CN115006529B - 一种蛋白颗粒稳定共载光热剂和化疗药物的皮克林乳液载药系统、其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于化学、药学、医学等多学科交叉技术领域，更具体地，涉及一种蛋白颗粒稳定共载光热剂和化疗药物的皮克林乳液载药系统、其制备方法和应用。该皮克林乳液载药系统包含水相连续相、油相分散相和颗粒稳定剂；水相连续相为光热剂分散在水中得到的连续相，油相分散相为疏水性化疗药物分散在生物相容性有机溶剂中得到的分散相，颗粒稳定剂为蛋白颗粒；该载药系统具有较高药物负载量，能够解决传统载药系统光热剂和化疗药物在肿瘤中有效浓度不足的问题；其可调控的流变性能有利于通过瘤内注射将光热剂和小分子前药高效递送至肿瘤部位，同时近红外激光照射可以使肿瘤部位的光热剂快速升温，通过热疗提高小分子前药的化疗效果，实现协同治疗。
Description
技术领域
本发明属于化学、药学、医学等多学科交叉技术领域，更具体地，涉及一种蛋白颗粒稳定共载光热剂和化疗药物的皮克林乳液载药系统、其制备方法和应用。
背景技术
癌症严重威胁人类健康。手术、放疗、化疗和免疫治疗仍是目前传统癌症治疗的“四大基石”。此外，光热治疗因其疗程短、疗效显著、毒副作用小而在肿瘤治疗研究中受到广泛关注。然而，在光热治疗过程中，由于光热剂自身光热转换效率以及肿瘤中异常微环境的影响，包载光热剂的治疗性纳米颗粒通过系统给药经血液循环到达肿瘤部位后有效浓度不足，严重影响肿瘤治疗效果。如何克服光热剂在肿瘤中有效浓度不足的问题，提高肿瘤治疗效果是本领域亟需解决的技术问题。
另外，研究人员还发现，单一的光热治疗难以取得较为理想的治疗效果，肿瘤中热休克蛋白的过度表达会使肿瘤细胞对光热治疗产生抗性，不能完全消除肿瘤细胞，进而导致肿瘤复发和在远处器官的转移。光热治疗和其他疗法如化疗相结合能够改善肿瘤治疗效果。
发明内容
针对现有技术的缺陷，本发明提供了一种蛋白颗粒稳定共载光热剂和化疗药物的皮克林乳液载药系统、其制备方法和应用，采用蛋白颗粒稳定的皮克林高内相乳液同时负载光热剂和疏水性小分子前药，有效解决了化疗药物和小分子前药在肿瘤中有效浓度不足导致肿瘤治疗效果不佳等的技术问题。
为实现上述目的，本发明提供了一种蛋白颗粒稳定共载光热剂和化疗药物的皮克林乳液载药系统，其包含水相连续相、油相分散相和颗粒稳定剂；其为以颗粒稳定剂作为乳化剂乳化得到的水相连续相包裹油相分散相的皮克林乳液；
所述水相连续相为光热剂分散在水中得到的连续相，所述油相分散相为疏水性化疗药物分散在生物相容性有机溶剂中得到的分散相，所述颗粒稳定剂为蛋白颗粒；
该皮克林乳液载药系统为由所述水相连续相、油相分散相和颗粒稳定剂混合后经剪切乳化得到的水包油型皮克林乳液。
优选地，所述光热剂为近红外光热剂，进一步优选为聚多巴胺、IR780、IR676和DiR中的一种或多种。
优选地，所述疏水性化疗药物为疏水性小分子前药，进一步优选为紫杉醇、阿霉素或喜树碱；所述生物相容性有机溶剂为肉豆蔻酸异丙酯、辛酸癸酸三甘油酯和角鲨烯中的一种或多种。
优选地，所述蛋白颗粒为牛血清蛋白颗粒、醇溶蛋白颗粒和藻蓝蛋白颗粒中的一种或多种。
优选地，所述皮克林乳液中所述油相分散相的体积分数为74％～87％；所述疏水性化疗药物的载药量为1～5mg/mL，进一步优选为3～4mg/mL；所述光热剂的载药量小于或等于1000μg/mL，进一步优选为200～600μg/mL。
按照本发明的另一个方面，提供了一种所述的载药系统的制备方法，将分散有颗粒稳定剂的水相连续相与油相分散相混合后经剪切乳化得到。
优选地，所述分散有颗粒稳定剂的水相连续相的制备方法包括如下步骤：将光热剂、颗粒稳定剂与水溶剂混合，涡旋振荡溶解得到所述分散有颗粒稳定剂的水相连续相；所述颗粒稳定剂在所述水相连续相中的含量为2wt％～40wt％。
优选地，所述油相分散相的制备方法包括如下步骤：将疏水性化疗药物与生物相容性有机溶剂以及第二有机溶剂混合，使得所述疏水性化疗药物分散在所述生物相容性有机溶剂中，然后去除所述第二有机溶剂，得到所述油相分散相；
其中所述第二有机溶剂用于促进所述疏水性化疗药物在生物相容性有机溶剂中的分散；所述生物相容性有机溶剂为肉豆蔻酸异丙酯、辛酸癸酸三甘油酯和角鲨烯中的一种或多种；所述第二有机溶剂为CH2Cl2、C4H8O2和C2H5OC2H5中的一种或多种。
按照本发明的另一个方面，提供了一种所述的皮克林乳液载药系统在制备治疗和/或预防癌症的药物中的应用。
按照本发明的另一个方面，提供了一种抗癌药物，包含所述的皮克林乳液载药系统和药学上可接受的添加剂。
总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，具有以下有益效果：
(1)本发明提供一种蛋白颗粒稳定共载光热剂和疏水性小分子前药的皮克林高内相乳液载药系统，其包含疏水性小分子前药和近红外光热剂，还包括蛋白颗粒稳定的皮克林高内相乳液；实验表明，蛋白颗粒稳定剂的引入，能够显著提高光热剂和疏水性小分子前药的自组装纳米粒的稳定性，解决了现有技术小分子前药自组装纳米药物稳定性不佳导致肿瘤治疗效果不佳的技术问题。并且实验证明该皮克林乳液载药系统具有超高药物负载量以及良好的稳定性，同时近红外光照射可以使肿瘤部位快速升温，通过热疗提高疏水性小分子药物的化疗效果，实现协同治疗。本发明旨在解决现有光热剂和传统化疗药物在肿瘤中有效浓度不足、化疗药物疏水性差需要借助使用溶剂而导致一系列临床不良反应的技术问题。
(2)本发明提出的一种蛋白颗粒稳定共载光热剂和疏水性小分子前药的皮克林高内相乳液载药系统，通过对该载药系统进行体内外光热性能评价，发现其相比于游离聚多巴胺纳米粒表现出更好的光热性能，能够更好地对肿瘤细胞进行杀伤。
(3)本发明提出的一种蛋白颗粒稳定共载光热剂和疏水性小分子前药的皮克林高内相乳液载药系统，在相同的给药剂量下，显示出了比纯化疗组和纯光热治疗组更好的抗肿瘤活性，显著抑制乳腺癌的瘤体积和瘤重，优选实施例中其抑瘤率达到86.0％，显著抑制乳腺癌中肿瘤细胞的增殖，促进肿瘤细胞的凋亡。
(4)本发明优选实施例中提出的一种蛋白颗粒稳定共载光热剂和疏水性小分子前药的皮克林高内相乳液载药系统，在808nm激光照射下能够快速升温，在体内外均能升至46℃以上，通过光热能够显著提高疏水性小分子药物化疗的抗肿瘤效果。
(5)本发明优选实施例提出的一种牛血清蛋白颗粒稳定共载光热剂聚多巴胺纳米粒和疏水性小分子前药紫杉醇的皮克林高内相乳液载药系统，利用牛血清蛋白颗粒为乳化剂，在高速剪切作用下将负载疏水性小分子前药的肉豆蔻酸异丙酯和负载近红外光热剂聚多巴胺纳米粒的水相乳化，形成液滴粒径约为2～20μm的载药皮克林乳液。该载药皮克林乳液具有较高药物负载量以及良好的稳定性，相较于游离聚多巴胺纳米粒表现出更好的光热性能，使用808nm激光照射后，能够快速升高肿瘤部位的温度，实现热疗和化疗联合治疗。本发明提供的一种牛血清蛋白颗粒稳定共载光热剂聚多巴胺纳米粒和疏水性小分子前药紫杉醇的皮克林高内相乳液载药系统具有良好的应用前景。
(6)本发明皮克林乳液载药系统包括光热剂和疏水性小分子前药，还包括蛋白颗粒稳定的皮克林高内相乳液，实验表明，皮克林高内相乳液的流变性能主要受乳化剂牛血清蛋白浓度的影响，而聚多巴胺的引入对载药系统的流变性能影响较小，使得该乳液载药系统中高负载量的光热剂成为可能；该载药系统具有超高药物负载量，最高负载量可达1000μg/ml光热剂，能够解决传统光热剂和化疗药物在肿瘤中有效浓度不足的问题。光热剂负载量高可以减少药物载体的量，能够减小载体浓度带来的潜在毒性，本发明优选实施例中乳液载药系统只需要注射25μl就能实现比较好的抑瘤效果。此外，其可调控的流变性能有利于通过瘤内注射将光热剂和小分子前药高效递送至肿瘤部位，同时近红外激光照射可以使肿瘤部位的光热剂快速升温，通过热疗提高小分子前药的化疗效果，实现协同治疗。
附图说明
图1为本发明一些实施例中制备蛋白颗粒稳定共载光热剂和疏水性小分子前药的皮克林乳液载药系统的流程示意图；
图2为本发明实施例1制备的BSA HIPEs宏观形貌及其在水相和油相中的分散状态；
图3内容(a)、内容(b)和内容(c)为本发明实施例1制备的BSA HIPE稀释不同倍数的明场显微镜结果；
图4为本发明实施例1制备的BSA HIPE共聚焦激光显微镜观察结果；
图5内容(a)和内容(b)为本发明实施例2中不同BSA浓度制备的BSA HIPEs流变性能结果；图5内容(c)和内容(d)为本发明实施例2中不同剪切搅拌速度制备的BSA HIPEs流变性能结果；
图6内容(a)为本发明实施例3不同连续相pH条件制备的BSA HIPEs正置照片；图6内容(b)为实施例3不同连续相pH条件制备的BSA HIPEs倒置照片；图6内容(c)为实施例3不同连续相pH条件制备的BSA HIPEs明场显微镜结果；图6内容(d)和(e)为实施例3不同连续相pH条件下BSA的水合粒径和Zeta电位大小；
图7内容(a)为本发明实施例4中PDA纳米粒的电镜结果；图7内容(b)为实施例4中PDA纳米粒的动态光散射测试结果；图7内容(c)为本发明实施例5中PTX@PDA/BSA HIPEs的外观形貌；图7内容(d)为本发明实施例6中不同PDA浓度制备的PTX@PDA/BSA HIPEs的流变测试结果；图7内容(e)为本发明实施例6中不同BSA浓度制备的PTX@PDA/BSA HIPEs的粘度随剪切速率变化曲线；图7内容(f)为本发明实施例6中不同BSA浓度制备的PTX@PDA/BSAHIPEs的流变性能测试结果；
图8内容(a)为本发明实施例7中不同离心速率处理后PTX@PDA/BSA HIPEs的外观结果；图8内容(b)为实施例7中不同离心速率处理后PTX@PDA/BSA HIPEs的乳析指数；图8内容(c)为实施例8中PTX@PDA/BSA HIPEs流变性能随温度变化曲线；
图9内容(a)为本发明实施例9中PDA/BSA HIPEs与游离PDA光热性能对比；图9内容(b)为本发明实施例9中不同PDA浓度下PDA/BSA HIPEs的升温结果。图9内容(c)和内容(d)为本发明实施例9中不同激光功率下PDA/BSA HIPEs的升温及定量结果；
图10内容(a)为本发明实施例10中不同药物处理后细胞存活情况；图10内容(b)为实施例11中不同药物处理后细胞死活染色结果；
图11内容(a)和内容(b)为本发明实施例12中PDA/BSA HIPEs与游离PDA的体内升温效果对比及相应定量；
图12内容(a)和内容(b)为本发明实施例13中PDA/BSA HIPEs和游离PDA NPs瘤内注射后，不同激光功率照射小鼠肿瘤部位的升温曲线及相应定量结果；
图13内容(a)为实施例14小鼠经不同给药处理后瘤体积的变化；图13内容(b)为实施例14小鼠经不同给药处理后瘤重的变化；图13内容(c)为实施例14小鼠经不同给药处理后瘤子大小的图片；图13内容(d)为实施例14小鼠经不同给药处理后对剥离的肿瘤进行的苏木精伊红染色，Ki67和TUNNEL免疫荧光染色结果；
图14内容(a)为实施例14中不同给药处理后小鼠体重的变化，评价不同药物对小鼠的毒性；图14内容(b)至内容(h)为实施例15小鼠经不同给药处理后对小鼠血液进行的血常规和血生化检测评价不同药物对小鼠的毒性；
图15为本发明实施例15中不同给药处理后小鼠主要器官的苏木精伊红染色切片结果。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明提供的一种蛋白颗粒稳定共载光热剂和化疗药物的皮克林乳液载药系统，其包含水相连续相、油相分散相和颗粒稳定剂；其为以颗粒稳定剂作为乳化剂乳化得到的水相连续相包裹油相分散相得到的乳液；所述水相连续相为光热剂分散在水中得到的连续相，所述油相分散相为疏水性化疗药物分散在生物相容性有机溶剂中得到的分散相，所述颗粒稳定剂为蛋白颗粒；该皮克林乳液载药系统为由所述水相连续相、油相分散相和颗粒稳定剂混合后经剪切乳化得到的水包油型皮克林乳液。
本发明所述光热剂分散于高内相皮克林乳液连续相；所述疏水性小分子前药分散于乳液分散相；该载药系统中所述皮克林高内相乳液为蛋白颗粒稳定的水包油型高内相乳液。
本发明一些实施例中提供的一种蛋白颗粒稳定共载光热剂和疏水性小分子前药的纳米载药系统，其包含疏水性小分子前药和光热剂，还包括牛血清蛋白稳定的高内相乳液；其中，所述疏水性小分子前药分散于分散相中；所述光热剂分散于连续相中；所述蛋白颗粒稳定的高内相乳液为水包油型高内相乳液，其通过蛋白颗粒稳定油水界面，实现光热剂和疏水性小分子前药的共载。
一些实施例中，所述光热剂为近红外光热剂，包括但不限于为聚多巴胺(缩写为PDA)、IR780、IR786和DiR中的一种或多种，所述光热剂为纳米粒，其粒径一般比乳液液滴的直径(2～20μm)至少小一个数量级，优选为160～200nm所述疏水性化疗药物为疏水性小分子前药，包括但不限于为二萜类化合物紫杉醇(缩写为PTX)、阿霉素或喜树碱。所述生物相容性有机溶剂包括但不限于为肉豆蔻酸异丙酯、辛酸癸酸三甘油酯或角鲨烯。所述蛋白颗粒包括但不限于为牛血清蛋白颗粒、醇溶蛋白颗粒或藻蓝蛋白颗粒。所述蛋白颗粒为纳米粒，其粒径比乳液液滴的直径(2～20μm)至少小一个数量级，比如一些实施例中，采用市购的牛血清蛋白颗粒的分子量66.45kD，等电点4.7，粒径在10nm左右。其中，PDA化学名为聚多巴胺，其单体多巴胺具有式(一)所示的结构式，PTX化学名为紫杉醇，其具有式(二)所示的结构式：
本发明提供的皮克林乳液为高内相乳液，其中所述油相分散相的体积分数为74％～87％，优选为80％；所述疏水性化疗药物的载药量为1～5mg/mL，优选为3～4mg/mL；所述光热剂的载药量为小于或等于1000μg/ml，优选为200～600μg/mL；所述水相连续相的pH范围为5～7。
本发明一些实施例在实验过程中使用牛血清蛋白颗粒稳定两相系统，并同时负载光热剂如聚多巴胺和疏水性小分子前药如紫杉醇后，发现牛血清蛋白的引入能够显著提高皮克林乳液的稳定性，PDA对牛血清蛋白稳定的皮克林乳液流变性能影响较小，最高PDA负载量可达1000μg/mL，能够解决光热剂和传统化疗药物在肿瘤中有效浓度不足而导致肿瘤治疗效果不佳的问题。实验证明该皮克林乳液载药系统具有超高药物负载量以及良好的稳定性，同时近红外光照射可以使肿瘤部位快速升温，通过热疗提高疏水性小分子药物的化疗效果，实现协同治疗。
本发明皮克林乳液的制备方法包括如下步骤：将分散有颗粒稳定剂并负载光热剂的水相连续相与负载疏水性小分子前药的油相分散相混合剪切乳化得到。所述剪切乳化为机械搅拌剪切乳化、撞击流剪切乳化或微流控剪切乳化。一些实施例中，所述分散有颗粒稳定剂的水相连续相的制备方法包括如下步骤：将光热剂和颗粒稳定剂与水溶剂混合，搅拌溶解得到所述分散有颗粒稳定剂的水相连续相；所述颗粒稳定剂在所述水相连续相中的含量为2wt％～40wt％。
一些实施例中，所述油相分散相的制备方法包括如下步骤：将疏水性化疗药物与生物相容性有机溶剂以及第二有机溶剂混合，使得所述疏水性化疗药物分散在所述生物相容性有机溶剂中，然后去除所述第二有机溶剂，得到所述油相分散相；其中所述第二有机溶剂用于促进所述疏水性化疗药物在生物相容性有机溶剂中的分散；所述生物相容性有机溶剂为肉豆蔻酸异丙酯、辛酸癸酸三甘油酯和角鲨烯中的一种或多种。所述第二有机溶剂为CH2Cl2(二氯甲烷)、C4H8O2(乙酸乙酯)和C2H5OC2H5(乙醚)中的一种或多种。
本发明一些实施例中提供的稳定共载的皮克林乳液载药系统的制备方法，包括如下步骤：
(1)将光热剂、蛋白颗粒与溶剂混合，涡旋振荡，获得含光热剂的连续相；
(2)将疏水性小分子前药与生物相容性有机溶剂超声混合，加入助溶剂(第二有机溶剂)超声混合，旋转蒸发，除去第二有机溶剂，获得含小分子前药的分散相；
(3)将步骤(1)和步骤(2)获得的连续相与分散相混合，高速剪切搅拌后得到牛血清蛋白稳定共载光热剂和疏水性小分子前药的皮克林乳液载药系统。
一些实施例中，步骤(2)所述涡旋振荡时间为3～5min；步骤(2)所述超声其超声功率为100～180W，超声时间5～10min；步骤(3)所述高速剪切搅拌的时间不短于30s，搅拌转速为13000～17000rpm，优选地控制在15000±500rpm。实验中发现剪切搅拌时间延长有利于获得液滴粒径更小、均一的皮克林乳液。可能原因是剪切搅拌过程中蛋白颗粒与油水界面接触更加充分，对其吸附率更高，并在油水界面形成了致密的单分子吸附层或多分子吸附层，阻碍了乳液液滴的运动和碰撞，因此观察到的液滴大小更小更均一。
本发明提供的皮克林乳液载药系统可用于制备治疗和/或预防癌症的药物；所述癌症包括但不限于为乳腺癌、肝癌、结肠癌、卵巢癌或黑色素瘤。同时本发明还提供了一种抗癌药物，包含所述的皮克林乳液载药系统和药学上可接受的添加剂。
与传统的纳米药物相比，本发明提出的基于高内相乳液构建的载药系统能同时负载亲疏水性药物，其高载药量、高粘度的特性使得化疗药物和光热剂能以高浓度滞留在肿瘤部位，克服传统纳米药物和光热剂在肿瘤中有效浓度不足的问题。本发明在皮克林乳液载药系统中共载化疗药物，能够避免传统化疗药物因水溶性差而导致的一系列临床不良反应，同时还能实现光热化疗协同治疗，显著增强肿瘤治疗效果。
本发明牛血清蛋白稳定共载光热剂和疏水性小分子前药的皮克林乳液载药系统的制备方法简单，如图1所示，首先将光热剂与蛋白颗粒混合振荡得到含光热剂的连续相，由于光热剂和蛋白颗粒电荷相同，因此蛋白颗粒不会与光热剂自组装形成纳米粒，然后将该连续相与含疏水性小分子前药的分散相混合剪切搅拌，通过蛋白颗粒的乳化作用稳定两相系统，光热剂加入与否对皮克林乳液流变性能影响不大，使得高载量光热剂成为可能，得到的皮克林乳液载药系统中液滴尺寸约为2～20μm。
本发明提供的稳定共载的皮克林乳液载药系统中含有疏水性小分子前药，能够用于制备治疗或预防癌症的药物，还含有光热剂，能对小分子前药的治疗效果发挥增效作用。这里癌症种类包括但不限于为乳腺癌、肝癌、结肠癌、卵巢癌或黑色素瘤。用于制备抗癌药物时，包含本发明所述的纳米载药系统和药学上可接受的添加剂。该抗癌药物剂型可以为各种剂型，包括但不限于为注射剂、粉针剂、口服剂、喷雾剂、胶囊剂或栓剂。肉豆蔻酸异丙酯是一种无色透明油状液体，不易氧化和水解，生物相容性良好、广泛应用于化妆品、药物配方以及药物递送系统中。本发明利用牛血清蛋白颗粒作为乳化剂来稳定皮克林乳液两相系统，同时对皮克林乳液的流变性能具有调控作用，使其能够通过瘤内注射的方式进一步放大自身载药量高的特点，提高肿瘤治疗效果。
本发明优选实施例中，选择牛血清蛋白颗粒作为乳化剂，选择肉豆蔻酸异丙酯作为油相，选择聚多巴胺纳米粒作为光热治疗的药物，选择紫杉醇作为化疗药物，制备得到乳液液滴尺寸在2～20μm左右，结构稳定的皮克林乳液。与游离聚多巴胺相比，该皮克林乳液表现出更好的体内外光热性能；与游离紫杉醇对比，该皮克林乳液在乳腺癌4T1皮下瘤小鼠模型中显示出更好的抗肿瘤效果，同时显示出良好的生物安全性。本发明提供的皮克林乳液载药体系，通过调控流变性能有利于瘤内注射放大自身载药量高的特点，同时利用激光照射肿瘤部位能够快速升高肿瘤部位的温度，实现光热疗法和化疗的联合治疗，增强抗肿瘤疗效，因此本发明提出的纳米载药体系具有良好的应用前景。
以下为实施例：
实施例1
牛血清蛋白稳定的皮克林高内相乳液BSA HIPEs的制备和表征。利用高速剪切搅拌法制备了油相体积分数为80％的牛血清蛋白稳定皮克林高内相乳液BSA HIPEs，具体方法如下：
(1)称取0.1mgBSA固体粉末，加入1mL超纯水在室温条件下置于涡旋振荡器上搅拌，使其充分溶解后静置至没有观察到明显气泡，DLS测得其水合粒径约为10nm。
(2)向上述(1)中溶有BSA的样品瓶中加入3.4g油相肉豆蔻酸异丙酯(Isopropylmyristate，IPM)。高速剪切乳化前分别使用无水乙醇和超纯水各清洗剪切机探头一次，吸水纸吸干，将样品瓶置于升降台上。高速剪切机探头伸至离瓶底0.5cm处，室温条件下，在剪切转速15000rpm条件下，由下至上对油水混合物进行剪切搅拌。制得的BSA HIPEs置于4℃冰箱中保存备用。将制备的BSA HIPEs分别分散在超纯水和肉豆蔻酸异丙酯中，结果如图2所示。BSA HIPEs在水中均匀分散，而在肉豆蔻酸异丙酯中分散较差，说明该BSA HIPEs是一种典型的水包油型(O/W)乳液。BSA HIPEs在倒立后仍能维持形态而未发生明显流动，呈现出半固体状态，说明该BSA HIPEs是一种典型的高内相乳液。
分别使用莱卡显微镜和荧光共聚焦显微镜对上述BSA HIPEs样品的形貌进行观察。分别使用莱卡显微镜和荧光共聚焦显微镜对上述BSA HIPEs样品进行观察，具体操作步骤如下：对于莱卡显微镜，取50μg的BSA HIPEs乳液于超纯水中稀释不同倍数，颠倒摇匀后在不同放大倍数的物镜下进行明场成像，结果如图3所示，图3内容(a)为未稀释，图3内容(b)为稀释10倍，图3内容(c)为稀释100倍，BSA HIPEs中液滴相对较为均一，大小在2～20μm范围内，加入超纯水稀释后液滴能够较好地分散。
激光共聚焦显微镜观察：在剪切乳化前使用荧光染料Cyanine 5(Ex＝646nm，Em＝664nm)和香豆素6(C6，Ex＝360nm，Em＝477nm)分别对BSA HIPEs的水相和油相进行标记。Cyanine 5和C6的工作浓度分别为1μg/mL，2μg/mL。采用激光共聚焦显微镜FV3000进行观察和图像采集，测试前应尽量减少样本被暴露于光照下，将样品滴加到载玻片中心，沿盖玻片边缘与样品贴合轻轻盖上，避免产生气泡。同时在488nm和633nm的激发波长下激发，发射波长稍大于相应激发波长，相应接收波长应设置在激发波长10nm后的位置，调节好后在尽短的时间内采集荧光图像。结果如图4所示，图4内容(a)为明场，图4内容(b)为Cyanine 5标记的水相，图4内容(c)为Coumarin 6标记的油相，图4内容(d)为图像叠加结果。绿色荧光代表油相，红色荧光代表水相，进一步验证了制备的乳液类型为水包油型，且液滴大小与明场显微镜结果基本一致。
实施例2
BSA HIPEs的流变性能测试:使用旋转流变仪对BSA HIPEs的流变性能进行测试。具体流变仪测试条件如下：锥板直径为60mm，锥角1°，间隙0.05mm。a)流动性测试：在25℃条件下，设置剪切速率为0.01s-1到1000s-1，选择流动模式对待测乳液的粘度随剪切速率变化的关系进行测试；b)线性粘弹区测试：恒定1Hz剪切频率下，设置应变为0.01到100％，选择振幅扫描模式对待测乳液的屈服应力进行测试；c)粘弹性测试：在线性粘弹性区下，设置角频率为0.1到600rad/s，选择频率扫描模式对待测乳液的弹性模量和复数粘度随角频率变化的关系进行测试；d)乳液温度稳定性测试：在恒定1％的剪切应变和1Hz的剪切频率下，在不同温度条件下(25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃)，对待测样品的弹性模量随温度变化的关系进行测试。同时探究了不同BSA浓度和不同剪切速率对BSA HIPEs流变性能的影响。不同BSA浓度(2wt％、6wt％、10wt％)制备的BSA HIPEs流变测试结果如图5内容(a)、内容(b)所示。不同剪切速率(13000rpm、15000rpm、17000rpm)制备的BSA HIPEs的流变结果如图5内容(c)和内容(d)所示。
结果显示，当施加较小的剪切应变时，G’＞＞G”。随着剪切应变的增加，G’明显下降最终G’<G”。BSA HIPEs的G’值随着BSA浓度的增加而增大，在BSA浓度为10wt％时最大，在BSA浓度为2wt％时最小，10wt％的BSA HIPEs弹性模量显著高于2wt％，稳定性更好。BSAHIPEs的G’值在剪切速率为15000rpm时G’达到最大，在剪切速率为13000rpm时G’最小，15000rpm时制备所得BSA HIPEs的G’显著高于13000rpm。流变测试结果G'在保证乳液能维持半固体状的前提下尽量小，以有利于通过瘤内注射将光热剂和小分子前药高效递送至肿瘤部位。
实施例3
探究pH对BSA HIPEs的稳定性影响
在连续相不同pH的条件下，采用高速剪切搅拌法制备油相体积分数为80％的BSAHIPEs，并探究了不同连续相pH(3、5、7、9、11)对BSA HIPEs的稳定性影响，如图6所示，实验中根据需要采用氢氧化钠和/或盐酸调控连续相pH。不同连续相pH制备的BSA HIPEs外观图如图6内容(a)和内容(b)所示；不同连续相的pH制备的BSA HIPEs微观形貌图如图6内容(c)所示；乳化剂BSA在不同pH条件下的粒径和Zeta电位曲线图如图6内容(d)和内容(e)所示。
结果显示，pH 5～9范围内制备的BSA HIPEs外观上为乳白色不透明油状物，色泽较为均一，无油水分层现象，且在倒置后仍能保持半固体形态，表明该条件制备的BSAHIPEs稳定性较好。在pH 5～9范围内，BSA HIPEs的乳液的粒径随着pH的升高而出现更多粒径较大的油滴。在pH 5、pH 7时，液滴中大油滴相对较少，油滴间未发生明显的聚集，表明此pH条件下制备的BSA HIPEs稳定性相对更好。在pH处于5～9范围内时，BSA的粒径虽然随着pH的增加而缓慢增加，但粒径变化幅度较小，从约25nm增加到约110nm，说明此pH范围内BSA活性受影响较小。
实施例4
聚多巴胺纳米粒的制备与表征
采用碱性自聚合法制备聚多巴胺纳米粒(PDA NPs)。具体步骤如下：准确称取180mg盐酸多巴胺固体粉末，于90mL超纯水中充分溶解，得到反应浓度为2mg/mL的多巴胺溶液。在50℃油浴锅中，对多巴胺溶液预热10min后，加入760μL浓度为1M的NaOH，使最终pH稳定在9左右，有氧条件下剧烈搅拌反应5h。得到的聚多巴胺溶液用0.22μm微孔滤膜抽真空过滤后，室温下台式高速离心机以转速12000rpm/min离心15min，小心吸掉上清液，加入超纯水重悬底部黑色沉淀，重复离心洗涤3次，最后用超纯水重悬，存储于4℃冰箱中备用。PDA的浓度测定采用真空干燥法测定PDA浓度。对1mL空离心管重量进行称量后，吸取100μL的PDA溶液于离心管中，置于真空干燥箱中干燥。干燥完成后称量离心管重量，平行重复3个样品管，以真空干燥前后两次的称量结果之差计算反应所得PDA的浓度。PDA NPs的粒径和形貌分别使用电镜和动态光散射法对聚多巴胺的粒径进行表征，结果如图7内容(a)和内容(b)所示。
结果显示，制备的PDA为规则的球形，且粒径分布较为均一，未出现明显团聚现象，粒径大小约为180nm，与DLS测试得到的水合粒径结果基本吻合。
实施例5
负载紫杉醇和聚多巴胺的高内相乳液的制备。
首先将制备的PDA溶液用超纯水稀释至2mg/mL，接着称取200mg BSA固体颗粒，加入500μL超纯水，涡旋振荡使BSA充分溶解，然后加入500μL上述PDA溶液，轻轻混匀，此时水相体积为1mL。准确称取31.25mg的PTX固体粉末溶于5mL肉豆蔻酸异丙酯中，加入2.5mL二氯甲烷助溶，此时溶液由混装变为澄清透明。37℃下旋转蒸发将助溶的二氯甲烷除净，吸取4mL溶有PTX的油相至上述水相中，此时PTX的浓度为5mg/mL，油水总体积5mL。通过高速剪切搅拌机以15000rpm由下至上搅拌30s，制备得到PTX@PDA/BSA HIPEs，置于4℃冰箱中保存备用。
实施例6
探究PDA浓度对PTX@PDA/BSA HIPEs流变性能的影响。
负载PDA纳米粒和PTX的PTX@PDA/BSA HIPEs制备流程及外观如图7内容(c)所示，固定BSA浓度为10wt％，探究不同PDA浓度(0μg/mL、25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、250μg/mL、500μg/mL)对PTX@PDA/BSA HIPEs流变性能的影响，结果如图7内容(d)所示。对不同BSA浓度(10wt％、15wt％、20wt％、30wt％、40wt％)制备的PTX@PDA/BSA HIPEs的表观粘度随剪切速率变化进行流变学测试，结果如图7内容(e)所示，其粘度测试结果和高内相乳液半固体的状态均能说明该乳液粘度较高。对不同BSA浓度(5wt％、10wt％、15wt％、20wt％)制备的PTX@PDA/BSA HIPEs的流变性能进行测试，结果如图7内容(f)所示。
结果显示，PDA纳米粒浓度为0～500μg/mL范围内时，PTX@PDA/BSA HIPEs的G’值波动较小，PDA对PTX@PDA/BSA HIPEs流变性能的影响较小，PTX@PDA/BSA HIPEs流变性能主要受BSA调控。
实施例7
PTX@PDA/BSA HIPEs的离心稳定性测试
乳液离心稳定性通过离心加速油水分层并计算相应乳析指数进行考察。室温下，取1.5mL的PTX@PDA/BSA HIPEs于2.0mL离心管中，在不同离心转速下(3000rpm、5000rpm、7000rpm、9000rpm、11000rpm)离心5min后，PTX@PDA/BSA HIPEs的宏观和微观形态如图8内容(a)所示。离心结束后用注射器小心吸取底部连续相，分别测定不同转速离心前后连续相下清液的体积V0和V并根据公式CI＝(V-V0)/V0×100％计算相应乳析指数，结果如图8内容(b)所示。
结果显示，在3000～11000rpm范围离心后，PTX@PDA/BSA HIPEs出现了不同程度的油水分层现象，显微镜结果显示，PTX@PDA/BSA HIPEs中油滴的大小随离心力的增加而增大，液滴间的融合、聚结程度增大，表现为液滴粒径增大。在3000～11000rpm离心后，PTX@PDA/BSA HIPEs的乳析指数均未超过8％。说明PTX@PDA/BSA HIPEs的离心稳定性良好。
实施例8
PTX@PDA/BSA HIPEs的温度稳定性测试
取800μL乳液于流变仪样品台表面，用塑料刮刀将其铺展均匀，在1％的恒定应变和1Hz的恒定频率下，通过旋转流变仪的动态温度扫描模式测试不同温度(25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃)下待测样品的G’和G”与温度间的关系曲线，结果如图8内容(c)所示。
结果显示，在此温度范围内，PTX@PDA/BSA HIPEs的G’值随着温度的逐渐升高。温度低于50℃时，BSA浓度为10wt％制备的PTX@PDA/BSA HIPE的G’值变化不显著，具有较好的温度稳定性，能够避免光热过程中乳液因光热剂PDA升温导致自身结构不稳定。
实施例9
PDA/BSA HIPEs的体外升温能力
以超纯水作为空白组，BSA/HIPEs作为对照组，取相同浓度的PDA纳米粒和PDA/BSAHIPEs与离心管中在808nm激光照射10min，每间隔2min通过热成像仪记录一次温度，并比较了不同PDA浓度(0μg/mL、25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、250μg/mL、500μg/mL)和不同激光照射功率(0.25W/cm2、0.5W/cm2、0.75W/cm2、0.1W/cm2、1.25W/cm2)下PDA/BSA/HIPEs的升温能力。首先对比了PDA/BSA HIPEs与游离PDA的光热性能，从图9内容(a)所示。不同PDA浓度下，PDA/BSA HIPEs的升温结果如图9内容(b)所示，不同激光功率下，PDA/BSA HIPEs的升温结果如图9内容(c)和内容(d)所示。
结果显示，PDA/BSA HIPEs的光热性能优于游离PDA，且与PDA浓度以及激光功率正相关。在近红外光照射相同时间内，PDA/BSA HIPEs相较于游离PDA升高的温度更高，表现出更好的光热性能。同时包载PTX和PDA的乳液体系PTX@PDA/BSA HIPE经测试与PDA/BSAHIPEs表现出相同的光热性能。
实施例10
细胞毒性实验。当细胞生长到80％左右汇合度时，对细胞进行消化离心收集，6mL完全培养基重悬后，细胞计数板计数，然后将细胞悬液稀释到合适浓度。以每孔5×103个4T1细胞接种到96孔板中，培养液体积为100μL，每组6个平行孔，96孔板外围孔每孔用150μLPBS液封。24h后，吸出旧培养基，分别给予BSA HIPEs、游离PTX、PTX@PDA/BSA HIPEs不光照和PTX@PDA/BSA HIPEs光照5min处理(1μg/mL、2μg/mL、4μg/mL、8μg/mL、16μg/mL PTX)。808nm激光功率1.5W/cm2，光照5min。空白组不铺细胞只加完全培养基，对照组细胞只加完全培养基进行孵育。继续孵育24h后，每孔加入10μL cck8检测工作液。在细胞培养箱中继续孵育4h后将培养基移入干净96孔板，用酶标仪检测每个孔的吸光度值，波长为570nm，并计算细胞存活率：PTX@PDA/BSA HIPEs对4T1肿瘤细胞的cck8细胞毒性结果如图10内容(a)所示，图中PTX@PDA/BSA HIPEs(-)表示PTX@PDA/BSA HIPEs不光照，PTX@PDA/BSA HIPEs(+)表示PTX@PDA/BSA HIPEs光照5min处理。
结果显示，游离PTX对4T1肿瘤细胞的杀伤效果较差，主要由于游离PTX水溶性差，导致其通过培养基稀释给药后容易析出，生物利用度低。与其它各组相比，PTX@PDA/BSAHIPEs光热组的细胞毒性最强，且当PTX浓度在4μg/mL时，其毒性效果相较其它组更加明显，表现出较好的光热化疗协同杀伤作用。
实施例11
细胞死活染色实验
共聚焦激光扫描显微镜观察。按照细胞传代的步骤消化收集细胞，计数后稀释至适合的浓度。以每皿1.5×105个细胞的浓度将4T1细胞接种至共聚焦皿中，培养体积为1mL。细胞过夜培养后，分别给予HIPEs、游离PTX、PTX@PDA/BSA HIPEs不光照和PTX@PDA/BSAHIPEs光照5min处理(PTX浓度分别为1μg/mL、2μg/mL、4μg/mL、8μg/mL、16μg/mL)。激光功率1.5W/cm2，光照5min。孵育12h后，吸掉旧培养基，PBS清洗3次，加入1mL4％多聚甲醛固定，室温避光20min。PBS清洗3次，加入1mL Calcein AM/PI检测工作液，室温避光孵育20min。PBS清洗3次后，加入1mL PBS，在共聚焦激光扫描显微镜下对细胞进行观察并拍照。Calcein AM为绿色荧光，Ex/Em＝494/517nm；PI为红色荧光，Ex/Em＝535/617nm。共聚焦激光扫描显微镜结果如图10内容(b)所示。
结果显示，BSA HIPEs的绿色荧光信号最强，且红色荧光信号最弱，对4T1细胞的毒性较弱。相较于游离PTX组以及PTX@PDA/BSA HIPEs不光照组，PTX@PDA/BSA HIPEs光照组的红色荧光信号最明显，具有更强的4T1肿瘤细胞杀伤能力。
实施例12
PDA/BSA HIPEs的体内光热性能
选取6周龄，20g雌性BALB/c小鼠提前在实验室饲养1周以适应环境，刮掉小鼠右后肢毛发以便于接种4T1乳腺癌细胞。4T1细胞培养至80％左右汇合度时进行消化离心收集，并用PBS稀释为1×107个/mL的细胞悬液，放于冰上备用。用胰岛素注射器将100μL细胞悬液注射到小鼠右后肢上方部位，建立小鼠乳腺癌4T1皮下瘤小鼠模型后将小鼠放回鼠笼中继续饲养。相同浓度的游离PDA和PDA/BSA HIPEs经瘤内注射后，在不同时间点通过808nm激光照射升温，随后使用热成像仪拍照并对其定量分析，结果如图11内容(a)和内容(b)所示。
结果显示，在此PDA浓度下，游离PDA组的升温效果随着光照时间的延后而有略微改善，在注射后48h进行光照的条件下表现最好。相较于注射后0h、24h和48h光照，PDA/BSAHIPEs组的光热效果表现均优于Saline组和游离PDA组。此外，PDA/BSA HIPEs组注射后立即光照相较于注射后24h和48h光照表现出最好的光热效果，提示PDA/BSA HIPEs在给药后应立即光照。
实施例13
PDA/BSA HIPEs体内升温激光功率筛选
按照实施例12所述方法构建小鼠4T1皮下瘤模型，使用不同功率(0.5W/cm-2、0.75W/cm-2、1W/cm-2、1.5W/cm-2)的808nm激光对瘤内注射相同剂量PDA/BSA HIPEs的小鼠肿瘤进行光照10min，PDA浓度为200μg/mL，结果如图12内容(a)和内容(b)所示。
结果显示，PDA/BSA HIPEs的体内升温效果与激光功率成正相关，激光功率越高，其升温效果越显著，并优选激光照射功率为1.5W/cm2照射5min作为后续动物药效实验条件，以保证体内光热温度不低于46℃。
实施例14
PTX@PDA/BSA HIPEs的动物药效实验评价抗肿瘤效果
按照实施例12所述方法构建小鼠4T1皮下瘤模型，待肿瘤体积达到50mm3左右时，将小鼠随机分成6组：(1)Saline；(2)Free PTX；(3)BSA HIPEs；(4)PDA/BSA HIPEs+Laser；(5)PTX@PDA/BSA HIPEs不光照；(6)PTX@PDA/BSA HIPEs光照，每组6只小鼠，记为第0天。第1天对各组小鼠进行一次不同药物的瘤内注射，注射体积25μL，对于PDA/BSA HIPEs和PTX@PDA/BSA HIPEs(PTX剂量为5mg/kg)，瘤内注射后立即使用808nm激光器以1.5W/cm2的功率照射小鼠肿瘤部位5min。自第1天起，每隔一天称量一次小鼠体重，使用游标卡尺测量每只小鼠的肿瘤长径(a)和宽径(b)，计算瘤体积并绘制瘤体积时间曲线。肿瘤体积计算公式为：V＝(a×b^2)/2，其中V表示肿瘤体积，a表示肿瘤长径，b表示肿瘤短径。在第18天的实验终点以颈椎脱臼法处死小鼠，剥离皮下瘤，称重拍照。药效实验结果如图13所示。各组小鼠肿瘤照片如图13内容(a)所示，小鼠肿瘤生长曲线如图13内容(b)所示，小鼠瘤重如图13内容(c)所示。将剥离的肿瘤用4％的多聚甲醛固定，石蜡包埋切片，进行H&E染色，Ki67和TUNEL免疫荧光染色，结果如图13内容(d)所示。图中G1：Saline；G2：Free PTX；G3：BSA HIPEs；G4：PDA/BSA HIPEs(+)；G5：PTX@PDA/BSA HIPEs(-)；G6：PTX@PDA/BSA HIPEs(+)。
结果显示，PTX@PDA/BSA HIPEs光照处理组的小鼠肿瘤在外观上较其他各组明显更小，且有一只小鼠的瘤子完全消除。PTX@PDA/BSA HIPEs光照组中小鼠肿瘤细胞大量死亡且显示出更大的坏死面积。相较于游离PTX组(Free PTX)、纯化疗组(PTX@PDA/BSA HIPEs不光照)和纯光热组(PDA/BSA HIPEs光照)，PTX@PDA/BSA HIPEs光照组均表现出更好的抑瘤效果，抑瘤率达到86.0％。PTX@PDA/BSA HIPEs能通过抑制4T1肿瘤细胞的增殖诱导肿瘤细胞凋亡，在一定程度上实现光热化疗协同治疗，具备良好的体内抗肿瘤效果。
实施例15
PTX@PDA/BSA HIPEs的生物安全性评价
血常规指标主要检测血浆中白细胞(White blood cell，WBC、红细胞(Red bloodcell，RBC)和血小板(Platelet，PLT)的含量。采血前向1.5mL离心管中加入不超过150μL的抗凝剂肝素钠，取血后立即加入至含抗凝血剂的离心管并充分混合：以相对离心力1200g离心血样10～15min。用移液枪吸取分离后上层液体，转移到干净的离心管中。必要时可将血浆样本在1200g下再离心5min，以分离任何可能残余的红细胞。血生化指标主要测定血清中谷丙转氨酶(Alanine aminotransferase，ALT)、谷草转氨酶(Asparateaminotransferase，AST)、尿素氮(Blood urea nitrogen，BUN)、肌酸激酶(Creatinekinase，CK)等指标。采血后，立即将血液放入1.5mL离心管(不加抗凝剂)。室温静置30～60min后，以相对离心力1200g离心血样10～15min，吸取上层液体转移到干净离心管中。4℃冰箱中放置过夜后，1200g离心5min，收集上层血清。图14内容(a)为小鼠经不同给药处理后体重的变化，评价不同药物对小鼠的毒性；图14内容(b)为血液中白细胞的量；图14内容(c)为血液中血红蛋白的量；图14内容(d)为血液中血小板的量；图14内容(e)为血清中谷丙转氨酶的量；图14内容(f)为谷草转氨酶的量；图14内容(g)为血清中肌酸激酶的量；图14内容(h)为血清中尿素氮的量。G1：Saline；G2：Free PTX；G3：BSA HIPEs；G4：PDA/BSA HIPEs(+)；G5：PTX@PDA/BSA HIPEs(-)；G6：PTX@PDA/BSA HIPEs(+)(n＝3；Mean±SD；ns，nosignificance；*，p<0.05；**，p<0.01；***，p<0.001)。
通过苏木精伊红染色法(Hematoxylin-eosin staining，H&E)对试验终点处小鼠的主要器官切片进行染色。碱性的苏木精染料能够使细胞核内的染色质和胞质内的核酸染为紫蓝色，酸性的伊红染料能够使细胞质和细胞外基质中的胶原纤维、弹性纤维蛋白、红血球、蛋白性液体等成分染为红色。不同组小鼠心、肝、脾、肺和肾的H&E染色切片结果如图15所示。
结果显示，PTX@PDA/BSA HIPEs组在给药后第二天小鼠体重有略微下降，但在给药后第四天体重得以恢复。血常规结果显示各组白细胞(WBC)、红细胞(RBC)、血红蛋白(HGB)及血小板(PLT)数均在正常范围内。血生化结果显示各组谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、尿素氮(BUN)和肌酸激酶(CK)等血生化指标也均未超出正常范围。各组小鼠的主要器官切片结果中未观察到明显的病理性变化，证明在药效实验所用剂量下，PTX@PDA/BSAHIPEs具有良好的生物安全性。
本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (4)
1.一种蛋白颗粒稳定共载光热剂和化疗药物的皮克林乳液载药系统，其特征在于，其包含水相连续相、油相分散相和颗粒稳定剂；其为以颗粒稳定剂作为乳化剂乳化得到的水相连续相包裹油相分散相的皮克林乳液；
所述水相连续相为光热剂分散在水中得到的连续相，所述油相分散相为疏水性化疗药物分散在生物相容性有机溶剂中得到的分散相，所述颗粒稳定剂为蛋白颗粒；
该皮克林乳液载药系统为由所述水相连续相、油相分散相和颗粒稳定剂混合后经剪切乳化得到的水包油型皮克林乳液；
所述光热剂为聚多巴胺；所述疏水性化疗药物为疏水性小分子前药；所述生物相容性有机溶剂为肉豆蔻酸异丙酯；所述蛋白颗粒为牛血清蛋白颗粒；
所述皮克林乳液中所述油相分散相的体积分数为74%~87%；所述疏水性化疗药物的载药量为1~5 mg/mL；所述光热剂的载药量小于或等于1000 μg/mL；所述水相连续相的pH范围为5~7。
2.如权利要求1所述的载药系统的制备方法，其特征在于，将分散有所述颗粒稳定剂的水相连续相与所述油相分散相混合后经剪切乳化得到；
所述分散有颗粒稳定剂的水相连续相的制备方法包括如下步骤：将光热剂、颗粒稳定剂与水溶剂混合得到所述分散有颗粒稳定剂的水相连续相；所述颗粒稳定剂在所述水相连续相中的含量为2wt%~40wt%；
所述油相分散相的制备方法包括如下步骤：将疏水性化疗药物与生物相容性有机溶剂以及第二有机溶剂混合，使得所述疏水性化疗药物分散在所述生物相容性有机溶剂中，然后去除所述第二有机溶剂，得到所述油相分散相；
其中所述第二有机溶剂用于促进所述疏水性化疗药物在生物相容性有机溶剂中的分散；所述生物相容性有机溶剂为肉豆蔻酸异丙酯；所述第二有机溶剂为CH2Cl2、C4H8O2和C2H5OC2H5中的一种或多种。
3.如权利要求1所述的皮克林乳液载药系统在制备治疗和/或预防癌症的药物中的应用。
4.一种抗癌药物，其特征在于，包含如权利要求1所述的皮克林乳液载药系统和药学上可接受的添加剂。
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