL＝毫升；1或L＝升；μM＝微摩尔；mM＝毫摩尔；M＝摩尔；kDa＝千道尔顿；i.m.＝肌肉内(经肌肉内)；i.p.＝腹膜内(经腹膜内)；SC或SQ＝皮下(经皮下)；QD＝每日一次；BID＝每日两次；QW＝每周一次；QM＝每月一次；HPLC＝高效液相色谱；BW＝体重；U＝单元；ns＝无统计学显著性；PBS＝磷酸盐缓冲盐水；PCR＝聚合酶链式反应；NHS＝N-羟基琥珀酰亚胺；HSA＝人血清白蛋白；MSA＝小鼠血清白蛋白；DMEM＝达氏改良伊氏培养基；GC＝基因组拷贝；EDTA＝乙二胺四乙酸。
应理解，在本公开内容中，根据单字母或三字母代码提及氨基酸。为了方便阅读者，单字母和三字母氨基酸代码在下表1中提供：
Figure BDA0003744535820000081
Figure BDA0003744535820000091
科学文献中描述了分子生物学的标准方法(参见，例如，Sambrook和Russell(2001)《分子克隆》(Molecular Cloning)，第3版，冷泉港实验室出版社(Cold SpringHarbor Laboratory Press)，纽约冷泉港；和Ausubel，等(2001)《新编分子生物学指南》(Current Protocols in Molecular Biology)，卷1-4，约翰威利父子公司(John Wileyand Sons，Inc.)纽约，N.Y.，其描述了在细菌细胞中克隆和DNA定点诱变(卷1)、哺乳动物细胞中和酵母中的克隆(卷2)、糖偶联物和蛋白质表达(卷3)，以及生物信息学(卷4))。科学文献描述了用于蛋白质纯化的方法，包括免疫沉淀、层析、电泳、离心和结晶，以及化学分析、化学修饰、翻译后修饰、融合蛋白的生产和蛋白糖基化(参见，例如，Coligan，等(2000)《新编蛋白质科学方案》(Current Protocols inProtein Science)，卷.1-2，约翰威利父子公司(John Wiley and Sons，Inc.)，NY)。
除非另有说明，下述术语意在具有如下含义。在整个说明书中定义了其他术语。
本文所用术语“激活”用于指受体或受体复合物以反映激动剂配体与受体结合的生物学效应。例如，据称IL2激动剂结合至IL2受体“激活”受体的信号转导以产生一种或多种胞内生物学效应(例如STAT5的磷酸化)。
如本文所用术语“活性”是针对分子而言，以描述分子在测试系统或生物学功能方面的特性，例如该分子结合至另一分子的程度。这种生物学功能的例子包括但不限于生物剂的催化活性、刺激胞内信号转导的能力、基因表达、细胞增殖、调节免疫学活性(如炎症反应)的能力。“活性”通常表示为每个单元的给予剂的生物活性，例如[催化活性]/[mg蛋白]、[免疫活性]/[mg蛋白]，活性的国际单位(IU)，[STAT5或STAT3磷酸化]/[mg蛋白]、[T-细胞增殖]/[mg蛋白]、噬斑形成单位(plaque forming units)(pfu)等。术语“增殖活性”涵盖了促进细胞分裂的活性，所述细胞分裂包括在肿瘤性疾病、炎症性疾病、纤维化、发育异常、细胞转化、转移和血管生成中观察到的失调的细胞分裂。
术语“给予”和“施用”在此可互换使用，指的是接触对象的行为，包括用试剂与对象体外、体内或离体的细胞、组织、器官或生物流体接触(例如，区交IL2、CAR-T细胞、化疗剂、抗体或调节剂或包括上述一种或多种的药物制剂)。试剂的给予可以通过多种本领域认可的方法中的任一种实现，包括但不限于局部、血管内注射(包括静脉或动脉内输注)、皮内注射、皮下注射、肌内注射、腹膜内注射、颅内注射、瘤内注射、经皮、经粘膜、离子渗透递送(iontophoretic delivery)、淋巴管内注射、胃内输注、前列腺内注射、膀胱内输注(如：膀胱)、呼吸道吸入器、眼内注射、腹内注射、病灶内注射、卵巢内注射、脑内输注或注射、脑室内注射(ICVI)等。术语“给予”包括试剂与细胞、组织或器官的接触，以及试剂与液体的接触，其中液体与细胞接触。
如本文所用术语“亲和力”是指第一分子(例如配体)特异性结合至第二分子(例如受体)的程度，并通过以Kd表示的结合动力学衡量，其为分子与其靶标之间的解离常数(Koff)和分子与其靶标之间的缔合常数(Kon)的比率。
如本文所用术语“生物样品”或“样品”表示获自或源自对象的样品。举例而言，生物样品包括选自下组的材料：体液、血液、全血、血浆、血清、粘液分泌物、唾液、脑脊液(CSF)、支气管肺泡灌洗液(BALF)、眼液(如玻璃体液、房水)、淋巴液、淋巴结组织、脾脏组织、骨髓，以及来自这些组织中一个或多个组织的免疫球蛋白富集部分。在一些实施方式中，样品获取自已经暴露于包括区交IL2药物制剂的治疗方案的对象，例如重复暴露于同一药物。在其他实施方式中，样本获取自最近没有暴露于区交IL2的对象，或在计划给予区交IL2之前从对象处获得。
如本文所用，术语“嵌合抗原受体”和“CAR”可互换使用，指的是包含多个功能结构域的嵌合多肽，其从氨基端到羧基端的序列依次排列为：(a)抗原结合结构域(ABD)；(b)跨膜结构域(TD)；和(c)一个或多个胞质信号转导结构域(CSD)，其中上述结构域可以任选地由一个或多个间隔子结构域连接。CAR还可进一步包括信号肽序列，其通常在翻译后处理过程中被去除，并在用包含编码CAR的核酸序列的表达载体转化的细胞表面呈递CAR。在本方法的实践中有用的CAR可以按照本领域众所周知的原理制备。参见，例如，Eshhaar等，美国专利号7,741,465B1，2010年6月22日授权；Sadelain，等(2013)Cancer Discovery 3(4)：388-398；Jensen和Riddell(2015)《新编免疫学观点》(Current Opinions in Immunology)33：9-15；Gross，等(1989)PNAS(USA)86(24)：10024-10028；Curran，等(2012)J Gene Med14(6)：405-15。可以被修饰以纳入本发明的正交受体的市售可得CAR-T细胞产品的例子包括阿基伦赛(axicabtagene ciloleucel)(从吉利德制药公司(Gilead Pharmaceuticals)以名称
Figure BDA0003744535820000111
市售可得)和替沙伦赛(tisagenlecleucel)(从诺华(Novartis)以名称
Figure BDA0003744535820000112
市售可得)。
如本文所用，术语“嵌合抗原受体T-细胞”和“CAR-T细胞”可互换使用，指的是经过重组修饰以表达嵌合抗原受体的T细胞。如本文所用，CAR-T细胞可以被工程改造以表达正交CD122多肽。
如本文所用，术语“白细胞介素-2”或″IL2″是指具有IL2活性的天然存在的IL2多肽。在一些实施方式中，IL2是指成熟的野生型人IL2。成熟的野生型人IL2(hIL2)是133个氨基酸的多肽(减去由额外的20个N-末端氨基酸组成的信号肽)，如Fujita，等，PNAS USA，80，7437-7441(1983)所述。成熟的野生型人IL2(hIL2)的天然存在的变体的氨基酸序列是：
APTSSSTKKT QLQLEHLLLD LQMILNGINN YKNPKLTRMLTFKFYMPKKA
TELKHLQCLE EELKPLEEVL NLAQSKNFHL RPRDLISNINVIVLELKGSE
TTFMCEYADE TATIVEFLNR WITFCQSIIS TLT(SEQ ID NO：2)
如本文所用，残基的编号是基于IL2序列UniProt ID P60568，不包括与SEQ IDNO：2的相同的信号肽。
如本文所用术语“天然人CD122”是指天然存在的人CD122，包括其天然存在的变体。天然存在人CD122变体的氨基酸序列是：
AVNGTSQFTC FYNSRANISC VWSQDGALQD TSCQVHAWPDRRRWNQTCEL
LPVSQASWAC NLILGAPDSQ KLTTVDIVTL RVLCREGVRWRVMAIQDFKP
FENLRLMAPI SLQVVHVETH RCNISWEISQ ASHYFERHLEFEARTLSPGH
TWEEAPLLTL KQKQEWICLE TLTPDTQYEF QVRVKPLQGEFTTWSPWSQP
LAFRTKPAAL GKDTIPWLGH LLVGLSGAFG FIILVYLLINCRNTGPWLKK
VLKCNTPDPS KFFSQLSSEH GGDVQKWLSS PFPSSSFSPGGLAPEISPLE
VLERDKVTQL LLQQDKVPEP ASLSSNHSLTSCFTNQGYFFFHLPDALEIE
ACQVYFTYDP YSEEDPDEGV AGAPTGSSPQ PLQPLSGEDDAYCTFPSRDD
LLLFSPSLLG GPSPPSTAPG GSGAGEERMP PSLQERVPRDWDPQPLGPPT
PGVPDLVDFQ PPPELVLREA GEEVPDAGPR EGVSFPWSRPPGQGEFRALN
ARLPLNTDAY LSLQELQGQD PTHL(SEQ ID NO：1)
如本文所用术语“人CD122”可以是天然人CD122或区交人CD122直向同源物(ortholog)。如本文所用，关于人CD122的残基的编号是基于SEQ ID NO：1。
如本文所用，术语″人正交CD122″或“正交人CD122”可以互换使用，指天然CD122多肽的变体，其能特异性结合至至少一种正交IL2。在一些实施方式中，正交人CD122在hCD122多肽的ECD中的组氨酸133(H133)和酪氨酸134(Y134)位置包含氨基酸取代。在一些实施方式中正交CD-122包含在133位的从组氨酸到天冬氨酸(H133D)、谷氨酸(H133E)或赖氨酸(H133K)的氨基酸取代和/或在134位从酪氨酸到苯丙氨酸(Y134F)、谷氨酸(Y134E)或精氨酸(Y134R)的氨基酸取代。在一些实施方式中，正交CD122是具有氨基酸取代H133D和Y134F的hCD122分子。
如本文所用术语“修饰的人CD122”是指包含人CD122和一个或多个STAT3结合基序的蛋白质。人CD122可以是人正交CD122或天然人CD122。在一些实施方式中，修饰的人CD122保留如天然人CD122中的STAT5基序YYLSL(SEQ ID NO：20)。
如本文所用术语“修饰的人正交CD122”是指一种修饰的人CD122蛋白质类型，其包含人正交CD122和一个或多个STAT3结合基序。在一些实施方式中，修饰的CD122保留STAT5基序YLSL(SEQ ID NO：20)。
如本文所用术语“来源于”，在氨基酸序列或多核苷酸序列的上下文中(例如“来源于”IL2多肽的氨基酸序列)意为表示多肽或核酸具有基于参考多肽或核酸的序列(例如天然存在的IL2多肽或编码IL2的核酸)，不意在被限制为制备蛋白质或核酸的来源或方法。举例而言，术语“来源于”包括参考氨基酸或DNA序列的同源物或变体。
如本文所用术语“胞外结构域”或其缩写“ECD”是指细胞质膜外侧的细胞表面蛋白质部分(例如细胞表面受体)。ECD可以包括跨膜蛋白、细胞表面或膜相关蛋白、分泌蛋白、细胞表面靶向蛋白的整个胞质外部分。
术语“IL2活性”是指对细胞与有效量的IL2多肽接触反应的细胞上的一个或多个生物学效应。可以测量IL2活性，例如，在细胞增殖试验中使用CTLL 2小鼠细胞毒性T细胞，参见，Gearing，A.J.H.和C.B.Bird(1987)在《淋巴因子和干扰素：实用方法》(Lymphokinesand Interferons，A PracticalApproach.)Clemens，M.J.等(编)：IRL Press.295。重组人IL2的比活性约为2.1 x 104IU/μg，其为针对重组人IL2 WHO国际标准(NIBSC编码：86/500)校准的。在一些实施方式中，例如当感兴趣的IL2正交多肽表现出(或被工程改造以具有)对CD25的减弱亲和力时，IL2活性可以在人细胞(例如YT细胞)中评估，所述细胞不需要CD25来通过IL2受体提供信号转导，而是能够通过中等亲和力CD122/CD132受体信号转导。当在对比实验中以相似浓度评估时，本发明的正交人IL2可以具有WHO国际标准(NIBSC编码：86/500)野生型成熟人IL2的活性的低于20％、或者低于约10％、或者低于约8％、或者低于约6％、或者低于约4％、或者低于约2％、或者低于约1％、或者低于约0.5％的。
本文所用术语“需要治疗”是指医生或其他护理人员对对象作出的判断，关于对象和对象需要或将有可能从治疗中受益。这种判断是基于医生或护理人员的专业知识领域中的多种因素作出的。
如本文所用术语″修饰的CD122的胞内结构域″或″ICD″是指跨膜正交受体的部分，它位于表达这种跨膜正交受体的细胞的质膜内。ICD可以包括一个或多个″增殖信号转导结构域″或″PSD″，其指向细胞发出信号以进入有丝分裂并开始细胞生长的蛋白结构域。例子包括Janus激酶，包括但不限于JAK1、JAK2、JAK3、Tyk2、Ptk-2、来自其他哺乳动物或真核物种的Janus激酶家族的同源成员、IL2受体β和/或γ链以及来自细胞因子受体超家族蛋白的其他亚基，它们可能与Janus激酶家族的蛋白相互作用以转导信号，或其部分、修饰或组合。信号的例子包括一个或多个STAT分子的磷酸化，包括但不限于STAT1、STAT3、STAT5a和/或STAT5b的一个或多个。
如本文所用，术语“配体”是指表现出特异性结合至受体并导致受体生物活性改变从而使其所结合的受体的活性发生改变的分子。在一个实施方式中，术语“配体”是指可以作为受体的激动剂或拮抗剂的分子或其复合物。如本文所用，术语“配体”包括天然和合成的配体。“配体”也包括小分子，例如细胞因子的肽模拟物和抗体的肽模拟物。配体和受体的复合物被称为“配体-受体复合物”。
″序列同一性百分比″通过在比较窗口中对比两种最佳比对序列而测定，其中比较窗口中多核苷酸序列的部分与参考序列(不含添加或缺失)相比可包含添加或缺失(即缺口)以最佳比对所述两种序列。该百分比可如下计算：通过测定两种序列中出现相同核酸碱基或氨基酸残基的位置数产生匹配位置数，将该匹配位置数除以比较窗口中位置的总数，得到的结果乘以100产生序列同一性百分比。氨基酸序列的基本同一性通常意味着至少40％的序列同一性。多肽的百分比同一性可以是40％到100％的任何整数，例如至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％。在一些实施方式中，″基本相似″的多肽共有如上所述的序列，除了可能因保守的氨基酸变化而不同的不相同的残基位置。保守氨基酸取代指的是具有相似侧链的残基的可互换性。例如，具有脂肪族侧链的一组氨基酸是甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；一组具有脂肪族羟基侧链的氨基酸是丝氨酸和苏氨酸；具有含酰胺侧链的一组氨基酸是天冬酰胺和谷氨酸；具有芳香族侧链的一组氨基酸是苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；具有碱性侧链的一组氨基酸是赖氨酸、精氨酸和组氨酸；具有含硫侧链的一组氨基酸是半胱氨酸和甲硫氨酸。示例性的保守氨基酸取代组是：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸，苯丙氨酸-酪氨酸，赖氨酸-精氨酸，丙氨酸-缬氨酸，天冬氨酸-谷氨酸，天冬酰胺-谷氨酰胺。
适合确定序列相同性和序列相似性百分数的算法分别是BLAST和BLAST 2.0算法，分别描述于Altschul等(Nuc.Acids Res.25：3389-3402，1977)和Altschul等(J.Mol.Biol.215∶403-410，1990)。进行BLAST分析的软件可从国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)(在ncbi.nlm.nih.gov/)公开获得。此算法包括：首先通过鉴定查询序列中长度为W的短字来鉴定高评分序列对(HSP)，与数据库序列中长度相同的字比对时它们能匹配或满足一些正值的阈值评分T。T称为相邻字评分阈值(Altschul等，同上)。这些初始相邻字命中(word hit)用作启动搜索的种子，以便找到含有它们的较长HSP。只要可提高累积比对评分，所述字命中在两个方向上沿各序列延伸。就核苷酸序列而言，采用参数M(一对匹配残基的奖励评分；总是＞0)和N(错配残基的罚分；总是＜0)计算累积评分。就氨基酸序列而言，用评分矩阵计算累积评分。出现以下情况时中止字命中在各个方向上的延伸：累积比对评分比其最大获得值降低X；由于一个或多个负评分残基比对的累积，累积评分变为零或零以下；或者达到任一序列的末端。BLAST算法参数W、T和X确定该比对的灵敏度和速度。BLASTN程序(用于核苷酸序列)采用的默认值如下：字长(W)11，期望值(E)或10，M＝5，N＝-4，以及比较两条链。对于氨基酸序列，BLAST程序使用的默认值为：字长(W)3，期望值(E)为10，BLOSUM62评分矩阵(参见Henikoff和Henikoff，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89∶10915(1989))比对(B)为50，期望值(E)为10，M＝5，N＝-4，以及比较两条链。
BLAST算法也对两条序列间的相似性进行统计学分析(参见例如，Karlin和Altschul，Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 90：5873-5787(1993))。BLAST算法提供的一种相似性度量是最小概率和(P(N))，它表明两条核苷酸或氨基酸序列之间偶尔发生匹配的概率。例如，如果测试核酸与参比核酸比较时的最小概率和小于约0.2，更优选小于约0.01，最优选小于约0.001，那么认为该核酸与参比序列相似。
如本文在多肽结构的上下文中使用，“N-末端”(或“氨基末端”)和“C-末端”(或“羧基末端”)分别指多肽的极氨基端和羧基端，而术语“N-末端的”和“C-末端的”分别指多肽的氨基酸序列中朝向N-末端和C-末端的相对位置，并可分别包括N-末端和C-末端残基。“近邻N-末端的”或“近邻C-末端的”是指第一氨基酸残基相对于第二氨基酸残基的位置，其中第一和第二氨基酸残基共价结合以提供连续的氨基酸序列。
术语“核酸”、“核酸分子”、“多核苷酸”等在本文中可互换使用，并且是指任何长度的核苷酸的聚合形式，即脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，或其类似物。多核苷酸的非限制性例子包括线性和环形核酸、信使RNA(mRNA)、互补DNA(cDNA)、重组多核苷酸、载体、探针、引物等。
术语“可操作地连接”在本文中是指编码不同功能的核酸序列在组合成单个核酸序列时的关系，该核酸在被引入细胞时，提供能够在细胞中实现特定核酸序列的转录和/或翻译的核酸。例如，如果它被表达为参与多肽分泌的前蛋白，信号序列的DNA可操作地连接至多肽的DNA；如果它影响序列的转录，启动子或增强子可操作地连接至编码序列；或如果它被定位以促进翻译，核糖体结合位点可操作地连接至编码序列。通常，″可操作地连接″意为被连接的DNA序列是连续的，而且在分泌型前导的情况下，是连续的并且处于阅读段。然而，某些遗传元件，如增强子，不需要与它们产生作用的序列连续。
如本文所用术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文可互换使用，并且指任何长度的氨基酸的聚合形式，其可以包括遗传编码的或非遗传编码的氨基酸，化学或生物化学修饰的或衍生的氨基酸，和具有修饰的多肽主链的多肽。这些术语包括融合蛋白，包括但不限于具有异源氨基酸序列的融合蛋白；具有异源和同源前导序列的融合蛋白；具有或不具有N-末端甲硫氨酸残基的融合蛋白；具有免疫学标签蛋白的融合蛋白；免疫学活性蛋白(例如抗原性白喉或破伤风毒素片段)的融合蛋白等等。
本文所用的术语“预防”、“防止”等是指在对象疾病、紊乱、病症或其症状发生之前启动的行动过程，使得暂时或永久地预防、减轻、抑制或减少对象患某种疾病、紊乱、病症或类似疾病的风险(例如通过没有临床症状来确定)，或推迟其发作，一般是在对象由于遗传、经验或环境因素而易患某种特定疾病、紊乱或病症的情况下。在某些情况下，术语“预防”、“防止”也被用来指减缓疾病、紊乱或病症从目前的状态向更有害的状态发展。
如本文所用，术语“受体”是指具有特异性结合配体的结构域的多肽，该配体的结合导致该多肽的至少一种生物学特性的改变。在一些实施方式中，受体是“可溶性”受体，不与细胞表面关联。hCD25的可溶性形式是特异性结合hIL2的可溶性受体的例子。在一些实施方式中，受体是细胞表面受体，其包括胞外结构域(ECD)和膜关联结构域，后者用于将ECD锚定至细胞表面。在细胞表面受体的一些实施方式中，受体是跨膜多肽，其包括由通常称为跨膜结构域(transmembrane domain)(TM)的跨膜的结构域(membrane spanning domain)连接的胞内结构域(ICD)和胞外结构域(ECD)。配体结合至受体导致受体的构象变化，从而产生可测量的生物学效应。在一些情况下，如果受体是包括ECD、TM和ICD的跨膜多肽，配体结合至ECD导致由ICD的一个或多个结构域介导的可测量的胞内生物学效应，以反应于配体结合至ECD。在一些实施方式中，受体是多组分复合物的组分，以促进胞内信号转导。例如，配体可以结合细胞表面分子，该分子不单独与任何胞内信号转导相关联，但在配体结合后促进异源多聚体(包括异二聚体(例如中等亲和力CD122/CD132 IL2受体)、异三聚体(如高亲和力CD25/CD122/CD132 hIL2受体)或同源多聚体(同二聚体、同三聚体、同四聚体)复合物的形成，导致胞内信号转导级联(如Jak/STAT途径)的激活。
如本文所用，术语“重组的”或“工程改造的”是指使用重组DNA技术产生的多肽。重组DNA技术的技术和方案在本领域中是众所周知的。
术语“反应”、“响应”，例如，细胞、组织、器官或生物体的反应，包括生化或生理行为的变化，例如，浓度、密度、粘附性或生物隔室内的迁移、基因表达率或分化状态，其中该变化与激活、刺激或处理相关，或与内部机制如遗传编程相关。在某些情况下，术语“激活”、“刺激”等是指由内部机制以及外部或环境因素调节的细胞激活；而术语“抑制”、“下调”等则是指相反的效果。
本文所用的术语“特异性结合”是指一个分子结合至另一个分子的选择性或亲和性的程度。在结合对(如配体/受体、抗体/抗原、抗体/配体、抗体/受体结合对)的上下文中，当结合对的第一分子不大量结合至样品中存在的其他组分时，就称作结合对的第一分子特异性结合至结合对的第二分子。当结合对的第一分子对第二分子的亲和力比第一分子对样品中存在的其他组分的亲和力至少大2倍、或至少大5倍、或至少大10倍、或至少大20倍、或至少大100倍时，结合对的第一分子被称为特异性结合至结合对的第二分子。在特定实施方式中，当结合对中的第一分子是抗体时，如果结合对的抗体和第二分子之间的平衡解离常数大于约106M、或者大于约108M、或者大于约1010M、或者大于约1011M、或者大于约1010M、或者大于约1012M，例如通过Scatchard分析确定，该抗体特异性结合至结合对中的第二分子(例如，蛋白质、抗原、配体或受体)(Munsen，等1980Analyt.Biochem.107：220-239)。在一个实施方式中，其中配体是正交IL2，受体包括正交CD122 ECD，如果IL2直向同源物/正交CD122ECD的平衡解离常数大于约105M、或大于约106M、或大于约107M、或大于约108M、或大于约109M、或大于约1010M、或大于约1011M，则正交IL2特异性结合。特异性结合可使用本领域已知的技术进行评估，包括但不限于竞争ELISA、
Figure BDA0003744535820000191
试验和/或
Figure BDA0003744535820000192
试验。
术语“受体”、“个体”、“对象”和“患者”在本文中可互换使用，并指任何需要诊断、处理或治疗的哺乳动物对象，特别是人。用于治疗目的的“哺乳动物”是指被分类为哺乳动物的任何动物，包括人、家养和农场动物，以及动物园、运动或宠物动物，例如狗、马、猫、奶牛、绵羊、山羊、猪等。在一些实施方式中，哺乳动物为人。
如本文所用术语“T-细胞”或“T细胞”以其常规意义使用，是指在胸腺中分化的淋巴细胞，拥有特定细胞表面抗原受体，包括一些控制细胞介导的免疫和体液免疫和其他裂解携带抗原的细胞的起始或抑制的。在一些实施方式中，T细胞包括但不限于幼稚CD8+T细胞、细胞毒性CD8+T细胞、幼稚CD4+T细胞、辅助T细胞，例如TH1、TH2、TH9、TH11、TH22、TFH；调节性T细胞，例如TR1、Treg、诱导型Treg；记忆性T细胞，例如中心记忆T细胞、效应记忆T细胞、NKT细胞、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)和此类T细胞的工程改造变体，包括但不限于CAR-T细胞、重组修饰TIL和TCR工程改造细胞。
本文使用的短语“治疗有效量”是指向对象给予试剂，单独地或作为药物组合物或治疗方案的一部分，以单剂量或作为系列剂量的一部分，以在给予对象时能够对疾病、紊乱或病症的任何症状、方面或特征产生任何可检测的、积极影响的量。治疗有效量可以通过测量相关的生理效应来确定，并且可以结合给药方案和对对象病情的诊断分析等来调整。用于确定试剂的治疗有效量的评估参数由医生使用公认的诊断标准确定，包括但不限于指标例如年龄、体重、性别、总体健康状况、ECOG评分、可观察到的生理参数、血液浓度、血压、心电图、计算机断层扫描、X-射线等。或者或此外，还可以监测临床情境中通常评估的其他参数，以确定是否对对象给予了治疗有效量的试剂，如体温，心率，血液化学的正常化，血压的正常化，胆固醇水平的正常化，或疾病、紊乱或病症的任何症状、方面或特征，生物标志物(如炎症细胞因子、IFN-□、颗粒酶等)，血清肿瘤标志物的减少，实体瘤反应评估标准(RECIST)的改善、免疫相关缓解标准(irRC)的改善、生存期的延长、无进展生存期的延长、进展时间的延长、治疗失败时间的延长、无事件生存期的延长、下次治疗时间的延长、客观缓解率的改善、缓解持续时间的改善、肿瘤负担的减轻、完全缓解、部分缓解、稳定的疾病等，本领域的临床医生基于这些评估对象对给予试剂的反应的状况改善。如本文所用，涉及靶病灶的术语“完全缓解(CR)”、“部分缓解(PR)”、“稳定的疾病(SD)”和“进展性疾病(PD)”，涉及非靶病灶的术语“完全缓解(CR)”、“不完全缓解/稳定的疾病(SD)”和“进展性疾病(PD)”，应理解为RECIST标准中所定义。如本文所用术语“免疫相关完全缓解(irCR)”、“免疫相关部分缓解(irPR)”、“免疫相关进展性疾病(irPD)”和“免疫相关稳定的疾病(irSD)”如根据免疫相关缓解标准(irRC)定义。如本文所用，术语“免疫相关缓解标准(irRC)”是指用于评估免疫治疗的缓解的体系，如描述于Wolchok，等(2009)评估实体瘤中免疫治疗活性的指南：免疫相关缓解标准(Guidelines for the Evaluation of Immune TherapyActivity in Solid Tumors：Immune-Related Response Criteria)，Clinical CancerResearch 15(23)：7412-7420。在对象疗程期间，可以根据给药方案和/或对象病情的评估及前述因素的变化调整治疗有效量。在一个实施方式中，治疗有效量是在哺乳动物对象给药过程中当单独使用或与另一试剂组合使用时不导致不可逆的严重不良事件的试剂的量。
术语“治疗”、“疗法”、“处理”等是指在诊断、观察到对象的疾病、紊乱或病症或其症状后，起始的行动过程(例如给予IL2、CAR-T细胞或包含其的药物组合物)或类似情况，以便暂时或永久地消除、减少、抑制、减轻或改善困扰对象的这种疾病、紊乱或病症的至少一个根本原因，或与这种疾病、紊乱或病症相关的至少一个症状。治疗包括对患有疾病的对象采取的行动过程，其中该行动过程导致对象的疾病被抑制(例如，阻止疾病、紊乱或病症的发展或改善与此相关的一个或多个症状)。
本文所用的术语“调节性T细胞”或“Treg细胞”是指CD4+T细胞的类型，其能够抑制其他T细胞的反应，包括但不限于效应T细胞(Teff)。Treg细胞特征在于表达CD4、IL2受体的a亚基(CD25)和转录因子叉头盒P3(FOXP3)(Sakaguchi，Annu Rev Immunol22，531-62(2004)。“常规CD4+T细胞”意指除调节性T细胞以外的CD4+T细胞。
野生型：“野生型”或“WT”或“天然”在本文中是指在自然界中存在的氨基酸序列或核苷酸序列，包括等位基因变异。WT蛋白，多肽，抗体，免疫球蛋白，IgG等具有未经人工修饰的氨基酸序列或核苷酸序列。
修饰的人CD122
本发明提供修饰的人CD122，其包括天然STAT5识别基序和一个或多个STAT3结合基序。具有额外的STAT3结合基序增强信号转导并稳定IL2反应。
STAT蛋白和STAT3结合基序
STAT蛋白在C末端保守的酪氨酸残基处被磷酸化后，作为转录激活因子发挥作用，然后转位到核内，在那里它们结合至DNA并激活目的基因转录。Hennighausen L，RobinsonGW.Genes Dev.2008；22∶71121.在该家族中，有七种STAT蛋白：STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5A、STAT5B和STAT6，从先天和获得性免疫到细胞增殖、分化和存活，它们在多种途径中具有功能。Basham等，Nucleic Acids Res.2008年6月；36(11)：3802-3818。
STAT结合基序通常存在于细胞因子受体中，它们分别结合细胞因子激活Janus激酶(JAK)家族的酪氨酸激酶，这磷酸化受体的胞内结构域的某些酪氨酸。磷酸化的受体将STAT招募至受体上的STAT识别基序并变成磷酸化的。磷酸化的STAT被二聚体化并转位至核中并激活重要基因的转录，Hennighausen L， Robinson GW。通过转录因子STAT5A和STAT5B对细胞因子信号转导的解释。Genes Dev.2008；22：71121。
在这些STAT蛋白中，STAT5可以通过结合至其同源受体被细胞因子(包括IL2、IL-4、IL-7、IL-9、IL-15和IL21)激活。Lara E.Kallal和ChristineA.Biron(2013)在舞蹈中改变伙伴(Changing partners at the dance，JAK-STAT)，2：1，e23504，DOI：10.4161/jkst.23504，第2页，第2栏。激活的STAT5能够靶向基因(例如识别基序)和招募STAT5，这激活了例如Cis、spi2.1和Socs-1的转录。Basham等，Nucleic Acids Res.2008年6月；36(11)：3802-3818。例如，本发明的修饰的CD122，又称IL2的β受体，包含STAT5识别基序且能够招募和激活STAT5。
STAT5基序具有YX1X2L((SEQ ID NO：19)的序列。X1和X2可以是任何天然氨基酸。在一些情况下，X1和X2是相同的氨基酸残基。在一些情况下，X1和X2是不同的氨基酸残基。在一个实施方式中，STAT5具有YLSL(SEQ ID NO：20)的序列。
STAT3结合基序不存在于天然人CD122中。它通常存在于结合至IL-6、IL-10、IL21、IFNα β、IFNγ和IFNλ的受体中。激活后，STAT3靶向，Bcl-XL、存活蛋白、细胞周期蛋白D1，和激活c-myc。Lara E.Kallal和Christine A.Biron(2013)在舞蹈中改变伙伴(Changingpartners at the dance，JAK-STAT)，2∶1，e23504，DOI：10.4161/jkst.23504，第3页。STAT3可以通过酪氨酸磷酸化被多种细胞因子激活，这些细胞因子的受体共有gp130链，包括IL-6和IL21、制瘤素M(OSM)和白血病抑制因子(LIF)[2]。STAT3在多种生物学功能中发挥作用，包括肿瘤发生、血管生成和肿瘤转移，以及抗凋亡。参见Wei Sun等，FEBS Lett.2006年10月30日；580(25)：5880-4.Epub 2006年10月2日.和Fukada等Immunity，1996年11月1日，449-460卷5，第5期。因此，STAT3信号转导赋予细胞抗凋亡特性并因而增加了表达修饰的人CD122的细胞的半衰期。
在本发明中，人CD122(包括完整的STAT5基序)已经被修饰以引入一个或多个STAT3结合基序，这样产生的修饰的人CD122保留STAT5识别基序并获得一个或多个STAT3结合基序。
在一些实施方式中，修饰的CD122可以包括一个、两个、三个或更多STAT3结合基序。STAT3识别基序具有YX1X2Q(SEQ ID NO：21)的序列。在一些实施方式中，X1选自下组：L、R、F、M，X2选自下组：R、K、H和P。在一些实施方式中，STAT3序列选自下组：YLRQ(SEQ ID NO：11)；YLKQ(SEQ ID NO：12)；YRHQ(SEQ ID NO：13)；YLRQ(SEQ ID NO：14)；YFKQ(SEQ ID NO：15)；YLPQ(SEQ ID NO：16)；YMPQ(SEQ ID NO：17)和YDKPH(SEQ ID NO：18)。
人CD122(包括天然人CD122和人CD122直向同源物)
除了STAT3结合基序之外，修饰的人CD122包括人CD122，其可以是天然人CD122或人正交CD122。
在一些实施方式中，修饰的人CD122包括正交人CD122。正交人CD122是通过突变天然CD122的残基产生的，使得其特异性结合至正交IL2但不特异性结合至天然IL2。例如，对正交IL2的结合亲和力比天然CD122对天然IL2的亲和力高，例如2X、3X、4X、5X、10X或更多倍。在一些实施方式中，正交IL2对同源正交CD122的亲和力表现出与天然IL2对天然CD122的亲和力相当，例如，具有天然CD122对天然IL2的结合亲和力的至少约1％、至少约5％、至少约10％、至少约25％、至少约50％、至少约75％、至少约100％。在一些情况下，正交CD122是相对于天然人CD122在选自R41、R42、Q70、K71、T73、T74、V75、S132、H133、Y134、F135、E136和Q214的至少一个或多个残基处修饰的。在一些实施方式中，正交人CD122是在H133和Y134处修饰的。在一些实施方式中，正交人CD122包含H133D和Y134F取代。在一些实施方式中，正交人CD122是包含相对于天然人CD122蛋白质在Q70、T73、H133和Y134处的氨基酸取代。在一些实施方式中，正交人CD122包含氨基酸取代H133和Y134。在一些实施方式中，氨基酸被取代为酸性氨基酸，例如天冬氨酸和/或谷氨酸。相对于天然人CD122，具体的氨基酸取代包括但不限于：Q70Y；T73D；T73Y；H133D，H133E；H133K；Y134F；Y134E；Y134R。直向同源(orthologous)细胞因子的选择可能随着直向同源受体的选择而变化。
在一些实施方式中，除了具有相对于天然人CD122的上述取代外，正交人CD122具有与天然CD122(SEQ ID NO：2)的全长序列至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的序列。
正交IL2：
在使用修饰的正交人CD122的情况下，可使用正交IL2以促进对工程改造以表达修饰的正交CD122的细胞的选择性刺激。表达修饰的正交CD122的工程改造T细胞与这种正交CD122的对应正交配体接触能够特异性激活这种工程改造T细胞。特别是这种正交IL2受体配体复合物提供了细胞的混合群体，特别是T细胞的混合群体中工程改造以表达正交受体的细胞的选择性扩增。IL2正交配体通过受体提供选择性结合和信号转导，所述受体包括CD122正交受体的胞外结构域，特别是包含氨基酸取代H133D和Y134F的人CD122的胞外结构域。与表达正交CD122的细胞上的正交IL2的活性相比，在表达野生型CD122的细胞上正交IL2的IL2活性显著减弱。因此，提供了在工程改造的细胞群上使用正交IL2选择性激活和/或扩增表达包含正交IL2的胞外结构域的受体的工程改造的细胞。
正交IL2将修饰纳入其一级结构以提供多肽变体，其表现出：(a)对其天然CD122(即从中衍生正交IL2的天然IL2的天然受体)亲和力显著减少；和(b)特异性结合工程改造的天然CD122的变体正交CD122。正交IL2结合至正交CD122后(正交CD122在细胞表面表达，所述细胞被重组DNA技术修饰以纳入编码正交受体的核酸序列，其可操作地连接至控制元件，以实现重组修饰细胞中正交受体的表达)，激活的正交CD122起始信号转导，通过天然细胞元件转导，以提供模拟同源物的天然反应但对表达正交受体的重组修饰细胞群特异性的生物学活性。在本发明的一些实施方式中，相对于天然CD122受体，直向同源物具有对正交CD122显著的选择性，且相对于天然CD122，任选地具有显著减少的效力。通常在对配体/受体结合反应诱导的活性的表征试验中通过活性测量评估选择性。在一些实施方式中，在同一试验中测得的EC50中，直向同源IL2具有至少5倍、或者至少10倍、或者至少20倍、或者至少30倍、或者至少40倍、或者至少50倍、或者至少100倍、或者至少200倍的差异。
IL2直向同源物对直向同源CD122的胞外结构域表现出特异性结合，例如在133位和134位纳入修饰的人CD122。
IL2直向同源物
在各种实施方式中，本发明的方法包括使用包含下式1的氨基酸序列的正交IL2：
(AA1)-(AA2)-(AA3)-(AA4)-(AA5)-(AA6)-(AA7)-(AA8)-(AA9)i-T10-Q11-L12-(AA13)-(AA14)-(AA15)-(AA16)-L17-(AA18)-(AA19)-(AA20)-L21-(AA22)-(AA23)-I24-L25-N26-(AA27)-I28-N29-N30-Y31-K32-N33-P34-K35-L36-T37-(AA38)-(AA39)-L40-T41-(AA42)-K431F44-Y451M461P471K48-K49-A50-(AA51)-E52-L53-K54-(AA55)-L56-Q571C581L591E601E61-E62-L63-K64-P65-L66-E67-E68-V69-L70-N71-L72-A73-(AA74)-S75-K76-N77-F78-H79-(AA80-(AA81)-P82-R83-D84-(AA85)-(AA86)-S87-N88-(AA89)-N90-(AA91)-(AA92)-V93-L94-E95-L96-(AA97)-G98-S99-E100-T101-T102-F103-(AA104)-C105-E106-Y107-A108-(AA109)-E110-T111-A112-(AA113)-I114-V115-E116-F117-L118-N119-R120-W121-I122-T123-F124-(AA125)-(AA126)-S127-I128-I129-(AA130)-T131-L132-T133
其中：
AA1是A(野生型)或缺失；
AA2是P(野生型)或缺失；
AA3是T(野生型)、C、A、G、Q、E、N、D、R、K、P或缺失
AA4是S(野生型)或缺失；
AA5是S(野生型)或缺失；
AA6是S(野生型)或缺失；
AA7是T(野生型)或缺失；
AA8是K(野生型)或缺失；
AA9是K(野生型)或缺失；
AA13是Q(野生型)、W或缺失；
AA14是L(野生型)、M、W或缺失；
AA15是E(野生型)、K、D、T、A、S、Q、H或缺失；
AA16是H(野生型)、N或Q或缺失；
AA18是L(野生型)或R、L、G、M、F、E、H、W、K、Q、S、V、I、Y、H、D或T；
AA19是L(野生型)、A、V、I或缺失；
AA20是D(野生型)、T、S M L或缺失；；
AA22是Q(野生型)或F、E、G、A、L、M、F、W、K、S、V、I、Y、H、R、N、D、T、F或缺失
AA23是M(野生型)、A、W、H、Y、F、Q、S、V、L、T或缺失；
AA27是G(野生型)、K、S或缺失；
AA38是R(野生型)、W或G；
AA39是M(野生型)、L或V；
AA42是F(野生型)或K；
AA51是T(野生型)、I或缺失
AA55是H(野生型)或Y；
AA74是Q(野生型)、N、H、S；
AA80是L(野生型)、F或V；
AA81是R(野生型)、I、D、Y、T或缺失
AA85是L(野生型)或V；
AA86是I(野生型)或V；
AA88是N(野生型)、E或Q或缺失；
AA89是I(野生型)或V；
AA91是V(野生型)、R或K；
AA92是I(野生型)或F；
AA97是K(野生型)或Q；
AA104是M(野生型)或A；
AA109是D(野生型)、C或具有激活侧链的非天然氨基酸；
AA113是T(野生型)或N；
AA125是C(野生型)、A或S；
AA126是Q(野生型)或H、M、K、C、D、E、G、I、R、S或T；和/或
AA130是S(野生型)、T或R。
在一些实施方式中，本发明提供正交IL2，其为hIL2多肽，包括以下几组氨基酸修饰：
[E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K]
[H16N，L19V，D20N，Q22T，M23H，G27K]；
[E15D，H16N，L19V，D20L，Q22T，M23H]；
[E15D，H16N，L19V，D20L，Q22T，M23A]，
[E15D，H16N，L19V，D20L，Q22K，M23A]；
[E15S；H16Q；L19V，D20T；Q22K，M23L]；
[E15S；H16Q；L19V，D20T；Q22K，M23S]；
[E15S；H16Q；L19V，D20S；Q22K，M23S]；
[E15S；H16Q；L19I，D20S；Q22K；M23L]；
[E15S；L19V；D20M；Q22K；M23S]；
[E15T；H16Q；L19V；D20S；M23S]；
[E15Q；L19V；D20M；Q22K；M23S]；
[E15Q；H16Q；L19V；D20T；Q22K；M23V]；
[E15H；H16Q；L19I；D20S；Q22K；M23L]；
[E15H；H16Q；L19I；D20L；Q22K；M23T]；
[L19V；D20M；Q22N；M23S]。
Cys125：
在一些实施方式中，本发明提供正交IL2以促进细菌细胞中的重组表达，通过消除125位处的未配对半胱氨酸残基和/或消除直接表达的IL2多肽的N-末端Met以及通过内源细菌蛋白酶翻译后加工消除1位处的丙氨酸。当氨基酸丢失时，它被称为“des”。在一些实施方式中，125位处的半胱氨酸被取代为丙氨酸或丝氨酸(C125A或C125S)。当在细菌中重组表达和从包涵体中分离时，这种突变通常用于避免蛋白的错误折叠。例如，“des-Ala1”意为第1位的丙氨酸在IL2多肽中不存在。在一些实施方式中，正交IL2或本发明包括以下几组氨基酸修饰之一：
[E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-M23A-C125S]；
[E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-C125S]；
[E15S-H16Q-L19V-D20L-M23A-C125S]；
[E15S-H16Q-L19V-D20L-C125S]；
[E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-M23A-C125A]；
[E15S-H16Q-L19V-D20L-M23A-C125A]；
[E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-C125A]；
[E15S-H16Q-L19V-D20L-C125A]；
[desAla1-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-M23A-C125S]；
[desA1a1-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-C125S]；
[desAla1-E15S-H16Q-L19V-D20L-C125S]；
[desAla1-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-M23A-C125A]；
[desAla1-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-C125A]；
[desAla1-E15S-H16Q-L19V-D20L-C125A]；
[desAla1-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-M23A]；
[desAla1-E15S-H16Q-L19V-D20L-M23A]；
[desAla1-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K]；或
[desAlal-E15S-H16Q-L19V-D20L]。
增加CD122亲和力的突变
在一些实施方式中，正交IL2在hIL2序列的位置中包含一个或多个突变，其或接触hCD122或改变接触CD122的其他位置的取向，导致正交IL2具有对于CD122的增加的亲和力。被鉴定为参与IL2结合至CD122的IL2残基包括L12、Q13、H16、L19、D20、M23、Q74、L80、R81、D84、L85、I86、S87、N88、I89V91、I92和E95。在一些实施方式中，正交IL2包含一个或多个氨基酸取代：Q74N、Q74H、Q74S、L80F、L80V、R81D、R81T、L85V、I86V、I89V和/或I92F或其组合。在一些实施方式中，正交IL2包含一个或多个氨基酸取代：L80F、R81D、L85V、I86V和I92F。在一些实施方式中，正交IL2包含一个或多个氨基酸取代：N74Q、L80F、R81D、L85V、I86V、I89V和I92F。在一些实施方式中，正交IL2包含一个或多个氨基酸取代：Q74N、L80V、R81T、L85V、I86V和I92F。在一些实施方式中，正交IL2包含一个或多个氨基酸取代：Q74H、L80F、R81D、L85V、I86V和192F。在一些实施方式中，正交IL2包含一个或多个氨基酸取代：Q74S、L80F、R81D、L85V、I86V和I92F。在一些实施方式中，正交IL2包含一个或多个氨基酸取代：Q74N、L80F、R81D、L85V、I86V和I92F。在一些实施方式中，正交IL2包含一个或多个氨基酸取代：Q74S、R81T、L85V和I92F。在一些实施方式中，正交IL2包含
[L80F-R81D-L85V-I86V-I92F]。在一些实施方式中，本发明提供正交IL2，其包括以下几组氨基酸修饰之一：
[E15S-H16Q-L19V-D20L-M23A-L80F-R81D-L85V-I86V-I92F]；
[E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-L80F-R81D-L85V-I86V-I92F]；
[E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-M23A L80F-R81D-L85V-I86V-I92F]；
[E15S-H16Q-L19V-D20L-M23A-L80F-R81D-L85V-I86V-I92F-Q126H]；
[E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-L80F-R81D-L85V-I86V-I92F-Q126H]；
[E15S-H 16Q-L 19V-D20L-Q22K-M23A-L80F-R81D-L85V-I86V-I92F-Q126H]；
[E 15S-H16Q-L 19V-D20L-M23A-L80F-R81D-L85V-I86V-I92F-Q126M]；
[E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-L80F-R81D-L85V-I86V-I92F-Q126M]；或
[E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-M23A-L80F-R81D-L85V-I86V-I92F-Q126M]。
在一些实施方式中，直向同源物包含被鉴定为增加IL2对CD122亲和力的取代L85V。在一些实施方式中，本发明提供正交IL2，其为hIL2多肽，包括以下几组氨基酸修饰之一：
[E15S-H16Q-L19V-D20L-M23A-L85V]；
[E15S-H16Q-L 19V-D20L-Q22K-M23A-L85V]；
[E15S-H16Q-L19V-D20L-M23A-L85V]；
[E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-M23A-L85V]；
[E15S-H16Q-L19V-D20L-M23A-L85V-Q126H]；
[E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-M23A-L85V-Q 126H]；
[E 15S-H 16Q-L 19V-D20L-M23A-L85V-Q126M]；或
[E15S-H16Q-L 19V-D20L-Q22K-M23A-L85V-Q126M]。
调节CD25亲和力
在一些实施方式中，正交IL2在IL2序列的位置中包含一个或多个突变，其或接触CD25或改变接触CD25的其他位置的取向，导致正交IL2对于CD25的亲和力减少。突变可以是位于或靠近已知非常接近CD25的区域，基于发表的晶体结构(Wang，等Science 310∶11592005)。据信接触CD25的IL2残基包括K35、R38、T41、F42、K43、F44、Y45、E61、E62、K64、P65、E68、V69、L72和Y107。在一些实施方式中，本发明的正交IL2包含一个或多个点突变：R38A、F41A和F42A(Suave等(1991)PNAS(USA)88：4636-4640)；P65L(Chen等Cell Death andDisease(2018)9：989)；F42A/G/S/T/Q/E/N/R/K，Y45A/G/S/T/Q/E/N/D/R/K/和/或L72G/A/S/T/Q/E/N/D/R/K(Ast，等美国专利申请公开2012/0244112A1，公开于2012年9月27日；美国专利号9266938B2，授权于2016年2月23日)。取代的特定组合已经被鉴定为减少对CD25的结合。在一些实施方式中，本发明的正交IL2包含一个或多个下组取代：[R38A-F42A-Y45A-E62A]，描述于Carmenate，等(2013)JImmunol190：6230-6238；[F42A-Y45A-L72G](RocheRG7461(RO6874281)；和/或[T41P-T51P](Chang，等(1995)Molecular Pharmacology 47：206-211)。在一些实施方式中，本发明提供正交IL2，其为hIL2多肽，包括以下几组氨基酸修饰之一：
[E15S-H16Q-L19V-D20L-M23A-R38A-F42A-Y45A-E62A]；
[E15S-H16Q-L19V-D20L-M23A-R38A-F42A-Y45A-E62A]；
[E15S-H 16Q-L19V-D20L-Q22K-M23A-R38A-F42A-Y45A-E62A]；
[E15S-H16Q-L 19V-D20L-M23A-R38A-F42A-Y45A-E62A-Q126H]；
[E15S-H 16Q-L 19V-D20L-M23A-R38A-F42A-Y45A-E62A-Q 126H]；
[E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-M23A-R38A-F42A-Y45A-E62A-Q126H]；
[E15S-H16Q-L19V-D20L-M23A-R38A-F42A-Y45A-E62A-Q126M]；或
[E15S-H16Q-L19V-D20L-M23A-R38A-F42A-Y45A-E62A-Q126M]。
在本发明的一些实施方式中，正交IL2在IL2序列的位置中包含一个或多个突变，其或接触CD132或改变接触CD132的其他位置的取向，导致对CD132的结合改变。示例性正交IL2在IL2序列的位置中包含一个或多个突变，其或接触CD132或改变接触CD122的其他位置的取向，导致对CD132的结合改变。据信接触CD132的IL2残基包括Q11、L18、Q22、E110、N119、T123、Q126、S127、I129、S130和T133。在一些实施方式中，IL2包含修饰，在L18AA18为L(野生型)或R、L、G、M、F、E、H、W、K、Q、S、V、I、Y、H、D或T；AA126为Q(野生型)或H、M、K、C、D、E、G、I、R、S或T；和/或AA22为Q(野生型)或F、E、G、A、L、M、F、W、K、S、V、I、Y、H、R、N、D、T或F。
在一些实施方式中，本发明提供正交IL2，其为hIL2多肽，包括以下几组氨基酸修饰之一：
[E15S-H16Q-L19V-D20L-M23A-Q126H]；
[E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-M23A-Q126H]；
[E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-Q126H]；
[E15S-H16Q-L19V-D20L-M23A-Q126M]；
[E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-M23A-Q126M]；
[E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-Q126M]；
[desAla1-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q126M]；
[desAla1-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-Q126M]；
[desAla1-E15S-H16Q-L19V-D20L-M23A-Q126M]；
[desAla1-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-M23A-Q126M]；
[desAla1-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-M23A-Q126M]；
[E15S-H16Q-L19V-D20L-M23A-L80F-R81D-I86V-I92F-Q126H]；
[E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-L80F-R81D-I86V-I92F-Q126H]；
[E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-M23A-L80F-R81D-I86V-I92F-Q126H]；
[E15S-H16Q-L19V-D20L-M23A-L80F-R81D-I86V-I92F-Q126M]；
[E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-M23A-L80F-R81D-I86V-I92F-Q126M]；
[E15S-H16Q-L19V-D20L-M23A-L85V-Q126H]；
[E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-L85V-Q126H]；
[E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-M23A-L85V-Q126H]；
[E15S-H16Q-L19V-D20L-M23A-L85V-Q126M]；
[E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-L85V-Q126H]；或
[E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-M23A-L85V-Q126M]。
当在细菌表达系统中直接重组生产时，在没有前导序列的情况下，内源性蛋白酶导致N-末端Met-Ala1残基缺失，以提供“desAla1”正交IL2。在一些实施方式中，本发明提供正交IL2，其为hIL2多肽，包括以下几组氨基酸修饰之一：
[desAla1-E15S-H16Q-L19V-D20L]；
[desAla1-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K]；
[desAla1-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-M23A]；
[desAla1-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q126H]；
[desAla1-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-Q126H]；
[desAla1-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-M23A-Q126H]；
[desAla1-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q126M]；
[desAla1-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-Q126H]；
[desAla1-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-M23A-Q126H]；
[desAla1-E15S-H16Q-L19V-D20L-C125A]；
[desAla1-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-C125A]；
[desAla1-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-M23A-C125A]；
[desAla1-E15S-H16Q-L19V-D20L-C125A-Q126H]；
[desAlal-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-C125A-Q126H]；
[desAla1-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-M23A-C125A-Q126H]；
[desA1a1-E15S-H16Q-L19V-D20L-C125A-Q126M]；
[desAla1-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-C125A-Q126H]；
[desAla1-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-M23A-C125A-Q126H]；
[desAla1-E15S-H16Q-L19V-D20L-C125S]；
[desAlal-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-C125S]；
[desAla1-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-M23A-C125S]；
[desAla1-E15S-H16Q-L19V-D20L-C125S-Q126H]；
[desAla1-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-C125S-Q126H]；
[desAla1-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-M23A-C125S-Q126H]；
[desAla1-E15S-H16Q-L19V-D20L-C125S-Q126M]；
[desAla1-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-C125S-Q126M]；或
[desAla1-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-M23A-C125S-Q126M]。
保守氨基酸取代
除了前述有助于正交IL对CD122正交受体的活性和选择性的修饰之外，正交IL2可以包含对其一级结构的一个或多个修饰，提供对活性IL2的最小影响。在一些实施方式中，本发明的正交IL2可以进一步包含在野生型IL-2氨基酸序列中的一个更保守的氨基酸取代。这种保守取代包括那些由Dayhoff描述于《蛋白质序列和结构图册5》(The Atlas ofProtein Sequence and Structure 5)(1978)，以及由Argos描述于EMBO J.，8：779-785(1989)。通常根据表3中示出的以下表格进行保守取代。
Figure BDA0003744535820000331
通过选择比表3中示出的那些更不保守的氨基酸取代，可以进行功能或免疫学特性中的实质性改变。例如，可以进行更显著地影响多肽骨架结构或破坏二级或三级元件的取代，包括用大电荷的大侧链(天冬酰胺)取代具有小的无电荷侧链的氨基酸(例如甘氨酸)。特别是那些参与与CD25、CD122和/或CD123的一个或多个相互作用的IL2残基的取代，这可以从IL2与其描述的受体相缔合的晶体结构中看出
除了前述有助于正交IL2对CD122正交受体的活性和选择性的修饰之外，正交IL2可以包含对其一级结构的一个或多个修饰。如上文提供的对一级结构的修饰可以任选地进一步包括不实质性降低正交IL2的IL2活性的修饰，包括但不限于修饰：N30E；K32E；N33D；P34G；T37I、M39Q、F42Y、F44Y、P47G、T51I、E52K、L53N、Q57E、M104A(参见美国专利号5,206,344)。
去除糖基化位点
本发明的正交IL2可以包含消除Thr3位的O-糖基化位点的修饰，以在哺乳动物细胞(例如CHO或HEK细胞)中表达正交IL2时促进非糖基化正交IL2的产生。因此，在某些实施方式中正交IL2包含消除IL-2的对应于人IL-2的残基3位置的O-糖基化位点的修饰。在一些实施方式中所述消除IL-2的对应于人IL-2的残基3位置的O-糖基化位点的修饰是氨基酸取代。示例性的氨基酸取代包括T3A、T3G、T3Q、T3E、T3N、T3D、T3R、T3K和T3P，其去除位置3处的糖基化位点而没有消除生物学活性(参见美国专利号5,116,943；Weiger等，(1989)Eur.J.Biochem.，180：295-300)。在特定的实施方式中，所述修饰是氨基酸取代T3A。在一些实施方式中，本发明提供正交IL2，其为hIL2多肽，包括以下几组氨基酸修饰之一：
[T3A-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-M23A-C125S]；
[T3A-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-C125S]；
[T3A-E15S-H16Q-L19V-D20L-M23A-C125S]；
[T3A-E15S-H16Q-L19V-D20L-C125S]；
[T3A-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-M23A-C125A]；
[T3A-E15S-H16Q-L19V-D20L-M23A-C125A]；
[T3A-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-C125A]；
[T3A-E15S-H16Q-L19V-D20L-C125A]；
[T3A-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-M23A]；
[T3A-E15S-H16Q-L19V-D20L-M23A]；
[T3A-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K]；
[T3A-E15S-H16Q-L19V-D20L]；
[desAla1-T3A-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-M23A-C125S]；
[desAla1-T3A-E15S-H16Q-L19V-D20L-M23A-C125S]；
[desAla1-T3A-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-C125S]；
[desAla1-T3A-E15S-H16Q-L19V-D20L-C125S]；
[desAla1-T3A-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-M23A-C125A]；
[desAla1-T3A-E15S-H16Q-L19V-D20L-M23A-C125A]；
[desAla1-T3A-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-C125A]；
[desAla1-T3A-E15S-H16Q-L19V-D20L-C125A]；
[desAla1-T3A-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-M23A]；
[desAla1-T3A-E15S-H16Q-L19V-D20L-M23A]；
[desAla1-T3A-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K]；或
[desAla1-T3A-E15S-H16Q-L19V-D20L]。
正交IL2可以包含头两个氨基酸的缺失(desAla1-desPro2)，以及用半胱氨酸残基取代Thr3糖基化以促进选择性N-末端修饰，特别是半胱氨酸的巯基基团的聚乙二醇化(参见，例如，Katre，等美国专利号5，206，344授权于1993年4月27日)。在一些实施方式中，本发明提供正交IL2，其为hIL2多肽，包括以下几组氨基酸修饰之一：
[desAla1-desPro2-T3C-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-M23A-C125S]；
[desA1a1-desPro2-T3C-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-C125S]；
[desAla1-desPro2-T3C E15S-H16Q-L19V-D20L-M23A-C125S]；
[desAla1-desPro2-T3C-E15S-H16Q-L19V-D20L-C125S]；
[desAla1-desPro2-T3C-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-M23A-C125A]；
[desAla1-desPro2-T3C-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-C125A]；
[desAla1-desPro2-T3C E15S-H16Q-L19V-D20L-M23A-C125A]；
[desAla1-desPro2-T3C-E15S-H16Q-L19V-D20L-C125A]；
[desAla1-desPro2-T3C-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-M23A]；
[desAla1-desPro2-T3C-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K]；
[desAla1-desPro2-T3C-E15S-H16Q-L19V-D20L-M23A]；或
[desAlal-desPro2-T3C-E15S-H16Q-L19V-D20L]。
氧化稳定化的M104A
本文公开的正交IL2可以任选地进一步包含M104位处的修饰，在一个实施方式中用丙氨酸残基取代甲硫氨酸104(M104A)以提供更抗氧化的直向同源物(参见Koths，等，美国专利4,752,585，1988年6月21日授权)。
N末端缺失
当在细菌表达系统中直接重组生产时，在没有前导序列的情况下，内源性蛋白酶导致N-末端Met-Ala1残基缺失，以提供“desAla1”正交IL2。本文公开的正交IL2可以包含头两个氨基酸的缺失(desAla1-desPro2)，以及用半胱氨酸残基取代Thr3糖基化(T3C)以促进N-末端修饰，特别是半胱氨酸的巯基基团的PEG化(参见，例如，Katre，等美国专利号5,206,344授权于1993年4月27日)。
正交IL2可以进一步包含消除在1-9位的一个或多个N-末端氨基酸，或1-8位、或1-7位、或1-6位、或1-5位、或1-4位、或1-3位、或1-2位。在一些实施方式中，本发明提供正交IL2，其为hIL2多肽，包括以下几组氨基酸修饰之一：
[desAla1-desPro2-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-M23A]；
[desAlal-desPro2-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K]；
[desAla1-desPro2-E15S-H16Q-L19V-D20L-M23A]；
[desAla1-desPro2-E15S-H16Q-L19V-D20L]；
[desAla1-desPro2-desThr3-E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-M23A]；
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最小化血管渗漏综合征
在本发明的一些实施方式中，正交IL2包含氨基酸取代以避免血管渗漏综合征，血管渗漏综合征是在人中使用IL2疗法的实质性负面和剂量限制性的副作用，而不会出现效力上的实质性损失。参见，Epstein，等，美国专利号7,514,073B2，2009年4月7日授权。本发明的正交IL2中包含的这种修饰的例子包括R38W、R38G、R39L、R39V、F42K和H55Y中的一个或多个。
亲和力成熟：
在一些实施方式中，正交IL2可经亲和成熟以增强其对正交CD122的活性。“亲和成熟的”多肽是在一个或多个残基上具有一个或多个改变的多肽，与不拥有这一个或多个改变的亲本多肽相比，这导致正交多肽对同源正交受体的亲和力改进，或反之亦然。与“亲本”多肽相比，可进行亲和成熟以增加正交IL2的结合亲和力至少约10％、或至少约50％、或至少约100％、或至少约150％、或1-5倍。在合适的试验条件下使用足够量的分子通过ELISA和/或FACS分析评估时，本发明的工程改造的正交IL2激活其同源正交受体，如上所述，但显著减少对野生型IL2受体的结合和激活。
延长体内作用时间的修饰
如上所述，本发明的组合物包括已经被修饰以提供用于延长体内寿命和/或延长在对象中的作用时间的正交IL2。这种提供延长的寿命和/或作用时间的修饰包括对正交IL2一级序列的修饰、偶联至运载体分子(例如白蛋白、酰化、聚乙二醇化)和Fc融合体。
延长体内作用时间的序列修饰
如上所述，术语正交IL2包括IL2的修饰，以提供用于延长体内寿命和/或延长在对象中的作用时间。
在一些实施方式中，正交IL2可以包含某些氨基酸取代，其导致延长体内寿命。例如，Dakshinamurthi，等(International Journal of Bioinformatics Research(2009)1(2)：4-13)描述在IL2多肽中一个或多个取代V91R、K97E和T113N将产生拥有增强的稳定性和活性的IL2变体。在一些实施方式中，本发明的正交IL2包含V91R、K97E和T113N修饰中的一个、两个或全部三个。
偶联物和运载体分子
在一些实施方式中正交IL2被修饰，为正交IL2提供某些特性(例如延长的对象中作用时间)，这可以通过偶联至运载体分子以提供所需的药理学特性，例如延长半衰期来实现。在一些实施方式中，正交IL2可以共价地连接至IgG的Fc结构域、白蛋白或其他分子以延长其半衰期，例如，通过本领域已知的聚乙二醇化、糖基化、脂肪酸酰化等。
白蛋白融合体
在一些实施方式中，正交IL2被表达为与白蛋白分子(例如人血清白蛋白)的融合蛋白质，其在本领域中是已知的，以促进延长体内暴露。
在本发明的实施方式中，hIL2类似物被偶联至白蛋白，在本文中称为“正交IL2白蛋白融合体”。在hIL2类似物白蛋白融合体的上下文中使用术语“白蛋白”时，包含白蛋白，例如人血清白蛋白(HSA)、食蟹猴血清白蛋白(cyno serum albumin)和牛血清白蛋白(BSA)。在一些实施方式中，相对于野生型HSA序列，该HSA包含C34S或K573P氨基酸取代。根据本发明，白蛋白可以被偶联至正交IL2，在羧基末端、氨基末端、羧基及氨基末端和内部(参见，例如，USP 5,876,969和USP 7,056,701)。在本公开所预期的HSA-正交IL2多肽偶联物中，可以使用多种形式的白蛋白，例如白蛋白分泌前序列(albumin secretion pre-sequence)及其变体、其片段和变体和HSA变体。这种形式通常具有一种或多种所需的白蛋白活性。在其他实施方式中，本发明涉及包含hIL2类似物多肽直接或间接融合至白蛋白、白蛋白片段和白蛋白变体等的融合蛋白，其中融合蛋白比未融合的药物分子具有更高的血浆稳定性和/或融合蛋白保留了未融合药物分子的治疗活性。在一些实施方式中，直接融合是通过接头实现的，例如肽接头或其修饰的版本，如下文更充分地讨论的。
或者，hIL2类似物白蛋白融合体包含正交IL2，其为包含白蛋白结合结构域(ABD)多肽序列和正交IL2多肽的融合蛋白。如上所述，包含白蛋白结合结构域(ABD)多肽序列和hILI2类似物多肽的融合蛋白能够，例如，通过遗传操作实现，使得编码HSA的核酸或其片段被接合至编码一种或多种正交IL2序列的核酸。在一些实施方式中，白蛋白结合肽包括氨基酸序列DICLPRWGCLW(SEQ ID#6)。
正交IL2多肽还可以偶联至大的、缓慢代谢的大分子，例如蛋白质；多糖，例如琼脂糖(sepharose)、琼脂糖(agarose)、纤维素或纤维素珠；聚氨基酸，例如聚谷氨酸或聚赖氨酸；氨基酸共聚物；灭活的病毒颗粒；灭活的细菌毒素，例如来自白喉、破伤风、霍乱的类毒素或白细胞毒素分子；灭活的细菌、树突细胞、甲状腺球蛋白；破伤风类毒素；白喉类毒素；聚氨基酸例如聚(D-赖氨酸：D-谷氨酸)；轮状病毒VP6多肽；流感病毒血蓝蛋白(hemaglutinin)、流感病毒核蛋白；钥孔戚血蓝素(Keyhole LimpetHemocyanin)(KLH)；和乙肝病毒核心蛋白和表面抗原。如果需要，这种偶联形式可用于产生针对本公开的多肽的抗体。
在一些实施方式中，正交IL2与XTEN偶联(化学地或作为融合蛋白)，其提供了延伸的类似于聚乙二醇化的延长的持续时间，可在大肠杆菌中作为重组融合蛋白生产。适合与本发明的正交IL2偶联的XTEN聚合物提供于Podust，等(2016)“通过XTEN蛋白聚合物延长生物活性分子的体内半衰期(Extension ofin vivo half-life of biologically activemolecules by XTENprotein polymers)”，J Controlled Release 240：52-66和Haeckel等(2016)“XTEN作为PEG化的生物学替代方案，允许完全表达基于蛋白酶可激活的杀伤性细胞抑制剂(XTEN as Biological Alternative to PEGylation AllowsComplete Expressionof a Protease-Activatable Killin-Based Cytostatic)”PLOS ONE|DOI：10.1371/journal.pone.0157193，2016年6月13日。XTEN聚合物融合蛋白可以在XTEN多肽和正交IL2之间纳入蛋白酶敏感裂解位点，例如MMP-2裂解位点。
其他用于偶联的候选组分和分子包括其他适于分离或纯化的组分和分子。特定的非限制性例子包括结合分子，例如生物素(生物素-亲和素特异性结合对)、抗体、受体、配体、凝集素或包含固体支持物(包括，例如塑料或聚苯乙烯珠、板或珠、磁珠、测试条和膜)的分子。
在一些实施方式中，IL-2突变蛋白还可以被连接至其他治疗剂，包括治疗性化合物，例如抗炎化合物或抗肿瘤剂、治疗性抗体(例如赫赛汀)、免疫检查点调节剂、免疫检查点抑制剂(例如抗-PD1抗体)、癌症疫苗，如本文他处所述。抗微生物剂包括氨基糖苷类(包括庆大霉素)，抗病毒化合物，例如利福平(rifampicin)、3′-叠氮-3′-脱氧胸苷(AZT)和阿昔洛韦(acyclovir)，抗真菌剂，例如唑类，包括氟康唑(fluconazole)、大环内酯类(plyremacrolide)，例如两性霉素B和杀念菌素(candicidin)，抗寄生生物化合物，例如含锑剂(antimonial)等。正交IL2可以被偶联至其他细胞因子如CSF、GSF、GMCSF、TNF、促红细胞生成素(erythropoietin)，免疫调节剂或细胞因子，例如干扰素或白细胞介素，神经肽，生殖激素，例如HGH、FSH或LH，甲状腺激素，神经递质，如乙酰胆碱，激素受体，例如雌激素受体。还包括非甾体抗炎药，例如吲哚美辛、醋酸水杨酸、布洛芬、舒林酸、吡罗昔康和萘普生，以及麻醉剂或镇痛剂。还包括放射性同位素，如那些对成像以及治疗有用的放射性同位素。
本发明的正交IL2可以使用众所周知的化学偶联方法化学偶联至此类运载体分子。双功能交联剂例如本领域已知的同功能和异功能交联剂可用于此目的。使用的交联剂的类型取决于将要偶联至IL-2突变蛋白的分子的性质，本领域技术人员可以很容易地确定。或者或另外，正交IL2和/或意在与之偶联的分子可以被化学衍生化，使得二者在单独地反应中被偶联，这也是本领域众所周知的。
聚乙二醇化：
在一些实施方式中，正交IL2偶联至一个或多个水溶性聚合物。在本发明实践中有用的水溶性聚合物的例子包括聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇(PPG)、多糖(聚乙烯吡咯烷酮、乙二醇和丙二醇的共聚物、聚(氧乙基化多元醇)、聚烯烃醇(polyolefinic alcohol)、多糖、聚-α-羟基酸、聚乙烯醇(PVA)、聚磷腈、聚噁唑啉(polyoxazoline)(POZ)、聚(N-丙烯酰吗啉)，或其组合。
在一些实施方式中，正交IL2偶联至一个或多个聚乙二醇分子或“聚乙二醇化”。尽管PEG附接至正交IL2的方法或位点可能不同，在某些实施方式中聚乙二醇化不改变或仅在最小程度上改变正交IL2的活性。
在一些实施方式中，半胱氨酸可以被取代为第3位的苏氨酸(3TC)以促进使用特定化学方法的N-末端聚乙二醇化。
在一些实施方式中，正交IL2的选择性聚乙二醇化(例如通过纳入具有侧链的非天然氨基酸以促进选择性PEG偶联化学反应，如描述于Ptacin，等(2018年8月3日提交的PCT国际申请号PCT/US2018/045257，并于2019年2月7日作为国际公开号WO2019/028419Al公开)可用于产生对IL2受体复合物的一个或多个亚基(如CD25、CD132)的亲和力降低的正交IL2。例如，纳入在IL2的序列或残基处具有PEG化特异性部分的非天然氨基酸的正交IL2鉴定为与包含氨基酸34-45、61-72和105-109的CD25相互作用，通常提供对CD25结合减弱的正交IL2。相似地，纳入在IL2的序列或残基处具有可PEG化特异性部分的非天然氨基酸的正交IL2鉴定为与包含氨基酸18、22、109、126或119-133的hCD132相互作用，提供对hCD132结合减弱的正交IL2。
在某些实施方式中，半衰期的增加大于生物学活性的任何减少。适合偶联至多肽序列的PEG通常在室温溶于水，并且具有通式R(O-CH2-CH2)nO-R，其中R是氢或保护基团，例如烷基或烷醇基，其中n是1-1000的整数。当R是保护基团时，其通常具有1-8个碳。偶联至多肽序列的PEG可以是直链的或支链的。本发明考虑了支链PEG衍生物，“星形-PEG(star-PEG)”和多臂PEG。
本发明中使用的PEG的分子量不限于任何特定范围。PEG-正交IL2的PEG组分可以具有大于约5kDa、大于约10kDa、大于约15kDa、大于约20kDa、大于约30kDa、大于约40kDa、或大于约50kDa的分子量。在一些实施方式中，分子量为约5kDa至约10kDa，约5kDa至约15kDa，约5kDa至约20kDa，约10kDa至约15kDa，约10kDa至约20kDa，约10kDa至约25kDa或约10kDa至约30kDa。直链或支链PEG分子的分子量从约2,000至约80,000道尔顿，或者约2，000至约70，000道尔顿，或者约5,000至约50,000道尔顿，或者约10,000至约50,000道尔顿，或者约20,000至约50,000道尔顿，或者约30,000至约50,000道尔顿，或者约20,000至约40,000道尔顿，或者约30,000至约40,000道尔顿。在本发明的一个实施方式中，PEG为包含两个20kD臂的40kD支链PEG。
本公开还考虑了偶联物的组合物，其中PEG具有不同的n值，因此在特定的比率下存在多种不同的PEG。例如，一些组合物包含偶联物的混合物，其中n＝1、2、3和4。在一些组合物中，n＝1的偶联物的百分比为18-25％，n＝2的偶联物的百分比为50-66％，n＝3的偶联物的百分比为12-16％，n＝4的偶联物的百分比多达5％。这种组合物可以通过本领域已知的反应条件和纯化方法生产。层析可用于分辨偶联物的馏分，然后鉴定包含具有例如附接所需数量的PEG的偶联物的馏分，从未修饰的蛋白质序列和具有附接其他数量PEG的偶联物中纯化出来。
适合偶联至多肽序列的PEG通常在室温溶于水，并且具有通式R(O-CH2-CH2)nO-R，其中R是氢或保护基团，例如烷基或烷醇基，其中n是1-1000的整数。当R是保护基团时，其通常具有1-8个碳。
两种广泛使用的第一代激活的单甲氧基PEG(mPEG)是琥珀酰亚胺基碳酸酯PEG(SC-PEG；参见，例如，Zalipsky，等(1992)Biotehno1.Appl.Biochem 15：100-114)和苯并三唑碳酸酯PEG(BTC-PEG；参见，例如Dolence，等美国专利号5,650,234)，其优选与赖氨酸残基反应以形成氨基甲酸酯连接，但也已知与组氨酸和酪氨酸残基反应。使用PEG-醛接头通过还原性胺化靶向多肽的N-末端单个位点。
聚乙二醇化经常发生在多肽N-末端的口-氨基基团，赖氨酸残基侧链上的ε氨基基团和组氨酸残基侧链上的咪唑基团。由于大多数重组多肽具有单一的α和若干ε氨基基团和咪唑基团，根据接头的化学性质，可以产生许多位置异构体。本领域中已知的一般聚乙二醇化策略可在本文中应用。
PEG可以通过末端反应性基团(“间隔子″)结合至本发明的正交IL2，该基团在一个或多个多肽序列的游离氨基或羧基与聚乙二醇之间介导成键。具有可结合至游离氨基基团的间隔子的PEG包括N-羟基琥珀酰亚胺聚乙二醇，它可以通过用N-羟基琥珀酰亚胺激活聚乙二醇的琥珀酸酯来制备。
在一些实施方式中，通过纳入带有独特侧链的非天然氨基酸以促进特定位点的聚乙二醇化来促进正交IL2的聚乙二醇化。将非天然氨基酸纳入多肽以提供功能部分以实现此类多肽的位点特异性聚乙二醇化是本领域中已知的。参见，例如Ptacin，等，(PCT国际申请号PCT/US2018/045257，2018年8月3日提交并公开于2019年2月7日，国际公开号WO 2019/028419Al。在一个实施方式中，本发明的正交IL2在正交IL2的D109位纳入非天然氨基酸。在本发明的一个实施方式中，正交IL2是正交IL2的109位PEG化的，PEG分子分子量约为20kD，或约30kD，或约40kD。
偶联至多肽序列的PEG可以是直链的或支链的。本发明考虑了支链PEG衍生物，“星形-PEG(star-PEG)”和多臂PEG。本发明的实践中有用的具体实施方式PEG包括10kDa直链PEG-醛(例如，
Figure BDA0003744535820000431
ME-100AL、NOF美国公司(NOF America Corporation)，北百老汇(One North Broadway)，纽约州白原市(White Plains，NY)10601USA)、10kDa直链PEG-NHS酯(例如，
Figure BDA0003744535820000432
ME-100CS，
Figure BDA0003744535820000433
ME-100AS，
Figure BDA0003744535820000434
ME-100GS，
Figure BDA0003744535820000435
ME-100HS，NOF)、20kDa直链PEG-醛(例如
Figure BDA0003744535820000436
ME-200AL，NOF、20kDa直链PEG-NHS酯(例如，
Figure BDA0003744535820000437
ME-200CS，
Figure BDA0003744535820000441
ME-200AS，
Figure BDA0003744535820000442
ME-200GS，
Figure BDA0003744535820000443
ME-200HS，NOF)、20kDa 2-臂支链PEG-醛，该20kDA PEG-醛，其包含两个10kDA直链PEG分子(例如，
Figure BDA0003744535820000444
GL2-200AL3，NOF)、20kDa 2-臂支链PEG-NHS酯，该20kDA PEG-NHS酯，其包含两个10kDA直链PEG分子(例如，
Figure BDA0003744535820000445
GL2-200TS，
Figure BDA0003744535820000446
GL200GS2，NOF)、40kDa 2-臂支链PEG-醛，该40kDA PEG-醛，其包含两个20kDA直链PEG分子(例如，
Figure BDA0003744535820000447
GL2-400AL3)、40kDa 2-臂支链PEG-NHS酯，该40kDA PEG-NHS酯，其包含两个20kDA直链PEG分子(例如，
Figure BDA0003744535820000448
GL2-400AL3，
Figure BDA0003744535820000449
GL2-400GS2，NOF)、直链30kDa PEG-醛(例如，
Figure BDA00037445358200004410
ME-300AL)和直链30kDa PEG-NHS酯。
如前所述，PEG可以直接或通过接头分子附接至正交IL2。合适的接头包括“柔性接头”，其长度通常足以允许修饰的多肽序列与连接的组分和分子之间有一些移动。接头分子通常约6-50个原子长。接头分子也可以是，例如，芳基乙炔、含有2-10个单体单元的乙二醇寡聚物、二胺、二酸、氨基酸或其组合。合适的接头可以容易地选择，可以是任何合适的长度，例如1个氨基酸(如Gly)、2、3、4、5、6、7、8、9、10、10-20、20-30、30-50或超过50个氨基酸。柔性接头的例子包括甘氨酸聚合物(G)n、甘氨酸-丝氨酸聚合物、甘氨酸-丙氨酸聚合物、丙氨酸-丝氨酸聚合物和其他柔性接头。甘氨酸和甘氨酸-丝氨酸聚合物是相对非结构化的，因此可以用作组分之间的中性系链(tether)。柔性接头的其他例子包括甘氨酸聚合物(G)n、甘氨酸-丙氨酸聚合物、丙氨酸-丝氨酸聚合物、甘氨酸-丝氨酸聚合物。甘氨酸和甘氨酸-丝氨酸聚合物是相对非结构化的，因此可以用作组分之间的中性系链(tether)。这些接头序列的多聚体(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、10-20、20-30或30-50)可以连接在一起，以提供柔性接头，可用于将异源氨基酸序列偶联至本文公开的多肽。
此外，这种接头可用于将正交IL2连接至本文所述的其他异源多肽组分，异源氨基酸序列可以是信号序列和/或融合伴侣，例如，白蛋白、Fc序列等。
在本发明的一个实施方式中，正交IL2是式2的人正交IL2：
40kD-支链的-PEG-接头-desAla1-hIL2[E15S-H16Q-L19V-D20L-Q22K-M23A]-COOH。
在本发明的另一个实施方式中，正交IL2是式3的人正交IL2：
40KdPEG-(接头)n-PTSSSTKKTQLQLSQLLVLLKAILNGINNYKNPKLTRM
LTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLT(SEQ ID NO：23)
其中n＝0或1。
酰化
在一些实施方式中，本发明的正交IL2可以是通过偶联至脂肪酸分子酰化的，如描述于Resh(2016)《脂质研究进展》(Progress in Lipid Research)63∶120-131。可被偶联的脂肪酸的例子包括肉豆蔻酸、棕榈酸和棕榈油酸。肉豆蔻酸通常被连接至N-末端甘氨酸，但赖氨酸也可以被肉豆蔻酰化。棕榈酰化通常通过对游离的半胱氨酸-SH基团的酶促修饰来实现，例如DHHC蛋白催化S-棕榈酰化。丝氨酸和苏氨酸残基的棕榈酰化通常通过使用PORCN酶酶促实现。
乙酰化
在一些实施方式中，IL-2突变蛋白在N-末端通过与N-末端乙酰转移酶和，例如，乙酰CoA的酶促反应被乙酰化。替代或除了N-末端乙酰化之外，IL-2突变蛋白在一个或多个赖氨酸残基处乙酰化，例如通过与赖氨酸乙酰转移酶的酶促反应。参见，例如，Choudhary等(2009)Science 325(5942)：834L2 ortho840。
Fc融合体
在一些实施方式中，IL2融合蛋白可以纳入来源于IgG抗体亚类的Fc区，其缺乏IgG重链可变区。″Fc区″可以是天然存在或合成的多肽，其与用木瓜蛋白酶消化IgG产生的IgGC-末端结构域同源。IgG Fc的分子量约为50kDa。突变的IL-2多肽可以包含整个Fc区，或保留延长其作为嵌合多肽的部分的循环半衰期能力的较小部分。此外，全长或片段的Fc区可以是野生型分子的变体。即，它们可以包含可能影响或不影响多肽功能的突变；正如下文进一步描述的那样，在所有情况下都不需要或不希望有天然活性。在某些实施方式中，IL-2突变蛋白融合蛋白(如本文所述的IL-2部分激动剂或拮抗剂)包括IgGl、IgG2、IgG3或IgG4 Fc区。示例性Fc区可以包括抑制补体固定和Fc受体结合的突变，或者它可以是裂解性的，即能够结合补体或通过另一种机制如抗体依赖性补体裂解(ADCC)来裂解细胞。
在一些实施方式中，正交IL2包含Fc融合体嵌合多肽分子的功能域。Fc融合体偶联物已被证明可以增加生物药物的全身半衰期，因此，生物药物产品可以不需要频繁给药。Fc结合至衬垫在血管的内皮细胞中的新生Fc受体(FcRn)，结合后，Fc融合分子被保护，不被降解并重新释放到循环中，使分子在循环中保持更长的时间。这种Fc结合被认为是内源性IgG保持其长血浆半衰期的机制。最近的Fc融合体技术将一份生物药物的单拷贝连接至抗体的Fc区，与传统的Fc融合体偶联物相比，优化了生物药物的药代动力学和药效动力学特性。用于制备Fc融合体的″Fc区″可以是天然存在或合成的多肽，其与用木瓜蛋白酶消化IgG产生的IgG C-末端结构域同源。IgG Fc的分子量约为50kDa。正交IL-2可以提供整个Fc区，或保留延长其作为嵌合多肽的循环半衰期能力的较小部分。此外，全长或片段的Fc区可以是野生型分子的变体。在一个典型的呈现中，二聚体Fc的每个单体携带异源多肽，异源多肽是相同或不同的。
在一些实施方式中，当正交IL2要以Fc融合体的形式给予时，特别是在那些偶联至Fc二聚体的各个亚单位的多肽链不同的情况下，Fc融合体可以被工程改造为具有“钮入孔(knob-into-hole)修饰”。钮入孔修饰更全面地描述于Ridgway，等(1996)《蛋白质工程改造》(Protein Engineering)9(7)：617-621和1998年3月24日授权的美国专利号5，731，168。钮入孔修饰是指在CH3结构域中两个免疫球蛋白重链之间界面的修饰，其中：i)在第一条重链的CH3结构域中，氨基酸残基被具有较大侧链的氨基酸残基(例如，酪氨酸或色氨酸)替代，从表面产生突起(“钮”)和ii)在第二条重链的CH3结构域中，氨基酸残基被具有较小侧链的氨基酸残基(如丙氨酸或苏氨酸)替代，从而在第二CH3结构域的界面内产生空腔(“孔”)，其中第一CH3结构域的突出侧链(“钮”)被第二CH3结构域中的空腔接收。在一个实施方式中，“钮入孔修饰”包括抗体重链之一中的氨基酸取代T366W和任选地氨基酸取代S354C，和另一个抗体重链中的氨基酸取代T366S、L368A、Y407V和任选地Y349C。此外，Fc结构域可以通过在S354和Y349位置引入半胱氨酸残基进行修饰，从而在Fe区的两个抗体重链之间产生稳定的二硫键(Carter，等(2001)Immunol Methods 248，7-15)。钮入孔形式用于促进在具有“钮”修饰的第一Fc单体上第一多肽(如正交IL2)的表达和在具有“孔”修饰的第二Fc单体上的第二多肽的表达，以促进异二聚体多肽偶联物的表达。
Fc区可以是″溶解性″或″非溶解性″的，但通常是非溶解性的。非溶解性Fc区通常缺乏高亲和力Fc受体结合位点和Clq结合位点。鼠IgG Fc的高亲和力Fc受体结合位点包括IgG Fc第235位的Leu残基。因此，Fc受体结合位点可以通过突变或缺失Leu235而被抑制。例如，用Glu取代Leu235抑制Fc区结合至高亲和力Fc受体的能力。通过突变或缺失IgG的Glu318、Lys 320和Lys 322残基，可以在功能上破坏鼠Clq结合位点。例如，用Ala残基取代Glu 318、Lys 320和Lys 322，使IgG1 Fc不能引导抗体依赖性补体裂解。与此相反，溶解性IgG Fc区具有高亲和力Fc受体结合位点和C1q结合位点。高亲和力的Fc受体结合位点包括IgG Fc的235位Leu残基，而Clq结合位点包括IgG 1的Glu 318、Lys 320和Lys 322残基。溶解性IgG Fc在这些位点具有野生型残基或保守的氨基酸取代。溶解性IgGFc可以针对细胞进行抗体依赖性细胞毒性或补体定向细胞溶解(CDC)。人IgG的适当突变也是已知的(参见，例如，Morrison等，The Immunologist 2：119-124，1994；和Brekke等，The Immunologist 2∶125，1994)。
在某些实施方式中，本发明的正交IL2的氨基或羧基末端可与免疫球蛋白Fc区(如人Fc)融合，形成融合体偶联物(或融合分子)。Fc融合体偶联物已被证明可以增加生物药物的全身半衰期，因此，生物药物产品可以不需要频繁给药。Fc结合至衬垫在血管的内皮细胞中的新生Fc受体(FcRn)，结合后，Fc融合分子被保护，不被降解并重新释放到循环中，使分子在循环中保持更长的时间。这种Fc结合被认为是内源性IgG保持其长血浆半衰期的机制。最近的Fc融合体技术将一份生物药物的单拷贝连接至抗体的Fc区，与传统的Fc融合体偶联物相比，优化了生物药物的药代动力学和药效动力学特性。
在一些实施方式中，Fc结构域单体包括相对于野生型人IgG1、IgG2或IgG4 Fc区域的至少一个突变，如美国专利号US10259859B2所述，其全部指导通过引用纳入本文。如本文所公开的，Fc结构域单体包括：
(a)相对于野生型人IgG1的下列氨基酸取代之一：T366W、T366S、L368A、Y407V、T366Y、T394W、F405W、Y349T、Y349E、Y349V、L351T、L351H、L351N、L351K、P353S、S354D、D356K、D356R、D356S、E357K、E357R、E357Q、S364A、T366E、L368T、L368Y、L368E、K370E、K370D、K370Q、K392E、K392D、T394N、P395N、P396T、V397T、V397Q、L398T、D399K、D399R、D399N、F405T、F405H、F405R、Y407T、Y407H、Y407I、K409E、K409D、K409T或K409I；
或
(b)(i)N297A突变，相对于人IgG1 Fc区；
(ii)L234A、L235A和G237A突变，相对于人IgG1 Fc区；
(iii)L234A、L235A、G237A和N297A突变，相对于人IgG1 Fc区；
(iv)N297A突变，相对于人IgG2 Fc区；
(v)A330S和P331S突变，相对于人IgG2 Fc区；
(vi)A330S、P331S和N297A突变，相对于人IgG2 Fc区；
(vii)S228P、E233P、F234V、L235A和delG236突变，相对于人IgG4Fc区；或
(viii)S228P、E233P、F234V、L235A、delG236和N297A突变，相对于人IgG4 Fc区。
在一些实施方式中，Fc结构域单体包括：
(a)相对于野生型人IgG1的下列氨基酸取代之一：T366W、T366S、L368A、Y407V、T366Y、T394W、F405W、Y349T、Y349E、Y349V、L35IT、L351H、L351N、L351K、P353S、S354D、D356K、D356R、D356S、E357K、E357R、E357Q、S364A、T366E、L368T、L368Y、L368E、K370E、K370D、K370Q.K392E、K392D、T394N、P395N、P396T、V397T、V397Q、L398T、D399K、D399R、D399N、F405T、F405H、F405R、Y407T、Y407H、Y407I、K409E、K409D、K409T或K409I；
以及
(b)Fc结构域单体进一步包括
(i)N297A突变，相对于人IgG1 Fc区；
(ii)L234A、L235A和G237A突变，相对于人IgG1 Fc区；
(iii)L234A、L235A、G237A和N297A突变，相对于人IgG1 Fc区；
(iv)N297A突变，相对于人IgG2 Fc区；
(v)A330S和P331S突变，相对于人IgG2 Fc区；
(vi)A330S、P331S和N297A突变，相对于人IgG2 Fc区；
(vii)S228P、E233P、F234V、L235A和delG236突变，相对于人IgG4Fc区；或
(viii)S228P、E233P、F234V、L235A、delG236和N297A突变，相对于人IgG4 Fc区。
在一些实施方式中，与具有野生型人IgG Fc区的多肽相比，该多肽在吞噬试验中表现出吞噬作用的降低。在一些实施方式中，Fc结构域单体连接至包含第二Fc结构域单体的第二多肽，形成Fc结构域二聚体。
嵌合多肽/融合蛋白
在一些实施方式中，正交IL2可以包含嵌合多肽的功能域。本发明的正交IL2融合蛋白可以通过本领域已知的技术通过重组DNA方法容易地生产，通过构建重组载体，该载体包含核酸序列，该核酸序列包括在框内的编码正交IL2的核酸序列与编码正交IL2的N-末端或C-末端融合伴侣的核酸序列，该序列可任选地进一步包括在框内的编码接头或间隔子多肽的核酸序列。
Flag标签
在其他的实施方式中，正交IL2可以被修饰为包括功能为抗原标签的其他多肽序列，例如FLAG序列。如本文所述，FLAG序列可被生物素化、高特异性的抗-FLAG抗体识别(参见例如，Blanar等(1992)Science256：1014和LeClair，等(1992)PNAS-USA 89∶8145)。在一些实施方式中，正交IL2多肽进一步包括C-末端的c-myc表位标签。
His标签
在一些实施方式中，本发明的正交IL2(包括这种正交IL2的融合蛋白)被表达为具有一个或多个过渡金属螯合多肽序列的融合蛋白。纳入这种过渡金属螯合结构域促进纯化固定化金属亲和层析(IMAC)，如Smith等1986年2月11日授权的美国专利第4,569,794号所述。在本发明的实践中有用的过渡金属螯合多肽的例子描述于Smith等(同上)以及Dobeli等的1995年5月10日授权的美国专利第5,320,663号，其中的全部教导通过引用纳入此处。特别的在本发明的实践中有用的过渡金属螯合多肽是包含3-6个连续的组氨酸残基的肽，例如6-组氨酸肽(His)6，在本领域经常被称为“His-标签”。
靶向的正交IL2融合蛋白：
在一些实施方式中，正交IL2被提供为具有多肽序列(“靶向结构域”)的融合蛋白，以促进选择性地结合到特定的表达特异性结合至这种靶向域的细胞表面分子的细胞类型或组织，任选地在正交IL2序列和融合蛋白的靶向结构域序列之间纳入1-40(或2-20、或5-20、或10-20)个氨基酸的接头分子。
在其他实施方式中，可以产生包含突变IL-2和其抗体或抗原结合部分的嵌合多肽。嵌合蛋白的抗体或抗原结合组分可以作为靶向部分。例如，它可以用来将嵌合蛋白定位到特定的细胞亚群或靶分子。产生细胞因子-抗体嵌合多肽的方法描述于，例如，美国专利号6,617,135。
在一些实施方式中，正交IL2融合蛋白的靶向结构域特异性地结合至肿瘤细胞的细胞表面分子。在一个实施方式中，其中CAR-T细胞的CAR-T细胞的ECD特异性地结合至CD-19，正交IL2可以作为具有CD-19靶向部分的融合蛋白提供。例如，在一个实施方式中，其中CAR-T细胞的CAR的ECD是提供特异性结合至CD-19的scFv分子，正交IL2作为与CD-19靶向部分(例如特异性结合至CD-19的单链抗体(例如scFv或VHH))的融合蛋白提供。
在一些实施方式中，融合蛋白包括IL-2突变蛋白和抗-CD19 sdFv FMC63(Nicholson，等(1997)Mol Immunol 34：11571165)。类似地，在一些实施方式中，其中CAR-T细胞的CAR的ECD特异性结合至BCMA，正交IL2作为与BCMA靶向部分的融合蛋白提供，所述靶向部分例如包含Kalled等(美国专利9,034,324，2015年5月9日授权)所述的抗BMCA抗体的CDR的抗体或包含Brogdon等(美国专利号10,174,095，2019年1月8日授权)所述的CDR的抗体。在一些实施方式中，正交IL2作为与GD2靶向部分的融合蛋白提供，所述靶向部分例如包含Cheung等(美国专利号9,315,585,2016年4月19日授权)所述CDR，或来自ME36.1(Thurin等，(1987)CancerResearch 47∶1229-1233)、14G2a、3F8(Cheung等，1985CancerResearch45：2642-2649)、hu14.18、8B6、2E12或ic9的CDR的抗体。
在替代性实施方式中，本发明的靶向正交IL2可与CAR-T细胞疗法组合给予，以提供基于CAR-T细胞的胞外受体的正交IL2至CAR-T细胞的靶向递送，例如通过和抗-FMC63抗体，以将IL2活性靶向CAR-T细胞，并再生体内耗尽的CAR-T细胞。因此，本公开的实施方式包括通过将这种正交IL2偶联至设计为与CAR-T细胞的特定细胞表面分子相互作用的抗体或配体来靶向递送正交IL2。这种分子的例子是抗-FMC63-正交IL2。
在其他实施方式中，嵌合多肽包括突变IL-2多肽和异源多肽，其功能为增强突变IL-2多肽的表达或指导细胞定位，例如Aga2p凝集素亚基(参见，例如，Boder和Wittrup，Nature Biotechnol.15：553-7，1997)。
蛋白转导结构域融合蛋白
在一些实施方式中，正交IL2进一步包括“蛋白转导结构域”或“PTD”。PTD是多肽、多核苷酸、碳水化合物、或有机或无机分子，其有利于穿越脂质双分子层、胶束、细胞膜、细胞器膜或囊泡膜。PTD纳入正交IL2有利于分子穿越膜。在一些实施方式中，PTD共价连接至正交IL2的氨基或羧基末端。在一些实施方式中，PTD作为PTD-正交IL2融合蛋白的部分，位于分子的N末端或C末端。
示例性的蛋白转导结构包括但不限于最小的十肽蛋白转导结构域(对应于HIV-1TAT的残基47-57)；聚精氨酸序列，其包括足以指导进入细胞的精氨酸残基数量(例如，3、4、5、6、7、8、9、10或10-50个精氨酸)；VP22结构域(Zender等(2002)Cancer Gene Ther.9(6)：489-96)；果蝇触角足突变Drosophila Antennapedia)蛋白转导结构域(Noguchi等(2003)Diabetes52(7)：1732-1737)；截短的人降血钙素肽(Trehin等(2004)Pharm.Research21：1248-1256)；聚赖氨酸(Wender等(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA97∶13003-13008)、转运蛋白(如描述于Wierzbicki，等，(2014)FolioHistomchemica etCytobiologica 52(4)：270-280和Pooga，等(1998)FASEB J12(1)67-77且可以商购自AnaSpec，目录号AS-61256)；KALA(如描述于Wyman等，(1997)Biochemistry 36(10)3008-3017且可商购自AnaSpec，目录号AS-65459)；触角足突变肽(如描述于Pietersz等，(2001)Vaccine19：1397且可商购自AnaSpec，目录号AS-61032)；TAT47-57(可商购自AnaSpec，目录号AS-60023)。
在一些实施方式中，IL-2偶联物在人对象体内的血浆半衰期大于4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、12小时、18小时、24小时、2天、3天、4天、5天、6天、7天、10天、14天、或30天。
修饰的CD122的正交IL2特异性构造
STAT3结合基序可以位于胞内结构域的C-末端，或作为人CD122(例如，人正交CD122或天然人CD122)的内部序列。
包含融合至人CD122的C-末端的一个或多个STAT3结合基序的修饰的CD122实施方 式
在一些情况下，修饰的人CD122包含一个或多个融合至人CD122的胞内结构域的C-末端的STAT3结合基序。人CD122可以是天然人CD122(SEQ ID NO：1)或上文公开的正交人CD122。
表1示例性融合蛋白，如下：
Figure BDA0003744535820000521
Figure BDA0003744535820000531
术语“正交-CD122”是指本文公开的任何正交人CD122蛋白质。
在一些情况下，修饰的人CD122包含STAT3结合基序，其通过接头连接至人CD122。接头可以来自天然存在的蛋白质或合成序列。设计接头的方法在本领域是众所周知的，例如描述于Chen等Adv.Drug.Deliv.Rev.2013年10月15日；65(10)：13571369，其相关部分通过引用纳入本文。在一些情况下，接头由1-20个氨基酸残基、1-10个氨基酸残基或1-5个氨基酸残基组成。在一些实施方式中，接头包括二核苷酸Gn，其中n可以是1-10，或1-5，例如2-4。
修饰的人CD122可包含一个或多个STAT3结合基序和一个或多个接头序列。所述接头序列可以连接人CD122和STAT3结合基序之一或连接单独的STAT3结合基序。一个或多个接头序列可以有相同或不同的序列。
包括STAT3识别基序作为CD122胞内结构域的内部序列的修饰的CD122实施方式。
在一些实施方式中，一个或多个STAT3结合基序作为CD122的内部(即，不在C或N末端)序列存在。这种构造的修饰的人CD122可以通过在天然人CD122或人正交CD122编码序列中鉴定合适的区来产生，该区可以被突变以编码STAT3结合基序。在一个实施方式中，该区具有类似于STAT3结合基序的序列，例如，包含以酪氨酸残基开始的四核苷酸序列的区。天然人CD122中的一个这样的区编码YFTYDPYSEE的序列，其位于天然人CD122蛋白的355位和364位之间。在一些实施方式中，该区中包含的YFTY、YDPY或YSEE中的一个或两个被STAT3识别基序取代，以产生本文所公开的修饰的人CD122。
修饰的人CD122在结合至同源IL2配体后能够诱导STAT3和STAT5信号转导，这种能力可以通过例如检测STAT3和STAT5的磷酸化来证实。例如，可以在T细胞中引入并表达修饰的人CD122，并使用对磷酸化-STAT5和磷酸化-STAT3特异的抗体来检测STAT3和STAT5的磷酸化。一种检测重组蛋白诱导STAT3和STAT5信号转导能力的示例性方法描述于Kagoya等Nat Med.2018年3月；24(3)：352-359.doi：10.1038/nm.4478，于第7页。
多核苷酸和表达载体
编码修饰的人CD122的多核苷酸可以使用本领域众所周知的技术生产。在一些情况下，修饰的人CD122可以通过任何常规方法生产，包括重组或固相合成。在一些实施方式中，修饰的人CD122通过重组方法生产。编码的核酸序列在表达载体上被引入待工程改造的细胞中。编码修饰的人正交CD122的DNA可以按照工程改造过程中的设计从多种来源获得。如本文所述，通过在编码序列中引入适当的核苷酸变化，来制备产生本发明的修饰的人CD122的天然人CD122多肽的氨基酸序列变体。这种变体表示所指出的残基的插入、取代和/或特异性缺失。插入、取代和/或特异性缺失的任何组合都可以得到最终的构建体，只要最终的构建体拥有本文定义的所需生物活性。
为了表达修饰的CD122，将编码修饰的CD122的核酸插入可复制的载体中进行表达。许多这种载体是可用的。载体组分通常包括但不限于以下一个或多个：复制起点，一个或多个标志物基因，增强子元件、启动子和转录终止序列。载体包括病毒载体、质粒载体、整合载体等。质粒是非病毒载体的例子。为了促进目标细胞的转染，目标细胞可以直接暴露于非病毒载体，可以在有利于摄取非病毒载体的条件下。促进哺乳动物细胞摄取外源核酸的条件的例子在本领域是众所周知的，包括但不限于化学手段(例如
Figure BDA0003744535820000541
赛默飞世尔科技(Thermo-Fisher Scientific))，高盐和磁场(电穿孔)。
修饰的CD122不仅可以直接重组生产，而且可以作为与异源多肽(例如信号序列或其他在成熟蛋白质或多肽的N-末端具有特定裂解位点的多肽)的融合多肽。通常，信号序列可以是载体的组分，也可以是插入到载体中的编码序列的部分。所选择的异源信号序列优选是被宿主细胞识别和处理(即被信号肽酶裂解)的序列。在哺乳动物细胞表达中，可以使用天然信号序列，或其他哺乳动物信号序列是合适的，例如来自相同或相关物种的分泌多肽的信号序列，以及病毒分泌前导，例如单纯疱疹gD信号。
还提供了表达载体，其可用于将编码修饰的CD122的多核苷酸引入细胞中。多种载体是本领域已知的可用于此目的，例如，病毒载体、质粒载体、小环载体。表达载体通常包含选择基因，也被称为可选择标志物。该基因编码在选择性培养基中生长的转化宿主细胞的存活或生长所必需的蛋白质。未用含有选择基因的载体转化的宿主细胞无法在培养基中存活。典型的选择基因编码蛋白质，其将(a)对抗生素或其他毒素例如氨苄青霉素、新霉素、甲氨蝶呤或四环素赋予抗性；(b)弥补营养缺陷型缺陷；或(c)提供无法从复合培养基中获得的关键营养素。
表达载体将包含被宿主生物体识别的启动子，并可操作地连接至正交蛋白质编码序列。启动子是位于结构基因起始密码子上游(5′)的非翻译序列(通常在约100到1000bp内)，其控制与其可操作地连接的特定核酸序列的转录和翻译。这种启动子通常分为两类，诱导型的和组成型的。诱导型启动子是对培养条件的某些变化(如营养物的存在或不存在或温度的变化)反应，从其控制下的DNA启动增加转录水平的启动子。多种潜在的宿主细胞所识别的大量启动子是众所周知的。
哺乳动物宿主细胞中载体的转录可以被控制，由，例如，从病毒基因组中获得的启动子，例如多瘤病毒、牛痘病毒、腺病毒(如人类腺病毒血清型5)、牛乳头瘤病毒、禽肉瘤病毒、巨细胞病毒、逆转录病毒(如鼠干细胞病毒)、乙肝病毒和最理想的猿猴病毒40(SV40)，来自异源哺乳动物的启动子，例如，肌动蛋白启动子、PGK(磷酸甘油酸激酶)或免疫球蛋白启动子，来自热休克启动子，只要这些启动子与宿主细胞系统相容。SV40病毒的早期和晚期启动子可方便地作为SV40限制性片段获得，该片段也含有SV40病毒的复制起点。
高等真核生物的转录通常通过在载体中插入增强子序列来增加。增强子是DNA的顺式作用元件，通常约为10至300bp，它作用于启动子以增加其转录。增强子的取向和位置相对独立，在转录单元的5′和3′处、内含子内以及编码序列本身内都有发现。现在已经从哺乳动物基因(珠蛋白、弹性蛋白酶、白蛋白、甲胎蛋白和胰岛素)中得知了许多增强子序列。然而，通常人们会使用来自真核细胞病毒的增强子。例子包括复制起点后侧的SV40增强子、巨细胞病毒早期启动子增强子、复制起点后侧的多瘤增强子和腺病毒增强子。增强子可以被剪接到表达载体中编码序列的5′或3′的位置，但优选是位于离启动子5′的位置。用于真核宿主细胞的表达载体还将包含用于终止转录和用于稳定化mRNA所必需的序列。这种序列通常可以从真核生物或病毒DNA或cDNA的5′，偶尔3′非翻译区获得。含有一个或多个上述组分的合适载体的构建采用了标准技术。
用于克隆或表达修饰的CD122的编码序列的合适宿主细胞是上述的原核细胞、酵母或高等真核细胞。在一些实施方式中，宿主细胞是人免疫细胞，例如，T细胞。在一些实施方式中，宿主细胞是CAR-T细胞，如下文进一步描述。
在一些实施方式中，宿主细胞是哺乳动物宿主细胞系，例如，小鼠L细胞(L-M[TK-]，ATCC号CRL-2648)、由SV40转化的猴肾CV1细胞系(COS-7，ATCC CRL 1651)；人胚胎肾细胞系(293或293细胞亚克隆，在悬浮培养中生长；幼仓鼠肾细胞(BHK，ATCC CCL 10)；中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR(CHO)；小鼠塞尔托利氏细胞(TM4)；猴肾细胞(CV1 ATCC CCL70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)；人宫颈癌细胞(HELA，ATCC CCL 2)；犬肾细胞(MDCK，ATCC CCL 34)；水牛鼠肝细胞(BRL 3A，ATCC CRL 1442)；人肺细胞(W138，ATCC CCL75)；人肝细胞(Hep G2，HB8065)；小鼠乳腺肿瘤(MMT 060562，ATCC CCL51)；TRI细胞；MRC 5细胞；FS4细胞和人肝癌细胞系(Hep G2)。
包含修饰的CD122的编码序列的宿主细胞可以在被改良为适合用于诱导启动子、选择转化子或扩增编码所需序列的基因的常规营养培养基中培养。哺乳动物宿主细胞可以在多种培养基中培养。市售可得的培养基如汉姆氏F10(Ham′s F10)(西格玛(Sigma))、最小必需培养基((MEM)，西格玛)、RPMI 1640(西格玛)和达氏改良的伊氏培养基((DMEM)，西格玛)都适合培养宿主细胞。任何这些培养基可根据需要补充激素和/或其他生长因子(例如胰岛素、转铁蛋白或表皮生长因子)、盐类(如氯化钠、钙、镁和磷酸盐)、缓冲剂(如HEPES)、核苷(如腺苷和胸苷)、抗生素、微量元素和葡萄糖或等同的能量来源。任何其他必需的补充剂也可以以本领域技术人员已知的适当浓度包含。培养条件，如温度、pH值等，是以前用于选择表达的宿主细胞的条件，对普通技术人员来说是显而易见的。
在一些实施方式中，宿主细胞，如T细胞，用包含编码修饰的CD122的核酸序列的表达载体转化。IL2配体(例如，正交IL2)可用于选择性扩增这种工程改造T细胞(例如，人T细胞)的方法，这些T细胞已被工程改造以表达相应的修饰的人CD122(例如，修饰的正交CD122)。用于以本文所述构建体进行工程改造的T细胞包括幼稚T细胞、中央记忆T细胞、效应记忆T细胞或其组合。上述用于工程改造的T细胞是从对象或供者处收集的，可以通过富集所需细胞的技术从细胞混合物中分离出来，或者可以不经分离而进行工程改造和培养。或者，用于工程改造的T细胞可以与其他细胞分离。提供精确分离的技术包括荧光激活细胞分选机。通过使用与死细胞相关的染料(如碘化丙啶)，可以对死细胞进行细胞选择。分离出的细胞可被收集在任何适当的培养基中，以保持细胞的活力，通常在收集管的底部有血清垫。多种培养基是市售可得的，可根据细胞的性质使用，包括dMEM、HBSS、dPBS、RPMI、Iscove氏培养基等，通常补充胎牛血清(FCS)。收集的和任选地富集的细胞群可立即用于遗传修饰，或可在液氮温度下冷冻并储存，解冻后能够重新使用。细胞通常会被储存在10％DMSO、50％FCS、40％RPMI 1640培养基中。
表达修饰的CD122的工程改造的免疫细胞
本文还提供了表达修饰的人CD122的免疫细胞。免疫细胞可以是，例如，T细胞(例如，CD4+细胞，Cd8+细胞)和NK细胞。在一些实施方式中，T细胞包括但不限于幼稚CD8+T细胞、细胞毒性CD8+T细胞、幼稚CD4+T细胞、辅助T细胞，例如TH1、TH2、TH9、TH11、TH22、TFH；调节性T细胞，例如TR1、Treg、诱导型Treg；记忆性T细胞，例如中心记忆T细胞、效应记忆T细胞、NKT细胞、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)和此类T细胞的工程改造变体，包括但不限于CAR-T细胞、重组修饰TIL和TCR工程改造细胞。在一些实施方式中，工程改造的细胞包括免疫细胞的复杂混合物，例如，从需要治疗的个体中分离的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)。参见，例如，Yang和Rosenberg(2016)Adv Immunol.130∶279-94，“(过继T细胞疗法用于癌症)Adoptive TCell Therapy for Cancer；Feldman等(2015)肿瘤学研讨会(Seminars in Oncol.)42(4)：626-39“过继细胞疗法-肿瘤-浸润淋巴细胞，T细胞受体和嵌合抗原受体(Adoptive CellTherapy-Tumor-InfiltratingLymphocytes，T-Cell Receptors，and Chimeric AntigenReceptors)”；Clinical Trial NCT01174121，“使用肿瘤浸润淋巴细胞的免疫疗法用于患转移癌的患者(Immunotherapy Using Tumor Infiltrating Lymphocytes for PatientsWith Metastatic Cancer)”；Tran等(2014)Science 344(6184)641-645，“在上皮癌患者中基于突变-特异性CD4+T细胞的癌症免疫疗法(Cancer immunotherapy based onmutation-specific CD4+T cells in a patient withepithelial cancer)”。
CAR-T细胞
在一些实施方式中，工程改造的免疫细胞还表达嵌合抗原受体(CAR)。CAR允许免疫细胞能够结合至病变细胞(例如肿瘤细胞)上的抗原，从而能够特异性杀伤病变细胞。CAR的抗原结合结构域(ABD)可以是单价或多价的，包含特异性地结合至细胞表面肿瘤抗原的一个或多个(如1、2或3个)多肽序列(如scFv、VHH和/或配体配体)。在一些实施方式中，肿瘤抗原和包含选择性地结合至这种细胞表面肿瘤的ABD的CAR在本领域是已知的(参见，例如，Dotti，等，Immunol Rev.2014年1月；257(1)。本发明的方法和组合物与CAR疗法偶联使用，其中CAR的ABD特异性结合肿瘤抗原，包括但不限于CD123、CD19、CD20、BCMA、CD22、CD30、CD70、Lewis Y、GD3、GD3、间皮素、ROR CD44、CD171、EGP2、EphA2、ErbB2、ErbB3/4、FAP、FARIL11Ra、PSCA、PSMA和NCAM。与这些靶标反应的抗体在文献中是众所周知的，本领域的技术人员能够从这些抗体中分离出CDR，用于构建单链抗体的多肽序列(例如scFv、CDR移植的VHH等)，其可以被纳入CAR的ABD。
在本发明的一个实施方式中，工程改造免疫细胞是表达修饰的CD122的T细胞，同时表达嵌合抗原受体。该细胞被称为‘CAR-T’细胞。
CAR通常包括抗原结合结构域(ABD)，其可以特异性结合至靶细胞表面表达的抗原。ABD可以是任何多肽，其可以特异性结合至靶细胞表面表达的一个或多个抗原。CAR可以进一步包括跨膜结构域，将ABD(或接头，如果采用的话)接合至CAR的胞内胞质结构域。跨膜结构域由任何在真核细胞膜中热力学上稳定的多肽序列构成。跨膜结构域可以来自天然存在的跨膜蛋白的跨膜结构域，也可以是合成的。在设计合成的跨膜结构域时，优选使用有利于α-螺旋结构的氨基酸。用于构建CAR的跨膜结构域由约10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、22、23或24个有利于形成具有α-螺旋二级结构的氨基酸构成。具有有利于α-螺旋构象的氨基酸在本领域是众所周知的。参见，例如Pace，等(1998)BiophysicalJournal75：422-427。特别有利于α螺旋构象的氨基酸包括甲硫氨酸、丙氨酸、亮氨酸、谷氨酸和赖氨酸。在一些实施方式中，CAR跨膜结构域可来自于I型跨膜蛋白的跨膜结构域，如CD3ζ、CD4、CD8、CD28等。
CAR多肽的胞质结构域包括一个或多个胞内信号结构域。在一个实施方式中，胞内信号结构域包括在抗原受体接合后启动信号转导的T细胞受体(TCR)和共受体的胞质序列，以及其功能性衍生物和亚片段。胞质信号转导结构域，例如那些来自T细胞受体ζ-链的信号域，被用作CAR的部分，以在嵌合受体与靶抗原接合后产生刺激T淋巴细胞增殖和效应功能的信号。胞质信号转导结构域的例子包括但不限于CD27的胞质结构域、CD28的胞质结构域S、CD137的胞质结构域(也被称为4-1BB和TNFRSF9)、CD278的胞质结构域(也称为ICOS)，P13激酶的p110α、β或δ催化亚基、人CD3ζ-链，CD134的胞质结构域(也称为OX40和TNFRSF4)、FcεR1γ和β链、MB1(Igα)链、B29(Igβ)链等等)、CD3多肽(δ、Δ和ε)、syk家族酪氨酸激酶(Syk、ZAP 70等)、src家族酪氨酸激酶(Lck、Fyn、Lyn等)和其他参与T细胞转导的分子，如CD2、CD5和CD28。
在一些实施方式中，CAR还提供共刺激结构域。术语“共刺激结构域”，是指CAR的刺激结构域，通常是胞内结构域(endodomain)，其提供二级非特异性激活机制，通过该机制传播一级特异性刺激。共刺激结构域指的是CAR的部分，其能增强记忆细胞的增殖、生存或发育。共刺激的例子包括在通过T细胞受体的抗原特异性信号转导后，抗原非特异性T细胞共刺激，和在通过B细胞受体的信号转导后，抗原非特异性B细胞共刺激。共刺激，例如T细胞共刺激，以及所涉及的因素已描述于Chen和Flies.(2013)NatRev Immunol13(4)：227-42。在本发明的一些实施方式中，CSD包括一个或多个TNFR超家族成员，CD28、CD137(4-1BB)、CD134(OX40)、Dap10、CD27、CD2、CD5、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、Lck、TNFR-I、TNFR-II、Fas、CD30、CD40或其组合。
CAR通常称为第一代、第二代、第三代或第四代。术语第一代CAR指的是CAR其中的胞质结构域仅通过单个信号转导结构域传递来自抗原结合的信号，例如来自CD3ζ链或IgEFcεR1的高亲和力受体的信号转导结构域。该结构域包含一个或三个基于免疫受体酪氨酸的激活识别基序[ITAM]，用于抗原依赖的T细胞激活。基于ITAM的激活信号赋予T细胞对抗原结合反应进行裂解靶肿瘤细胞和分泌细胞因子的能力。第二代CAR除了CD3ζ信号外，还包括共刺激信号。递送的共刺激信号的共同递送增强细胞因子的分泌和CAR转导的T细胞诱导的抗肿瘤活性。共刺激结构域通常是相对于CD3ζ结构域的膜近端。第三代CAR包括三方信号转导结构域，例如包括CD28、CD3ζ、OX40或4-1BB信号转导区。在第四代，或“武装(armoredcar)”CAR T细胞被进一步修饰，以表达或阻断分子和/或受体，以增强免疫活性，例如表达IL-12、IL-18、IL-7和/或IL-10；4-1BB配体、CD-40配体。
包含可纳入本发明的CAR的胞内信号转导结构域的例子包括(氨基到羧基)：CD3ξ；CD28-41BB-CD3ζ；CD28-OX40-CD3ζ；CD28-41BBCD3ζ；41BB-CD-28--CD3ξ和41BB-CD3ξ。
本文使用的术语CAR还包括CAR变体，包括但不限于分裂CAR、开-开关CAR、双特异性或串联CAR、抑制性CAR(iCAR)和诱导多能干(iPS)CAR-T细胞。
术语“分裂CAR”是指CAR，其中CAR的胞外部分、ABD和胞质信号转导结构域存在于两个不同的分子上。CAR变体还包括开-开关CAR，其为条件性可激活的CAR，例如，包括分裂CAR，其中分裂CAR的两个部分的条件性异源二聚体是药理学受控的。CAR分子及其衍生物(即CAR变体)被描述于，例如，在PCT申请号US2014/016527、US1996/017060、US2013/063083中；Fedorov等Sci Transl Med(2013)；5(215)：215ra172；Glienke等Front Pharmacol(2015)6：21；Kakarla和Gottschalk 52Cancer J(2014)20(2)：151-5；Riddell等Cancer J(2014)20(2)：141-4；Pegram等Cancer J(2014)20(2)：127-33；Cheadle等Immunol Rev(2014)257(1)：91-106；Barrett等Annu Rev Med(2014)65：333-47；Sadelain等CancerDiscov(2013)3(4)：388-98；Cartellieri等，J Biomed Biotechnol(2010)956304；其公开内容通过引用全文纳入本文。
术语“双特异性或串联CAR”是指包含能够放大或抑制一级CAR的活性的二级CAR结合结构域的CAR。
术语“抑制性嵌合抗原受体”或“iCAR”在本文中可互换使用，指的是CAR其中结合iCAR使用双重抗原靶向，通过配备二级CAR结合结构域的抑制性信号转导结构域的第二抑制性受体的接合，关闭活性CAR的激活，导致一级CAR的激活的抑制。抑制性CAR(iCAR)设计为通过抑制性受体信号转导模块激活来调节CAR-T细胞活性。这种方法组合了两个CAR的活性，其中一个产生显性负信号，限制由激活受体激活的CAR-T细胞的反应。iCAR当结合至仅由正常组织表达的特异性抗原时，可以关闭抵消激活子CAR反应。通过这种方式，iCAR-T细胞可以区分癌细胞和健康细胞，并以抗原选择性的方式可逆地阻断转导的T细胞的功能。iCAR中的CTLA-4或PD-1胞内结构域触发T淋巴细胞上的抑制性信号，导致细胞因子产生减少，靶细胞裂解效率降低，淋巴细胞运动性改变。
术语“串联CAR”或“TanCAR”是指通过两个嵌合受体的接合介导T细胞的双特异性激活的CAR，这两个嵌合受体设计为对两个不同的肿瘤相关抗原的独立接合反应而递送刺激或共刺激性信号。
通常，嵌合抗原受体T-细胞(CAR-T细胞)是通过转导编码CAR的表达载体而重组修饰的T细胞，基本根据上述教导。
试剂盒
本发明还提供了可用于激活免疫细胞的试剂盒。在一些实施方式中，提供了包含编码修饰的人CD122的编码序列的载体，其中该编码序列可操作地连接至在所需细胞中活跃的启动子。多种载体是本领域已知的可用于此目的，例如，病毒载体、质粒载体、小环载体，其可以整合到靶细胞基因组中，或可以附加型维持。试剂盒中可以提供编码修饰CD122的载体，与编码结合至并激活受体的细胞因子的载体组合。在一些实施方式中，细胞因子的编码序列可操作地连接至高表达启动子，并被优化用于生产。在其他实施方式中，提供了一种试剂盒，其中编码正交受体的载体与同源细胞因子的纯化组合物一起提供，例如以单位剂量提供，包装用于给予患者。
离体激活方法
在一些实施方式中，本发明提供了一种刺激工程改造的免疫细胞的方法，所述免疫细胞表达包含一个或多个STAT3结合基序的修饰的人CD122，所述方法包括将所述免疫细胞与人IL2多肽接触，该多肽结合至修饰的人CD122，从而刺激工程改造的免疫细胞。
还提供了从包含工程改造的免疫细胞和天然免疫细胞的细胞群混合物中选择性激活工程改造的免疫细胞的方法，所述工程改造的免疫细胞表达修饰的人正交CD122，该方法包括使免疫细胞混合物与正交人IL2接触，后者特异性结合至修饰的正交人CD122，从而选择性地激活工程改造的免疫细胞。
治疗方法
在某些情况下，提供了一种治疗方法，该方法包括向有需要的对象引入如本发明提供的表达修饰的人CD122(例如，修饰的正交人CD122)的工程改造的细胞群。该工程改造的细胞群可以是离体工程改造的，通常对于对象是自体或同种异体的。在引入工程改造细胞群后，引入的工程改造细胞群在体内与同源的IL2配体(例如，IL2直向同源物)接触。
在一些情况下，对象患有癌症，工程改造的免疫细胞是表达修饰的人CD122(例如，修饰的正交人CD122)的CD8+T细胞。在一些情况下，对象患有自身免疫疾病，免疫细胞是表达修饰的人CD122的Treg细胞。在一些情况下，工程改造的免疫细胞是CAR-T细胞(例如CD8+T细胞或表达一个或多个CAR的Treg细胞)。
引入表达修饰的人CD122的免疫细胞
在一些实施方式中，工程改造的T细胞对于被治疗的个体是同种异体的。Graham等(2018)Cell 7(10)E155。在一些实施方式中同种异体工程改造T细胞是完全HLA匹配的。然而并非所有患者都具有完全匹配的供者，适合所有患者的独立于HLA类型的细胞产品提供了替代方案。
由于细胞产品可能由对象自身的T细胞组成，所以要给予对象的细胞群必然是可变的，而且对这种试剂的反应也可能不同。因此，鉴定细胞的最佳浓度涉及对治疗相关毒性的持续监测和管理。通常，至少将要给予1x106个细胞/kg，至少1x107个细胞/kg，至少1x108个细胞/kg，至少1x109个细胞/kg，至少1x1010个细胞/kg，或更多，通常受收集期间获得的T细胞数量限制。在一些情况下，患者在接受CAR-T细胞治疗之前，要接受药物免疫抑制或B细胞耗竭疗程。工程改造细胞可以在任何生理上可接受的介质中通过任何方便的给药途径输注给对象，通常是血管内，尽管其也可以通过其他途径引入细胞能够找到适合生长的部位。
如果T细胞是同种异体T细胞，这种细胞可以被修饰以减少移植物抗宿主病。例如，本发明的工程改造细胞可以是通过基因编辑技术实现TCRαβ受体敲除的。TCRαβ是异二聚体，α和β链都需要存在才能被表达。一个基因编码α链(TRAC)，2个基因编码β链，因此为此目的缺失TRAC基因座KO。许多不同的方法被用于完成此缺失，例如CRISPR/Cas9；兆核酸酶(meganuclease)；工程改造的I-CreI归巢内切核酸酶等。参见，例如，Eyquem等(2017)Nature 543：113-117，其中TRAC编码序列被CAR编码序列替代；和Georgiadis等(2018)M0l.Ther.26：1215-1227，其将CAR表达与TRAC破坏通过规律成簇的间隔短回文重复序列(CRISPR)/Cas9连接起来，而不直接将CAR纳入TRAC基因座。防止GVHD的替代性策略修饰T细胞以表达TCRαβ信号转导的抑制剂，例如使用CD3ζ的截短形式作为TCR抑制分子。
给予正交IL2
在引入表达修饰的人CD122的工程改造的免疫细胞群后，可以通过向对象给予编码同源IL2配体的核酸构建体来向对象提供同源IL2配体，以实现对象持续暴露于同源IL2配体。在一些情况下，工程改造的免疫细胞表达修饰的正交人CD122，引入编码同源正交IL2的重组载体，以为对象提供正交IL2的长期递送，并延长相应的工程改造以表达与这种正交IL2相缔合的同源正交受体的细胞的激活。
非病毒的：
在一个实施方式中，正交IL2可以以在非病毒递送系统中提供的非病毒载体中的正交IL2的核酸表达构建体的形式给予对象。非病毒递送系统通常是复合物以促进用核酸载物转导目标细胞，其中核酸与试剂复合，所述试剂例如阳离子脂质(DOTAP、DOTMA)、表面活性剂、生物制品(明胶、壳聚糖)、金属(金、磁铁)和合成聚合物(PLG、PEI、PAMAM)。非病毒递送系统的许多实施方式是本领域众所周知的，包括脂质载体系统(Lee等(1997)治疗性药物运载体系统的关键性综述(Critical Reviews of Therapeutic Drug CarrierSystems)14：173-206)；聚合物涂覆脂质体(Marin等，美国专利号5,213,804，授权于1993年5月25日；Woodle，等，美国专利号5,013,556，授权于1991年5月7日)；阳离子脂质体(Epand等，美国专利号5,283,185，授权于1994年2月1日；Jessee，J.A.，美国专利号5,578,475，授权于1996年11月26日；Rose等，美国专利号5,279,833，授权于1994年1月18日；Gebeyehu等，美国专利号5,334,761，授权于1994年8月2日)。在一个实施方式中，非病毒载体系统中编码IL2受体的核酸序列是在可调节启动子、诱导型启动子、组织特异性或肿瘤特异性启动子或时间调节启动子的控制下。
病毒载体：
在另一个实施方式中，正交IL2可以以编码正交IL2的病毒载体中核酸表达构建体的形式给予对象。术语“病毒载体”和“病毒”在本文中可互换使用，指任何没有蛋白质合成或能量产生机制的专性胞内寄生体。病毒基因组可以是含有脂质膜的蛋白质的包被结构的RNA或DNA。术语病毒和病毒载体在本文中可互换使用。在本发明的实践中有用的病毒包括重组修饰的包膜或非包膜DNA和RNA病毒，优选选自杆状病毒科(baculoviridiae)、细小病毒科(parvoviridiae)、微小RNA病毒科(picornoviridiae)、疱疹病毒科(herpesviridiae)、痘病毒科(poxviridae)或腺病毒科(adenoviridiae)。该病毒通过DNA重组技术修饰以包含表达外源性转基因(例如编码正交IL2的核酸序列)，并可被工程改造为复制缺陷型、条件性复制型或复制能力型。也可采用最小载体系统，其中病毒骨架仅包含病毒载体包装所需的序列，任选地包含转基因表达盒。术语“复制缺陷型”是指在野生型哺乳动物细胞中的复制高度减弱的载体。为了大量生产这种载体，通常通过与辅助病毒共转染或通过基因组修饰来补充缺失的功能，从而建立生产者细胞系。术语“复制能力型病毒载体”是指能够感染、DNA复制、包装和裂解受感染细胞的病毒载体。本文使用的术语“条件性复制型病毒载体”指的是有复制能力的载体，其被设计成在特定的细胞类型中实现选择性表达。这种条件性复制可以通过将组织特异性、肿瘤特异性或细胞类型特异性或其他选择性诱导的调控控制序列可操作性地连接至早期基因(如腺病毒载体的E1基因)来实现。用重组病毒或非病毒载体感染对象可以在对象中提供正交IL2的长期表达，并提供表达CD122正交受体的工程改造T细胞的连续选择性维持。在一个实施方式中，在病毒载体系统中编码IL2受体的核酸序列是在可调节启动子、诱导型启动子、组织特异性或肿瘤特异性启动子或时间调节启动子的控制下。
药物制剂
工程改造T细胞可以被提供在适合治疗用途(例如用于人治疗)的药物组合物中。包含这些细胞的治疗制剂可以冷冻，或用生理上可接受的运载体、赋形剂或稳定剂制备用于给药(《雷明顿药物科学》(Remington′s Pharmaceutical Sciences)第16版，Osol，A.Ed.(1980))，以水性溶液的形式。细胞将以符合良好医学实践的方式进行配制、确定剂量和给药。就此而言的考量因素包括所治疗的具体病症、所治疗的具体哺乳动物、患者个体临床状况、病因、试剂递送部位、给药方法、给药安排，以及医务人员所知的其它因素。
细胞可以通过任何合适的方式给药，通常是肠胃外。肠胃外输注包括肌内、静脉内(推注或缓慢输注)、动脉内、腹膜内、鞘内或皮下给予。在典型的实践中，工程改造T细胞可以在生理上可接受的介质中输注给对象，通常是血管内，尽管其也可以被引入任何其他方便的部位，在那里细胞可以找到适合生长的部位。通常，至少将要给予1x105个细胞/kg，至少1x106个细胞/kg，至少1x107个细胞/kg，至少1x108个细胞/kg，至少1x109个细胞/kg，或更多，通常受收集期间获得的T细胞数量限制。
例如，用于本方法实践中的工程改造免疫细胞的典型给药范围为每疗程每kg对象体重约1x105至5x108个活细胞。因此，根据体重调整后，每个疗程人对象给予活细胞的典型范围为约1x106至约1x1013个活细胞，或者约5x106至约5x1012个活细胞，或者约1x107至约1x1012个活细胞，或者约5x107到约1x1012个活细胞，或者约1x108到约1x1012个活细胞，或者约5x108到约1x1012个活细胞，或者约1x109到约1x1012个活细胞。在一个实施方式中，每个疗程细胞的剂量在2.5-5x109个活细胞的范围内。
疗程可以是单剂量或在一段时期内的多剂量。在一些实施方式中，细胞以单剂量给予。在一些实施方式中，在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、21、28、30、60、90、120或180天的时间内，以两次或更多次分剂量给予细胞。在这种分次给药方案中，工程改造细胞的数量在每次给药中可以是相同的，也可以以不同水平提供。在时间段内的多天给药方案可由熟练技术人员(如医生)提供，监测细胞的给予，考虑对象对治疗的反应，包括治疗的不良反应及其调节，如上文所述。
本发明的组合物和方法还提供了一种在没有事先淋巴清除的情况下用T细胞疗法(特别是CAR T细胞疗法)治疗对象的方法。淋巴清除通常与CAR T细胞疗法共同在对象中进行，因为随后给予混合细胞群和给予非特异性试剂(例如IL2)以扩增对象体内的工程改造细胞群，组合给予细胞治疗产品的行为，导致显著的全身性毒性(包括细胞因子释放综合征或“细胞因子风暴”)，这是因为通过给予导致广泛激活的试剂，以及细胞治疗产品本身中相当部分的非工程改造细胞，而导致免疫细胞广泛增殖和激活。本发明的方法和组合物通过以下两点(或其中之一)避免了这一重大障碍：当采用前述离体方法时，提供基本纯化的工程改造细胞群，基本上没有非工程改造细胞的污染，和/或用本发明的正交IL2选择性激活和扩增工程改造T细胞，这大大减少非特异性增殖剂如IL2的脱靶效应。
例如，在目前CAR-T细胞治疗的临床实践中，CAR-T细胞通常与淋巴清除(例如，通过给予阿仑单抗(单克隆抗-CD52)、嘌呤类似物等)组合给予，以促进CAR-T细胞在宿主免疫恢复之前的扩增。在一些实施方式中，CAR-T细胞可被修饰为对阿仑单抗具有抗性。在本发明的一个方面，目前采用的与CAR-T疗法相关联的淋巴清除可由表达本发明的CAR-T的正交配体避免或减少。如上所述，通常采用淋巴清除来实现CAR-T细胞的扩增。然而，淋巴清除也与CAR-T细胞治疗的主要副作用有关。由于正交配体提供了选择性扩增特定T细胞群的手段，可以减少在给予表达正交配体的CAR-T之前对淋巴清除的需要。本方法使CAR-T细胞治疗的实践在给予表达正交配体的CAR-T之前无需或减少了淋巴清除。
在一个实施方式中，本发明提供了一种治疗患有可通过CAR-T细胞疗法治疗的疾病、紊乱或病症(例如癌症)的对象的方法，其通过给予表达正交配体的CAR-T，在给予正交配体CAR-T之前不进行淋巴清除。在一个实施方式中，本发明提供了一种治疗哺乳动物对象的方法，该对象患有与异常细胞群(例如肿瘤)的存在有关的疾病、紊乱，所述细胞群特征为表达一种或多种表面抗原(例如一种或多种肿瘤抗原)，该方法包括以下步骤：(a)从该个体获得包含T细胞的生物样品；(b)富集生物样品中的T细胞；(c)用一个或多个表达载体转染T细胞，该载体包含编码CAR的核酸序列和编码正交CD122受体的核酸序列，CAR的抗原靶向结构域能够结合至异常细胞群上存在的至少一种抗原；(d)用正交IL2离体扩增表达正交受体的CAR-T细胞群；(e)给予哺乳动物药学有效量的表达正交受体的CAR-T细胞；以及(f)通过给予治疗有效量的正交IL2调节表达正交CD122受体的CAR-T细胞的生长，该IL2可选择性地结合至CAR-T细胞上表达的正交CD122受体。在一个实施方式中，上述方法与开始CAR-T细胞治疗疗程之前的哺乳动物的淋巴清除或免疫抑制相关联。在另一个实施方式中，上述方法是在没有对哺乳动物进行淋巴清除和/或免疫抑制的情况下实施的。
治疗组合：
本发明的组合物和方法可与其他治疗剂组合。例如，当要治疗的疾病、紊乱或病症是肿瘤性疾病(如癌症)时，本发明的方法可与传统的化学治疗剂或其他生物抗癌药物如检查点抑制剂(如PD1或PDL1抑制剂)或治疗性单克隆抗体(如阿瓦斯丁(Avastin)、赫赛汀)组合。
本领域中被鉴定为对治疗肿瘤性疾病有用的化学试剂的例子包括但不限于：必除癌(abitrexate)、阿霉素(adriamycin)、氟尿嘧啶(adrucil)、安吖啶(amsacrine)、天冬酰胺酶(asparaginase)、蒽环类(anthracyclines)、氮杂胞苷(azacitidine)、硫唑嘌呤(azathioprine)、必先优(bicnu)、硫酸博来霉素(blenoxane)、白消安(busulfan)、博来霉素(bleomycin)、开普拓(camptosar)、喜树碱(camptothecins)、卡铂(carboplatin)、卡莫司汀(carmustine)、柔红霉素(cerubidine)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、顺铂(cisplatin)、克拉屈滨(cladribine)、更生霉素(cosmegen)、阿糖胞苷(cytarabine)、赛德萨(cytosar)、环磷酰胺(cyclophosphamide)、癌得星(cytoxan)、放线菌素(dactinomycin)、多西他赛(docetaxel)、多柔比星(doxorubicin)、道诺霉素(daunorubicin)、(ellence)、门冬酰胺酶(elspar)、表柔比星(epirubicin)、依托泊苷(etoposide)、氟达拉滨(fludarabine)、氟尿嘧啶(fluorouracil)、福达华(fludara)、吉西他滨(gemcitabine)、健择(gemzar)、和美新(hycamtin)、羟基脲(hydroxyurea)、羟基脲(hydrea)、伊达比星(idamycin)、伊达比星(idarubicin)、异环磷酰胺(ifosfamide)、异环磷酰胺(ifex)、伊立替康(irinotecan)、兰快舒(lanvis)、瘤可宁(leukeran)、克拉屈滨(leustatin)、甲苯肼(matulane)、氮芥(mechlorethamine)、巯嘌呤(mercaptopurine)、甲氨蝶呤(methotrexate)、丝裂霉素(mitomycin)、米托蒽醌(mitoxantrone)、光神霉素(mithramycin)、丝裂霉素(mutamycin)、马利兰(myleran)、阿扎胞苷(mylosar)、诺维本(navelbine)、喷司他丁(nipent)、能灭瘤(novantrone)、长春新碱(oncovin)、奥沙利铂(oxaliplatin)、紫杉醇(paclitaxel)、铂尔定(paraplatin)、喷司他丁(pentostatin)、顺铂(platinol)、普卡霉素(plicamycin)、甲基苄肼(procarbazine)、巯基嘌呤(purinetho1)、雷替曲塞(ralitrexed)、泰素帝(taxotere)、紫杉醇(taxol)、替尼泊苷(teniposide)、硫鸟嘌呤(thioguanine)、拓优得(tomudex)、拓扑替康(topotecan)、戊柔比星(valrubicin)、长春碱(velban)、凡毕士(vepesid)、长春花碱(vinblastine)、长春地辛(vindesine)、长春新碱(vincristine)、长春瑞滨(vinorelbine)、VP-16和威猛(vumon)。
本发明的组合物可与一种或多种其他治疗剂组合给予，这些治疗剂选自下组：酪氨酸激酶抑制剂，例如甲磺酸伊马替尼(Imatinib mesylate)(作为
Figure BDA0003744535820000691
上市，也称为STI-571)、吉非替尼(
Figure BDA0003744535820000692
也称为ZD1839)、厄洛替尼(作为
Figure BDA0003744535820000693
上市)、索拉非尼
Figure BDA0003744535820000694
舒尼替尼
Figure BDA0003744535820000695
达沙替尼
Figure BDA0003744535820000696
拉帕替尼
Figure BDA0003744535820000697
尼洛替尼
Figure BDA0003744535820000698
和硼替佐米
Figure BDA0003744535820000699
Figure BDA00037445358200006910
(鲁索替尼)；Janus激酶抑制剂，如托法替尼；ALK抑制剂，如克唑替尼(crizotinib)；Bcl-2抑制剂，如奥巴克拉(obatoclax)、维纳妥拉(venclexta)和棉子酚(gossypo1)；FLT3抑制剂，例如米哚妥林(midostaurin)
Figure BDA00037445358200006911
IDH抑制剂，例如AG-221；PARP抑制剂，如伊尼帕利布(Iniparib)和奥拉帕尼(Olaparib)；PI3K抑制剂，如哌立福新(perifosine)；VEGF受体2抑制剂，如阿帕替尼；AN-152(AEZS-108)多柔比星连接至[D-Lys(6)]-LHRH；Braf抑制剂，如威罗非尼(vemurafenib)、达拉非尼(dabrafenib)和LGX818；MEK抑制剂，如曲美替尼(trametinib)；CDK抑制剂，例如PD-0332991和LEE011；Hsp90抑制剂，如盐霉素(salinomycin)；和/或小分子药物偶联物，如维他拉肽(Vintafolide)；丝氨酸/苏氨酸激酶抑制剂，如坦西莫司(Temsirolimus)
Figure BDA00037445358200006912
依维莫司(everolimus)
Figure BDA00037445358200006913
维莫非尼(Vemurafenib)
Figure BDA00037445358200006914
曲美替尼(Trametinib)(Mekinist)和达拉非尼(Dabrafenib)
Figure BDA00037445358200006915
在一些实施方式中，特别是在CAR的肿瘤抗原结合部分针对BCMA的情况下，工程改造的CAR-T细胞与γ-分泌酶抑制剂(GSI)组合给予，如描述于Pont等(2019)″γ-分泌酶抑制增加BCMA特异性嵌合抗原受体T细胞在多发性骨髓瘤中的疗效(γ-secretaseinhibition increases efficacy of BCMA-specific chimeric antigen receptor Tcells in multiple myeloma)″Blooddoi.org/10.1182/blood.2019000050。
本领域中鉴定的对治疗肿瘤性疾病有用的生物试剂的例子包括但不限于：细胞因子或细胞因子拮抗剂，例如IL-12、INFα或抗表皮生长因子受体、放疗、伊立替康；四氢叶酸抗代谢剂，例如培美曲塞；针对肿瘤抗原的抗体、单克隆抗体和毒素的复合物、T细胞助剂、骨髓移植、或抗原呈递细胞(例如树突状细胞治疗)、抗肿瘤疫苗、复制能力型病毒、信号传导抑制剂(如
Figure BDA00037445358200006916
或
Figure BDA00037445358200006917
)或免疫调节剂，以实现对肿瘤生长的补充或协同抑制、环氧合酶-2(COX-2)抑制剂、类固醇、TNF拮抗剂(如。
Figure BDA0003744535820000701
和
Figure BDA0003744535820000702
)、干扰素
Figure BDA0003744535820000703
和干扰素
Figure BDA0003744535820000704
以及本领域熟练的临床医生容易理解的已知化疗治疗方案中的上述一种或多种的组合。
可与工程改造细胞组合给予的肿瘤特异性单克隆抗体可包括但不限于利妥昔单抗(作为MabThera或Rituxan上市)、阿仑单抗、帕尼单抗、伊匹单抗(Yervoy)等。
在一些实施方式中，本发明的组合物和方法可与免疫检查点疗法组合。免疫检查点疗法的例子包括PD1结合至PDL1和/或PDL2的抑制剂。PD1至PDL1和/或PDL2的抑制剂是本领域内众所周知的。干扰PD1结合至PDL1和/或PDL2的市售可得的单克隆抗体的例子包括纳武单抗(
Figure BDA0003744535820000705
BMS-936558，MDX1106，商购自BristolMyers Squibb公司，新泽西州普林斯顿)，派姆单抗
Figure BDA0003744535820000706
MK-3475，兰姆单抗，商购自默克公司(Merck andCompany)，新泽西州肯尼尔沃斯)和阿特珠单抗(
Figure BDA0003744535820000707
基因泰克/罗氏(Genentech/Roche)，加利福尼亚州南旧金山)。PD1抑制性抗体的其他例子包括但不限于杜瓦鲁单抗(MEDI4736，阿斯利康/米迪缪尼(Medimmune/AstraZeneca))、匹利珠单抗(CT-011，CureTech)、PDR001(诺华(Novartis))、BMS-936559(MDX1105，Bristol Myers Squibb)，以及阿维鲁单抗(MSB0010718C，默克/辉瑞(Merck Serono/Pfizer))和SHR-1210(因赛特医疗(Incyte))。2012年7月10日授权的美国专利号8,217,149(基因泰克公司)、2012年5月1日授权的美国专利号8，168,757(默沙东(Merck Sharp andDohme Corp))、2011年8月30日授权的美国专利号8,008,449(美达莱(Medarex))、2011年5月17日授权的美国专利号7,943,743(美达莱公司)中描述了其他抗体PD1途径抑制剂。此外，小分子PD1至PDL1和/或PDL2的抑制剂是本领域内众所周知的。参见，例如Sasikumar，等的WO2016142833A1和Sasikumar，等WO2016142886A2，BMS-1166和BMS-1001(Skalniak，等(2017)Oncotarget 8(42)：72167-72181)。
实施例1.CD19CAR_T2 A_hoRb和CD19CAR_T2A_hoRB_GGVRHOT细胞的制备
本研究中使用的CD19嵌合抗原受体蛋白(以下称为“CD19_28z”)具有以下结构：GMCSF受体信号肽、FMC63抗-CD19 scFv、AAA接头、CD28铰链/跨膜/共刺激结构域和CD3ζ。CD19_28z的氨基酸序列如下：
MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSAAAIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(SEQ ID NO：24)
用于进行这些的正交T细胞是通过本领域已知的技术产生的，通过用慢病毒载体转染分离的T细胞，前述CD19_28z CAR，T2A接头多肽和具有以下氨基酸序列的人正交CD122正交受体(hoCD122)：
MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSAAAIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPGSGEGRGSLLTCGDVEENPGPMAAPALSWRLPLLILLLPLATSWASAAVNGTSQFTCFYNSRANISCVWSQDGALQDTSCQVHAWPDRRRWNQTCELLPVSQASWACNLILGAPDSQKLTTVDIVTLRVLCREGVRWRVMAIQDFKPFENLRLMAPISLQVVHVETHRCNISWEISQASDFFERHLEFEARTLSPGHTWEEAPLLTLKQKQEWICLETLTPDTQYEFQVRVKPLQGEFTTWSPWSQPLAFRTKPAALGKDTIPWLGHLLVGLSGAFGFIILVYLLINCRNTGPWLKKVLKCNTPDPSKFFSQLSSEHGGDVQKWLSSPFPSSSFSPGGLAPEISPLEVLERDKVTQLLLQQDKVPEPASLSSNHSLTSCFTNQGYFFFHLPDALEIEACQVYFTYDPYSEEDPDEGVAGAPTGSSPQPLQPLSGEDDAYCTFPSRDDLLLFSPSLLGGPSPPSTAPGGSGAGEERMPPSLQERVPRDWDPQPLGPPTPGVPDLVDFQPPPELVLREAGEEVPDAGPREGVSFPWSRPPGQGEFRALNARLPLNTDAYLSLQELQGQDPTHLV(SEQ ID NO：25)
也被称为CD19 CAR_T2A_hoRb对于具有野生型ICD的hoRB，以及对于包含以下氨基酸序列的hoRB：
MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSAAAIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPGSGEGRGSLLTCGDVEENPGPMAAPALSWRLPLLILLLPLATSWASAAVNGTSQFTCFYNSRANISCVWSQDGALQDTSCQVHAWPDRRRWNQTCELLPVSQASWACNLILGAPDSQKLTTVDIVTLRVLCREGVRWRVMAIQDFKPFENLRLMAPISLQVVHVETHRCNISWEISQASDFFERHLEFEARTLSPGHTWEEAPLLTLKQKQEWICLETLTPDTQYEFQVRVKPLQGEFTTWSPWSQPLAFRTKPAALGKDTIPWLGHLLVGLSGAFGFIILVYLLINCRNTGPWLKKVLKCNTPDPSKFFSQLSSEHGGDVQKWLSSPFPSSSFSPGGLAPEISPLEVLERDKVTQLLLQQDKVPEPASLSSNHSLTSCFTNQGYFFFHLPDALEIEACQVYFTYDPYSEEDPDEGVAGAPTGSSPQPLQPLSGEDDAYCTFPSRDDLLLFSPSLLGGPSPPSTAPGGSGAGEERMPPSLQERVPRDWDPQPLGPPTPGVPDLVDFQPPPELVLREAGEEVPDAGPREGVSFPWSRPPGQGEFRALNARLPLNTDAYLSLQELQGQDPTHLVGGYRHQ(SEQ ID NO：26)
使用T2A接头能够实现使用单个慢病毒质粒来产生正交CAR-T细胞。
用抗-CD3和抗-CD28抗体刺激原代CD4和CD8富集的T细胞，并在WT IL-2中生长，直到转导后2天。用编码CD19 CAR_T2A_hoRb或CD19CAR_T2A hoRb_GGYRHQ的慢病毒转导细胞。2天后，洗涤细胞并转换成包含40Kd PEG化的正交配体STK-009(100nM)的T细胞生长培养基。细胞以1E6个细胞/ml的T细胞培养基+STK-009的细胞密度维持，直到第10天收获细胞。
实施例2：正交配体STK-009
在这些研究中使用的hoCD122受体的正交同源配体(以下称为STK-009)是hIL2突变蛋白的化合物，包括缺失N-末端丙氨酸残基和包括氨基酸取代L18R、Q22E和Q126K(根据成熟的野生型hIL2编号)，通过用醛接头在N-末端脯氨酸残基上添加40kD的支链(2x20kD)PEG分子进一步修饰，该PEG分子是40kDa的2-臂支链PEG-醛，40kDA的PEG-醛包括两个20kDA的直链PEG分子(
Figure BDA0003744535820000731
GL2-400AL3，NOF美国公司(NOFAmerica Corporation)，北百老汇(One North Broadway)，纽约州白原市(WhitePlains，NY)10601USA。
实施例3.磷酸-信号转导试验：
用CD19CAR_T2A_hoRb或CD 19CAR_T2A hoRb_GGYRHQ稳定转导的T细胞在RPMI培养基+10％FBS中休息1小时。然后用WT IL-2或STK-009的剂量滴定刺激细胞20分钟，并对各种磷酸化抗原进行染色。然后对细胞进行流式细胞术分析。这些研究的结果在附图的图4和5中提供。如上所述，在CAR T细胞中的hoCD122受体上添加STAT3基序导致pERK、pS6K的激活增加和更高的pSTAT3的基线。
实施例4.细胞毒性共培养试验
用CD19 CAR_T2A_hoRb或CD19 CAR_T2A hoRb_GGYRHQ稳定转导的T细胞与CD19靶细胞系(Raji-荧光素酶)以指示的效应物比靶细胞(E：T)的比率共培养过夜。通过D-荧光素转化为光并通过生物发光读板器读板，评估细胞活力。数据显示为特异性裂解，计算方式为100％x(自发死亡RLU-测试RLU)/(自发死亡RLU-最大杀伤力RLU)。研究的结果示于附图图6。该数据表明，在CAR T细胞的正交受体上添加STAT3基序产生优异的细胞毒性活性。
将STAT3信号转导结构域添加到人正交Rb(hoRb，hoCD122)受体的胞内结构域的有益功能性效应在一系列研究中得到了证明，其以评估表达wthoCD122受体，以及修饰以将STAT3信号转导结构域(YRHQ)纳入到hoCD122的ICD羧基末端的hoCD122受体的细胞的作用。受体结构的图解见附图的图1。制备了稳定表达具有野生型ICD和STAT3修饰的ICD的hoRB受体的细胞系，并用野生型IL2和正交配体STK-009进行测试(实施例2)如图2和图3所示，带有野生型ICD的hoRB受体和STAT3修饰的ICD在修饰的细胞中具有功能。评估表达受体的细胞中多种磷酸化配体的表达，基本根据实施例3。结果在图4和图5中提供。如图4和5所示，在CAR T细胞中的hoCD122受体上添加STAT3基序导致pERK、pS6K的激活增加和更高的pSTAT3的基线水平。
为了评估表达STAT3修饰的正交CD122的CAR-T细胞的增强功效，在使用Raji肿瘤细胞系的细胞毒性实验中对CAR-T细胞进行了评估。与包含具有野生型CD122胞内结构域的正交CD122(hoRb)的CD19CAR T细胞构建体相比，STAT3对包含具有其他STAT3信号转导基序的正交CD122(horb)受体的CD19CAR T细胞构建体的细胞毒性的影响，以多种效应物：靶标(E：T；CART：Raji肿瘤细胞)的比率，基本根据实施例4的教导。研究的结果提供于附图图6。图6中的数据证明表达具有修饰成包含STAT3基序的胞内结构域(ICD)的hoRb的CD19CAR T细胞构建体，其针对Raji肿瘤细胞的细胞毒性比包含具有野生型CD122胞内结构域的正交CD122(horb)的CD19 CAR T细胞改进了。前述数据证明了本发明的STAT3基序修饰受体的有益性质。
现在已经完全描述了本发明，对于本领域的普通技术人员来说，显然可以做出许多改变和修改而不偏离本发明的构思或范围。
说明性序列：
SEQ ID NO：1(天然人CD122，成熟蛋白质)
AVNGTSQFTC FYNSRANISC VWSQDGALQD TSCQVHAWPDRRRWNQTCEL
LPVSQASWAC NLILGAPDSQ KLTTVDIVTL RVLCREGVRWRVMAIQDFKP
FENLRLMAPI SLQVVHVETH RCNISWEISQ ASHYFERHLEFEARTLSPGH
TWEEAPLLTL KQKQEWICLE TLTPDTQYEF QVRVKPLQGEFTTWSPWSQP
LAFRTKPAAL GKDTIPWLGH LLVGLSGAFG FIILVYLLINCRNTGPWLKK
VLKCNTPDPS KFFSQLSSEH GGDVQKWLSS PFPSSSFSPGGLAPEISPLE
VLERDKVTQL LLQQDKVPEP ASLSSNHSLTSCFTNQGYFF FHLPDALEIE
ACQVYFTYDP YSEEDPDEGV AGAPTGSSPQPLQPLSGEDD AYCTFPSRDD
LLLFSPSLLG GPSPPSTAPG GSGAGEERMP PSLQERVPRDWDPQPLGPPT
PGVPDLVDFQ PPPELVLREA GEEVPDAGPREGVSFPWSRP PGQGEFRALN
ARLPLNTDAY LSLQELQGQD PTHL
SEQ ID NO：2
APTSSSTKKT QLQLEHLLLD LQMILNGINN YKNPKLTRMLTFKFYMPKKA
TELKHLQCLE EELKPLEEVL NLAQ SKNFHL RPRDLISNINVIVLELKGSE
TTFMCEYADE TATIVEFLNR WITFCQSIIS TLT
SEQ ID NO：3
GGYLRQ
SEQ ID NO：4
GGYLKQ
SEQ ID NO：5
GGYRHQ
SEQ ID NO：6
GGYLRQ
SEQ ID NO：7
GGYFKQ
SEQ ID NO：8
GGYLPQ
SEQ ID NO：9
GGYMPQ
SEQ ID NO：10
GGYDKPH
SEQ ID NO：11
YLRQ
SEQ ID NO：12
YLKQ
SEQ ID NO：13
YRHQ
SEQ ID NO：14
YLRQ
SEQ ID NO：15
YFKQ
SEQ ID NO：16
YLPQ
SEQ ID NO：17
YMPQ
SEQ ID NO：18
YDKPH
SEQ ID NO：19
YX1X2L
SEQ ID NO:20
YLSL
SEQ ID NO：21
YX1X2Q
SEQ ID NO：22(天然人CD122，全长蛋白质)
开头下划线区为信号肽
MAAPALSWRLPLLILLLPLATSWASAAVNGTSOFTCFYNqRANISCVWSQDGALQDTSCQ
VHAWPDRRRWNQTCELLPVSQASWACNLILGAPDSQKLTTVDIVTLRVLCREGVRWRVMA
IQDFKPFENLRLMAPISLQVVHVETHRCNISWEISQASHYFERHLEFEARTLSPGHTWEE
APLLTLKQKQEWICLETLTPDTQYEFQVRVKPLQGEFTTWSPWSQPLAFRTKPAALGKDT
IPWLGHLLVGLSGAFGFIILVYLLINCRNTFPWLKKVLKCNTPDPSKFFSQLSSEHGGDV
QKWLSSPFPSSSFSPGGLAPEISPLEVLERDKVTQLLLQQDKVPEPASLSSNHSLTSCFT
NQGYFFFHLPDALEIEACQVYFTYDPYSEEDPDEGVAGAPTGSSPQPLQPLSGEDDAYCT
FPSRDDLLLFSPSLboLGGPSPPSTAPGGSGAGEERMPPSLQERVPRDWDPQPLGPPTPGVP
DLVDFQPPPELVLREAGEEVPDAGPREGVSFPWSRPPGQGEFRALNARLPLNTDAYLSLQ
ELQGQDPTHLV
SEQ ID NO：23
PTSSSTKKTQLQLSQLLVLLKAILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLT

Claims (42)

1.一种编码修饰的人CD122的多核苷酸，其中所述修饰的人CD122包括一个或多个STAT3结合基序。
2.如权利要求1所述的多核苷酸，其中所述修饰的人CD122包括融合至一个或多个STAT3结合基序的正交人CD122或天然人CD122。
3.如权利要求2所述的多核苷酸，其中所述正交人CD122是相对于天然人CD122在选自R41、R42、Q70、K71、T73、T74、V75、S132、H133、Y134、F135、E136和Q214的一个或多个残基处修饰的。
4.如权利要求2所述的多核苷酸，其中所述正交人CD122是相对于天然人CD122在H133和Y134处修饰的。
5.如权利要求1所述的多核苷酸，其中所述人CD122连接至两个或三个STAT3结合基序。
6.如权利要求1所述的多核苷酸，其中所述修饰的人CD122包括与SEQ ID NO：1至少90％同一性的序列，其中所述修饰的人CD122结合至天然IL2多肽或正交IL2多肽。
7.如权利要求1所述的多核苷酸，其中所述一个或多个STAT3结合基序包括YX1X2Q的序列，其中X1和X2是任何氨基酸。
8.如权利要求7所述的多核苷酸，其中所述X1选自下组：L、R、F、M，X2选自下组：R、K、H和P。
9.如权利要求7所述的多核苷酸，其中所述STAT3识别基序选自下组：
(a)YLRQ(SEQ ID NO：11)，
(b)YLKQ(SEQ ID NO：12)，
(c)YRHQ(SEQ ID NO：13)
(d)YLRQ(SEQ ID NO：14)，
(e)YFKQ(SEQ ID NO：15)，
(f)YLPQ(SEQ ID NO：16)，
(g)YMPQ(SEQ ID NO：17)，和
(h)YDKPH(SEQ ID NO：18)。
10.如权利要求1所述的多核苷酸，其中所述一个或多个STAT3结合基序被融合至所述天然人CD122或正交人CD122的胞内结构域的C-末端，任选地通过接头。
11.如权利要求1所述的多核苷酸，其中至少一个所述STAT3结合基序位于对应于天然人CD122的355位和364位之间，其中至少一个所述STAT3识别基序替换天然人CD122的YFTY、YDPY或YSEE的氨基酸序列。
12.如权利要求11所述的多核苷酸，其中所述修饰的人CD122是相对于天然人CD122在选自R41、R42、Q70、K71、T73、T74、V75、S132、H133、Y134、F135、E136和Q214的一个或多个残基处进一步修饰的。
13.如权利要求10所述的多核苷酸，其中所述接头包括二核苷酸GG。
14.如权利要求13所述的多核苷酸，其中所述修饰的CD122包括含有所述接头和至少一个STAT3结合基序的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列选白下组：
(i)GGYLRQ(SEQ ID NO：3)，
(a)GGYLKQ(SEQ ID NO：4)，
(b)GGYRHQ(SEQ ID NO：5)，
(c)GGYLRQ(SEQ ID NO：6)，
(d)GGYFKQ(SEQ ID NO：7)，
(e)GGYLPQ(SEQ ID NO：8)，
(f)GGYMPQ(SEQ ID NO：9)，和
(g)GGYDKPH(SEQ ID NO：10)。
15.一种包含如权利要求1-14中任一项所述的多核苷酸的表达载体。
16.一种包含权利要求1-14中任一项所述的多核苷酸的细胞。
17.如权利要求16所述的细胞，其中所述细胞进一步表达嵌合抗原受体(CAR)，其中所述细胞是人免疫细胞。
18.如权利要求17所述的细胞，其中所述CAR选自下组：CD19 CAR和BCMACAR。
19.一种用于选择性激活细胞内受体的试剂盒，所述试剂盒包括
(a)表达权利要求1中所述多核苷酸编码的修饰的人CD122的细胞，和
(b)人IL2多肽。
20.如权利要求19所述的试剂盒，其中所述修饰的人CD122包括SEQ ID NO：1编码的天然人CD122，其中所述人IL2多肽是SEQ ID NO：2编码的天然人IL2多肽。
21.如权利要求19所述的试剂盒，其中所述修饰的人CD122包括正交人CD122，其中所述人IL2多肽是正交人IL2多肽，其中所述正交人IL2多肽相较于天然人CD122优先结合至所述修饰的人CD122。
22.如权利要求21所述的试剂盒，其中所述正交人IL2多肽包含至少一个氨基酸取代，其由除了相对于天然人CD122残基T51、R81的位置处的天然人IL2多肽的氨基酸之外的氨基酸取代，或对应于天然人CD122M23的位置处包含丙氨酸，并且对应于天然人CD122E15、H16、L19和D20的每个位置处包含氨基酸取代。
23.如权利要求19所述的试剂盒，其中所述正交人IL2多肽在对应于天然人IL2选自以下的位置包含一个或多个氨基酸取代：[E15D、E15T、E15A、E15S]、[H16N、H16Q]、[L19V、L19I、L19A]、[D20L、D20M]、[Q22S、Q22T、Q22E、Q22K、Q22E]、[M23A、M23W、M23H、M23Y、M23F、M23Q、M23Y]、[G27K、G27S]、[R81D、R81Y]、[N88E、N88Q]、[T51I]。
24.如权利要求19所述的试剂盒，其中所述修饰的人CD122是由哺乳动物细胞表达的。
25.如权利要求24所述的试剂盒，其中所述哺乳动物细胞是免疫细胞。
26.如权利要求25所述的试剂盒，其中所述免疫细胞是T细胞。
27.如权利要求26所述的试剂盒，其中所述T细胞是嵌合抗原受体(CAR)-T细胞。
28.一种刺激免疫细胞的方法，所述免疫细胞表达包含一个或多个STAT3结合基序的修饰的人CD122，所述方法包括将所述免疫细胞与人IL2多肽接触。
29.如权利要求28所述的方法，其中所述刺激是离体进行的。
30.如权利要求28所述的方法，其中所述刺激是体内进行的。
31.如权利要求28所述的方法，其中所述修饰的人CD122包括融合至一个或多个STAT3结合基序的正交人CD122或天然人CD122。
32.如权利要求28所述的方法，其中所述至少一个STAT3结合基序位于对应于天然人CD122的381位和390位之间，其中所述至少一个STAT3结合基序替换天然人CD122的YFTY、YDPY或YSEE的氨基酸序列。
33.如权利要求30所述的方法，其中所述方法包括将表达包含一个或多个STAT3结合基序的修饰的人CD122的免疫细胞引入个体，并将人IL2多肽给予所述个体，从而激活所述个体中的免疫反应。
34.如权利要求33所述的方法，其中所述修饰的人CD122包括正交人CD122，其中所述人IL2多肽是正交人IL2多肽，其中所述正交人IL2多肽相较于天然人CD122优先结合至并激活所述修饰的人CD122。
35.如权利要求28所述的方法，其中所述一个或多个STAT3结合基序包括YX1X2Q的序列，其中X1和X2是任何氨基酸。
36.如权利要求35所述的方法，其中X1选自下组：L、R、F和M，X2选自下组：R、K、H和P。
37.如权利要求34所述的方法，其中所述正交人CD122包括选自下组的序列
GGYLRQ(SEQ ID NO：2)，
GGYLKQ(SEQ ID NO：3)
GGYRHQ(SEQ ID NO：4)
GGYLRQ(SEQ ID NO：5)
GGYFKQ(SEQ ID NO：6)
GGYLPQ(SEQ ID NO：7)
GGYMPQ(SEQ ID NO：8)，和
GGYDKPH(SEQ ID NO：9)。
38.如权利要求33所述的方法，其中，所述免疫细胞是T细胞。
39.如权利要求38所述的方法，其中所述T细胞是CAR-T细胞。
40.如权利要求33-39中任一项所述的方法，其中所述免疫细胞是CD8+T细胞，其中所述个体具有癌症。
41.如权利要求33-39中任一项所述的方法，其中所述免疫细胞是Treg细胞且其中所述个体具有自身免疫疾病。
42.如权利要求33-39中任一项所述的方法，其中所述个体具有病毒、细菌或真菌感染。
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