CN115011712A - 一种哈维氏弧菌感染的生物标志物 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物技术领域，公开了一种哈维氏弧菌感染的生物标志物，具体公开了一种哈维氏弧菌感染的生物标志物，所述生物标志物包括氨基肽酶、钙转运ATP酶、组蛋白H2B和组蛋白H2A中的至少一种。本发明在感染哈维氏弧菌的病鱼的细菌感染特征中，对海洋硬骨鱼半滑舌鳎粘液中的DEPs进行了鉴定和开发，并进过qRT‑PCR验证，结果表明氨肽酶和钙转运ATP酶显著上调，组蛋白H2B和组蛋白H2A显著下调，可上述4种蛋白作为生物标志物来鉴定硬骨鱼是否感染哈维氏弧菌。

Description

一种哈维氏弧菌感染的生物标志物
技术领域
本发明属生物技术领域，具体涉及一种哈维氏弧菌感染的生物标志物。
背景技术
粘液是抵抗不利环境的第一道天然屏障，与外部因素直接接触，在逆境阶段，粘液中分子成分的改变将为评估病理状态和过程提供一个指示性标准。同时，粘液是一种友好的样本类型，极易获得，几乎不会对宿主造成损害。粘液是一种来源于鱼体最大的组织—皮肤的外分泌体液，它含有多种特定的蛋白质和代谢物，这些蛋白质和代谢物具有特定的功能特征，这些功能特征具体描述了生物体的生理状态，这使得它在无创诊断和生理状态检测方面具有天然优势。
感染哈维氏弧菌的半滑弧菌的腐烂尾巴、皮肤溃疡和鳞片脱落都反映了皮肤粘膜屏障的破坏，因此感染哈维氏弧菌容易导致海鱼养殖业出现严重损失。作为第一道防线，鱼类表皮粘液富含多种蛋白质和多糖，包括许多免疫相关分子，如免疫球蛋白、C3、肌动蛋白、凝集素、组蛋白、溶菌酶、粘蛋白、热休克分子、超氧化物歧化酶和转铁蛋白。研究了鱼类皮肤粘液的组成及其在不同条件下的相对变化。现研究表明，在感染方面，当面临细菌或寄生虫入侵时，如黄鲶(Pelteobagrus fulvidraco)、褐斑石斑鱼(Epinephelusfuscoguttatus)、大西洋鳕鱼(Gadus morhua)、金枪鱼(Sparus aurata)、大安伯杰克(Seriola dumerili)和鲤鱼(Cyprinus carpio)等鱼类皮肤粘液的蛋白质组学图谱将发生改变；当用某些益生菌或昆虫幼虫喂养鱼类时，也观察到皮肤粘液中免疫蛋白的显著变化；正(有利)或负(不利)刺激干扰宿主皮肤粘液系统的稳态，导致部分硬骨鱼的外观表型、基因表达水平、酶活性和蛋白质组学特征发生不同程度的变化。上述研究表明皮肤粘液与鱼类的免疫和感染存在着密切相关。
蛋白质组研究经历了二维电泳、无标记LC/MS-MS、相对和绝对定量的等压标签(iTRAQ)和TMT从低通量和分辨率到高通量定量蛋白质组筛选的过程。其中iTRAQ分析是一种广泛应用的高通量技术，用于蛋白质组研究，适用于细胞质蛋白、膜蛋白和核蛋白。iTRAQ测序侧重于组间常见蛋白质的相对表达丰度，而不考虑特定组中呈现的特定类型的蛋白质。目前的鱼类感染检测方法主要是针对病原体的微生物学、免疫学和分子技术，而硬骨鱼中很少报告生物标记物指示疾病的相关技术。在人类中，C反应蛋白(CRP)、降钙素原(PCT)、血清淀粉样蛋白A(SAA)和白细胞介素(IL)-6都是指示炎症和感染的常见生物标记物，其浓度被认为与炎症的程度和模式有关。然而，到目前为止，在鱼类中还没有这样的生物标记物。
发明内容
本发明第一方面的目的，在于提供一种哈维氏弧菌感染的生物标志物。
本发明第二方面的目的，在于提供检测本发明第一方面的生物标志物表达量的试剂在制备细菌感染检测试剂盒中的应用。
本发明第三方面的目的，在于提供检测本发明第一方面生物标志物表达量的试剂在制备细菌感染预测制剂中的应用。
本发明第四方面的目的，在于提供一种试剂盒。
本发明第五方面的目的，在于提供本发明第四方面的试剂盒的使用方法。
本发明第六方面的目的，在于提供一种用于检测鱼类哈维氏弧菌感染的检测装置。
本发明第七方面的目的，在于提供一种用于检测鱼类哈维氏弧菌感染的检测系统。
为了实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：
本发明的第一个方面，提供一种哈维氏弧菌感染的生物标志物，所述生物标志物包括氨基肽酶、钙转运ATP酶、组蛋白H2B和组蛋白H2A中的至少一种。
优选地，所述生物标志物为氨基肽酶。
本发明的第二个方面，提供检测本发明第一方面的生物标志物表达量的试剂在制备细菌感染检测试剂盒中的应用。
优选地，所述试剂包括在基因或蛋白水平上检测生物标志物的试剂。
优选地，所述在基因水平上检测生物标志物的试剂包括通过测序技术、核酸杂交技术、核酸扩增技术或免疫测定的方法检测标志物基因表达水平的试剂。
优选地，所述在蛋白水平上检测生物标志物的试剂包括免疫组化、蛋白免疫印迹、酶联免疫吸附(ELISA)、流式细胞术、化学发光、电化学、紫外分光光度法-近红外光谱法、液相芯片法、高效液相色谱法、比色法或质谱鉴定的方法检测蛋白表达水平的试剂。
优选地，所述细菌为哈维氏弧菌。
本发明的第三个方面，提供检测本发明第一方面的生物标志物表达量的试剂在制备细菌感染预测制剂中的应用。
优选地，所述试剂包括在基因或蛋白水平上检测生物标志物的试剂。
优选地，所述在基因水平上检测生物标志物的试剂包括通过测序技术、核酸杂交技术、核酸扩增技术或免疫测定的方法检测标志物基因表达水平的试剂。
优选地，所述在蛋白水平上检测生物标志物的试剂包括免疫组化、蛋白免疫印迹、酶联免疫吸附(ELISA)、流式细胞术、化学发光、电化学、紫外分光光度法-近红外光谱法、液相芯片法、高效液相色谱法、比色法或质谱鉴定的方法检测蛋白表达水平的试剂。
优选地，所述细菌为哈维氏弧菌。
本发明的第四个方面，提供一种试剂盒，包括检测本发明第一方面的生物标志物的表达水平的试剂。
优选地，所述试剂包括在基因或蛋白水平上检测生物标志物的试剂。
优选地，所述试剂盒包括生化诊断试剂盒、免疫诊断试剂盒、或分子诊断试剂盒中的一种或多种。
优选地，所述试剂盒为免疫诊断试剂盒。
优选地，所述试剂盒包括Western印迹试剂盒、酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒、放射免疫测定(RIA)试剂盒、放射免疫扩散试剂盒、ouchterlony免疫扩散试剂盒、火箭免疫电泳试剂盒、免疫组织化学染色试剂盒、免疫沉淀测定试剂盒、补体结合测定试剂盒、荧光激活细胞分选(FACS)试剂盒、适体芯片试剂盒、微阵列试剂盒、蛋白质芯片试剂盒中的一种或多种。
本发明的第五个方面，提供本发明第四方面的试剂盒的使用方法，以下步骤：采集待测样品，检测所述样品中生物标志物的表达水平。
优选地，所述样品为鱼类皮肤粘液。
本发明的第六个方面，提供一种用于检测鱼类哈维氏弧菌感染的检测装置，所述检测装置包括用于检测本发明第一方面的生物标志物表达量的试剂。
优选地，所述鱼类为硬骨鱼；进一步为半滑舌鳎。
本发明的第七个方面，提供一种用于检测鱼类哈维氏弧菌感染的检测系统，所述检测系统包括用于检测本发明第一方面的生物标志物表达量的试剂。
优选地，所述鱼类为硬骨鱼；进一步为半滑舌鳎。
本发明的有益效果是：
本发明在感染哈维氏弧菌的病鱼的细菌感染特征中，对海洋硬骨鱼半滑舌鳎粘液中的DEPs进行了鉴定和开发，并进过qRT-PCR验证，结果表明氨肽酶和钙转运ATP酶显著上调，组蛋白H2B和组蛋白H2A显著下调，可用上述4种蛋白作为生物标志物来鉴定硬骨鱼是否感染哈维氏弧菌。
附图说明
图1为从正常对照组和感染性疾病半滑舌鳎的皮肤粘液中取样，红色椭圆圈表示两个样本的具体采样位置，中间的两个红色椭圆大圆是局部放大图。
图2为1531个已鉴定蛋白质按氨基酸个数分布的结果统计图。
图3为GO富集分析结果统计图。
图4为KEGG通路分析结果统计图。
图5为MS组和MC组之间335种DEPs的热图。
图6为4个上调和16个下调的的DEPs的PPI分析结果图，每个节点代表一种蛋白质(以基因名称命名)，节点的大小与蛋白质的折叠变化有关，红色表示上调，每个方块代表一个GO/KEGG项，绿线表示抑制，红线表示激活，蓝色虚线代表KEGG路径，而灰色虚线代表GO路径。
图7为实时荧光定量PCR检测结果统计图。
具体实施方式
以下通过具体的实施例对本发明的内容作进一步详细的说明。
应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
本实施例中所使用的材料、试剂等，如无特别说明，为从商业途径得到的材料和试剂。
实施例1人工感染实验及粘液样品
获取从中国河北省维卓有限公司购得60尾半滑舌鳎(平均276.35克，长25.3厘米)，将半滑舌鳎分别置于6个水槽中(每个槽中10条鱼)，25℃通气暂养一周，以排除病鱼。然后将鱼随机分为两组(患病组和对照组)，每组三个鱼缸，25℃通气饲养。将保存的哈维氏弧菌菌株(TJV-02)在2216E琼脂上28℃活化30小时，然后将单个菌落在2216E肉汤中28℃下振荡培养(150rpm)24小时；4000g下离心10分钟收集细菌，用无菌0.01M PBS洗涤三次，并以无菌0.01M PBS调整终浓度为106CFU/mL。患病组(MS)的鱼在有眼侧肌肉注射0.1mL上述菌悬液，而对照组(MC)的鱼眼侧肌肉注射0.1mL 0.01M PBS。注射后7天，通过无菌玻片从每组20条鱼的两侧收集表皮粘液(图1)，混合后进行蛋白质组学分析。若不立即进行蛋白质组学分析，则将收集的表皮粘液在-80℃下冷冻，直至使用。
实施例2粘液蛋白质组测序
1.蛋白质消化、iTRAQ标记和分馏
将MS组和MC组的粘液预解冻，在4℃下12000g离心10分钟，收集上清液，重复一次。用BCA法和SDS-PAGE法检测上清液中蛋白质的质量和浓度，MS组和MC组分别取得了浓度为5.052μg/μL和3.503μg/μL的总蛋白，分批保存至-80℃，备用。
对所获得的的蛋白进行消化，具体步骤如下：分别取50μgMS组和MC组的蛋白质，用120μL缓冲液(10mM DTT、8M尿素、100mM TEAB，pH 8.0)在10K超滤管上，60℃提取1小时；加入IAA(3-Indoleacetic acid)至蛋白终浓度为50mM；然后将混合物置于25℃下避光孵育35分钟；将溶液离心，并丢弃下管液体，加入100μL 300mM TEAB，混合并离心，此过程重复两次；将离心得到的物质小心地转移到新的收集管中，并添加100μL 300mM TEAB，然后再添加1.5μL测序级的胰蛋白酶(1μg/μL)，37℃消化12小时；将消化后的肽在4℃以12000rpm离心15分钟，并添加50μL 200mM TEAB后再次离心，收集最终溶液并冷冻干燥，备用。
将消化后的得到的多肽进行iTRAQ标记，具体步骤如下：将200μL异丙醇添加到预先平衡至室温的iTRAQ试剂瓶(AB SCIEX，Framing ham，MA，USA)中，混合并离心，重复一次；以40μL 200mM TEAB重悬消化后的多肽样品，并将100μL上述混合物分别添加到iTRAQ试剂瓶，室温下孵育2.5小时；向每个iTRAQ试剂瓶中添加200μL HPLC水，室温孵育40分钟以终止反应，得到iTRAQ标记的肽溶液；将标记的肽溶液冻干并储存在-80℃，备用。
使用安捷伦1100系列HPLC系统配备的安捷伦Zorbax Extend-C18(5μm，2.1×150mm；安捷伦科技有限公司，中国)对iTRAQ标记的多肽进行分馏，具体步骤如下：iTRAQ标记的多肽分别在缓冲液[ACN-H2O(2:98，v/v)]中复溶，然后上样，多肽溶液以300μL/min的流速进行洗脱，洗脱程序为：0～8分钟，98％的缓冲液，8～8.01分钟，98～95％的缓冲液；8.01～48分钟，95～75％的缓冲液；48～60分钟，使用75～60％缓冲液；60～60.01分钟，使用60～10％缓冲液；60.01～70分钟，使用10％缓冲液；70～70.01分钟，使用10～98％缓冲液；70.01～75分钟，使用98％缓冲液。通过测量210nm和280nm处的吸光度来监测洗脱。在8～60分钟内每隔一分钟将洗脱液依次收集到标记为1～15号的离心管中。然后将收集的样品真空冷冻干燥并储存在-80℃，备用，用于质谱分析。
2.蛋白质组学筛选
通过LC-MS/MS进行蛋白质组筛选，由鹿明生物医药公司(中国上海)进行。具体步骤如下：在美国马萨诸塞州沃尔瑟姆市赛默飞世尔科技有限公司(Thermo FisherScientific)的Acclaim PepMap100 trap柱和Acclaim PepMap100 RSLC分析柱上连续处理多肽。用缓冲液A(99.9％水和0.1％甲酸)复溶多肽，缓冲液B(80％乙腈、19.9％水和0.1％甲酸)分离蛋白质。梯度从5％～26％缓冲液B开始，在26％～35％缓冲液B保持35分钟，在35％～100％缓冲液B下维持40分钟，然后再100％缓冲B保持55分钟。质谱仪设置为正离子模式，MS光谱范围为300～1600m/z，MS扫描分辨率为70000。选择MS光谱中强度最强的前十个信号进行后续MS/MS分析。所有的MS/MS图谱都是在依赖于数据的正离子模式下，通过高能碰撞裂解得到的，碰撞能量设置为32eV，MS/MS分辨率设置为15000，自动增益控制设置为4e5。
通过过LC-MS/MS进行蛋白质组筛选，结果表面，共检测到9544条肽段和7952条独特的肽段。共有2241个定性蛋白质和1759个定量蛋白质(FDR<1％)，其中获得1531个可信蛋白质(评分顺序HT>0，独特肽≧1)。原始数据已上传至ProteomeXchange Consortium(http://proteomecentral.proteomexchange.org)，通过标识符为PXD033480的iProX。在1531个可信蛋白质中，有54.5％(835个)的序列覆盖率超过10％，59.4％(968个)被不少于三个肽覆盖，显示出理想的覆盖率。可信蛋白质的质量分布范围广泛，从6.6kD到531.9kD，大多数在100kD以下(1304，85.17％)，其中，20个低于10kD的蛋白质、178个在100～200kD之间的蛋白质和49个高于200kD的蛋白质。编码200～300个氨基酸的蛋白质数量最多(261)，其次是100～200个氨基酸的蛋白质组(248)(图2)。可以看出，大多数蛋白质的氨基酸数不到700个，由700多个氨基酸组成的蛋白质数急剧减少，在许多片段中只有几十个甚至一位数。在可信蛋白质中鉴定到核糖体蛋白、细胞骨架蛋白和各种酶，免疫相关分子，如S100、整合素β、组蛋白、溶菌酶、C-C基序趋化因子、补充因子H、丝裂原活化蛋白激酶和SghC1q蛋白也被鉴定出来。
MS组和MC组之间发现335个DEPs，MS组中有166个上调蛋白(FC>2)和169个下调蛋白(FC<0.5)(图5)，其中，共鉴定出62种蛋白质，包括22种上调蛋白质和40种下调蛋白质。在MS和MC之间，肌红蛋白在上调类别(FC＝12.502)中的折叠变化最高；甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH，FC＝9.37)、钙转运ATP酶(FC＝4.39)、整合素β(FC＝2.64)和ELAV样蛋白(FC＝2.60)在MS中均上调。组蛋白H2A的折叠变化在下调的蛋白中最高(FC＝0.119)，其次是鸟苷酸环化酶(FC＝0.150)，组蛋白H2A、组蛋白H2B、组蛋白H4、组蛋白簇2H3家族成员A(HIST2H3A)和组蛋白H3在MS中均显著下调。
实施例3生物信息学分析
为了在最大范围内筛选出DEPs，同时最大限度地减少有意义目标的损失，将DEPs定义为FC>2或FC<1/2(基于t检验的P值<0.05)，用UniProt数据库进行注释，以半滑舌鳎的数据为参考。通过OmicsBean，使用基因本体(GO)数据库(http://www.geneontology.org/)对DEPs进行注释，并以Daniorerio据库为样本，对蛋白质的细胞成分(CC)、生物过程(BP)和分子函数(MF)进行GO分析。使用京都基因和基因组百科全书(KEGG)数据库(//www.genome.jp/kegg/)进行通路分析。用FC值表征MS组和MC组之间常见蛋白的表达水平，并与R语言进行比较，绘制热图以显示两组之间蛋白质的差异表达丰度。此外，使用String数据库对DEPs进行蛋白质相互作用(PPI)分析(http://string.embl.de/)，并用“networkx”python语言可视化。
根据GO富集分析，结果表明，MS组和MC组的蛋白质组图谱中丰度不同的蛋白质主要富集于细胞成分类别，如细胞内部分、大分子复合体、细胞质和细胞器部分；在BP方面，具有差异丰度的蛋白主要参与细胞组分的生物发生、细胞组分的组装、大分子复合物的组装、细胞酰胺的代谢过程等过程；MF类的DEPs主要参与细胞骨架蛋白结合、肌动蛋白结合、核糖体结构等(图3)。在KEGG通路分析中，类似的趋势也得到了确认和统一，核糖体、碳代谢、糖酵解/糖异生和丙酮酸代谢被确定为在所有11条显著富集的途径中发生显著变化的前四条途径(P值<0.05)(图4)，KEGG通路还涉及其他七个类别，包括氨基酸生物合成、脂肪酸降解、色氨酸代谢、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸降解、赖氨酸降解、组氨酸代谢以及酮体的合成和降解。
对4个上调和16个下调的DEPs进行网络分析，并根据数据库中的基因名称进行分析，结果如图6所示，DEPs参与核糖体、碳代谢、组氨酸代谢、蛋白质代谢和蛋白质代谢相关的途径，色氨酸代谢、丙酮酸代谢、赖氨酸降解、脂肪酸降解、糖酵解/糖异生、酮体的合成和降解，以及缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸降解。在上调蛋白(以基因名称呈现)中，gapdh(A0A3P8WUX4，gapdh)、hnmt(A0A3P8W9F4，组胺N-甲基转移酶)、pgam2(A0A3P8V6T9，磷酸甘油酯变位酶)和aldoaa(A0A3P8WX70，果糖二磷酸醛缩酶)均与代谢有关。在下调的蛋白中，大多数是核糖体蛋白，如rps11(A0A3P8X593，40S核糖体蛋白S11)、rps7、rps18、rps28、rps25、rpl5a(A0A3P8WT02，核糖体蛋白L5)、rpl19、rpl23、rpl24和rpl35，它们在抑制方面相互作用。Pabpc1a(A0A3P8W8J4，聚腺苷酸结合蛋白)能结合mRNA的聚(A)尾，与核糖体蛋白紧密相互作用。代谢相关蛋白，如aldh9a1b(A0A3P8UL50，乙醛脱氢酶6家族成员A1)、acat1(A0A3P8UX53，羟酰辅酶A脱氢酶三功能多酶复合物亚基β)、aldob(A0A3P8VPK1，果糖二磷酸醛缩酶)和fh(A0A3P8WW97，富马酸水合酶，线粒体)在MS中也下调。
实施例4实时荧光定量PCR检测mRNA的表达
根据折叠变化和功能选择五种上调蛋白和五种下调蛋白，选择五尾新的感染哈维氏弧菌的半滑舌鳎(S1～S5)和五个新的健康对照个体(C1～C5)的皮肤样本进行qRT PCR，以验证候选蛋白的mRNA表达。每条鱼分别在身体前部、中部和后部取三块皮肤。按照说明书使用从百奥创新科技有限公司(中国北京)购买的试剂盒提取各样本的总RNA。通过QuantstStudio6 Flex实时PCR系统(加利福尼亚州赛默飞世尔科学公司，美国)在96孔板中使用PowerUp SYBR Green Master Mix(ABI，加利福尼亚州，美国)进行qRT PCR，反应体积为10μL(反应体系按说明书配制)，反应程序为：50℃ 3分钟；95℃ 2分钟；94℃ 30秒，40个循环；64℃ 30秒，以β-肌动蛋白的表达水平作为正常化的内源性对照，重复三次。所用的引物如表1所示。使用2-ΔCt方法计算mRNA表达的相对定量。
表1各蛋白的引物序列
Figure BDA0003688104710000081
Figure BDA0003688104710000091
通过qRT PCR检测皮肤样本中10种蛋白质的mRNA的相对表达水平，其中4种与蛋白质组学筛查结果一致，在MS组和MC组之间存在显著差异，4种蛋白质分别为氨基肽酶(anpep)、钙转运ATP酶(LOC103382755)、组蛋白H2B(LOC103381126)和组蛋白H2A(LOC103381127)。与MC相比，MS中的氨肽酶和钙转运ATP酶显著上调(p＝0.002，p＝0.007)，而组蛋白H2B和组蛋白H2A则下调(p＝0.000，p＝0.004)(图7)。而其他六个候选基因的表达水平，包括测序上调的真核细胞延伸因子2激酶、肌钙蛋白C 2型(fast)、整合素β，以及测序下调的核糖体蛋白S20、鸟苷酸环化酶、异种核核糖核蛋白A0b，与蛋白质组测序结果不符。
上面结合附图对本发明实施例作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
SEQUENCE LISTING
<110> 南方海洋科学与工程广东省实验室（湛江）
<120> 一种哈维氏弧菌感染的生物标志物
<130>
<160> 20
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ccttcgtcgt ctgtgatttc g 21
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ttcggcgttg tctcctccc 19
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gctgcctcat cacatcctg 19
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
tccgccctcg tcatagtc 18
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
gtagtgagtg cgttccagag tg 22
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
cgtcgggaat gaggtggtt 19
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
atgactgacg cccaacaag 19
<210> 8
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
cggaagcact ctgccaac 18
<210> 9
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
catctgtaat gggaagggca aag 23
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
tggcagtagt cgccgtggta 20
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
gtcggtcgtg ttcacagatt g 21
<210> 12
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
tctcagcggt caaatactcc aa 22
<210> 13
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
accaaggtga ccagcaagac t 21
<210> 14
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
ctggaggtga tggtggagc 19
<210> 15
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
ccgagggtac tggtacgatt t 21
<210> 16
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
tgggaggagt gactggtgg 19
<210> 17
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
atggctttca aggacaccg 19
<210> 18
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
aggttcaatg ctgatggagg t 21
<210> 19
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 19
caagggaaga cgcaaacaaa c 21
<210> 20
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 20
cgaatcgtgc tcggtgaag 19

Claims (10)

1.一种哈维氏弧菌感染的生物标志物，其特征在于，所述生物标志物包括氨基肽酶、钙转运ATP酶、组蛋白H2B和组蛋白H2A中的至少一种。
2.检测权利要求1所述的生物标志物表达量的试剂在制备细菌感染检测试剂盒中的应用。
3.检测权利要求1所述的生物标志物表达量的试剂在制备细菌感染预测制剂中的应用。
4.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于，所述试剂包括在基因或蛋白水平上检测生物标志物的试剂。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述细菌为哈维氏弧菌。
6.一种试剂盒，包括检测权利要求1所述的生物标志物的表达水平的试剂。
7.一种权利要求6所述试剂盒的使用方法，其特征在于，包括以下步骤：采集待测样品，检测所述样品中生物标志物的表达水平。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述样品为鱼类皮肤粘液。
9.一种用于检测鱼类哈维氏弧菌感染的检测装置，其特征在于，所述检测装置包括用于检测权利要求1所述生物标志物表达量的试剂。
10.一种用于检测鱼类哈维氏弧菌感染的检测系统，其特征在于，所述检测系统包括用于检测权利要求1所述生物标志物表达量的试剂。
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Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20140273065A1 (en) * 2013-03-15 2014-09-18 The Procter & Gamble Company Noninvasive method for measuring antimicrobial peptides from skin as an objective measurement of natural protection from microbes
US20150147761A1 (en) * 2012-06-20 2015-05-28 Helmut E. Meyer Specific biomarkers for hepatocellular carcinoma (hcc)
CN109576275A (zh) * 2018-12-16 2019-04-05 中国水产科学研究院黄海水产研究所 一种半滑舌鳎抗细菌病相关基因及其应用方法
CN112858685A (zh) * 2019-11-28 2021-05-28 中国科学院深圳先进技术研究院 一种神经退行性疾病标志物β-spectrin及其应用

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20150147761A1 (en) * 2012-06-20 2015-05-28 Helmut E. Meyer Specific biomarkers for hepatocellular carcinoma (hcc)
US20140273065A1 (en) * 2013-03-15 2014-09-18 The Procter & Gamble Company Noninvasive method for measuring antimicrobial peptides from skin as an objective measurement of natural protection from microbes
CN109576275A (zh) * 2018-12-16 2019-04-05 中国水产科学研究院黄海水产研究所 一种半滑舌鳎抗细菌病相关基因及其应用方法
CN112858685A (zh) * 2019-11-28 2021-05-28 中国科学院深圳先进技术研究院 一种神经退行性疾病标志物β-spectrin及其应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MARÍA CÁMARA-RUIZ等: "Alteration of the Immune Response and the Microbiota of the Skin during a Natural Infection by Vibrio harveyi in European Seabass (Dicentrarchus labrax)", 《MICROORGANISMS》 *
裴立硕: "点带石斑鱼致病性哈维氏弧菌的分离鉴定及药敏试验", 《天津农学院学报》 *

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