CN115004030A - 方法 - Google Patents

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Abstract

本文提供了一种将拴系复合物集中在如脂质膜等两亲性层的区域中的方法。本文还提供了组装拴系复合物的方法；将分析物集中在检测器的区域中的方法；两亲性层；以及在所公开方法中使用的阵列和装置。

Description

方法
技术领域
本公开涉及将拴系复合物集中在如脂质膜等两亲性层的区域中的方法。本公开还涉及组装拴系复合物的方法；将分析物集中在检测器的区域中的方法；两亲性层；以及在所公开方法中使用的阵列和装置。
背景技术
生物分子的表征在生物医学和生物技术应用中越来越重要。
例如，核酸的测序允许研究基因组和其编码的蛋白质，并且例如允许在核酸突变与可观察现象(如疾病适应症)之间建立相关性。可以在进化生物学中使用测序来研究生物体之间的关系。宏基因组学涉及通过允许鉴定样品中存在的生物体，例如微生物组中的微生物，的核酸测序来鉴定所述生物体。在医学上，受试者的基因检测可以突显遗传疾病的风险或允许选择最佳疗法来治疗医学病状。DNA测序也是法医学中的一项关键技术。
如多肽等其它分析物的表征也非常重要。例如，蛋白质序列的知识可以允许建立结构-活性关系，并且对用于开发特定受体的配体的合理药物开发策略产生影响。翻译后修饰的鉴定也是理解许多蛋白质的功能性质的关键。例如，通常30％-50％的蛋白质物种在真核生物中被磷酸化。一些蛋白质可能具有多个磷酸化位点，用于激活或灭活蛋白质、促进蛋白质降解或调节与蛋白质配偶体的相互作用。
可以使用许多已知技术来表征包含核酸和多肽在内的分析物。单分子技术已被证明特别有吸引人的，因为它们具有高保真度、避免扩增偏差以及可能实现极长读段长度。多核苷酸和多肽的单分子测序还可以提供与如碱基修饰、氧化、还原、脱羧基、脱氨基、翻译后修饰等特性的存在有关的信息。
单分子分析物表征的一种有吸引力的方法是纳米孔感测。纳米孔感测是一种依赖于对分析物分子与离子传导通道之间的个别结合或相互作用事件的观察的分析物检测和表征方法。可以通过在电绝缘膜中放置纳米尺寸的单孔和测量在存在分析物分子的情况下通过孔的电压驱动的离子电流来产生纳米孔传感器。纳米孔内部或附近的分析物的存在将改变通过孔的离子流，从而引起在通道上测量的离子或电流改变。分析物的同一性通过其独特的电流特征揭露，尤其是电流块的持续时间和程度以及与孔相互作用期间电流电平的变化。纳米孔感测可能允许快速且廉价的多核苷酸测序，从而提供数十到数万个碱基长度的多核苷酸的单分子序列读段。纳米孔感测还可以允许对包含多肽在内的其它技术上重要的分析物进行快速且低成本的表征。
对于纳米孔应用，需要高效地捕获分析物。例如，在DNA测序中，重要的是，一旦已对前一分析物进行处理，就通过孔捕获新的分析物。类似的考虑适用于如多肽等其它分析物的纳米孔表征。
为了解决此问题，已知的是，使用疏水性系链(也称为锚)将分析物连接到纳米孔所处的膜。通过将分析物连接到膜，纳米孔附近分析物的局部浓度相对于本体溶液增加。这会提高使用纳米孔表征分析物的效率。
尽管已证明此类连接方法可用于促进如多核苷酸和多肽等分析物的表征，但仍存在一些技术问题。一个问题是，用于将分析物连接到膜的系链就其能够进入的位置而言通常是非选择性的；例如，在发现与系链结合并用于产生膜的两亲性分子的化学环境方面，系链通常是非选择性的。这会导致效率损失，因为如果此类两亲性分子不在纳米孔附近，则纳米孔可能无法获得与两亲性分子连接的分析物分子以进行表征。因此，需要将分析物集中在纳米孔的区域中的另外方法。
发明内容
本公开涉及在两亲性层如脂质膜的区域中集中拴系复合物的方法。两亲性层包括多个两亲性分子和检测器，如纳米孔。虽然本公开提供了作为示例性检测器的纳米孔，但本文所提供的方法适用于检测器，所述检测器包含(i)零模波导，(ii)场效应晶体管，任选地纳米线场效应晶体管；(iii)AFM尖端；(iv)纳米管，任选地碳纳米管以及(v)纳米孔。
拴系复合物可以用于与分析物连接以使分析物能够集中在拴系复合物集中的两亲性层的区域中。通过将拴系复合物集中在包括纳米孔的两亲性层的区域中，待使用纳米孔检测的分析物可以集中在纳米孔附近。
用于所公开的方法的拴系复合物包括通过疏水性接头连接的一种或多种亲水性组分。亲水性组分可以例如是可以与分析物连接以使分析物能够定位并且因此促进其表征的组分。
所公开的方法包括使所述拴系复合物或其一种或多种组分与所述两亲性分子接触。所述两亲性层包括第一区域和第二区域，所述第一区域包括所述检测器，其中所述第一区域在化学上和/或物理上不同于所述第二区域，并且其中相对于所述第二区域，所述拴系复合物优先定位到所述第一区域。这样，拴系复合物以及因此与所述拴系复合物连接的分析物分子集中在纳米孔的附近。
因此，本公开提供了一种将拴系复合物集中在两亲性层的区域中的方法，所述两亲性层包括多个两亲性分子和检测器，其中所述拴系复合物包括通过疏水性接头连接的一种或多种亲水性组分；
所述方法包括使所述拴系复合物或其一种或多种组分与所述多个两亲性分子接触；
并且其中所述两亲性层包括第一区域和第二区域，所述第一区域包括所述检测器，其中所述第一区域在化学上和/或物理上不同于所述第二区域，并且其中相对于所述第二区域，所述拴系复合物优先定位到所述第一区域；由此将所述拴系复合物集中在所述两亲性层的所述第一区域中。
在一些实施例中，拴系复合物包括通过疏水性接头与第二亲水性组分连接的第一亲水性组分。
在一些实施例中，所述第一区域是所述两亲性层的多层区域。
在一些实施例中，所述第一区域和所述第二区域两者均包括同一类型的两亲性分子。在一些实施例中，所述第一区域包括由两亲性分子构成的第一组合物并且所述两亲性第二区域包括由两亲性分子构成的第二组合物，并且所述第一组合物不同于所述第二组合物。
在一些实施例中，所述两亲性层的所述第一区域和所述第二区域分别对应于基材的第一区和第二区，其中所述基材的第一区在化学上和/或物理上不同于所述第二区。在一些实施例中，所述第一区对应于基材中的孔，并且所述第二区对应于所述基材的任选涂覆的部分。在一些实施例中，所述第一区域对应于第一液滴与第二液滴对之间的界面表面区，其中所述第一液滴和第二液滴各自具有两亲性涂层；并且所述第二区域对应于所述第一液滴的未与第二液滴介接的部分的表面区。在一些实施例中，所述第一区域和所述第二区域是所述两亲性层的相分离区域。
在一些实施例中，所述拴系复合物如本文所描述的组装。
本文还提供了一种用于将拴系复合物组装在两亲性层中的方法，其中所述拴系复合物包括通过疏水性接头连接的一种或多种亲水性组分；所述方法包括使所述拴系复合物或其一种或多种组分与多个两亲性分子接触并且随后形成所述两亲性层。
还提供了一种用于将拴系复合物组装在两亲性层中的方法，其中所述拴系复合物包括通过疏水性接头连接的一种或多种亲水性组分；所述方法包括(i)由多个两亲性分子形成所述两亲性层；以及(ii)使所述两亲性层与所述拴系复合物或其一种或多种组分接触
在一些实施例中，上述方法包括(i)使所述疏水性接头与所述两亲性分子或所述两亲性层接触；其中当所述疏水性接头与所述两亲性分子或两亲性层接触时，所述疏水性接头未与所述一种或多种亲水性组分中的至少一种亲水性组分连接；以及(ii)一旦已形成所述两亲性层，就将所述一种或多种亲水性组分中的至少一种亲水性组分与所述疏水性接头连接，由此形成所述拴系复合物。
本文还提供了一种用于将拴系复合物组装在两亲性层中的方法，其中所述拴系复合物包括通过疏水性接头与第二亲水性组分连接的第一亲水性组分，所述方法包括使所述拴系复合物或其一种或多种组分与多个两亲性分子接触并且随后形成所述两亲性层。
在一些实施例中，所述方法包括(i)使所述疏水性接头与所述多个两亲性分子接触；以及(ii)形成所述两亲性层。在一些实施例中，所述疏水性接头与所述第一亲水性组分和/或所述第二亲水性组分中的至少一者连接。
在一些实施例中，当所述疏水性接头与所述两亲性分子接触时，所述疏水性接头未与所述第一亲水性组分和/或所述第二亲水性组分连接，并且所述方法进一步包括一旦已形成所述两亲性层，就将所述第一亲水性组分和/或所述第二亲水性组分与所述疏水性接头连接，由此形成所述拴系复合物。
在一些实施例中，所述方法包括提供包括两亲性分子和所述疏水性接头的混合物；以及
A：(a)使孔与所述混合物接触，其中在所述孔的反式侧存在包括所述第二亲水性组分的缓冲液，使得包括所述疏水性接头的两亲性层跨所述孔形成，并且所述第二亲水性组分与所述疏水性接头连接；以及
(b)将包括所述第一亲水性组分的缓冲液添加到所述两亲性层的顺式侧，使得所述第一亲水性组分与所述疏水性接头连接；
或
B：(a)使孔与所述混合物接触，其中在所述孔的顺式侧存在包括所述第一亲水性组分的缓冲液，使得包括所述疏水性接头的两亲性层跨所述孔形成，并且所述第一亲水性组分与所述疏水性接头连接；以及
(b)将包括所述第二亲水性组分的缓冲液添加到所述两亲性层的反式侧，使得所述第二亲水性组分与所述疏水性接头连接。
在一些实施例中，所述方法包括：(a)提供包括两亲性分子和首先与第一亲水性组分结合的所述疏水性接头的混合物；以及(b)使孔与所述混合物接触，其中在所述孔的反式侧存在包括第二亲水性组分的缓冲液，使得包括所述疏水性接头的两亲性层跨所述孔形成，并且所述第二亲水性组分在膜的反式侧与所述疏水性接头连接。
在一些实施例中，所述方法包括(a)提供包括两亲性分子和首先与第二亲水性组分结合的所述疏水性接头的混合物；以及(b)使孔与所述混合物接触，其中在所述孔的顺式侧存在包括第一亲水性组分的缓冲液，使得包括所述疏水性接头的两亲性层跨所述孔形成，并且所述第一亲水性组分在膜的顺式侧与所述疏水性接头连接。
本文还提供了一种用于将拴系复合物组装在两亲性层中的方法，其中所述拴系复合物包括通过疏水性接头与第二亲水性组分连接的第一亲水性组分，所述方法包括：(i)由多个两亲性分子形成所述两亲性层；以及(ii)使所述两亲性层与所述疏水性接头接触；其中所述疏水性接头任选地与所述第一亲水性组分或所述第二亲水性组分连接。
在一些实施例中，所述方法进一步包括一旦已经形成所述两亲性层，就将所述第一亲水性组分和/或所述第二亲水性组分与所述疏水性接头连接，由此形成所述拴系复合物。
在一些实施例中，所述方法包括使所述第一亲水性组分；所述第二亲水性组分；以及所述疏水性接头接触；其中所述第一亲水性组分包括第一反应性基团；所述第二亲水性组分包括第二反应性基团；并且所述疏水性接头包括反应性基团；并且使所述第一反应性基团与所述疏水性接头上的反应性基团反应并且使所述第二反应性基团与所述疏水性接头上的反应性基团反应，以通过所述疏水性接头将所述第一亲水性组分与所述第二亲水性组分连接，由此形成所述拴系复合物。
还提供了一种用于将拴系复合物组装在两亲性层中的方法，其中所述拴系复合物包括通过疏水性接头与第二亲水性组分连接的第一亲水性组分，所述方法包括(a)使第一部分与第二部分接触，其中所述第一部分包括所述第一亲水性组分，所述第一亲水性组分与包括第一反应性基团的第一疏水性部分连接，并且所述第二部分包括所述第二亲水性组分，所述第二亲水性组分与包括第二反应性基团的第二疏水性部分连接；以及(b)使所述第一反应性基团与所述第二反应性基团反应，由此形成将所述第一亲水性组分与所述第二亲水性组分连接的疏水性接头，由此形成所述拴系复合物。
在一些实施例中，所述第一亲水性组分由所述两亲性层的第一面提供，并且所述第二亲水性组分由所述两亲性层的第二面提供。
在本文所提供的用于组装拴系复合物的方法的一些实施例中，所述方法进一步包括将检测器插入到所述两亲性层中。
在本文所描述的各种方法的一些实施例中，包括在所述拴系复合物中的所述疏水性接头与(i)所述一种或多种亲水性组分或(ii)所述第一亲水性组分和/或所述第二亲水性组分非共价连接。在一些实施例中，所述疏水性接头与(i)所述一种或多种亲水性组分或(ii)所述第一亲水性组分和/或所述第二亲水性组分非共价连接。在一些实施例中，(i)所述疏水性接头与所述第一亲水性组分共价连接并且与所述第二亲水性组分非共价连接；或(ii)所述疏水性接头与所述第一亲水性组分非共价连接并且与所述第二亲水性组分共价连接。在一些实施例中，所述疏水性接头包括以下或由以下组成：饱和或非饱和烃或有机分子、或饱和或非饱和无机分子；其中任选地所述疏水性接头包括以下或由以下组成：疏水性多肽、螺缩酮、聚二甲基硅氧烷(PDMS)、烷烃、蛋白质、跨膜孔、碳纳米管、天然脂质或合成脂质样分子。
在一些实施例中，(i)所述一种或多种亲水性组分中的至少一种亲水性组分；或(ii)所述第一亲水性组分包括分析物结合部分。在一些实施例中，(i)所述分析物结合部分包括生物素并且所述第一亲水性组分包括链霉亲和素；(ii)所述分析物结合部分包括胆固醇并且所述第一亲水性组分包括环糊精；或(iii)所述第一亲水性组分包括核苷酸或多核苷酸。
在一些实施例中，所述第二亲水性组分包括锚或锚结合部分；在一些实施例中，(i)所述锚结合部分包括生物素并且所述锚包括链霉亲和素；或(ii)所述锚结合部分包括胆固醇并且所述锚包括环糊精；或(iii)所述锚包括核苷酸或多核苷酸。
本文还提供了一种将分析物集中在检测器的区域中的方法，所述方法包括：
-如本文所描述的将拴系复合物集中在两亲性层中；以及
-使所述分析物与所述拴系复合物接触，使得所述分析物与所述拴系复合物的所述第一亲水性组分连接；
由此将所述分析物集中在所述检测器的区域中。
在一些实施例中，所述分析物与多个拴系复合物结合，由此将所述分析物集中在所述检测器的区域中。
本文还提供了一种将分析物集中在包括检测器的两亲性层的区域中的方法，所述方法包括将多个拴系复合物集中在所述检测器的区域中；以及
i)使所述分析物与所述拴系复合物接触，使得所述分析物与多个所述拴系复合物结合；或
ii)使以下接触：(A)夹板，所述夹板包括(i)用于所述拴系复合物的多个结合位点和(ii)用于所述分析物的一个或多个结合位点；以及(B)具有所述拴系复合物的所述分析物，使得所述夹板与多个所述拴系复合物结合并且所述分析物与所述夹板结合；
由此将所述分析物集中在所述检测器的区域中。
在一些实施例中，所述拴系复合物和/或所述两亲性层如本文所定义的。
本文还提供了一种表征靶分析物的方法；所述方法包括将所述分析物集中在如本文所描述的检测器的区域中，并且在所述分析物相对于所述检测器移动时进行一个或多个测量，其中所述一个或多个测量指示所述分析物的一种或多种特性，并且由此在所述分析物相对于所述检测器移动时对所述分析物进行表征。
在一些实施例中，对多种靶分析物进行表征。在一些实施例中，所述分析物或每种分析物是多核苷酸、蛋白质、肽、碳水化合物或代谢物。
在涉及检测器的那些所公开的方法中，一些实施例中的所述检测器包括跨膜纳米孔，所述跨膜纳米孔能够在所述分析物相对于所述纳米孔移动时表征所述分析物。
本文还提供了可通过本文所描述的方法获得的两亲性层。
还提供了一种两亲性层，所述两亲性层包括跨膜纳米孔和拴系复合物，其中所述拴系复合物包括跨越所述两亲性层的疏水性接头、位于所述两亲性层的顺式侧的第一亲水性组分和位于所述两亲性层的反式侧的第二亲水性组分。在一些实施例中，所述两亲性层包括第一区域和第二区域；其中所述第一区域在化学上和/或物理上不同于所述第二区域，并且其中所述纳米孔位于所述第一区域中并且所述拴系复合物集中在所述第一区域中。
在一些实施例中，所提供的两亲性层如本文更详细地定义的，和/或包括如此处更详细地描述的拴系复合物。
还提供了一种阵列，所述阵列包括两个或更多个如本文所定义的两亲性层。还提供了一种装置，所述装置包括所述阵列、用于跨所述两亲性层施加电压电位的构件和用于检测跨所述两亲性层的电荷的构件。在一些实施例中，所述装置任选地进一步包括用于将样品供应到所述两亲性层的流体系统。
附图说明
图1.共聚焦显微照片，其示出了通过将通过非共价连接形成的拴系复合物集中在膜的第一区域中来集中荧光标记的多核苷酸。A：拴系复合物中不存在第二亲水性组分(“反式锚(trans anchor)”)并且拴系复合物未定位于两亲性层的第一区域中。B：拴系复合物中存在第二亲水性组分(“反式锚”)并且拴系复合物定位于两亲性层的第一区域中。结果在实例1中描述。
图2.共聚焦显微照片，其示出了通过将通过共价连接形成的拴系复合物集中在膜的第一区域中来集中荧光标记的多核苷酸。A：拴系复合物中不存在第二亲水性组分(“反式锚”)并且拴系复合物未定位于两亲性层的第一区域中。B：拴系复合物中存在第二亲水性组分(“反式锚”)并且拴系复合物定位于两亲性层的第一区域中。C：使用了疏水性接头比(B)中的疏水性接头短的拴系复合物和DNA系链。拴系复合物定位于两亲性层的第一区域中。结果在实例2中描述。
图3.共聚焦显微照片，其示出了通过将通过共价连接形成的拴系复合物集中在膜的第一区域中来集中荧光标记的多核苷酸。A：拴系复合物中不存在第二亲水性组分(“反式锚”)并且拴系复合物未定位于两亲性层的第一区域中。B：拴系复合物中存在第二亲水性组分(“反式锚”)并且拴系复合物定位于两亲性层的第一区域中。结果在实例3中描述。
具体实施方式
本发明将相对于具体实施例并参考某些附图来说明，但本发明并不受限于此而只受权利要求限制。权利要求中的任何附图标记不应被解释为限制范围。当然，应当理解，不一定所有方面或优点可以根据本发明的任何特定实施例来实现。因此，例如，本领域技术人员将认识到，本发明可以以实现或优化如本文所教导的一个优点或一组优点的方式体现或执行，而不必实现如本文可以教导或建议的其它方面或优点。
当结合附图阅读时，通过参考以下详细描述，可以最好地理解本发明(关于组织和操作方法两者)以及其特征和优点。本发明的各方面和优点将根据下文描述的一个或多个实施例而变得显而易见，并且将参考所述实施例进行阐述。在整个本说明书中对“一个实施例”或“一实施例”的提及意味着结合实施例描述的特定特征、结构或特性包含在本发明的至少一个实施例中。因此，在整个本说明书中各个地方出现的短语“在一个实施例中(inone embodiment)”或“在一实施例中(in an embodiment)”不一定都是指同一个实施例，但是可以指代同一个实施例。类似地，应当理解，在本发明的示例性实施例的描述中，出于简单化本公开并且帮助理解各种发明性方面中的一个或多个的目的，本发明的各种特征有时被一起分组在单个实施例、附图或其描述中。然而，本公开的方法不应被解释为反映所要求保护的发明需要的特征比在每个权利要求中明确地叙述的更多的意图。相反，如以下权利要求书所反映，发明性方面在于比单个前述公开的实施例的所有特征更少。
应当理解，除非上下文另有说明，否则本公开的“实施例”可以具体地组合在一起。所有公开的实施例的特定组合(除非上下文另有暗示)是要求保护的发明的进一步公开的实施例。
另外，如在本说明书和所附权利要求中所使用的，除非内容另外明确指明，否则单数形式的“一个/一种(a/an)”以及“所述(the)”均包含复数对象。因此，例如，对“多核苷酸”的提及包含两个或更多个多核苷酸；对“马达蛋白”的提及包含两个或更多个此类蛋白质；对“解旋酶”的提及包含两个或更多个解旋酶；对“单体”的提及是指两个或更多个单体；对“孔”的提及包含两个或更多个孔等。
本文引用的所有出版物、专利和专利申请，无论是上文还是下文，均通过引用整体并入本文。
定义
当提及单数名词(例如“一个/一种(a/an)”、“所述(the)”)时使用不定冠词或定冠词时，除非另有具体说明，否则这包含所述名词的复数形式。在本说明书和权利要求书中使用术语“包括(comprising)”时，其并不排除其它要素或步骤。此外，说明书和权利要求书中的术语第一、第二、第三等用于区分相似要素，而不一定用于描述顺序或时间次序。应当理解，如此使用的术语在适当情况下是可互换的，并且本文所描述的本发明的实施例能够以不同于本文所描述或说明的其它顺序操作。提供以下术语或定义仅用于帮助理解本发明。除非本文另有具体定义，否则在本文中使用的所有术语具有对本发明所属领域的技术人员来说相同的含义。针对本领域的定义和术语，执业医师特别参照Sambrook等人,《分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)》,第4版,纽约普莱恩维尤冷泉港出版社(Cold Spring Harbor Press,Plainsview,New York)(2012)；和Ausubel等人,《分子生物学最新方案(Current Protocols in Molecular Biology)》(增刊114),纽约约翰威利父子出版社(John Wiley&Sons,New York)(2016)。本文提供的定义不应被解释为具有小于本领域普通技术人员所理解的范围。
当提及如量、持续时间等可测量的值时，本文所使用的术语“约”意味着涵盖与指定值的±20％或±10％，更优选±5％，甚至更优选±1％，以及还更优选±0.1％的偏差，因为此类偏差适合于执行所公开的方法。
本文所使用的术语“核苷酸序列”、“DNA序列”或“一个或多个核酸分子”是指任何长度的核苷酸的聚合形式，无论是核糖核苷酸还是脱氧核糖核苷酸。此术语仅指分子的一级结构。因此，此术语包含双链和单链DNA，以及RNA。本文所使用的术语“核酸”是单链或双链共价连接的核苷酸序列，其中每个核苷酸上的3'和5'末端通过磷酸二酯键连接。多核苷酸可以由脱氧核糖核苷酸碱基或核糖核苷酸碱基构成。核酸可以在体外合成制造，或者从天然来源中分离。核酸可以进一步包含经修饰的DNA或RNA，例如已经被甲基化的DNA或RNA，或已经经受翻译后修饰的RNA，所述翻译后修饰例如是采用7-甲基鸟苷的5'封端、如裂解和聚腺苷酸化等3'加工以及剪接。核酸还可以包含合成核酸(XNA)，如己糖醇核酸(HNA)、环己烯核酸(CeNA)、苏糖核酸(TNA)、甘油核酸(GNA)、锁核酸(LNA)和肽核酸(PNA)。核酸(在本文中也称为“多核苷酸”)的大小通常表示为双链多核苷酸的碱基对(bp)的数量，或在单链多核苷酸的情况下，表示为核苷酸(nt)的数量。一千bp或nt等于千碱基(kb)。长度小于约40个核苷酸的多核苷酸通常被称为“寡核苷酸”，并且可以包括用于如通过聚合酶链反应(PCR)操纵DNA的引物。
在本公开的上下文中，术语“氨基酸”以其最广泛的意义使用，并且意指包含含有胺(NH2)和羧基(COOH)官能团以及对每种氨基酸具有特异性的侧链(例如R基团)的有机化合物。在一些实施例中，氨基酸是指天然存在的Lα-氨基酸或残基。本文中使用天然存在的氨基酸的一个和三个常用的字母缩写：A＝Ala；C＝Cys；D＝Asp；E＝Glu；F＝Phe；G＝Gly；H＝His；I＝Ile；K＝Lys；L＝Leu；M＝Met；N＝Asn；P＝Pro；Q＝Gln；R＝Arg；S＝Ser；T＝Thr；V＝Val；W＝Trp；并且Y＝Tyr(Lehninger,A.L.,(1975)《生物化学(Biochemistry)》,第2版,第71-92页,纽约沃茨出版社(Worth Publishers,New York))。一般术语“氨基酸”进一步包含D-氨基酸、逆反式氨基酸以及化学修饰的氨基酸，如氨基酸类似物、通常不并入到蛋白质中的天然存在的氨基酸(如正亮氨酸)以及具有本领域已知为氨基酸特性的性质的化学合成的化合物(如β-氨基酸)。例如，允许与天然Phe或Pro相同的肽化合物的构象限制的苯丙氨酸或脯氨酸的类似物或模拟物包含在氨基酸的定义内。此类类似物和模拟物在本文中被称为相应氨基酸的“功能等同物”。氨基酸的其它实例由Roberts和Vellaccio,《肽：分析、合成、生物学(The Peptides:Analysis,Synthesis,Biology)》,Gross和Meiehofer编辑,第5期第341页,纽约学术出版社(Academic Press,Inc.,N.Y.),1983，所述文献通过引用并入本文。
术语“多肽”和“肽”在本文中可互换使用以指代氨基酸残基的聚合物以及其变体和合成类似物。因此，这些术语适用于氨基酸聚合物，其中一个或多个氨基酸残基是合成的非天然存在的氨基酸，如对应的天然存在的氨基酸的化学类似物，以及适用于天然存在的氨基酸聚合物。多肽还可以经历成熟或翻译后修饰过程，所述过程可以包含但不限于：糖基化、蛋白水解切割、脂质化、信号肽切割、前肽切割、磷酸化等。可以使用重组技术例如通过表达重组或合成的多核苷酸来制备肽。重组产生的肽通常基本上不含培养基，例如，培养基占蛋白质制剂体积的小于约20％，更优选小于约10％，最优选小于约5％。
术语“蛋白质”用于描述具有二级或三级结构的折叠多肽。蛋白质可以由单个多肽构成，或者可以包括组装形成多聚体的多个多肽。多聚体可以是同源寡聚体或异源寡聚体。蛋白质可以是天然存在的或野生型蛋白质，或者是经修饰的或非天然存在的蛋白质。蛋白质可以例如通过一个或多个氨基酸的添加、取代或缺失而不同于野生型蛋白质。
蛋白质的“变体”涵盖肽、寡肽、多肽、蛋白质和酶，其相对于所讨论的未经修饰的或野生型蛋白质具有氨基酸取代、缺失和/或插入，并且具有与其所衍生的未经修饰的蛋白质类似的生物和功能活性。如本文所用，术语“氨基酸同一性”是指序列在氨基酸对氨基酸的基础上在比较窗口上相同的程度。因此，“序列同一性百分比”通过以下来计算：在比较窗口上比较两个经过最佳比对的序列，确定相同的氨基酸残基(例如，Ala、Pro、Ser、Thr、Gly、Val、Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、Lys、Arg、His、Asp、Glu、Asn、Gln、Cys和Met)出现在这两个序列中的位置的数量以产生匹配位置的数量，用匹配位置的数量除以比较窗口中的位置的总数(即，窗口大小)，以及将结果乘以100以产生序列同一性百分比。
对于本发明的所有方面和实施例，“变体”与对应的野生型蛋白质的氨基酸序列具有至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％完整序列同一性。序列同一性还可以是全长多核苷酸或多肽的片段或部分。因此，序列可以与全长参考序列具有仅50％的整体序列同一性，但是特定区域、结构域或亚基的序列可以与参考序列共享80％、90％或多达99％的序列同一性。
术语“野生型”是指与天然存在的来源分离的基因或基因产物。野生型基因是群体中最常观察到的基因，并且因此被任意设计为基因的“正常”或“野生型”形式。相反，术语“经修饰的”、“突变体”或“变体”是指与野生型基因或基因产物相比显示序列的修饰(例如，取代、截短或插入)、翻译后修饰和/或功能特性质(例如，改变的特性)的基因或基因产物。注意，天然存在的突变体可以被分离；通过与野生型基因或基因产物相比其具有改变的特性这一事实来鉴定这些突变体。用于引入或取代天然存在的氨基酸的方法在本领域是众所周知的。例如，可通过在编码突变单体的多核苷酸中的相关位置处用精氨酸的密码子(CGT)置换甲硫氨酸的密码子(ATG)，而用精氨酸(R)来取代甲硫氨酸(M)。用于引入或取代非天然存在的氨基酸的方法在本领域也是众所周知的。例如，可以通过在用于表达突变单体的IVTT系统中包含合成氨基酰基-tRNA来引入非天然存在的氨基酸。可替代地，其可以通过在大肠杆菌(E.coli)中表达突变单体来引入，所述突变单体在存在那些特定氨基酸的合成(即非天然存在的)类似物的情况下对于特定氨基酸是营养缺陷型的。如果突变单体使用部分肽合成产生，则其还可以通过裸连接产生。保守取代用具有相似化学结构、相似化学特性或相似侧链体积的其它氨基酸代替氨基酸。引入的氨基酸可以具有与其替代的氨基酸相似的极性、亲水性、疏水性、碱性、酸性、中性或电荷。可替代地，保守取代可以引入芳香族或脂肪族的另一种氨基酸代替预先存在的芳香族或脂肪族氨基酸。保守氨基酸改变在本领域是众所周知的，并且可以根据如在下表1中限定的20种主要氨基酸的性质来进行选择。在氨基酸具有类似极性的情况下，还可以参考表2中的氨基酸侧链的亲水性尺度来确定这一点。
表1-氨基酸的化学性质
Ala 脂肪族的、疏水性的、中性的 Met 疏水性的、中性的
Cys 极性的、疏水性的、中性的 Asn 极性的、亲水性的、中性的
Asp 极性的、亲水性的、带电荷的(-) Pro 疏水性的、中性的
Glu 极性的、亲水性的、带电荷的(-) Gln 极性的、亲水性的、中性的
Phe 芳香族的、疏水性的、中性的 Arg 极性的、亲水性的、带电荷的(+)
Gly 脂肪族的、中性的 Ser 极性的、亲水性的、中性的
His 芳香族的、极性的、亲水性的、带电荷的(+) Thr 极性的、亲水性的、中性的
Ile 脂肪族的、疏水性的、中性的 Val 脂肪族的、疏水性的、中性的
Lys 极性的、亲水性的、带电荷的(+) Trp 芳香族的、疏水性的、中性的
Leu 脂肪族的、疏水性的、中性的 Tyr 芳香族的、极性的、疏水性的
表2-亲水性标度
Figure BDA0003765571150000101
突变体或经修饰的蛋白质、单体或肽还可以以任何方式和在任何位点进行化学修饰。优选地通过将分子附接到一个或多个半胱氨酸(半胱氨酸连接)、将分子附接到一个或多个赖氨酸、将分子附接到一个或多个非天然氨基酸、表位的酶修饰或末端的修饰对突变体或经修饰的单体进行化学修饰。用于进行此类修饰的合适方法在本领域是众所周知的。经修饰的蛋白质、单体或肽的突变体可以通过任何分子的附接进行化学修饰。例如，经修饰的蛋白质、单体或肽的突变体可以通过染料或荧光团的连接进行化学修饰。
所公开的方法
本公开涉及将拴系复合物集中在两亲性层区域中的方法。
本发明人惊奇地发现，包括通过疏水性接头连接的一种或多种亲水性组分的拴系复合物可以优先地位于包括纳米孔的两亲性层区域中，而已知的拴系复合物不一定如此。因此，通过使用如本文所描述的拴系复合物将用于通过纳米孔检测的分析物锚定到膜上，可以提高纳米孔附近分析物的局部浓度。
因此，本文提供了一种将拴系复合物集中在两亲性层区域中的方法，所述两亲性层包括多个两亲性分子和检测器，其中所述拴系复合物包括通过疏水性接头连接的一种或多种亲水性组分；
所述方法包括使所述拴系复合物或其一种或多种组分与所述多个两亲性分子接触；
并且其中所述两亲性层包括第一区域和第二区域，所述第一区域包括所述检测器，其中所述第一区域在化学上和/或物理上不同于所述第二区域，并且其中相对于所述第二区域，所述拴系复合物优先定位到所述第一区域；由此将所述拴系复合物集中在所述两亲性层的所述第一区域中。
包括通过疏水性接头连接的一种或多种亲水性组分的任何合适的拴系复合物可以用于所公开的方法中。可以根据两亲性层中的两亲性分子来选择或设计拴系复合物。可替代的，可以根据拴系复合物来选择或设计用于形成两亲性层的两亲性分子。本文更详细地描述了拴系复合物及其生产生方法。
可以使用任何合适的两亲性分子来形成两亲性层。本文更详细地描述了示例性两亲性分子。
在所公开的方法中，两亲性层包括检测器。在所公开的方法中可以使用任何合适的检测器。如本文更详细地描述的，合适的检测器包含纳米孔。
在所公开的方法中，两亲性层包括第一区域和第二区域。第一区域包括检测器。第二区域不包括检测器。第一区域在化学上和/或物理上不同于第二区域。可以使用任何合适的方法将两亲性层分成第一层和第二层。本文更详细地讨论了一些合适的策略。
本文还公开了一种将分析物集中在检测器的区域中的方法。可以研究可以使用如纳米孔的检测器检测的任何合适的分析物。本文更详细地讨论了示例性分析物。
还公开了一种表征靶分析物的方法。可以使用如纳米孔等检测器检测到的分析物的任何特性都可以使用所公开的方法来确定。本文讨论了合适的特性。表征靶分析物通常包括在分析物相对于检测器，例如纳米孔，移动时进行分析物特有的一个或多个测量。所述一个或多个测量可以是任何合适的测量。通常，所述一个或多个测量是电测量，例如电流测量，和/或是一个或多个光学测量。本文更详细地描述了用于记录合适测量的设备以及此类测量可以提供的信息。
集中拴系复合物
在开发本公开的方法时，已经发现当使用常规连接技术将分析物与膜连接时，纳米孔附近的分析物的浓度有时低于基于溶液浓度可能预期或需要的浓度。发现用于将分析物与膜连接的系链通常不只定位于纳米孔区域中。这导致在表征分析物的效率降低，因为其在孔附近的局部浓度降低。本发明人试图探索此效应的起源，并在这样做的过程中开发了目前所要求的方法。
使用纳米孔表征分析物的已知装置通常包括包含水溶液的室和将室分成两个部分的屏障。屏障通常具有孔，在所述孔中形成含有跨膜孔的膜。
为了制备用于表征如多核苷酸的分析物的此类装置，所述孔通常涂覆有如十六烷的油。油在其中形成孔的固体基材和穿过孔形成的膜之间提供界面。一旦孔已经经油涂覆，就可以施加用于形成膜(两亲性层)的两亲性分子。
用于涂覆孔的油通常涂覆除孔之外的设备的重要部分，例如其中形成孔的基材也可以涂覆有油。在不受理论束缚的情况下，本发明人认为纳米孔附近的分析物浓度降低的起源可能是用于形成两亲性层的两亲性分子不仅位于孔处，而且通常涂覆通过油接触的设备的所有区。
已知两亲性膜通常是天然可移动的，基本上以大约10-8cm s-1的脂质扩散速率充当二维液体。这意味着除非另有限制，否则位于两亲性层的组分可以在两亲性层内自由移动。因此，并且再次在不受理论束缚的情况下，本发明人认为，在常规方法中用于将分析物分子集中在纳米孔附近的系链因此可能不会集中在纳米孔附近，而是可能扩散到两亲性分子可到达的整个可用区内，即使此区的大部分区可能无法进入纳米孔。本发明人认为这可能导致分析物分子不仅优先地位于纳米孔附近，而且更广泛地跨两亲性分子可接近的装置区，即使此类区距离纳米孔太远而无法对位于所述区的分析物进行表征。
在开发所公开的方法中，发现如果用于将分析物定位于纳米孔区域中的锚优先定位于纳米孔的区域中，则可以缓解此问题。所公开的方法因此提供了实现这一点(即，优先定位于期望区域中(例如，纳米孔附近))并且因此可以用于将分析物集中在期望区域中(例如，纳米孔附近)以便随后对分析物进行分析的拴系复合物的用途，以及此类拴系复合物本身。
因此，所公开的方法提供了拴系复合物及其在将分析物定位于两亲性层的所期望的区域中的用途。本发明人已经发现，通过使用包括通过疏水性接头连接的一种或多种亲水性组分的拴系复合物，所述拴系复合物可以集中在所期望的区域中。已经发现此类方法允许分析物类似地集中。两亲性层的所期望的靶区域是两亲性层的第一区域，所述两亲性层包括如纳米孔的检测器。相对于其它不期望的“第二”区域，将拴系复合物集中在所期望的区域中。第一区域在化学上和/或物理上不同于第二区域。如本文更详细地解释的，拴系复合物可以设计成根据其包含其两亲性分子成分的性质优先地位于第一区域中。
在所公开的方法中，将拴系复合物优先地集中在两亲性层的第一区域中，所述第一区域还包括检测器。拴系复合物未优先地集中在两亲性层的第二区域中。
在所公开的方法中，拴系复合物优先地集中在包括检测器，例如，纳米孔的两亲性层的区域中。然而，拴系复合物通常不定位于纳米孔本身。换言之，拴系复合物定位于检测器区域中的两亲性分子中，但通常不与检测器结合。在一些实施例中，拴系复合物不与检测器结合。
在所公开的方法中，第一区域在化学上和/或物理上不同于第二区域。在一些实施例中，所述第一区域是所述两亲性层的多层区域。在一些实施例中，所述第一区域和所述第二区域两者均包括同一类型的两亲性分子。在此类实施例中，两亲性层的第一区域和第二区域的性质通常在物理形式上不同。
在一些实施例中，第一区域是多层区域并且第二区域具有与第一区域不同的层数。例如，在一些实施例中，第一区域可以由双层组成或包括双层，并且第二区域可以由单层组成或包括单层。因此，在一些实施例中，两亲性第一区域包括所述两亲性分子的双层或由所述两亲性分子的双层组成，并且两亲性第二区域包括所述两亲性分子的单层或由所述两亲性分子的单层组成。
在其它实施例中，第一区域和第二区域两者均可以由双层组成，但是第一区域和第二区域中双层的性质可以不同。例如，在一些实施例中，第一区域的两亲性层中的另外的组分以及两亲性分子可以导致第一区域具有与第二区域的两亲性层不同的性质。在其它实施例中，第二区域的两亲性层中的另外的组分以及两亲性分子可以导致第二区域具有与第一区域的两亲性层不同的性质。可以在两亲性层的第一区域和第二区域之间改变的性质可以例如包含其厚度。例如，第二区域中的两亲性层的厚度可以大于第一区域中的两亲性层的厚度。可替代地，第一区域中的两亲性层的厚度可以大于第二区域中的两亲性层的厚度。
在一些实施例中，可以对两亲性层进行修饰以形成第一区域和第二区域。在一些实施例中，可以将两亲性层修饰为相分离以形成第一区域和第二区域。相分离是从单个均匀混合物中产生两个或更多个不同的相。例如，DOPC和鞘磷脂的1:1混合物将相分离形成脂筏。某些组分优先地位于一个或其它相中。例如，与DOPC区域相比，膜蛋白PLAP(糖基磷脂酰肌醇锚定的蛋白胎盘碱性磷酸酶)优先地插入到凸起的鞘磷脂筏中。
因此，两亲性层的第一区域和第二区域可以是两亲性层的相分离区域。在一些实施例中，可以使用分配剂来诱导两亲性层中的相分离。在一些实施例中，可以修饰两亲性层以形成第一区域和第二区域的试剂选自脂肪酸，如棕榈酸、肉豆蔻酸和油酸；脂肪醇，如棕榈醇、肉豆蔻醇和油醇；甾醇，如胆固醇、麦角固醇、羊毛甾醇、谷甾醇和豆甾醇；溶血磷脂，如1-酰基-2-羟基-sn-甘油-3-磷酸胆碱；以及神经酰胺。在一些实施例中，分配剂的实例可以包含例如胆固醇和鞘磷脂。
在一些实施例中，第一区域和第二区域可以包括不同类型的两亲性分子。换言之，在一些实施例中，第一区域包括两亲性分子的第一组合物并且两亲性第二区域包括两亲性分子的第二组合物，并且所述第一组合物不同于所述第二组合物。
在一些此类实施例中，第一区域因此可以具有与第一区域不同的化学性质。例如，第一区域可以包括具有亲水性头基的两亲性分子并且第二区域可以包括具有不同亲水性头基的两亲性分子。这样，第一区域的化学反应性可以不同于第二区域的化学反应性。例如，第一区域中两亲性分子的头基的氢键性质可能不同于第二区域中两亲性分子的头基的氢键性质。
在一些实施例中，第一区域可以具有与第一区域不同的物理特性。例如，第一区域可以包括具有比第二区域中的两亲性分子更长的疏水性部分的两亲性分子。当两亲性分子用于形成两亲性层时，可以形成多层两亲性层。然而，第一区域和第二区域中两亲性分子的填充物将不同，使得两亲性分子组装在第一区域和第二区域中。两亲性层(例如，双层)然后将在第一区域和第二区域中具有不同的物理性质。例如，第二区域中的两亲性层的厚度可以大于第一区域中的两亲性层的厚度。可替代地，第一区域中的两亲性层的厚度可以大于第二区域中的两亲性层的厚度。
在一些实施例中，与第二区域中的两亲性层相比，第一区域中的两亲性层可以在化学上和物理上均不同。
如下文更详细地解释的，在一些实施例中，两亲性层中的两亲性分子选自脂质和共聚物。
因此，在一些实施例中，第一区域可以由脂质双层组成或包括脂质双层。在一些实施例中，第二区域可以由脂质双层组成或包括脂质双层，所述脂质双层包括与第一区域中的脂质不同的脂质。在一些实施例中，第二区域可以由脂质单层组成或包括脂质单层。在一些实施例中，第一区域的脂质双层中的脂质不同于第二区域的脂质双层或单层中的脂质。在一些实施例中，第一区域包括脂质双层或由脂质双层组成，并且第二区域包括脂质单层或由脂质单层组成，并且第一区域中的脂质与第二区域中的脂质相同。换言之，在一些实施例中，两亲性多层第一区域包括所述两亲性分子的双层并且两亲性第二区域包括所述两亲性分子的单层。
在一些实施例中，第一区域可以由嵌段共聚物层组成或包括嵌段共聚物层。如本文更详细地解释的，如本文所使用的，嵌段共聚物层是多层结构。在一些实施例中，第二区域可以由共聚物层组成或包括共聚物层，所述共聚物层包括与第一区域中的共聚物不同的共聚物。在一些实施例中，第一区域可以包括嵌段共聚物的双层并且第二区域可以由共聚物单层组成或包括共聚物单层。在一些实施例中，第一区域的共聚物双层中的共聚物不同于第二区域的共聚物双层或单层中的共聚物。在一些实施例中，第一区域包括共聚物层或由共聚物层组成，并且第二区域包括共聚物层或由共聚物层组成，并且第一区域中的共聚物与第二区域中的共聚物相同。
在一些实施例中，第一区域可以由脂质双层组成或包括脂质双层，并且第二区域可以由嵌段共聚物层组成或包括嵌段共聚物层。在一些实施例中，第一区域可以由嵌段共聚物层组成或包括嵌段共聚物层，并且第二区域可以由脂质双层或单层组成或包括脂质双层或单层。
在一些实施例中，第一区域可以包括脂质双层或由脂质双层组成，并且第二区域可以包括经分离的脂质单层或由经分离的脂质单层组成。在一些实施例中，第二区域包括脂质单层或由脂质单层组成，所述脂质单层通过疏水性层，例如，油层分离。在一些实施例中，第一区域可以包括嵌段共聚物层或由嵌段共聚物层组成，并且第二区域可以包括经分离的嵌段共聚物层或由经分离的嵌段共聚物层组成。在一些实施例中，第二区域包括由疏水性层，例如，油层分离的脂质单层或由脂质单层组成。
在一些实施例中，所述两亲性层的所述第一区域和所述第二区域分别对应于基材的第一区和第二区，其中所述基材的第一区在化学上和/或物理上不同于所述第二区。例如，在一些实施例中，第一区域可以对应于基材中的孔。
在一些实施例中，第一区域可以对应于基材上的凸起区，并且第二区域可以对应于基材上的凹陷区。在一些实施例中，第一区域可以对应于基材上的凹陷区，并且第二区域可以对应于基材上的凸起区。
在一些实施例中，第一区域可以对应于具有与第二区域不同的化学性质的区。在一些实施例中，第一区域经化学处理以具有与第二区域不同的化学性质。在一些实施例中，第二区域经化学处理以具有与第一区域不同的化学性质。在一些实施例中，第一区域和/或第二区域是基材的任选涂覆的部分。在一些实施例中，涂层是油涂层。
在一些实施例中，所述第一区域对应于第一液滴与第二液滴对之间的界面表面区，其中所述第一液滴和第二液滴各自具有两亲性涂层；并且所述第二区域对应于所述第一液滴的未与第二液滴介接的部分的表面区。
在一些实施例中，可以使用此类特征的组合。例如，在一些实施例中，(i)第一区域可以对应于基材中的孔，并且第二区域对应于所述基材的任选涂覆的区；以及(ii)第一区域包括脂质双层或由脂质双层组成并且第二区域包括脂质单层或由脂质单层组成，或者第一区域包括嵌段共聚物层或由嵌段共聚物层组成并且第二区域包括嵌段共聚物层或由嵌段共聚物层组成，所述嵌段共聚物层在化学上和/或物理上与第一区域不同。
如从本文的讨论中显而易见的，所述方法包括与第二区域相比将拴系复合物集中在两亲性层的第一区域中。可以使用任何合适的方法将拴系复合物优先地靶向到两亲性层的第一区域。
在一些实施例中，通过控制拴系复合物的物理性质将拴系复合物集中在两亲性层中。在一些实施例中，通过控制拴系复合物的物理性质将拴系复合物集中在两亲性层中。
通过控制其物理性质可以将拴系复合物集中在两亲性层的第一区域中。拴系复合物包括通过疏水性接头连接的一种或多种亲水性组分。在一些实施例中，拴系复合物包括通过疏水性接头与第二亲水性组分连接的第一亲水性组分。可以控制的一种示例性特性是疏水性接头的长度。
例如，在一些实施例中，第一区域中的两亲性层的厚度不同于第二区域中的两亲性层的厚度。通过控制拴系复合物中疏水性接头的长度以与第一区域中两亲性层的厚度对应，拴系复合物可以优先地定位于第一区域中。
例如，在一些实施例中，两亲性层的第一区域比第二区域中的两亲性层薄。在此类实施例中，使用可以跨越第一区域中的两亲性层但不跨越第二区域中的两亲性层的疏水性接头可以导致拴系复合物定位于两亲性层的第一区域中。
在不受理论束缚的情况下，据信在一些实施例中，可以跨越第一区域中的两亲性层但不跨越第二区域中的两亲性层的疏水性接头由于与疏水性接头连接的亲水性组分可以导致拴系复合物定位于两亲性层的第一区域中。如果接头可以跨越两亲性层，那么亲水性组分可以延伸超出两亲性层的典型疏水性核并延伸到典型的水性介质中。然而，如果接头不能跨越两亲性层，则存在于两亲性层的疏水性核中的亲水性组分的能量屏障对于接头来说太大而不能存在于所述区域中。因此，拴系复合物定位于第一区域中。
在一些实施例中，两亲性层的第一区域比第二区域中的两亲性层厚。在此类实施例中，使用可以跨越第一区域中的两亲性层的疏水性接头将比跨越第二区域中的两亲性层所需的疏水性接头更长。在再次不受理论束缚的情况下，认为在一些实施例中，这可以防止接头很好地堆积在第二区域的两亲性层中，并且因此导致拴系复合物定位于两亲性层的第一区域中。
因此，在一些实施例中，拴系复合物定位到两亲性第一区域，使得疏水性接头跨越两亲性层；并且一种或多种亲水性组分从两亲性层延伸。在一些实施例中，拴系复合物包括通过疏水性接头与第二亲水性组分连接的第一亲水性组分，并且拴系复合物定位到两亲性第一区域，使得疏水性接头跨越两亲性层；第一亲水性组分从两亲性层的第一面延伸，并且第二亲水性组分从两亲性层的第二面延伸。
在一些实施例中，可以控制疏水性接头的化学性质以将拴系复合物定位于两亲性层的第一区域中。例如，在一些实施例中，可以选择或确定在两亲性层的第一区域中的两亲性分子的头基以吸引拴系复合物中的亲水性组分、与拴系复合物中的亲水性组分连接或与拴系复合物中的亲水性组分反应，而不会在第二区域中发生此类吸引、连接或反应。因此，拴系复合物优选地定位于第一层的区域中。在一些实施例中，反应是在两亲性层的第一区域中的两亲性分子的亲水性头基与拴系复合物的亲水性组分之间形成氢键。
在一些实施例中，通过修饰两亲性层的第二区域中的两亲性分子以从第二区域排除拴系复合物，从而将拴系复合物集中在两亲性层的第一区域中。
在一些实施例中，拴系复合物集中在两亲性层的第一区域中，因为拴系复合物或其组分可以从两亲性层的其它区域(例如，两亲性层的第二区域)扩散到两亲性层的第一区域中。例如，在一些实施例中，疏水性接头扩散到两亲性层的第一区域中。在一些实施例中，与一种或多种亲水性组分连接的疏水性接头扩散到两亲性层的第一区域中。在其中拴系复合物包括通过疏水性接头与第二亲水性组分连接的第一亲水性组分的一些实施例中，与第一亲水性组分连接的疏水性接头扩散到两亲性层的第一区域中。在其中拴系复合物包括通过疏水性接头与第二亲水性组分连接的第一亲水性组分的一些实施例中，与第二亲水性组分连接的疏水性接头扩散到两亲性层的第一区域中。通过用(另外的)亲水性组分“封端”疏水性接头的非结合端，可以将任选地与亲水性组分连接的疏水性接头的扩散定位于两亲性层的第一区域中。例如，在其中拴系复合物包括通过疏水性接头与第二亲水性组分连接的第一亲水性组分的一些实施例中，根据需要，通过用第二亲水性组分或第一亲水性组分“封端”疏水性接头的非结合端，可以将任选地与第一亲水性组分或第二亲水性组分连接的疏水性接头的扩散定位于两亲性层的第一区域中。
因此，在一些实施例中，所述方法包括允许疏水性接头扩散到两亲性层的第一区域中，并且然后将一种或多种亲水性组分与疏水性接头连接。
在其中拴系复合物包括通过疏水性接头与第二亲水性组分连接的第一亲水性组分的一些实施例中，所述方法包括允许疏水性接头扩散到两亲性层的第一区域中，并且然后将第一亲水性组分与疏水性接头连接。在一些实施例中，所述方法包括允许与第二亲水性组分连接的疏水性接头扩散到两亲性层的第一区域中，并且然后将第一亲水性组分与疏水性接头连接。在一些实施例中，所述方法包括允许疏水性接头扩散到两亲性层的第一区域中，并且然后将第二亲水性组分与疏水性接头连接。在一些实施例中，所述方法包括允许与第一亲水性组分连接的疏水性接头扩散到两亲性层的第一区域中，并且然后将第二亲水性组分与疏水性接头连接。
在其中拴系复合物包括通过疏水性接头与第二亲水性组分连接的第一亲水性组分的一些实施例中：
(i)第一区域可以对应于基材中的孔，并且第二区域对应于所述基材的任选涂覆的区，例如，基材的油涂覆的区；
(ii)第一区域包括脂质双层或由脂质双层组成，并且第二区域包括脂质单层或由脂质单层组成；或者第一区域包括嵌段共聚物层或由嵌段共聚物层组成，并且第二区域包括嵌段共聚物层或由嵌段共聚物层组成，其中第一区域和第二区域在化学上和/或物理上不同；
(iii)允许疏水性接头(任选地与至少一个亲水性组分连接)从两亲性层的第二区域扩散到两亲性层的第一区域中；以及
(iv)疏水性接头与亲水性组分连接以形成拴系复合物并将拴系复合物定位于两亲性层的第一区域中。
在其中拴系复合物包括通过疏水性接头与第二亲水性组分连接的第一亲水性组分的一些实施例中：
(i)第一区域可以对应于基材中的孔，并且第二区域对应于所述基材的任选涂覆的区；例如，基材的油涂覆的区；
(ii)第一区域包括脂质双层或由脂质双层组成，并且第二区域包括脂质单层或由脂质单层组成；或者第一区域包括嵌段共聚物层或由嵌段共聚物层组成，并且第二区域包括嵌段共聚物层或由嵌段共聚物层组成，其中第一区域和第二区域在化学上和/或物理上不同；
(iii)疏水性接头(允许与第一亲水性组分或第二亲水性组分任选地连接以从两亲性层的第二区域扩散到两亲性层的第一区域中)；以及
(iv)根据需要将疏水性接头与第一亲水性组分和第二亲水性组分连接至以形成拴系复合物并将拴系复合物定位于两亲性层的第一区域中。
在一些实施例中，与第二区域相比，所公开的方法导致纳米孔的第一区域中的拴系复合物的浓度显著增加。例如，在一些实施例中，相对于第二区域中的拴系复合物的浓度，第一区域中的拴系复合物的浓度增加了约2到约10000的因子，如约10到约1000，例如，约50到约500，例如，约100。
接头
如上文所解释的，拴系复合物包括通过疏水性接头连接的一种或多种亲水性组分。在一些实施例中，第一亲水性组分在疏水性接头的第一末端处与疏水性接头连接。在一些实施例中，第二亲水性组分在疏水性接头的第二末端处与疏水性接头连接。在一些实施例中，第一亲水性组分在疏水性接头的第一末端处与疏水性接头连接，并且第二亲水性组分在疏水性接头的第二末端处与疏水性接头连接
可以使用任何合适的接头来连接亲水性组分。在一些实施例中，疏水性接头能够在形成两亲性层之前稳定地嵌入到其中提供两亲性分子的溶剂中。在一些实施例中，疏水性接头能够在形成两亲性层之前稳定地嵌入到在其上与两亲性分子接触的油中。在一些实施例中，疏水性接头可溶于两亲性层的第二区域中。
在一些实施例中，疏水性接头能够在两亲性层的第一区域和第二区域之间扩散。例如，在一些实施例中，第一区域是膜区域并且第二区域是围绕基材中的孔的环。在一些实施例中，环包括在形成两亲性层之前两亲性分子接触的油。在一些实施例中，疏水性接头能够在环和膜区域之间扩散。
在一些实施例中，疏水性接头能够稳定地嵌入在两亲性层的第一区域中。
在一些实施例中，疏水性接头具有足以跨越两亲性层的第一区域的长度。
在一些实施例中，疏水性接头由线性分子或结构组成或包括线性分子或结构。
在一些实施例中，所述疏水性接头包括以下或由以下组成：饱和或非饱和烃或有机分子、或饱和或非饱和无机分子。
在一些实施例中，疏水性接头由聚合物组成或包括聚合物。在一些实施例中，聚合物选自以下：丙烯酸、酰胺和酰亚胺、碳酸酯、二烯、酯、醚、碳氟化合物、烯烃、苯乙烯、乙烯基缩醛、乙烯基和偏二氯乙烯、乙烯基酯、乙烯基醚和酮，以及乙烯基吡啶和乙烯基吡咯烷酮聚合物。疏水性聚合物可从西格玛奥德里奇(Sigma Aldrich)(美国)商购获得。在一些实施例中，聚合物可以包括2到约50个单体酸单元，如约10到约30个单体，例如，约20个单体。
在一些实施例中，疏水性接头由疏水性多肽组成或包括疏水性多肽。疏水性多肽可以包括天然或非天然氨基酸。本文更详细地描述了多肽。在一些实施例中，疏水性多肽包括疏水性氨基酸或由疏水性氨基酸组成。疏水性氨基酸包含甘氨酸(Gly)、丙氨酸(Ala)、缬氨酸(Val)、亮氨酸(Leu)、异亮氨酸(Ile)、脯氨酸(Pro)、苯基丙氨酸(Phe)、蛋氨酸(Met)和色氨酸(Trp)。倘若整个多肽是疏水性的，则疏水性多肽可以包括一个或多个亲水性肽单元。在一些实施例中，多肽可以包括2到约50个氨基酸单元，如约10到约30个氨基酸，例如，约20个氨基酸。
在一些实施例中，疏水性接头由螺环缩酮组成或包括螺环缩酮。
在一些实施例中，疏水性接头由硅酮组成或包括硅酮。在一些实施例中，硅酮包括[SiR2-O]n主链，其中R是烃基，例如，烷烃，如甲基。在一些实施例中，硅酮是聚二甲基硅氧烷(PDMS)。在一些实施例中，硅酮是长度为约2到约200个单体单元的PDMS。
在一些实施例中，疏水性接头由烃组成或包括烃。在一些实施例中，疏水性接头由烷烃、烯烃或炔烃组成或包括烷烃、烯烃或炔烃。在一些实施例中，烷烃、烯烃或炔烃的长度为约10到约100个碳原子，如约25到约75个碳原子，例如，约40到约60个原子。
在一些实施例中，疏水性接头由蛋白质组成或包括蛋白质。在一些实施例中，疏水性接头由跨膜孔组成或包括跨膜孔。在其中疏水性接头由跨膜孔组成或包括跨膜孔的实施例中，跨膜孔不用作检测器。因此，在其中疏水性接头由第一跨膜孔组成或包括第一跨膜孔的实施例中，第二跨膜孔用作检测器。在此类实施例中，第一跨膜孔通常不同于第二跨膜孔。本文更详细地描述了跨膜孔。
在一些实施例中，疏水性接头由碳纳米管组成或包括碳纳米管。在一些实施例中，碳纳米管是单壁碳纳米管。在一些实施例中，碳纳米管是多壁碳纳米管。碳纳米管及其化学修饰在本领域中是众所周知的。
在一些实施例中，疏水性接头由天然脂质或合成脂质样分子组成或包括天然脂质或合成脂质样分子。本文中更详细地描述了此类分子。在其中疏水性接头由天然脂质或合成脂质样分子组成或包括天然脂质或合成脂质样分子的实施例中，天然脂质或合成脂质样分子通常不用作用于产生两亲性层的两亲性分子。因此，在其中疏水性接头由第一天然脂质或合成脂质样分子组成或包括第一天然脂质或合成脂质样分子的实施例中，第二两亲性分子包括在两亲性层中。在此类实施例中，第一脂质/脂质型分子通常不同于包括在两亲性层中的两亲性分子。然而，在一些实施例中，第一脂质/脂质型分子与包括在两亲性层中的两亲性分子具有同一类型。
第一和第二亲水性组分
在一些实施例中，一种或多种亲水性组分中的至少一种亲水性组分包括分析物结合部分或由分析物结合部分组成。在一些实施例中，分析物结合部分是分析物的系链。因此，分析物可以与分析物结合部分结合并且因此在本文所公开的方法中在拴系复合物集中的地方被集中。
可以使用任何合适的化学反应以将分析物与系链连接。换言之，分析物结合部分可以是任何合适的结合部分。下文讨论了合适的化学反应的实例。例如，在一些实施例中，分析物结合部分包括生物素并且亲水性组分(例如，第一亲水性组分)包括链霉亲和素。在一些实施例中，分析物结合部分包括链霉亲和素并且亲水性组分(例如，第一亲水性组分)包括生物素。在一些实施例中，分析物结合部分包括胆固醇并且亲水性组分(例如，第一亲水性组分)包括环糊精。在一些实施例中，分析物结合部分包括环糊精并且亲水性组分(例如，第一亲水性组分)包括胆固醇。
在一些实施例中，分析物结合部分包括多核苷酸或多核苷酸或由多核苷酸或多核苷酸组成。在一些实施例中，分析物结合部分包括多核苷酸或由多核苷酸组成。在一些实施例中，多核苷酸与分析物或其上的衔接子互补，使得多核苷酸可以与分析物连接。
在一些实施例中，第二亲水性组分包括锚或锚结合部分或由锚或锚结合部分组成。在一些实施例中，锚或(与锚结合部分结合的锚)不穿过两亲性层，即其不能穿过两亲性层。在一些实施例中，锚或(与锚结合部分结合的锚)不干扰两亲性层。
可以使用任何合适的化学反应以将锚(或锚结合部分)连接到系链上。换言之，锚结合部分可以是任何合适的结合部分。下文讨论了合适的化学反应的实例。
例如，在一些实施例中，第二亲水性组分包括生物素，任选地与链霉亲和素连接。在一些实施例中，第二亲水性组分包括胆固醇，任选地与环糊精连接。形成可以用于将锚与锚结合部分连接的强(例如，共价)连接的基团的其它实例包含DBCO/叠氮化物、硫醇/马来酰亚胺、硫醇/二溴二酰胺、反式环辛烯/四嗪和反式环辛烯/邻醌。
在一些实施例中，第二亲水性组分包括多核苷酸或多肽或由多核苷酸或多肽组成。在一些实施例中，第二亲水性组分包括多核苷酸或由多核苷酸组成。
在一些实施例中，第二亲水性组分包括硫醇、生物素或表面活性剂。在一些实施例中，第二亲水性组分包括直链淀粉(用于与麦芽糖结合蛋白或融合蛋白结合)、Ni-NTA(用于与聚组氨酸或聚组氨酸标记的蛋白结合)或肽(例如，抗原)。
在一些实施例中，第二亲水性组分包括增加第二亲水性组分与两亲性层的相互作用的部分。合适的部分可以包含但不限于增加与两亲性层相互作用的疏水性基团，以及增加与两亲性层中的两亲性分子相互作用的亲和标记物。在一些实施例中，第二亲水性组分与两亲性分子和/或两亲性层之间的相互作用的程度用作用于选择或鉴定用于拴系复合物中的适当的第二亲水性组分的标准。
在其中拴系复合物包括第一亲水性组分和第二亲水性组分的一些实施例中，第一亲水性组分不同于第二亲水性组分。在一些实施例中，使用正交化学反应将拴系复合物的疏水性接头与第一和第二亲水性组分连接是有利的。这可以确保接头与一种第一亲水性组分和一种第二亲水性组分准确地连接(并且不会与两种第一亲水性组分或两种第二亲水性组分无意地连接)。在一些实施例中，使用正交化学反应将拴系复合物的疏水性接头从两亲性层的顺式侧连接到第一亲水性组分并且从两亲性层的反式侧连接到第二亲水性组分是有利的。这可以确保接头与一种第一亲水性组分和一种第二亲水性组分准确地连接，由此确保最终的拴系复合物以跨膜构型形成。
正交化学反应的一些非限制性示例性实例包含：
-(1)生物素/链霉亲和素，以及(2)胆固醇/环糊精
-(1)生物素/链霉亲和素，以及(2)DBCO/叠氮化物
-(1)硫醇/马来酰亚胺，以及(2)DBCO/叠氮化物。
组装拴系复合物
在本文所公开的方法中使用的拴系复合物可以以任何合适的方式组装。然而，本公开还提供了用于在两亲性层中组装拴系复合物的方法。
本公开提供了一种用于将拴系复合物组装在两亲性层中的方法，其中所述拴系复合物包括通过疏水性接头连接的一种或多种亲水性组分；所述方法包括使所述拴系复合物或其一种或多种组分与多个两亲性分子接触并且随后形成所述两亲性层。
还提供了一种用于将拴系复合物组装在两亲性层中的方法，其中所述拴系复合物包括通过疏水性接头连接的一种或多种亲水性组分；所述方法包括(i)由多个两亲性分子形成所述两亲性层；以及(ii)使所述两亲性层与所述拴系复合物或其一种或多种组分接触。
在这些实施例中，所述方法可以包括(i)使所述疏水性接头与所述两亲性分子或所述两亲性层接触；其中当所述疏水性接头与所述两亲性分子或两亲性层接触时，所述疏水性接头未与所述一种或多种亲水性组分中的至少一种亲水性组分连接；以及(ii)一旦已形成所述两亲性层，就将所述一种或多种亲水性组分中的至少一种亲水性组分与所述疏水性接头连接，由此形成所述拴系复合物。
在一些实施例中，所述拴系复合物可以与面向所述两亲性层的顺式面的所述一种或多种亲水性组分中的至少一种亲水性组分组装。
本公开还提供了一种用于将拴系复合物组装在两亲性层中的方法，其中所述拴系复合物包括通过疏水性接头与第二亲水性组分连接的第一亲水性组分，所述方法包括使所述拴系复合物或其一种或多种组分与多个两亲性分子接触并且随后形成所述两亲性层。
在一些实施例中，拴系复合物在两亲性层或其组分存在的情况下组装。拴系复合物可以组装以便在所述拴系复合物中定向，所述拴系复合物具有面向两亲性层的第一面(例如，顺式面)的第一亲水性组分以及面向两亲性层的第二面(例如反式面)的第二亲水性组分。因此，在一些实施例中，组装所述拴系复合物的方法包括(i)使所述疏水性接头与所述多个两亲性分子接触；以及(ii)形成所述两亲性层。
在一些实施例中，在使疏水性接头与多个两亲性分子接触之前将疏水性接头与第一亲水性组分连接。在一些实施例中，在使疏水性接头与多个两亲性分子接触之前将疏水性接头与第二亲水性组分连接。
在一些实施例中，在使疏水性接头与多个两亲性分子接触之前将疏水性接头与第一亲水性组分和第二亲水性组分两者连接。然而，通常在使疏水性接头与多个两亲性分子接触之前未将疏水性接头与第一亲水性组分和第二亲水性组分两者连接。因此，在一些组装所述拴系复合物的方法中，当所述疏水性接头与所述两亲性分子接触时，所述疏水性接头未与所述第一亲水性组分和/或所述第二亲水性组分连接，并且所述方法进一步包括一旦已形成所述两亲性层，就将所述第一亲水性组分和/或所述第二亲水性组分与所述疏水性接头连接，由此形成所述拴系复合物。
因此，在一些实施例中，(i)将疏水性接头与第一亲水性组分和第二亲水性组分中的一种亲水性组分连接；(ii)将与第一亲水性组分和第二亲水性组分中的一种亲水性组分连接的接头与两亲性分子混合；(iii)两亲性层由混合物形成；以及(iv)将第一亲水性组分和第二亲水性组分中的另一种亲水性组分与两亲性层中的接头连接。
在一些实施例中，组装所述拴系复合物包括提供包括两亲性分子和疏水性接头的混合物；以及
(a)使孔与所述混合物接触，其中在所述孔的反式侧存在包括所述第二亲水性组分的缓冲液，使得包括所述疏水性接头的两亲性层跨所述孔形成，并且所述第二亲水性组分与所述疏水性接头连接；以及
(b)将包括所述第一亲水性组分的缓冲液添加到所述两亲性层的顺式侧，使得所述第一亲水性组分与所述疏水性接头连接。
在一些实施例中，组装所述拴系复合物包括：
(a)提供包括两亲性分子和首先与第二亲水性组分结合的所述疏水性接头的混合物；以及
(b)使孔与所述混合物接触，其中在所述孔的顺式侧存在包括第一亲水性组分的缓冲液，使得包括所述疏水性接头的两亲性层跨所述孔形成，并且所述第一亲水性组分在膜的顺式侧与所述疏水性接头连接。
在此类实施例中，疏水性接头、第一亲水性组分和第二亲水性组分通常如本文更详细描述的。
在一些实施例中，组装所述拴系复合物包括提供包括两亲性分子和疏水性接头的混合物；以及
(a)使孔与所述混合物接触，其中在所述孔的顺式侧存在包括所述第一亲水性组分的缓冲液，使得包括所述疏水性接头的两亲性层跨所述孔形成，并且所述第一亲水性组分与所述疏水性接头连接；以及
(b)将包括所述第二亲水性组分的缓冲液添加到所述两亲性层的反式侧，使得所述第二亲水性组分与所述疏水性接头连接。
在一些实施例中，组装所述拴系复合物包括
(a)提供包括两亲性分子和首先与第一亲水性组分结合的所述疏水性接头的混合物；以及
(b)使孔与所述混合物接触，其中在所述孔的反式侧存在包括第二亲水性组分的缓冲液，使得包括所述疏水性接头的两亲性层跨所述孔形成，并且所述第二亲水性组分在膜的反式侧与所述疏水性接头连接。
在此类实施例中，疏水性接头、第一亲水性组分和第二亲水性组分通常如本文更详细描述的。
还提供了一种用于将拴系复合物组装在两亲性层中的方法，其中所述拴系复合物包括通过疏水性接头与第二亲水性组分连接的第一亲水性组分，所述方法包括：(i)由多个两亲性分子形成所述两亲性层；以及(ii)使所述两亲性层与所述疏水性接头接触。
在一些实施例中，疏水性接头与第一亲水性组分连接。在一些实施例中，疏水性接头与第二亲水性组分连接。
在一些实施例中，所述方法进一步包括一旦已经形成所述两亲性层，就将所述第一亲水性组分与所述疏水性接头连接，由此形成所述拴系复合物。在一些实施例中，所述方法进一步包括一旦已经形成所述两亲性层，就将所述第二亲水性组分与所述疏水性接头连接，由此形成所述拴系复合物。在一些实施例中，所述方法进一步包括一旦已经形成所述两亲性层，就将所述第一亲水性组分和所述第二亲水性组分与所述疏水性接头连接，由此形成所述拴系复合物。
在一些实施例中，所述方法包括使所述第一亲水性组分；所述第二亲水性组分；以及所述疏水性接头接触；其中所述第一亲水性组分包括第一反应性基团；所述第二亲水性组分包括第二反应性基团；并且所述疏水性接头包括反应性基团；以及
使所述第一反应性基团与所述疏水性接头上的反应性基团反应并且使所述第二反应性基团与所述疏水性接头上的反应性基团反应，以通过所述疏水性接头将所述第一亲水性组分与所述第二亲水性组分连接，由此形成所述拴系复合物。
在一些实施例中，本文提供了一种用于将拴系复合物组装在两亲性层中的方法，其中所述拴系复合物包括通过疏水性接头与第二亲水性组分连接的第一亲水性组分，所述方法包括：
(a)使第一部分与第二部分接触，其中所述第一部分包括所述第一亲水性组分，所述第一亲水性组分与包括第一反应性基团的第一疏水性部分连接，并且所述第二部分包括所述第二亲水性组分，所述二亲水性组分与包括第二反应性基团的第二疏水性部分连接；以及
(b)使所述第一反应性基团与所述第二反应性基团反应，由此形成将所述第一亲水性组分与所述第二亲水性组分连接的疏水性接头，由此形成所述拴系复合物。
在一些实施例中，所述第一亲水性组分由所述两亲性层的第一面提供，并且所述第二亲水性组分由所述两亲性层的第二面提供。例如，所述第一亲水性组分可以由所述两亲性层的顺式面提供，并且所述第二亲水性组分由所述两亲性层的反式面提供。在一些实施例中，第一部分和与第二部分之间的反应是点击化学反应。
在一些实施例中，将拴系复合物组装在两亲性层中的方法进一步包括将检测器如纳米孔插入到两亲性层中的步骤。
在拴系复合物的方法中，可以使用任何合适的缓冲液。缓冲液通常在水溶液中。通常，缓冲液是磷酸盐缓冲液或包括磷酸盐缓冲液。其它合适的缓冲液是HEPES和Tris-HCl缓冲液。缓冲液组分可以以约10到约50mM，如约25mM的浓度存在。通常在以下的pH下执行所述方法：4.0到12.0、4.5到10.0、5.0到9.0、5.5到8.8、6.0到8.7或7.0到8.8或7.5到8.5。所使用的pH优选地是约8。缓冲溶液中可以存在另外的组分，如亚铁氰化物/铁氰化物阴离子和/或任何水溶性氧化还原活性对。
在包括将疏水性接头与第一亲水性组分和/或第二亲水性组分反应的组装拴系复合物的方法中，可以使用任何合适的反应性基团。
在一些实施例中，疏水性接头与第一亲水性组分共价连接。在一些实施例中，疏水性接头与第二亲水性组分共价连接。在一些实施例中，疏水性接头与第一亲水性组分和第二亲水性组分共价连接。
在一些实施例中，疏水性接头具有可以用于促进与第一亲水性组分和/或第二亲水性组分连接的反应性官能团。在一些实施例中，疏水性接头在其第一末端处具有用于与第一亲水性组分共价连接的反应性官能团。在一些实施例中，疏水性接头在其第二末端处具有用于与第二亲水性组分共价连接的反应性官能团。在一些实施例中，疏水性接头在其第一末端处具有用于与第一亲水性组分共价连接的反应性官能团，以及在其第二末端处具有用于与第二亲水性组分共价连接的反应性官能团。
在一些实施例中，疏水性接头与第一亲水性组分非共价连接。在一些实施例中，疏水性接头与第二亲水性组分非共价连接。在一些实施例中，疏水性接头与第一亲水性组分和第二亲水性组分非共价连接。
在一些实施例中，疏水性接头在其第一末端处具有用于与第一亲水性组分非共价连接的配体。在一些实施例中，疏水性接头在其第二末端处具有用于与第二亲水性组分非共价连接的配体。在一些实施例中，疏水性接头在其第一末端处具有用于与第一亲水性组分非共价连接的配体，以及在其第二末端处具有用于与第二亲水性组分非共价连接的配体。
在一些实施例中，所述疏水性接头与所述第一亲水性组分共价连接并且与所述第二亲水性组分非共价连接。在一些实施例中，所述疏水性接头与所述第一亲水性组分非共价连接并且与所述第二亲水性组分共价连接。
在一些实施例中，疏水性接头在其第一末端处具有用于与第一亲水性组分共价连接的反应性官能团，以及在其第二末端处具有用于与第二亲水性组分非共价连接的配体。在一些实施例中，疏水性接头在其第一末端处具有用于与第一亲水性组分非共价连接的配体，以及在其第二末端处具有用于与第二亲水性组分共价连接的反应性官能团。
可以使用任何合适的反应性基团和/或配体。
例如，半胱氨酸残基可以用于与多核苷酸或其上的经修饰的基团形成二硫键。在一些实施例中，疏水性接头包括半胱氨酸并且第一亲水性组分和/或第二亲水性组分包括硫醇，例如，半胱氨酸。
在一些实施例中，疏水性接头经修饰以促进其与第一亲水性组分和/或第二亲水性组分连接。例如，在一些实施例中，通过连接包括用于与疏水性接头连接的反应性官能团的部分来修饰疏水性接头。
疏水性接头与第一亲水性组分以及疏水性接头与第二亲水性组分之间的连接化学反应不受特别限制。可以使用任何合适的反应性官能团的组合。在一些实施例中，将疏水性接头与第一亲水性组分连接的化学反应与将疏水性接头与第二亲水性组分连接的化学反应正交。如本文所使用的，正交化学反应涉及不发生交叉反应的成对反应。换言之，在一些实施例中，疏水性接头的第一末端与第一亲水性组分反应但不与第二亲水性组分反应，并且疏水性接头的第二末端与第二亲水性组分反应但不与第一亲水性组分反应。正交化学反应的实例包含硫醇与马来酰亚胺和叠氮化物与炔烃的反应。此类反应可以在没有任何交叉反应的情况下发生；即，硫醇不与叠氮化物反应，以及马来酰亚胺不与炔烃反应。
许多合适的反应性基团和其化学目标是本领域已知的。一些示例性的反应性基团和其对应的目标包含可以与胺反应的芳基叠氮化物、可以与胺和羧基反应的碳二亚胺、可以与碳水化合物反应的酰肼、可以与胺反应的羟甲基膦、可以与胺反应的亚氨酸酯、可以与羟基反应的异氰酸酯、可以与肼反应的羰基、可以与巯基反应的马来酰亚胺、可以与胺反应的NHS-酯、可以与胺反应的PFP-酯、可以与胸腺嘧啶反应的补骨脂素、可以与巯基反应的吡啶基二硫化物、可以与巯基胺和羟基反应的乙烯基砜等。
用于将疏水性接头与第一亲水性组分和/或第二亲水性组分连接的另一种合适的化学反应包含点击化学反应。本领域中已知许多合适的点击化学反应试剂。点击化学反应的合适的实例包含但不限于以下：
(a)铜(I)催化的叠氮化物-炔烃环加成(叠氮化物炔烃胡伊斯根(Huisgen)环加成)；
(b)应变促进的叠氮化物-炔烃环加成；包含烯烃和叠氮化物[3+2]环加成；烯烃和四嗪逆需求狄尔斯-阿尔德(Diels-Alder)反应；以及烯烃和四唑光点击反应；
(c)1,3偶极环加成反应的无铜变体，其中叠氮化物与炔烃在应变下反应，例如在环辛烷环中；
(d)一个接头上的氧亲核试剂与另一个接头上的环氧化物或氮丙啶反应性部分的反应；以及
(e)Staudinger连接，其中炔烃部分可以被芳基膦替代，导致与叠氮化物的特定反应以产生酰胺键。
任何反应性基团都可以用于形成缀合物。一些合适的反应性基团包含[1,4-双[3-(2-吡啶基二硫代)丙酰胺基]丁烷；1,1 1-双-马来酰亚胺基三乙二醇；3,3'-二硫代二丙酸二(N-羟基琥珀酰亚胺酯)；乙二醇-双(琥珀酸N-羟基琥珀酰亚胺酯)；4,4'-二异硫氰酸基二苯乙烯-2,2'-二磺酸二钠盐；双[2-(4-叠氮基水杨酰基氨基)乙基]二硫化物；3-(2-吡啶基二硫代)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯；4-马来酰亚胺丁酸N-羟基琥珀酰亚胺酯；碘乙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯；S-乙酰巯基乙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯；叠氮化物-PEG-马来酰亚胺；和炔烃-PEG-马来酰亚胺。反应性基团可以是在WO 2010/086602中，特别是在此申请的表3中公开的那些基团中的任何一个。
在一些实施例中，疏水性接头与第一亲水性组分和/或第二亲水性组分之间的连接是非共价的。本文给出了可以用于组装拴系复合物的非共价连接化学反应的实例并且包含生物素与链霉亲和素的非共价相互作用；环糊精与胆固醇、配体与其受体的相互作用、抗体与抗原的相互作用等。
多价结合
如上文所解释的，所公开的方法涉及将拴系复合物集中在纳米孔的所期望的区域中。
在一些实施例中，期望最大化所关注的分析物与拴系复合物之间的结合强度。然而，在一些实施例中，有益效果来自控制结合强度。如下文所解释的，在一些实施例中可以优先使用弱结合以改善分析物的定位。
如本文所描述的拴系复合物的使用导致拴系复合物优先定位于两亲性层的所期望的区域中。然而，在一些实施例中，拴系复合物在两亲性层的期望区域中的定位或集中的效率可能达不到100％，但仍可以实现有效集中。在一些实施例中，例如在拴系复合物在两亲性层的所期望的区域中的定位不是100％有效的情况下，可能期望调节拴系复合物与所关注的分析物之间的结合强度
在一些实施例中，期望强结合。这导致所关注的分析物与拴系复合物强结合。如果要通过检测器重复探测分析物，例如在牙线洁牙模式(flossing mode)下探测，则这可能很有用。
然而，在一些实施例中，期望弱结合。弱结合意味着当与拴系复合物结合时相对于未与拴系复合物结合时分析物的平衡向有利于非结合状态转变。
本发明人已经认识到，仅与拴系复合物弱结合但可以与多种拴系复合物结合的分析物可以具有显著优势。当使用相对低浓度的拴系复合物时尤其如此，因为拴系复合物优先定位于两亲性层的所期望的区域，如本文所描述的。
例如，如果可以与拴系复合物强结合的分析物遇到不在两亲性层的所期望的区域中的拴系复合物分子，则分析物可能与拴系复合物强结合，并且因此无法被检测器感测。然而，如果分析物与拴系复合物的结合较弱，则分析物将从拴系复合物中分离出来并变成可用于与可能定位于两亲性层的所期望的区域中的其它拴系复合物部分结合。因为拴系复合物优先定位于两亲性层的所期望区域中，所以两亲性层的所期望区域中拴系复合物部分的浓度大于非所期望区域中的浓度，并且因此分析物在两亲性层的所期望区域中遇到拴系复合物的概率更高。因此，分析物将优先位于两亲性层的所期望的区域中。当分析物能够与多个拴系复合物结合时，这一点会进一步增强。虽然与每个单独的拴系复合物的每次结合可能较弱，但与被分析物结合的多个拴系复合物的累积结合强度更大并防止分析物从两亲性层的所期望区域中的拴系复合物分离。此策略，在本文中称为“弱多价连接”，可以导致分析物在两亲性层的所期望区域中接近极高水平的定位，并且因此可用于通过检测器感测。在此方法的上下文中，“弱”结合通常涉及拴系复合物与分析物之间的结合，所述结合弱于仅使用单价连接(即，一个连接点)时所需的结合。
因此，在一个实施例中，拴系复合物包括分析物结合部分并且分析物包括拴系复合物结合部分。在一些实施例中，分析物结合部分与分析物上的拴系复合物结合部分之间的结合强度相对较弱。在一些实施例中，分析物包括多个拴系复合物结合部分。在一些实施例中，通过与优先定位于两亲性层的所期望区域中的多个拴系复合物结合，将分析物集中在两亲性层的所期望区域中，如包括检测器的两亲性层的区域。
在一些实施例中，拴系复合物包括分析物结合部分，所述分析物结合部分包括寡核苷酸。在一些实施例中，分析物的拴系复合物结合部分或每个拴系复合物结合部分包括寡核苷酸。
在一些实施例中，拴系复合物的分析物结合部分的寡核苷酸的长度为约2到约20个核苷酸，如约5到约15个核苷酸，例如约10个核苷酸。在一些实施例中，分析物的拴系复合物结合部分的寡核苷酸的长度为约2到约20个核苷酸，如约5到约15个核苷酸，例如约10个核苷酸。在一些实施例中，拴系复合物的分析物结合部分的寡核苷酸与分析物的拴系复合物结合部分的寡核苷酸互补或基本上互补。当然，其它结合部分也可以用于本发明的此类方面。本文公开了合适的结合对。
在一些实施例中，基于本文所提供的方法的标准操作条件为约34℃，多价结合中每种结合的强度对应于约10℃到约30℃的熔融温度；更优选地，多价结合中的每种结合的强度对应于约15℃到约30℃的熔融温度，如约20℃或约25℃到约30℃。例如，两个此类结合位点可以用于将分析物或夹板与两个拴系复合物结合。相比之下，在相当的条件下，强单结合位点可以具有与大于约35℃，如至少40℃、至少45℃或至少50℃或更高的熔融温度相对应的结合强度。
在一些实施例中，分析物与多个拴系复合物结合。在一些实施例中，分析物与2到10个拴系复合物；如2到5个拴系复合物，例如2到3个拴系复合物结合。
在一些实施例中，分析物通过夹板与拴系复合物或多个拴系复合物结合。夹板可以例如包括能够与多核苷酸分析物结合并且能够与多个拴系复合物上的多个分析物结合部分结合的寡核苷酸。在一些实施例中，夹板因此可以包括用于与分析物结合的分析物结合部分；和用于与多个拴系复合物结合的多个拴系复合物结合部分。当拴系复合物的分析物结合部分包括寡核苷酸，如上文所描述的寡核苷酸时，夹板的每个拴系复合物结合部分可以包括互补或基本上互补的多核苷酸序列。
因此，本文提供了一种将分析物集中在包括检测器的两亲性层的区域中的方法，所述方法包括将多个拴系复合物集中在所述检测器的区域中；以及
i)使所述分析物与所述拴系复合物接触，使得所述分析物与多个所述拴系复合物结合；或
ii)使以下接触：(A)夹板，所述夹板包括(i)用于所述拴系复合物的多个结合位点和(ii)用于所述分析物的一个或多个结合位点；以及(B)具有所述拴系复合物的所述分析物，使得所述夹板与多个所述拴系复合物结合并且所述分析物与所述夹板结合；
由此将所述分析物集中在所述检测器的区域中。在一些实施例中，分析物、两亲性层、检测器和/或拴系复合物如本文进一步所描述的。
在一些实施例中，每个拴系复合物包括用于夹板的第一结合位点。在一些实施例中，夹板包括多个第二结合位点，每个第二结合位点均能够与拴系复合物上的第一结合位点结合；以及用于结合分析物的第三结合位点。在一些实施例中，分析物包括能够与第三结合位点结合的第四结合位点。
在此类实施例中，分析物可以通过以下表征：(i)将拴系复合物集中在两亲性层的所期望区域中，例如，集中在检测器区域中；(ii)使夹板与集中在两亲性层的所期望区域中的拴系复合物接触，由此导致夹板与多个拴系复合物结合；以及(iii)使分析物与夹板接触，由此导致分析物与夹板结合。在一些实施例中，夹板首先与多个拴系复合物接触，并且分析物然后与夹板接触。在一些实施例中，分析物首先与夹板接触，并且夹板然后与多个拴系复合物接触。
本领域技术人员将理解在一些实施例中可以使用多种夹板。例如，第一夹板可以用于与集中在两亲性层的所期望区域中的多个拴系复合物结合。第二夹板可以用于与第一夹板结合，并且任选地更多另外的夹板中的一个夹板可以用于与第二夹板结合。分析物可以然后与第二夹板结合，或如果存在的话，可以与一个或多个另外的夹板结合。
在一些其它实施例中，每个拴系复合物包括用于分析物的第一结合位点。在一些实施例中，分析物包括多个第二结合位点，每个第二结合位点均能够与第一结合位点结合。
在此类实施例中，分析物可以因此通过以下表征：(i)将拴系复合物集中在两亲性层的所期望区域中，例如，集中在检测器区域中；以及(ii)使分析物与集中在两亲性层的所期望区域中的拴系复合物接触，由此导致分析物与多个拴系复合物结合。
本领域技术人员将理解弱多价连接策略适用于如本文所描述的拴系复合物，但也更广泛地适用于优先位于两亲性层如膜的所期望区域中的任何锚。因此，本文还提供了一种将分析物集中在膜的所期望区域中的方法，所述方法包括将膜锚集中在膜的所期望区域中；并将分析物与多个所述膜锚直接或间接地结合，由此将所述分析物集中在膜的所期望区域中。在一些实施例中，膜的所期望区域包括如本文所描述的检测器，例如如本文所描述的纳米孔。在一些实施例中，每个膜锚均包括如本文所描述的拴系复合物。在一些实施例中，所述结合是直接结合。在一些实施例中，所述结合是通过与所述多个膜锚和与分析物结合的夹板进行的。在一些实施例中，分析物或夹板与膜锚或拴系复合物的结合是通过膜锚/拴系复合物和分析物或夹板上的寡核苷酸结合位点的杂交进行的。
两亲性层
如上文所解释的，本文所提供的方法包括将拴系复合物集中在两亲性层的区域中。两亲性层包括多个两亲性分子和检测器，如纳米孔。
如本文所使用的，两亲性层，在本文中也称为膜，是由如磷脂等两亲性分子形成的层，其具有亲水性和亲脂性两种性质。两亲性分子可以是合成的或天然存在的。非天然存在的两亲物和形成单层的两亲物在所属领域中是已知的，并且包含例如嵌段共聚物(Gonzalez-Perez等人,《朗缪尔(Langmuir)》,2009,25,10447-10450)。
在一些实施例中，包括在两亲性层中的两亲性分子是共聚物。在一些实施例中，两亲性层因此是嵌段共聚物膜。
嵌段共聚物是聚合在一起的两个或更多个单体亚基产生单个聚合物链的聚合材料。嵌段共聚物通常具有由每个单体亚基贡献的性质。然而，嵌段共聚物可以具有由个别子单元形成的聚合物不拥有的独特特性。嵌段共聚物可以进行工程改造，使得单体子单元中的一个在水性介质中是疏水性的(即亲脂性)，而其它子单元是亲水性的。这样，嵌段共聚物可以拥有两亲特性，并且可以形成模拟生物膜的结构(两亲性层)。
嵌段共聚物可以是二嵌段的(其由两个单体子单元组成)，但也可以由多于两个的单体子单元来构建以形成表现为两亲物的更复杂的布置。共聚物可以是三嵌段、四嵌段或五嵌段共聚物。在一些实施例中，两亲性层是三嵌段共聚物膜。
如本文所使用的，由二嵌段、三嵌段、四嵌段或五嵌段共聚物形成的两亲性层是“多层”结构。如本文所使用的，术语“多层”以其最广泛的意义使用，是指包括2个或更多个构成组分或由2个或更多个构成组分组成的结构或系统，所述构成组分可以均匀地布置在整个结构或系统中，也可以不均匀地布置在整个结构或系统中。例如，在一些实施例中，由三嵌段共聚物形成的两亲性层可以描述为三层结构。在一些实施例中，由四嵌段共聚物形成的两亲性层可以描述为四层结构。
可以设计共聚物材料以模拟天然存在的两亲性分子。例如，古细菌双极性四醚脂质是天然存在的脂质，其被构建使得脂质形成膜。这些脂质一般发现于在苛刻生物环境中存活的嗜极生物、嗜热生物、嗜盐生物和嗜酸生物中。其稳定性被认为是源于最终双层的融合性质。直接了当的做法是，通过产生具有一般基序亲水性-疏水性-亲水性的三嵌段聚合物来构建模拟这些生物实体的嵌段共聚物材料。这种材料可以形成表现类似于脂质双层并且涵盖从囊泡到层状膜的一系列阶段表现的两亲性层。由这些三嵌段共聚物形成的两亲性层可以在生物脂质膜上保持优势。例如，因为合成了三嵌段共聚物，所以可小心地控制准确的构建以提供形成具有所期望的性质，例如，促进与孔和其它蛋白质的相互作用的两亲性层所需的正确链长度和性质。
还可以由不被归类为脂质亚材料的亚单元来构建嵌段共聚物；例如可由硅氧烷或其它非基于烃的单体来制成疏水性聚合物。嵌段共聚物的亲水性亚区段还可以具备低蛋白质结合特性，这允许产生当暴露于原始生物样品时具有高度抗性的膜。此头基单元还可以源自非经典的脂质头基。
相比于生物脂质膜，三嵌段共聚物膜还具有增加的机械和环境稳定性，例如高得多的操作温度或pH范围。嵌段共聚物的合成性质提供定制用于广泛范围应用的基于聚合物的膜的平台。
在一些实施例中，两亲性层是在国际申请第WO2014/064443或WO2014/064444号中所公开的膜之一，所述国际申请的全部内容以其整体明确地并入。
在一些实施例中，两亲性层是在US 6,723,814中公开的膜之一，所述文献的全部内容整体明确地并入。
两亲性层可以包括脂质分子。例如，两亲性层可以包括脂质双层。
脂质双层是细胞膜的模型，并且用作一系列实验研究的极佳平台。例如，脂质双层可以用于通过单通道记录对膜蛋白的活体外研究。可替代地，脂质双层可以用作检测一系列物质的存在的生物传感器。脂质双层可以是任何脂质双层。合适的脂质双层包含但不限于平面脂质双层、支持双层或脂质体。脂质双层优选地是平坦脂质双层。合适脂质双层公开于WO2008/102121、WO 2009/077734和WO 2006/100484中。
由脂质的两个相对层形成脂质双层。因此，如本文所使用的，脂质双层是多层结构。两个脂质层被典型的布置成使得其疏水性尾基面朝彼此，以形成疏水性内部。脂质的亲水性头基朝外面向双层每侧上的水性环境。双层可以存在于多种脂质阶段中，所述脂质阶段包含但不限于液体无序阶段(液体片层)、液体有序阶段、固体有序阶段(片层凝胶阶段、交错结合的凝胶阶段)和平面双层晶体(片层亚凝胶阶段、片层结晶阶段)。
用于形成脂质双层的方法在本领域中是已知的。脂质双层通常通过Montal和Mueller(《美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)》,1972；69:3561-3566)的方法形成，其中脂质单层携载于通过开孔的任一侧的水溶液/空气界面上，所述开孔垂直于所述界面。通常通过首先将脂质溶解在有机溶剂中，并且然后使在开孔两侧上的水溶液的表面上蒸发一滴溶剂，来将脂质添加到水性电解质溶液的表面。一旦有机溶剂已蒸发，那么开孔两侧上的溶液/空气界面来回物理地移动通过开孔，直到形成双层为止。可以跨膜中的开孔或跨凹槽中的开口形成平面脂质双层。
Montal和Mueller的方法是常用的，这是因为是节约成本的，且是形成适合于蛋白孔插入的良好品质脂质双层的相对直接了当的方法。双层形成的其它常见方法包含脂质体双层的尖端浸没、双层涂刷和贴片夹持。
尖端浸没双层形成需要使开孔表面(例如移液管尖端)接触到携载脂质单层的测试溶液的表面。同样，通过将溶解于有机溶剂中的一滴脂质在溶液表面处蒸发来首先在溶液/空气界面处产生脂质单层。接着，通过朗缪尔-沙佛(Langmuir-Schaefer)过程形成双层，并且需要机械自动以使开孔相对于溶液表面移动。
对于涂刷的双层，将溶解于有机溶剂中的一滴脂质直接应用于开孔，所述开孔浸没在水性测试溶液中。使用笔刷或等效物，使脂质溶液稀薄地扩散在开孔内。溶剂的稀化使得形成脂质双层。然而，从双层完全去除溶剂是非常困难的，并且因此通过这种方法形成的双层较不稳定且更倾向于在电化学测量期间具有噪声。
贴片夹持是在生物细胞膜研究中常用的。通过抽汲将细胞膜夹持到移液管的末端，并且膜贴片变为连接在开孔内。所述方法适用于通过夹持接着爆裂以离开密封在移液管的开孔内的脂质双层的脂质体来产生脂质双层。所述方法需要稳定的、巨大的且单层脂质体和在具有玻璃表面的材料中制造小开孔。脂质体可以通过超声处理、挤出或Mozafari方法(Colas等人(2007)《微米(Micron)》38:841-847)来形成。
在一些实施例中，可以如国际申请第WO 2009/077734号中所描述形成脂质双层。在此方法中有利的是，由干燥脂质形成脂质双层。在一最优选实施例中，跨越开口形成脂质双层，如WO2009/077734中所描述。
在所公开的方法中，形成两亲性层例如脂质双层的任何脂质均可以用作两亲性分子。可以选择在两亲性层中使用的两亲性分子，使得脂质双层具有所需的特性，如表面电荷、支持膜蛋白的能力、充填密度或所形成的机械特性。脂质组合物可以包括一种或多种不同脂质。例如，脂质组合物可以含有至多100种脂质。脂质组合物优选地含有1到10种脂质。脂质组合物可以包括天然存在的脂质和/或人工脂质。
脂质分子脂质通常包括头基、界面部分和可以相同或不同的两个疏水性尾基。合适的头基包含(但不限于)：中性头基，例如二酰基甘油酯(DG)和脑酰胺(CM)；两性离子头基，如磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)和鞘磷脂(SM)；带负电荷的头基，如磷脂酰甘油(PG)；磷脂酰丝氨酸(PS)、磷脂酰肌醇(PI)、磷脂酸(PA)和心磷脂(CA)；以及带正电荷的头基，如三甲基铵丙烷(TAP)。合适界面部分包含但不限于天然存在的界面部分，例如基于甘油或基于脑酰胺的部分。合适的疏水性尾基包含但不限于：饱和烃链，例如月桂酸(正十二烷酸)、肉豆蔻酸(正十四烷酸)、棕榈酸(正十六烷酸)、硬脂酸(正十八烷酸)和花生酸(正二十烷酸)；不饱和烃链，如油酸(顺-9-十八烷酸)；和支链烃链，如植烷酰基。链的长度和不饱和烃链中的双键的位置和数量可以变化。链的长度和支链烃链中的支链(如甲基)的位置和数量可以变化。疏水性尾基可以作为醚或酯连接到界面部分。脂质可以是分枝菌酸。
在所公开的方法中使用的两亲性分子可以是经化学修饰的或官能化的。共聚物和脂质两者均可以进行化学修饰。
脂质的头基或尾基可以进行化学修饰。头基已进行化学修饰的合适的脂质包含但不限于：经PEG修饰的脂质，如1,2-二酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000]；官能化PEG脂质，如1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3磷酸乙醇胺-N-[生物素基(聚乙二醇)2000]；以及针对缀合修饰的脂质，如1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-(琥珀酰基)和1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-(生物素基)。尾基已进行化学修饰的合适的脂质包含但不限于：可聚合脂质，如1,2-双(10,12-二十三碳二炔基)-sn-甘油-3-磷酸胆碱；氟化脂质，如1-棕榈酰基-2-(16-氟棕榈酰基)-sn-甘油-3-磷酸胆碱；氘化脂质，如1,2-二棕榈酰基-D62-sn-甘油-3-磷酸胆碱；以及醚连接的脂质，如1,2-二-O-植烷基-sn-甘油-3-磷酸胆碱。
在所公开的方法中使用的两亲性分子可以以任何合适的方式进行化学修饰或官能化。例如，所述两亲性分子可以经化学修饰以促进与拴系复合物的相互作用。所述两亲性分子可以经化学修饰以与分析物，例如，与拴系复合物连接的分析物连接。
在一些实施例中，两亲性层，例如脂质组合物，可以包括一种或多种影响层的特性的添加剂。合适的添加剂包含但不限于：脂肪酸，如棕榈酸、肉豆蔻酸和油酸；脂肪醇，如棕榈醇、肉豆蔻醇和油醇；甾醇，如胆固醇、麦角固醇、羊毛甾醇、谷甾醇和豆甾醇；溶血磷脂，如1-酰基-2-羟基-sn-甘油-3-磷酸胆碱；以及神经酰胺。
例如，可以在固态层中或跨固态层形成两亲性层。固态层可以由有机材料和无机材料两者形成，所述材料包含但不限于：微电子材料、绝缘材料(如Si3N4、Al2O3和SiO)、有机和无机聚合物(如聚酰胺)、塑料(如
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)或弹性体(如双组分加成固化硅橡胶)以及玻璃。固态层可以由石墨烯形成。合适的石墨烯层公开于WO 2009/035647中。如果使用固态层，则检测器，例如，纳米孔通常存在于两亲性膜或层中，所述两亲性膜或层包含在固态层内，例如在固态层内的洞、孔、间隙、通道、沟槽或缝隙内。技术人员可以制备合适的固态/两亲性杂交系统。合适的系统公开于WO 2009/020682和WO 2012/005857中。可以使用以上所论述的两亲膜或层中的任一个。
通常使用以下来执行本文所公开的方法：(i)包括孔的人工两亲性层，(ii)包括孔的分离的、天然存在的两亲性层(例如，由天然存在的脂质形成)，(iii)具有插入其中的孔的细胞；或(iv)人工两亲性层，如人工三嵌段共聚物层。所述层可以包括其它跨膜和/或膜内蛋白质以及除孔以外的其它分子。
检测器
如上文所解释的，本文所提供的方法包括将拴系复合物集中在包括检测器的两亲性层的区域中。本公开还提供了将分析物集中在检测器的区域中的方法，以及使用检测器表征靶分析物的方法。
在所公开的方法中，可以使用任何合适的检测器。检测器可以选自以下：(i)零模波导；(ii)场效应晶体管，任选地纳米线场效应晶体管；(iii)AFM尖端；(iv)纳米管，任选地碳纳米管；以及(v)纳米孔。优选地，所述检测器是纳米孔。
本公开的各方面涉及检测分析物。可以以任何合适的方式在本文所提供的方法中表征分析物。在一个实施例中，分析物通过当分析物相对于纳米孔移动时检测离子电流或光信号来进行表征。这在本文中进行了更详细的描述。所述方法适用于这些和其它检测分析物的方法。
在另一个非限制性实例中，在一个实施例中，分析物是多核苷酸并且通过检测多核苷酸加工反应，如边合成边测序反应的副产物来进行表征。所述方法因此可以涉及检测通过酶，如聚合酶向核酸链中顺序添加(聚)核苷酸的产物。产物可以是酶的一种或多种性质的变化，例如酶的构型。这种方法因此可以包括在以下条件下使如聚合酶或逆转录酶等酶经受双链多核苷酸：响应于依次遇到的模板链核酸碱基和/或掺入模板指定的天然或类似物碱基(即，掺入事件)，使得将核苷酸碱基模板依赖性掺入生长中的寡核苷酸链中会引起酶的构象变化，响应于这种掺入事件检测酶的构象变化，并且由此检测模板链的序列。在此类方法中，可以根据本文所提供的方法移动多核苷酸链。这种方法可以涉及使用本领域的技术人员已知的方法，如在US 2017/0044605中描述的方法，检测和/或测量掺入事件。
在另一个实施例中，可以对副产物进行标记，以便在将核苷酸添加到与模板链互补的合成核酸链中时释放磷酸盐标记的物质，并且例如，使用如本文所描述的检测器检测磷酸盐标记的物质。可以根据本文的方法移动以此方式表征的多核苷酸。合适的标记物可以是使用纳米孔或零模波导或通过拉曼光谱(Raman spectroscopy)或其它检测器检测的光学标记物。合适的标记物可以是使用纳米孔或其它检测器检测的非光学标记物。
在另一种方法中，不标记核苷磷酸盐(核苷酸)，并且在向与模板链互补的合成核酸链中添加核苷酸后，检测到天然副产物物质。合适的检测器可以是离子敏感的场效应晶体管或其它检测器。
这些和其它检测方法适用于本文所描述的方法。
纳米孔
在一些实施例中，检测器是纳米孔。在一个实施例中，纳米孔是跨膜孔。
跨膜孔是在某种程度上穿过膜的结构。它允许由施加的电势驱动的水合离子在膜上或膜内流动。跨膜孔通常穿过整个膜，使得水合离子可以从膜的一侧流向膜的另一侧。然而，跨膜孔不必穿过膜。它可能在一端封闭。例如，孔可以是膜中的孔、间隙、通道、沟槽或狭缝，水合离子可以沿着膜流入或流入到膜中。
在本文提供的方法中可以使用任何跨膜孔。孔可以是生物的或人工的。合适的孔包含但不限于蛋白质孔、多核苷酸孔和固态孔。孔可以是DNA折纸孔(origami pore)(Langecker等人,《科学(Science)》,2012；338:932-936)。WO2013/083983中公开了合适的DNA折纸孔。
在一个实施例中，检测器是跨膜蛋白孔。跨膜蛋白孔是允许水合离子(例如多核苷酸)从膜的一侧流向膜的另一侧的多肽或多肽集合。在本文所提供的方法中，跨膜蛋白孔能够形成允许由施加的电势驱动的水合离子从膜的一侧流向另一侧的孔。跨膜蛋白孔优选地允许多核苷酸从膜(如三嵌段共聚物膜)的一侧流到另一侧。跨膜蛋白孔允许多核苷酸移动通过孔。
在一个实施例中，检测器是跨膜蛋白孔，所述跨膜蛋白孔是单体或寡聚体。孔优选地由若干重复的亚基，如至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个或至少16个亚基构成。孔优选地是六聚体、七聚体、八聚体或非聚体的孔。孔可以是同型寡聚体或异型低聚物。
在一个实施例中，跨膜蛋白孔包括离子可以通过其流动的桶或通道。孔的亚基通常围绕中心轴线，并向跨膜β-桶或通道或跨膜α-螺旋束或通道贡献链。
通常，跨膜蛋白孔的桶或通道包括促进与分析物，如靶多核苷酸(如本文所描述的)的相互作用的氨基酸。这些氨基酸优选地位于桶或通道的缢痕附近。跨膜蛋白孔通常包括一个或多个带正电荷的氨基酸，如精氨酸、赖氨酸或组氨酸，或芳香族氨基酸，如酪氨酸或色氨酸。这些氨基酸通常促进孔与核苷酸、多核苷酸或核酸之间的相互作用。
在一个实施例中，纳米孔是源自β-桶孔或α-螺旋束孔的跨膜蛋白孔。β-桶孔包括由β-链形成的桶或通道。合适的β-桶孔包含但不限于β-毒素，如α-溶血素、炭疽毒素和杀白细胞素，以及细菌的外膜蛋白/孔蛋白，如耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)孔蛋白(Msp)，例如MspA、MspB、MspC或MspD、CsgG，外膜孔蛋白F(OmpF)、外膜孔蛋白G(OmpG)、外膜磷脂酶A和奈瑟氏球菌(Neisseria)自转运蛋白(NalP)以及其它孔隙，如胞溶素。α--螺旋束孔包括由α-螺旋形成的桶或通道。合适的α-螺旋束孔包含但不限于内膜蛋白和α外膜蛋白，如WZA和ClyA毒素。
在一个实施例中，纳米孔是源自或基于Msp、α-溶血素(α-HL)、胞溶素、CsgG、ClyA、Sp1或溶血蛋白溶血毒素(fragaceatoxin)C(FraC)的跨膜孔。
在一个实施例中，纳米孔是源自CsgG，例如源自来自大肠杆菌菌株K-12亚株MC4100的CsgG的跨膜蛋白孔。此类孔是寡聚的，并且通常包括源自CsgG的7个、8个、9个或10个单体。孔可以是源自包括相同单体的CsgG的同质寡聚孔。可替代地，孔可以是源自包括至少一种不同于其他单体的单体的CsgG的异质寡聚孔。在WO 2016/034591中公开了源自CsgG的合适的孔的实施例。
在一个实施例中，纳米孔是源自胞溶素的跨膜孔。WO 2013/153359中公开了源自胞溶素的合适的孔的实施例。
在一个实施例中，纳米孔是源自或基于α-溶血素(α-HL)的跨膜孔。野生型α-溶血素孔由7个相同的单体或亚基形成(即，它是七聚的)。α-溶血素孔可以是α-溶血素-NN或其变体。变体优选地包括在位置E111和K147处的N个残基。
在一个实施例中，纳米孔是源自杀白细胞素的跨膜蛋白孔。杀白细胞素是具有两个不同亚基，一个S类亚基和一个F类亚基的异源寡聚孔。合适的杀白细胞素包含但不限于包括LukF(HlgB)和Hlg2(HlgA)的γ溶血素(g-HL)，包括LukF(HlgB)和LukS(HlgC)的杀白细胞素，包括LukF-PV和LukS-PV的杀白细胞素PV，包括LukE和LukD的LukE/LukD孔，以及包括LukF-I和LukS-I的LukS-I/LukF-I。
一个实施例中，纳米孔是源自Msp，例如源自MspA的跨膜蛋白孔。WO 2012/107778中公开了源自MspA的合适的孔的实例。
在一个实施例中，纳米孔是源自或基于ClyA的跨膜孔。
分析物
分析物可以是用于在本文所公开的方法中表征的任何合适的物质。合适的分析物包含但不限于金属离子、无机盐、聚合物，如聚合酸或碱、染料、漂白剂、药物、诊断剂、消遣性药物、炸药和环境污染物。在一些实施例中，分析物或每种分析物是多核苷酸、蛋白质、肽、碳水化合物或代谢物。
在一些实施例中，分析物经修饰用于与拴系复合物连接。在一些实施例中，分析物是根据其对拴系复合物的亲和力来选择的。在一些实施例中，分析物具有连接到其上的用于与拴系复合物连接的衔接子。
在一些实施例中，分析物是多核苷酸。在所公开的方法中可以表征任何合适的多核苷酸。
在一些实施例中，多核苷酸由细胞分泌。可替代地，多核苷酸可以在细胞内产生，使得必须从细胞中提取多核苷酸以用于所公开的方法。
多核苷酸可以作为一种或多种多核苷酸和一种或多种杂质的不纯混合物提供。杂质可以包括截短形式的多核苷酸，所述截短形式的多核苷酸不同于用于在所公开的方法中表征的靶多核苷酸。例如，在所公开的方法中用于表征的多核苷酸可以是基因组DNA，并且杂质可以包括基因组DNA、质粒等的部分。靶多核苷酸可以是基因组DNA的编码区域，并且不期望的多核苷酸可以包括DNA的非编码区域。
多核苷酸的实例包含DNA和RNA。DNA和RNA中的碱基可以通过其物理大小来区分。
多核苷酸或核酸可以包括任何核苷酸的任何组合。核苷酸可以是天然存在的或人工的。多核苷酸中的一个或多个核苷酸可以被氧化或甲基化。多核苷酸中的一个或多个核苷酸可以是受损的。例如，多核苷酸可以包括嘧啶二聚体。此类二聚体通常与紫外线损伤有关并且是皮肤黑色素瘤的主要病因。
多核苷酸中的一个或多个核苷酸可以例如用标记或标签修饰，所述标记或标签的合适的实例是技术人员已知的。多核苷酸可以包括一个或多个间隔子。衔接子，例如测序衔接子，可以包括在多核苷酸中。本文更详细地描述了衔接子、标签和间隔子。
经修饰的碱基的实例在本文中公开并且可以通过本领域已知的方式，例如通过在链复制期间(例如在PCR中)通过聚合酶掺入经修饰的核苷酸三磷酸或通过聚合酶填充方法掺入到多核苷酸中。在一些实施例中，可以使用本领域已知的试剂通过化学方式修饰一个或多个碱基。
核苷酸通常含有核碱基、糖和至少一个磷酸基。核碱基和糖形成核苷。核碱基通常是杂环的。核碱基包含但不限于嘌呤和嘧啶，并且更具体地包含腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)、尿嘧啶(U)和胞嘧啶(C)。糖通常是戊糖。核苷酸糖包含但不限于核糖和脱氧核糖。糖优选地是脱氧核糖。多核苷酸优选地包括以下核苷：脱氧腺苷(dA)、脱氧尿苷(dU)和/或胸苷(dT)、脱氧鸟苷(dG)和脱氧胞苷(dC)。核苷酸通常是核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸。核苷酸通常含有单磷酸、二磷酸或三磷酸。核苷酸可以包括多于三个磷酸，如4个或5个磷酸。磷酸可以附接在核苷酸的5'或3'侧上。多核苷酸中的核苷酸可以以任何方式彼此连接。核苷酸通常通过其糖和磷酸基连接，如在核酸中那样。核苷酸可以通过其核碱基连接，如在嘧啶二聚体中那样。
多核苷酸可以是双链或单链的。
在一些实施例中，多核苷酸是单链DNA。在一些实施例中，多核苷酸是单链RNA。在一些实施例中，多核苷酸是单链DNA-RNA杂交体。DNA-RNA杂交体可以通过将单链DNA与RNA连接来制备，或反之亦然。多核苷酸最典型地是单链脱氧核糖核酸(DNA)或单链核糖核酸(RNA)。
在一些实施例中，多核苷酸是双链DNA。在一些实施例中，多核苷酸是双链RNA。在一些实施例中，多核苷酸是双链DNA-RNA杂交体。双链DNA-RNA杂交体可以通过逆转录cDNA补体从单链RNA制备。
多核苷酸可以是任何长度的。例如，多核苷酸的长度可以是至少10个、至少50个、至少100个、至少150个、至少200个、至少250个、至少300个、至少400个或至少500个核苷酸或核苷酸对。多核苷酸的可以是长度为1000个或更多个核苷酸或核苷酸对、5000个或更多个核苷酸或核苷酸对、或长度为100000个或更多个核苷酸或核苷酸对。
核苷酸可以具有任何同一性，并且包含但不限于单磷酸腺苷(AMP)、单磷酸鸟苷(GMP)、单磷酸胸苷(TMP)、单磷酸尿苷(UMP)、5-甲基胞苷单磷酸、5-羟基甲基胞苷单磷酸、单磷酸胞苷(CMP)、单磷酸环腺苷(cAMP)、单磷酸环鸟苷(cGMP)、单磷酸脱氧腺苷(dAMP)、单磷酸脱氧鸟苷(dGMP)、单磷酸脱氧胸苷(dTMP)、单磷酸脱氧尿苷(dUMP)、单磷酸脱氧胞苷(dCMP)和单磷酸脱氧甲基胞苷。核苷酸优选地是选自AMP、TMP、GMP、CMP、UMP、dAMP、dTMP、dGMP、dCMP和dUMP。核苷酸可以无碱基(即缺乏核碱基)。核苷酸还可以缺乏核碱基和糖(即，是C3间隔子)。
多核苷酸可以包括PCR反应的产物、基因组DNA、内切核酸酶消化的产物和/或DNA文库。多核苷酸可以从任何生物体或微生物中获得或提取。多核苷酸可以获自人或动物，例如获自尿液、淋巴、唾液、粘液、精液或羊水，或获得自全血、血浆或血清。多核苷酸可以获自植物，例如谷类、豆类、水果或蔬菜。多核苷酸可以包括基因组DNA。可以使基因组DNA片段化。可以通过任何合适的方法使DNA片段化。例如，片段化DNA的方法是本领域已知的，此类方法可以使用转座酶，如MuA转座酶。通常，不对基因组DNA进行片段化。
在一些实施例中，分析物是多肽。在所公开的方法中可以表征任何合适的多肽。
在一些实施例中，多肽是未经修饰的蛋白质或其部分，或天然存在的多肽或其部分。
在一些实施例中，多肽由细胞分泌。可替代地，多肽可以在细胞内产生，使得必须从细胞中提取多肽以通过所公开的方法进行表征。多肽可以包括质粒的细胞表达产物，例如用于根据Sambrook等人,《分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning:A LaboratoryManual)》,第4版,纽约普莱恩维尤冷泉港出版社(Cold Spring Harbor Press,Plainsview,New York)(2012)；以及Ausubel等人,《当代分子生物学实验指南(CurrentProtocols in Molecular Biology)》(增刊114),纽约约翰威利父子出版公司,(2016)中所描述的方法克隆蛋白质的质粒。
多肽可以从任何生物体或微生物中获得或提取。多肽可以获自人或动物，例如获自尿液、淋巴、唾液、粘液、精液或羊水，或获得自全血、血浆或血清。多肽可以获自植物，例如谷类、豆类、水果或蔬菜。
多肽可以作为一种或多种多肽和一种或多种杂质的不纯混合物提供。杂质可以包括截短形式的靶多肽，其不同于用于在所公开的方法中表征的“靶多肽”。例如，靶多肽可以是全长蛋白质并且杂质可以包括蛋白质的部分。杂质还可以包括除靶蛋白之外的蛋白质，例如可以从细胞培养物中共同纯化或从样品中获得的蛋白质。
多肽可以包括任何氨基酸、氨基酸类似物和经修饰的氨基酸(即氨基酸衍生物)的任何组合。多肽中的氨基酸(和衍生物、类似物等)可以通过其物理大小和电荷来区分。
氨基酸/衍生物/类似物可以是天然存在的或人工的。
在一些实施例中，多肽可以包括任何天然存在的氨基酸。二十种氨基酸由通用遗传密码编码。这些密码为：丙氨酸(A)、精氨酸(R)、天冬酰胺(N)、天冬氨酸(D)、半胱氨酸(C)、谷氨酸(glutamic acid/glutamate)(E)、谷氨酰胺(Q)、甘氨酸(G)、组氨酸(H)、异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、赖氨酸(K)、甲硫氨酸(M)、苯丙氨酸(F)、脯氨酸(P)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、色氨酸(W)、酪氨酸(Y)和缬氨酸(V)。其它天然存在的氨基酸包含硒代半胱氨酸和吡咯赖氨酸。
在一些实施例中，多肽是经修饰的。在一些实施例中，多肽经修饰以用于使用所公开的方法进行检测。在一些实施例中，所公开的方法用于表征靶多肽中的修饰。
在一些实施例中，多肽中的一种或多种氨基酸/衍生物/类似物被修饰。在一些实施例中，多肽中的一种或多种氨基酸/衍生物/类似物是翻译后修饰的。因此，本文所公开的方法可以用于检测多肽中翻译后修饰的存在、不存在、位置的数量。所公开的方法可以用于表征多肽已被翻译后修饰的程度。
多肽中可以存在任何一个或多个翻译后修饰。典型的翻译后修饰包含用疏水性基团修饰、用辅因子修饰、添加化学基团、糖化(糖的非酶促连接)、生物素化和聚乙二醇化。翻译后修饰也可以是非天然的，使得它们是在实验室中出于生物技术或生物医学目的进行的化学修饰。与天然对应物相比，这可以允许监测实验室制造的肽、多肽或蛋白质的水平。
用疏水性基团进行的翻译后修饰的实例包含：豆蔻酰化、豆蔻酸酯的连接、C14饱和酸；棕榈酰化，棕榈酸酯的连接，C16饱和酸；异戊二烯化或异戊烯化，类异戊二烯基团的连接；法尼基化，法尼醇基团的连接；香叶酰香叶酰化，香叶基香叶醇基团的连接；和糖基磷脂酰肌醇化(glypiation)，以及通过酰胺键的糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚形成。
用辅因子进行翻译后修饰的实例包含脂酰化、硫辛酸酯(C8)官能团的连接；黄素化，黄素部分(例如黄素单核苷酸(FMN)或黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD))的连接；亚铁血红素C的连接，例如通过与半胱氨酸的硫醚键；磷酸巯基乙胺化(phosphopantetheinylation)，4'-磷酸泛酰巯基乙胺基的连接；以及亚视黄基席夫碱形成。
通过添加化学基团进行的翻译后修饰的实例包含酰化，例如O-酰化(酯)、N-酰化(酰胺)或S-酰化(硫酯)；乙酰化，例如将乙酰基与N末端或赖氨酸连接；甲酰化；烷基化，添加烷基，如甲基或乙基；甲基化，例如向赖氨酸或精氨酸添加甲基；酰胺化；丁酰化；γ-羧化；糖基化，糖基与例如精氨酸、天冬酰胺、半胱氨酸、羟赖氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸或色氨酸的酶促连接；聚唾液酸化，聚唾液酸的连接；丙二酰化；羟基化；碘化；溴化；瓜氨酸化；核苷酸添加，任何核苷酸，如上文所讨论的任何核苷酸的连接，ADP核糖基化；氧化；磷酸化，磷酸基团与例如丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸(O-连接)或组氨酸(N-连接)的连接；腺苷酸化，腺苷酸部分与例如酪氨酸(O-连接)或组氨酸或赖氨酸(N-连接)的连接；丙酰化；焦谷氨酸形成；S-谷胱甘肽化；苏素化；S-亚硝基化；琥珀酰化，琥珀酰基例如与赖氨酸的连接；硒酰化，硒的并入；以及泛素化，添加泛素亚基(N-连接)。
在一些实施例中，多肽含有一个或多个交联部分，例如C-C桥。在一些实施例中，在使用所公开的方法表征多肽之前，多肽未交联。
在一些实施例中，多肽包括含硫氨基酸并且因此具有形成二硫键的潜力。通常，在此类实施例中，在使用所公开的方法表征多条之前，使用如DTT(二硫苏糖醇)或TCEP(三(2-羧基乙基)膦)等试剂还原多肽。
多肽可以是任何合适长度的多肽。在一些实施例中，多肽的长度为至少10、至少50、至少100、至少150、至少200、至少250、至少300、至少400、至少500或至少1000个肽单元。在一些实施例中，多肽的长度为约2到约1000个肽单元，例如约10到约500个肽单元，例如约30到约300个肽单元，如约50到约200个肽单元，例如约100到约150个肽单元；
分析物可以是由细菌如病原菌产生的多糖。多糖可以是分子量为100-2000kDa的荚膜多糖。多糖可以由经核苷酸激活的前体(称为核苷酸糖)合成。多糖可以是脂多糖。多糖可以是治疗性多糖。多糖可以是有毒多糖。多糖可以适合用作疫苗。多糖可以是例如细菌或源自植物。多糖可以用作抗生素，如链霉素、新霉素、巴龙霉素、卡那霉素、查耳霉素、红霉素、大霉素、螺旋霉素、竹桃霉素、烬灰红菌素和友菌素或前述化合物中的任一种化合物的衍生物。多糖可以是糖。多糖可以是如以下等多糖：胼胝质、直链淀粉、昆布多糖、金藻昆布多糖、木聚糖、阿拉伯木聚糖、甘露聚糖、半乳甘露聚糖、葡聚糖、果聚糖、菊粉、聚半乳糖胺、结冷胶、黄原胶、纤维素、葡甘露聚糖、半纤维素、甲壳素、壳聚糖、透明质酸、埃尔辛南(elsinan)、普鲁兰多糖等。
在所公开的方法中可以表征任何数量的分析物。在一些实施例中，对多种靶分析物进行表征。例如，所述方法可以包括表征2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种、20种、30种、50种、100种或更多种分析物。如果表征两种或更多种分析物，则其可以是不同的分析物或同一分析物的两个实例。分析物可以是天然存在的或人工的。
用分子标记对分析物进行标记是在本文所提供的方法的范围内。分子标记可以是对分析物的修饰，其促进本文提供的方法中分析物的检测。例如，标记可以是对分析物的修饰，其改变表征分析物时所获得的信号。例如，标记可能会干扰通过纳米孔的离子的通量。以这种方式，标记可以改进方法的灵敏度。
本文所公开的一些实施例包括表征靶分析物。在一些实施例中，此类方法包括使用本文所公开的方法将分析物集中在检测器的区域中。在一些实施例中，当分析物相对于检测器移动时进行一个或多个测量，其中所述一个或多个测量指示所述分析物的一种或多种特性，并且由此在所述分析物相对于所述检测器移动时对所述分析物进行表征。
从以上讨论中将显而易见的是，在所公开的方法中进行的测量通常是分析物的一种或多种特性所特有的。例如，可以确定分析物的特性。在一些实施例中，分析物是多核苷酸。在一些此类实施例中，在所公开的方法中检测到的特性选自：(i)多核苷酸的长度；(ii)多核苷酸的同一性；(iii)多核苷酸的序列；(iv)多核苷酸的二级结构以及(v)多核苷酸是否被修饰。在一些实施例中，分析物是多肽。在一些此类实施例中，在所公开的方法中检测到的特性选自：(i)多肽的长度；(ii)多肽的同一性；(iii)多肽的序列；(iv)多肽的二级结构以及(v)多肽是否被修饰。
在典型的实施例中，测量是多核苷酸或多肽的序列所特有的。
衔接子
在本文所提供的其中分析物是多核苷酸的方法的实施例中，多核苷酸可以具有与其连接的多核苷酸衔接子。衔接子通常包括能够与多核苷酸的末端连接的多核苷酸链。
在一些实施例中，衔接子在多核苷酸与拴系复合物连接之前与多核苷酸连接。在一些实施例中，衔接子在多核苷酸与拴系复合物连接之后与多核苷酸连接。
因此，在一些实施例中，所述方法包括将衔接子(例如，如本文所描述的衔接子)与多核苷酸连接，并且将多核苷酸与拴系复合物连接。在一些实施例中，所述方法包括将多核苷酸与拴系复合物连接并且将衔接子(例如，如本文所描述的衔接子)与多核苷酸连接，因此与拴系复合物连接。
在一些实施例中，可以选择或修饰衔接子以提供用于与多核苷酸缀合的特定位点。
衔接子可以仅与多核苷酸的一个末端连接。多核苷酸衔接子可以添加到多核苷酸的两个末端。可替代地，可以将不同的衔接子添加到多核苷酸的两个末端。
衔接子可以添加到双链多核苷酸的两条链。衔接子可以添加到单链多核苷酸。将衔接子添加到多核苷酸的方法是本领域已知的。衔接子可以例如通过连接，通过点击化学，通过标记，通过拓扑异构化或通过任何其它合适的方法与多核苷酸连接。
在一个实施例中，所述衔接子或每个衔接子是合成的或人工的。通常，所述衔接子或每个衔接子包括如本文所描述的聚合物。在一些实施例中，所述衔接子或每个衔接子包括如本文所描述的间隔子。在一些实施例中，所述衔接子或每个衔接子包括多核苷酸。所述多核苷酸衔接子或每个多核苷酸衔接子可以包括DNA、RNA、经修饰的DNA(如无碱基DNA)、RNA、PNA、LNA、BNA和/或PEG。通常，所述衔接子或每个衔接子包括单链和/或双链DNA或RNA。衔接子可以包括与其所连接的多核苷酸链同一类型的多核苷酸。衔接子可以包括与其所连接的多核苷酸链不同类型的多核苷酸。在一些实施例中，在所公开的方法中所使用的多核苷酸链是单链DNA链并且衔接子包括DNA或RNA，通常是单链DNA。在一些实施例中，多核苷酸是双链DNA链并且衔接子包括DNA或RNA，例如，双链或单链DNA。
在一些实施例中，衔接子可以是桥接部分。桥接部分可以用于连接双链多核苷酸的两条链。例如，在一些实施例中，桥接部分用于将双链多核苷酸的模板链与双链多核苷酸的互补链连接。
桥接部分通常共价连接双链多核苷酸的两条链。桥接部分可以是能够连接双链多核苷酸的两条链的任何东西，前提是桥接部分不干扰多核苷酸相对于纳米孔移动。合适的桥接部分包含但不限于聚合接头、化学接头、多核苷酸或多肽。优选地，桥接部分包括DNA、RNA、经修饰的DNA(如无碱基DNA)、RNA、PNA、LNA或PEG。桥接部分更优选地是DNA或RNA。
在一些实施例中，桥接部分是发夹衔接子。发夹衔接子是包括单个多核苷酸链的衔接子，其中多核苷酸链的末端能够彼此杂交或被杂交到彼此，并且其中多核苷酸的中间区段形成环。可以使用本领域中已知的方法来设计合适的发夹衔接子。在一些实施例中，发夹环的长度通常为4到100个核苷酸，例如长度为4到50个，如4到20个，例如4到8个核苷酸。在一些实施例中，桥接部分(例如，发夹衔接子)连接在双链多核苷酸的一个末端处。桥接部分(例如，发夹衔接子)通常不连接在双链多核苷酸的两个末端处。
在一些实施例中，衔接子是线性衔接子。线性衔接子可以结合到单链多核苷酸的任一末端或两个末端。当多核苷酸是双链多核苷酸时，线性衔接子可以结合到双链多核苷酸的任一条链或两条链的任一末端或两个末端。线性衔接子可以包括如本文所描述的前导序列。线性衔接子可以包括用于与如本文所描述的标签(如孔标签)杂交的部分。线性衔接子的长度可以为10到150个核苷酸，如长度为20到120个，例如30到100个，例如40到80个，如50到70个核苷酸。线性衔接子可以是单链的。线性衔接子可以是双链的。
在一些实施例中，衔接子可以是Y衔接子。Y衔接子通常是多核苷酸衔接子。Y衔接子通常是双链的，并且包括(a)在一端，两条链杂交在一起的区域，和(b)在另一端，两条链不互补的区域。链的非互补部分通常形成突出端。由于两条链通常不像双链部分那样彼此不杂交，所以在Y衔接子中非互补区域的存在使衔接子具有Y形状。Y衔接子的两个单链部分的长度可以相同，或者长度可以不同。例如，Y衔接子的一个单链部分的长度可以为10到150个核苷酸，如长度为20到120个，例如30到100个，例如40到80个，如50到70个核苷酸，并且Y衔接子的另一个单链部分的长度可以独立地为10到150个核苷酸，如长度为20到120个，例如30到100个，例如40到80个，如50到70个核苷酸。Y衔接子的双链“茎”部分的长度可以为例如10到150个核苷酸，如长度为20到120个，例如30到100个，例如40到80个，如50到70个核苷酸。
可以通过本领域已知的任何合适的方式将衔接子与多核苷酸连接。衔接子可以单独地合成，并且化学连接或酶促地与多核苷酸连接。可替代地，衔接子可以在多核苷酸的加工中产生。在一些实施例中，衔接子在多核苷酸的一个末端处或附近与多核苷酸连接。在一些实施例中，衔接子与多核苷酸在所述多核苷酸末端的50个核苷酸内，例如20个核苷酸内，例如10个核苷酸内连接。在一些实施例中，衔接子在多核苷酸的末端处与所述多核苷酸连接。当衔接子与多核苷酸连接时，所述衔接子可以包括与所述多核苷酸同一类型的核苷酸或者可以包括与所述多核苷酸不同的核苷酸。
间隔子
在其中分析物是多核苷酸的本文所提供的方法的一些实施例中，本文所描述的多核苷酸或衔接子可以包括间隔子。例如，多核苷酸衔接子中可以存在一个或多个间隔子。例如，多核苷酸衔接子可以包括一个到约20个间隔子，例如，约1个到约10个，例如，1个到约5个间隔子，例如，1个、2个、3个、4个或5个间隔子。间隔子可以包括任何合适数量的间隔子单元。间隔子可以提供阻碍多核苷酸处理蛋白移动的能量势垒。例如，间隔子可以通过减少多核苷酸处理蛋白在多核苷酸上的牵引力来停滞多核苷酸处理蛋白。这可以例如通过使用无碱基间隔子，即其中从多核苷酸衔接子中的一个或多个核苷酸去除了碱基的间隔子来实现。间隔子可以物理地阻止多核苷酸处理蛋白的移动，例如通过引入庞大的化学基团以物理地阻碍多核苷酸处理蛋白的移动。
在一些实施例中，一个或多个间隔子包含在如本文要求保护的方法中使用的多核苷酸分析物或衔接子中，为了在所述多核苷酸分析物或衔接子穿过或跨过纳米孔时，即当所述多核苷酸分析物或衔接子相对于纳米孔移动时提供独特的信号。
在一些实施例中，间隔子可以包括线性分子，如聚合物。通常，此类间隔子具有与缀合物中使用的多核苷酸不同的结构。例如，如果多核苷酸分析物是DNA，则所述间隔子或每个间隔子不包括DNA。特别地，如果多核苷酸分析物是脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)，则所述间隔子或每个间隔子优选地包括肽核酸(PNA)、甘油核酸(GNA)、苏糖核酸(TNA)、锁核酸(LNA)或具有核苷酸侧链的合成聚合物。在一些实施例中，间隔子可以包括一个或多个硝基吲哚、一个或多个肌苷、一个或多个吖啶、一个或多个2-氨基嘌呤、一个或多个2-6-二氨基嘌呤、一个或多个5-溴-脱氧尿苷、一个或多个反向胸苷(反向dT)、一个或多个反向双脱氧胸苷(ddT)、一个或多个双脱氧胞苷(ddC)、一个或多个5-甲基胞苷、一个或多个5-羟甲基胞苷、一个或多个2'-O-甲基RNA碱基、一个或多个异脱氧胞苷(Iso-dC)、一个或多个异脱氧鸟苷(Iso-dG)、一个或多个C3(OC3H6OPO3)基团、一个或多个光可切割(PC)[OC3H6-C(O)NHCH2-C6H3NO2-CH(CH3)OPO3]基团、一个或多个己二醇基团、一个或多个间隔子9(iSp9)[(OCH2CH2)3OPO3]基团或一个或多个间隔子18(iSp18)[(OCH2CH2)6OPO3]基团；或一个或多个硫醇连接。间隔子可以包括这些基团的任何组合。这些基团中的许多可以从
Figure BDA0003765571150000371
(Integrated DNA
Figure BDA0003765571150000372
)商购获得。例如，C3、iSp9和iSp18间隔子均可从
Figure BDA0003765571150000373
获得。间隔子可以包括任何数量的上述基团作为间隔子单元。
在一些实施例中，间隔子可以包括一个或多个导致多核苷酸处理蛋白停滞的化学基团。
在一些实施例中，合适的化学基团是一个或多个化学侧基。一个或多个化学基团可以与多核苷酸分析物或衔接子中的一个或多个核碱基连接。一个或多个化学基团可以与多核苷酸衔接子的主链连接。可以存在任何数目的适当的化学基团，如2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个或更多。合适的基团包含但不限于荧光团、链霉亲和素和/或生物素、胆固醇、亚甲蓝、二硝基苯酚(DNP)、地高辛和/或抗地高辛和二苯基环辛炔基团。在一些实施例中，间隔子可以包括聚合物。在一些实施例中，间隔子可以包括聚合物，所述聚合物是多肽或聚乙二醇(PEG)。
在一些实施例中，间隔子可以包括一个或多个无碱基核苷酸(即，缺少核碱基的核苷酸)，如2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个或更多个无碱基核苷酸。在无碱基核苷酸中，核碱基可被-H(idSp)或-OH替换。通过从一个或多个相邻核苷酸中去除核碱基，可以将无碱基间隔子插入到靶多核苷酸中。例如，可以将多核苷酸修饰为包含3-甲基腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、1,N6-亚乙烯基腺嘌呤肌苷或次黄嘌呤，并且可以使用人烷基腺嘌呤DNA糖苷酶(hAAG)从这些核苷酸中去除核碱基。可替代地，可以将多核苷酸修饰成包含尿嘧啶，并且用尿嘧啶-DNA糖苷酶(UDG)去除核碱基。在一个实施例中，一个或多个间隔子不包括任何无碱基核苷酸。
标签
在其中检测器是纳米孔(上文所讨论的)的本文所提供的方法的一些实施例中，可以使用纳米孔上的标签，例如促进纳米孔捕获分析物。
纳米孔上的标签与分析物如多核苷酸上的结合位点(例如，存在于与多核苷酸连接的多核苷酸中或衔接子中的结合位点，其中结合位点可以由衔接子的锚或前导序列或由衔接子的双链体茎内的捕获序列提供)之间的相互作用可以是可逆的。例如，多核苷酸可以例如通过其衔接子结合到纳米孔上的标签，并且例如在通过纳米孔表征多核苷酸期间和/或在马达蛋白加工期间在某些点处释放。强的非共价结合(例如，生物素/亲和素)仍然是可逆的，并且可以用于本文所描述的方法的一些实施例中。例如，一对孔标签和多核苷酸衔接子可以被设计成在双链多核苷酸的补体(或衔接子的与补体连接的一部分)与纳米孔之间提供足够的相互作用，使得补体保持靠近纳米孔(不会与纳米孔分离并扩散)，但能够在处理时从纳米孔中释放出来。
孔标签和多核苷酸衔接子可以被配置成使得多核苷酸上的结合位点(例如，由衔接子的锚或前导序列或由衔接子的双链体茎内的捕获序列提供的结合位点)与纳米孔上的标签的结合强度或亲和力足以维持纳米孔与多核苷酸之间的连接，直到所施加的力放置于其上以从纳米孔释放结合的多核苷酸。
在一些实施例中，孔标签是不带电荷的。这样可以确保在电势差(如果存在的话)的影响下，其不会被拉入到纳米孔中。
吸引或结合分析物或衔接子的一个或多个分子可以与检测器，例如，与纳米孔连接。可以使用与分析物或衔接子杂交的任何分子。分子可以选自PNA标签、PEG接头、短寡核苷酸、带正电荷的氨基酸和适体。具有与其连接的此类分子的纳米孔是本领域已知的。例如，具有连接到其的短寡核苷酸的孔公开于Howarka等人(2001)《自然生物技术(NatureBiotech.)》19:636-639和WO 2010/086620，并且包括连接在孔的内腔内PEG的孔公开于Howarka等人(2000)《美国化学协会期刊(J.Am.Chem.Soc.)》122(11):2411-2416。
与纳米孔连接的短寡核苷酸包括与缀合物中的序列互补的序列(例如，在衔接子中的前导序列或另一个单链序列中)可以用于在本文所描述的方法中增强分析物的捕获。
在一些实施例中，孔标签可以包括或可以是寡核苷酸(例如，DNA、RNA、LNA、BNA、PNA或吗啉基)。寡核苷酸的长度可以为约10-30个核苷酸或长度为约10-20个核苷酸。在一些实施例中，寡核苷酸可以具有至少一个被修饰用于与其它修饰或固体底物表面(包含，例如珠粒)的末端(例如，3'末端或5'末端)缀合。末端改性剂可以添加可以用于缀合的反应性官能团。可以添加的官能团的实例包含但不限于氨基、羧基、硫醇、马来酰亚胺、氨氧基和其任何组合。官能团可以与不同长度的间隔子(例如，C3、C9、C12、间隔子9和18)组合以增加官能团与寡核苷酸序列末端的物理距离。
寡核苷酸的3'末端和/或5'末端上的修饰的实例包含但不限于3'亲和标签和用于化学连接的官能团(包含，例如3'-生物素、3'-伯胺、3'-二硫化物酰胺、3'-吡啶基二硫基及其任何组合)；5'末端修饰(包含，例如5'-伯胺和/或5'-荧光素)，用于点击化学的修饰(包含，例如3'-叠氮化物、3'-炔烃、5'-叠氮化物、5'-炔烃)和其任何组合。
在一些实施例中，孔标签可以进一步包括聚合物接头，例如，以促进连接到纳米孔。示例性聚合物接头包含但不限于聚乙二醇(PEG)。聚合物接头的分子量可以为约500Da到约10kDa(包括端值)，或约1kDa到约5kDa(包括端值)。聚合物接头(例如，PEG)可以用不同的官能团官能化，包含例如但不限于马来酰亚胺、NHS酯、二苯并环辛炔(DBCO)、叠氮化物、生物素、胺、炔烃、醛和其任何组合。
孔标签的其它实例包含但不限于His标签、生物素或链霉亲和素、与分析物结合的抗体、与分析物结合的适体、分析物结合结构域，如DNA结合结构域(包含例如肽拉链，如亮氨酸拉链、单链DNA结合蛋白(SSB))和其任何组合。
可以使用本领域已知的任何方法，将孔标签与纳米孔的外表面，例如，在膜的顺式侧连接。例如，一种或多种标签可以通过以下与纳米孔连接：一种或多种半胱氨酸(半胱氨酸键)、一种或多种伯胺(如赖氨酸)、一种或多种非天然氨基酸、一种或多种组氨酸(His标签)、一种或多种生物素或链霉亲和素、一种或多种基于抗体的标签、表位的一种或多种酶修饰(包含例如乙酰转移酶)和其任何组合。用于进行此类修饰的合适方法在本领域是众所周知的。合适的非天然氨基酸包含但不限于4-叠氮基-L-苯丙氨酸(Faz)，以及Liu C.C.和Schultz P.G.,《生物化学年鉴(Annu.Rev.Biochem.)》,2010,79,413-444的图1中编号为1-71的氨基酸中的任一种。
在一个或多个标签通过半胱氨酸键与纳米孔连接的一些实施例中，可以将一种或多种半胱氨酸引入到通过取代形成纳米孔的一种或多种单体中。在一些实施例中，可以通过连接如下来对纳米孔进行化学修饰：(i)马来酰亚胺，包含二溴马来酰亚胺，如：4-苯氮霉素、1.N-(2-羟乙基)马来酰亚胺、N-环己基马来酰亚胺、1.3-马来酰亚胺基丙酸、1.1-4-氨基苯基-1H-吡咯,2,5,二酮、1.1-4-羟基苯基-1H-吡咯,2,5,二酮、N-乙基马来酰亚胺、N-甲氧基羰基马来酰亚胺、N-叔丁基马来酰亚胺、N-(2-氨基乙基)马来酰亚胺、3-马来酰亚胺基-丙氧基、N-(4-氯苯基)马来酰亚胺、1-[4-(二甲基氨基)-3,5-二硝基苯基]-1H-吡咯-2,5-二酮、N-[4-(2-苯并咪唑基)苯基]马来酰亚胺、N-[4-(2-苯并恶唑基)苯基]马来酰亚胺、N-(1-萘基)马来酰亚胺、N-(2,4-二甲苯基)马来酰亚胺、N-(2,4-二氟苯基)马来酰亚胺、N-(3-氯-对-甲苯基)-马来酰亚胺、1-(2-氨基-乙基)-吡咯-2,5-二酮盐酸盐、1-环戊基-3-甲基-2,5-二氢-1H-吡咯-2,5-二酮、1-(3-氨基丙基)-2,5-二氢-1H-吡咯-2,5-二酮盐酸盐、3-甲基-1-[2-氧代-2-(哌嗪-1-基)乙基]-2,5-二氢-1H-吡咯-2,5-二酮盐酸盐、1-苄基-2,5-二氢-1H-吡咯-2,5-二酮、3-甲基-1-(3,3,3-三氟丙基)-2,5-二氢-1H-吡咯-2,5-二酮、1-[4-(甲基氨基)环己基]-2,5-二氢-1H-吡咯-2,5-二酮三氟乙酸、SMILES O＝C1C＝CC(＝O)N1CC＝2C＝CN＝CC2、SMILES O＝C1C＝CC(＝O)N1CN2CCNCC2、1-苄基-3-甲基-2,5-二氢-1H-吡咯-2,5-二酮、1-(2-氟苯基)-3-甲基-2,5-二氢1H-吡咯-2,5-二酮、N-(4-苯氧基苯基)马来酰亚胺、N-(4-硝基苯基)马来酰亚胺；(ii)碘代乙酰胺，如：3-(2-碘乙酰氨基)-丙氧基、N-(环丙基甲基)-2-碘乙酰胺、2-碘-N-(2-苯乙基)乙酰胺、2-碘-N-(2,2,2-三氟乙基)乙酰胺、N-(4-乙酰基苯基)-2-碘代乙酰胺、N-(4-(氨基磺酰基)苯基)-2-碘代乙酰胺、N-(1,3-苯并噻唑-2-基)-2-碘代乙酰胺、N-(2,6-二乙基苯基)-2-碘代乙酰胺、N-(2-苯甲酰基-4-氯苯基)-2-碘代乙酰胺；(iii)溴代乙酰胺：如N-(4-(乙酰氨基)苯基)-2-溴代乙酰胺、N-(2-乙酰基苯基)-2-溴代乙酰胺、2-溴-n-(2-氰基苯基)乙酰胺、2-溴-N-(3-(三氟甲基)苯基)乙酰胺、N-(2-苯甲酰基苯基)-2-溴代乙酰胺、2-溴-N-(4-氟苯基)-3-甲基丁酰胺、N-苄基-2-溴-N-苯基丙酰胺、N-(2-溴-丁酰基)-4-氯-苯磺酰胺、2-溴-N-甲基-N苯基乙酰胺、2-溴-N-苯乙基-乙酰胺、2-金刚烷-1-基-2-溴-N-环己基-乙酰胺、2-溴-N-(2-甲基苯基)丁酰胺、乙酰替对溴苯胺；(iv)二硫化物，如：aldrithiol-2、aldrithiol-4、异丙基二硫化物、1-(异丁基二硫烷基)-2-甲基丙烷、二苄基二硫化物、4-氨基苯基二硫化物、3-(2-吡啶基二硫代)丙酸、3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酰肼、3-(2-吡啶基二硫代)丙酸N-琥珀酰亚胺酯、am6amPDP1-βCD；以及(v)硫醇，如：4-苯基噻唑-2-硫醇、Purpald、5,6,7,8-四氢-喹唑啉-2-硫醇。
在一些实施例中，孔标签可以直接或通过一个或多个接头与纳米孔连接。可以使用WO2010/086602中所描述的杂交接头将标签与纳米孔连接。可替代地，可以使用肽接头。肽接头是氨基酸序列。肽接头的长度、柔性和亲水性通常被设计为使得其不干扰单体和孔的功能。肽接头可以是2到20个，如4个、6个、8个、10个或16个丝氨酸和/或甘氨酸氨基酸的延伸段。在一些实施例中，柔性接头包含(SG)1、(SG)2、(SG)3、(SG)4、(SG)5和(SG)8，其中S是丝氨酸并且G是甘氨酸。在一些实施例中，刚性接头是2到30个，如4个、6个、8个、12个、16个或24个脯氨酸的延伸段。
控制分析物的移动
如上文更详细地解释的，所公开方法的一些实施例包括对分析物进行表征。当分析物相对于检测器，例如，纳米孔移动时，可以对分析物进行表征。
分析物相对于检测器移动可以通过任何合适的方式来驱动。在一些实施例中，分析物的移动通过物理或化学力(势)来驱动。在一些实施例中，物理力由电势(例如电压电势)或温度梯度等提供。
在一些实施例中，当跨检测器(例如，跨纳米孔)施加电势时，分析物相对于检测器(例如，相对于纳米孔)移动。如多核苷酸等分析物带负电荷，并且因此跨纳米孔施加电压电势将导致分析物在所施加的电压电势的影响下相对于纳米孔移动。例如，如果相对于纳米孔的顺式侧向纳米孔的反式侧施加正电压电势，则这将诱导带负电的分析物从纳米孔的顺式侧移动到纳米孔的反式侧。类似地，如果相对于纳米孔的顺式侧向纳米孔的反式侧施加正电压电势，则这将阻碍带负电的分析物从纳米孔的反式侧向纳米孔的顺式侧移动。如果相对于纳米孔的顺式侧向纳米孔的反式侧施加负电压电势，则会发生相反的情况。本文更详细地描述了施加适当电压的设备和方法。
在一些实施例中，化学力由浓度(例如，pH)梯度提供。
在一些实施例中，分析物的移动通过分析物处理酶来驱动。例如，在其中分析物是如多核苷酸或多肽等生物聚合物的实施例中，聚合物的移动可以通过多核苷酸处理酶或多肽处理酶来控制。
在其中分析物是多核苷酸的一些实施例中，多核苷酸处理蛋白控制分析物相对于检测器的移动。
合适的多核苷酸处理蛋白也被称为马达蛋白或多核苷酸处理酶。合适的多核苷酸处理蛋白是本领域已知的，并且下文中更详细地描述了一些示例性多核苷酸处理蛋白。
在一个实施例中，马达蛋白是或源自多核苷酸处理酶。多核苷酸处理酶是能够与多核苷酸相互作用并且修饰其的至少一个性质的多肽。酶可以通过切割多核苷酸以形成单独的核苷酸或较短核苷酸链如二核苷酸或三核苷酸来对多核苷酸进行修饰。所述酶可以通过将多核苷酸朝向或使其移动到特定位置来对多核苷酸进行修饰。
在一些实施例中，多核苷酸处理蛋白可以在分析物与纳米孔接触之前存在于分析物上。例如，多核苷酸处理蛋白可以存在于多核苷酸分析物上，或存在于与多核苷酸分析物连接的衔接子上。
在一些实施例中，多核苷酸处理蛋白被修饰成防止多核苷酸处理蛋白从多核苷酸或衔接子上脱离(除了通过伪装(pass off)多核苷酸/衔接子的末端之外)。多核苷酸处理蛋白可以以任何合适的方式进行调整。例如，可以将多核苷酸处理蛋白装载到衔接子或多核苷酸上并且然后对其进行修饰以防止其脱离。可替代地，可以在多核苷酸处理蛋白装载到衔接子或多核苷酸上之前对多核苷酸处理蛋白进行修饰以防止其脱离。可以使用本领域已知的方法，如在WO 2014/013260(特此通过引用整体并入)中所讨论的方法并特别参考描述修饰马达蛋白(多核苷酸结合蛋白)(如解旋酶)以防止其与多核苷酸链脱离来实现多核苷酸处理蛋白的修饰以防止其与多核苷酸或衔接子脱离。
例如，多核苷酸处理蛋白可以具有多核苷酸解结合开口；例如，当多核苷酸处理蛋白与链脱离时，多核苷酸链可以通过的空腔、裂缝或空隙。在一些实施例中，给定马达蛋白(多核苷酸结合蛋白)的多核苷酸解结合开口可以通过参考其结构，例如参考其X射线晶体结构来确定。X射线晶体结构可以在多核苷酸底物存在和/或不存在下获得。在一些实施例中，可以使用本领域已知的标准包通过分子建模来推断或证实给定多核苷酸处理蛋白中多核苷酸解结合开口的位置。在一些实施例中，多核苷酸解结合开口可以通过多核苷酸处理蛋白的一个或多个部分例如一个或多个结构域的移动而瞬时产生。
可以通过关闭多核苷酸解结合开口来修饰多核苷酸处理蛋白。因此，关闭多核苷酸解结合开口可以防止多核苷酸处理蛋白从多核苷酸或衔接子脱离。例如，可以通过共价关闭多核苷酸解结合开口来修饰多核苷酸处理蛋白。在一些实施例中，用于以此方式寻址的多核苷酸处理蛋白是如本文所描述的解旋酶。
在一个实施例中，多核苷酸处理蛋白是或源自多核苷酸处理酶。多核苷酸处理酶是能够与多核苷酸相互作用并且修饰其的至少一个性质的多肽。酶可以通过切割多核苷酸以形成单独的核苷酸或较短核苷酸链如二核苷酸或三核苷酸来对多核苷酸进行修饰。所述酶可以通过将多核苷酸朝向或使其移动到特定位置来对多核苷酸进行修饰。
在一个实施例中，多核苷酸处理蛋白源自任何酶分类(EC)组的成员：3.1.11、3.1.13、3.1.14、3.1.15、3.1.16、3.1.21、3.1.22、3.1.25、3.1.26、3.1.27、3.1.30和3.1.31。
在一些实施例中，多核苷酸处理蛋白是解旋酶、聚合酶、外切核酸酶、拓扑异构酶、解折叠酶或其变体。
在一个实施例中，所述多核苷酸处理蛋白是外切核酸酶。合适酶包含但不限于来自大肠杆菌的外切核酸酶I(SEQ ID NO:1)、来自大肠杆菌的外切核酸酶III(SEQ ID NO:2)、来自嗜热栖热菌(T.thermophilus)的RecJ(SEQ ID NO:3)和噬菌体λ外切核酸酶(SEQID NO:4)、TatD外切核酸酶和其变体。包括SEQ ID NO:3中所示序列的三个亚基或其变体相互作用以形成三聚体外切核酸酶。
在一个实施例中，所述多核苷酸处理蛋白是聚合酶。聚合酶可以是
Figure BDA0003765571150000411
3173 DNA聚合酶(其可商购自
Figure BDA0003765571150000421
公司)、SD聚合酶(可商购自
Figure BDA0003765571150000422
)、来自NEB的Klenow或其变体。在一个实施例中，酶是
Figure BDA0003765571150000423
DNA聚合酶(SEQ ID NO:5)或其变体。可以用于本发明的方法的
Figure BDA0003765571150000424
聚合酶的经修饰版本公开于美国专利第5,576,204号中。
在一个实施例中，所述多核苷酸处理蛋白是拓扑异构酶。在一个实施例中，拓扑异构酶是部分分类(EC)组5.99.1.2和5.99.1.3中的任一个的成员。拓扑异构酶可以是逆转录酶，其是能够催化从RNA模板形成cDNA的酶。它们可从例如New England
Figure BDA0003765571150000425
和
Figure BDA0003765571150000426
商购获得。
在一个实施例中，所述多核苷酸处理蛋白是解旋酶。可以根据本文提供的方法使用任何合适的解旋酶。例如，根据本公开所使用的所述多核苷酸处理蛋白或每个多核苷酸处理蛋白可以独立地选自Hel308解旋酶、RecD解旋酶、TraI解旋酶、TrwC解旋酶、XPD解旋酶和Dda解旋酶或其变体。单聚解旋酶可以包括连接在一起的若干结构域。例如，TraI解旋酶和TraI亚组解旋酶可以含有两个RecD解旋酶结构域、释放酶结构域和C末端结构域。这些结构域通常形成能够起作用而不会形成寡聚体的单聚解旋酶。合适的解旋酶的具体实例包含Hel308、NS3、Dda、UvrD、Rep、PcrA、Pif1和TraI。这些解旋酶通常作用于单链DNA。可以沿着双链DNA的两条链移动的解旋酶的实例包含FtfK和六聚酶复合物，或多亚基复合物，如RecBCD。
Hel308解旋酶在出版物如WO 2013/057495中有所描述，其全部内容通过引用并入。RecD解旋酶在如WO 2013/098562的出版物中有描述，其全部内容通过引用并入。XPD解旋酶在如WO 2013/098561的出版物中有所描述，其全部内容通过引用并入。Dda解旋酶在如WO2015/055981和WO 2016/055777的出版物中有所描述，其各自的全部内容通过引用并入。
在一个实施例中，解旋酶包括SEQ ID NO:6中所示的序列(Trwc Cba)或其变体、SEQ ID NO:7中所示的序列(Hel308 Mbu)或其变体或SEQ ID NO:8中所示的序列(Dda)或其变体。变体可以以本文所讨论的方式中的任何方式中天然序列不同。SEQ ID NO:8的示例变体包括E94C/A360C。SEQ ID NO:8的另一个示例变体包括E94C/A360C，并且然后是(ΔM1)G1G2(即M1的缺失，并且然后是G1和G2的添加)。
在一些实施例中，多核苷酸处理蛋白(例如，解旋酶)可以在至少两种活性操作模式(当多核苷酸处理蛋白具有所有必要组分以促进移动时，例如本文所讨论的燃料和辅因子，如ATP和Mg2+)和一种非活性操作模式(当多核苷酸处理蛋白没有提供促进移动必要组分时)中控制多核苷酸移动。
当提供所有必要组分以促进运动(即在活性模式下)时，多核苷酸处理蛋白(例如解旋酶)在5'到3'或3'到5'方向(取决于多核苷酸处理蛋白)上沿着多核苷酸移动。在其中使用多核苷酸处理蛋白来控制多核苷酸链相对于纳米孔的移动的实施例中，多核苷酸处理蛋白可以用于将多核苷酸移动远离(例如，移出)孔(例如，对抗所施加的力)或将多核苷酸朝向(例如，进入到)孔移动(例如，用所施加的力)。例如，当多核苷酸处理蛋白所移动的多核苷酸的末端被孔捕获时，多核苷酸处理蛋白会逆着力的方向工作，并且将穿过的多核苷酸拉出孔(例如，进入到顺式室中)。然而，当多核苷酸处理蛋白所移动的远离的末端被捕获在孔中时，多核苷酸处理蛋白使用力的方向工作并且将穿过的多核苷酸推入到孔中(例如，进入到反式室中)。
当多核苷酸处理蛋白(例如，解旋酶)没有提供促进移动的必要组分(即，处于非活性模式)时，其可以与多核苷酸物结合并作为制动器，当其相对于纳米孔移动时减慢多核苷酸的移动，例如通过被力拉入到孔中。在非活性模式下，多核苷酸的哪一个末端被捕获并不重要，所施加的力决定了多核苷酸相对于孔的移动，并且多核苷酸结合蛋白充当制动器。当在非活动模式中时，通过多核苷酸结合蛋白对多核苷酸的移动控制可以以多种方式(包含棘轮、滑动和制动)描述。
多核苷酸处理蛋白通常需要燃料来处理多核苷酸的加工。燃料通常是游离核苷酸或游离核苷酸类似物。游离核苷酸可以是但不限于腺苷一磷酸(AMP)、腺苷二磷酸(ADP)、腺苷三磷酸(ATP)、鸟苷一磷酸(GMP)、鸟苷二磷酸(GDP)、鸟苷三磷酸(GTP)、胸苷一磷酸(TMP)、胸苷二磷酸(TDP)、胸苷三磷酸(TTP)、尿苷一磷酸(UMP)、尿苷二磷酸(UDP)、尿苷三磷酸(UTP)、胞苷一磷酸(CMP)、胞苷二磷酸(CDP)、胞苷三磷酸(CTP)、环腺苷一磷酸(cAMP)、环鸟苷一磷酸(cGMP)、脱氧腺苷一磷酸(dAMP)、脱氧腺苷二磷酸(dADP)、脱氧腺苷三磷酸(dATP)、脱氧鸟苷一磷酸(dGMP)、脱氧鸟苷二磷酸(dGDP)、脱氧鸟苷三磷酸(dGTP)、脱氧胸苷一磷酸(dTMP)、脱氧胸苷二磷酸(dTDP)、脱氧胸苷三磷酸(dTTP)、脱氧尿苷一磷酸(dUMP)、脱氧尿苷二磷酸(dUDP)、脱氧尿苷三磷酸(dUTP)、脱氧胞苷一磷酸(dCMP)、脱氧胞苷二磷酸(dCDP)和脱氧胞苷三磷酸(dCTP)。游离核苷酸通常选自AMP、TMP、GMP、CMP、UMP、dAMP、dTMP、dGMP或dCMP。游离核苷酸通常是三磷酸腺苷(ATP)。
多核苷酸处理蛋白的辅因子是允许多核苷酸处理蛋白发挥功能的因子。辅因子优选地是二价金属阳离子。二价金属阳离子优选为Mg2+、Mn2+、Ca2+或Co2+。辅因子最优选地为Mg2+。
适用于控制多肽分析物的移动的马达蛋白也是本领域众所周知的。例如，解折叠酶或其变体可以用于控制多肽相对于纳米孔的移动。解折叠酶包含AAA+酶，如来自大肠杆菌的ClpX酶。
条件
可以使用适合于研究孔插入到膜中的膜/孔系统的任何设备进行本文所公开的方法。可以使用适合于跨膜孔感测的任何设备进行所述方法。例如，如上文所解释的，所述设备可以包括包含水溶液的室和将室分成两段的屏障。屏障通常具有开孔，在所述孔中形成含有跨膜孔的膜。本文描述了跨膜孔。
可以使用在WO 2008/102120、WO 2010/122293或WO 00/28312中描述的设备进行表征方法。
包括表征如多核苷酸或多肽方法等分析物的所公开的方法可以涉及通常通过测量电流来测量流过孔的离子电流。可替代地，可以光学测量通过孔的离子流，如在Heron等人：《美国化学会志(J.Am.Chem.Soc.)》9第131卷,第5期,2009中所公开的。因此，设备还可以包括能够施加电位并且测量跨膜和孔的电信号的电路。可以使用膜片钳或电压钳来进行表征方法。表征方法优选地涉及电压钳的使用。
所公开的方法可以在基于硅的孔阵列上进行，其中每个阵列包括128个、256个、512个、1024个、2000个、3000个、4000个、6000个、10000个、12000个、15000个或更多个孔。
包括表征分析物如多核苷酸或多肽的所公开的方法可以涉及测量流经孔的电流。所述方法通常在跨膜和孔施加电压的情况下进行。所使用的电压通常为+2V到-2V，通常为-400mV到+400mV。所使用的电压优选地处于具有下限和上限的范围内，所述下限选自-400mV、-300mV、-200mV、-150mV、-100mV、-50mV、-20mV和0mV，并且所述上限独立地选自+10mV、+20mV、+50mV、+100mV、+150mV、+200mV、+300mV和+400mV。所使用的电压更优选地处于100mV到240mV的范围内，并且最优选地处于120mV到220mV的范围内。通过使用增加的施加电位，可以通过孔增加不同核苷酸之间的区分度。
通常在存在任何电荷载流子的情况下进行所公开的方法，所述电荷载流子如金属盐，例如碱金属盐，卤盐，例如氯化物盐，如碱金属氯化物盐。电荷载流子可以包含离子液体或有机盐，例如四甲基氯化铵、三甲基苯基氯化铵、苯基三甲基氯化铵或1-乙基-3-甲基氯化咪唑。在上文所讨论的示例性设备中，盐存在于室中的水溶液中。通常使用氯化钾(KCl)、氯化钠(NaCl)或氯化铯(CsCl)。KCl是优选的。盐可以是碱土金属盐，如氯化钙(CaCl2)。盐浓度可以处于饱和状态。盐浓度可以是3M或更低，并且通常为0.1M到2.5M、0.3M到1.9M、0.5M到1.8M、0.7M到1.7M、0.9M到1.6M、或1M到1.4M。盐浓度优选地为150mM到1M。优选地使用至少0.3M的盐浓度进行表征方法，如至少0.4M，至少0.5M，至少0.6M，至少0.8M，至少1.0M，至少1.5M，至少2.0M，至少2.5M或至少3.0M。高盐浓度提供高信噪比，并允许在正常电流波动的背景下识别指示结合/无结合的电流。
通常在存在缓冲液的情况下进行所公开的方法。在上文所讨论的示例性设备中，缓冲液存在于室中的水溶液中。可以使用任何合适的缓冲液。通常，缓冲液是HEPES。另一种合适的缓冲液是Tris-HCl缓冲液。通常在以下的pH下执行所述方法：4.0到12.0、4.5到10.0、5.0到9.0、5.5到8.8、6.0到8.7或7.0到8.8或7.5到8.5。所使用的pH优选地是约7.5。
可以在以下温度下进行所公开的方法：0℃到100℃、15℃到95℃、16℃到90℃、17℃到85℃、18℃到80℃、19℃到70℃或20℃到60℃。通常在室温下进行表征方法。任选地在支持酶功能的温度下进行表征方法，如在约37℃下进行。
所公开的方法通常在体外进行。
本公开的另外的方面
本公开还提供了包括拴系复合物的两亲性层，所述拴系复合物可通过所公开的方法获得。
还提供了包括跨膜纳米孔和拴系复合物的两亲性层，其中所述拴系复合物包括跨越两亲性层并与一种或多种亲水性组分连接的疏水性接头。在一些实施例中，两亲性层被划分为含有纳米孔的第一区域和第二区域，并且第一区域在化学上和/或物理上不同于第二区域。在一些实施例中，拴系复合物包括通过疏水性接头与第二亲水性组分连接的第一亲水性组分。
还提供了一种两亲性层，所述两亲性层包括跨膜纳米孔和拴系复合物，其中所述拴系复合物包括跨越所述两亲性层的疏水性接头、位于所述两亲性层的顺式侧的第一亲水性组分和位于所述两亲性层的反式侧的第二亲水性组分。
在一些实施例中，所述两亲性层包括第一区域和第二区域；并且纳米孔位于第一区域中并将拴系复合物集中在第一区域中。
在一些实施例中，两亲性层如本文所描述的。在一些实施例中，拴系复合物如本文所描述的组装。
本文还提供了包括两个或更多个如本文所描述的两亲性层的阵列。在一些实施例中，阵列适于插入到传感器装置中。
还提供了一种装置，其包括此类阵列、用于跨两亲性层施加电压电位的构件和用于检测跨两亲性层的电荷的构件。在一些实施例中，所述装置任选地进一步包括用于将样品供应到所述两亲性层的流体系统。
还提供了一种系统，所述系统包括
-包括第一区域和第二区域的两亲性层；
-纳米孔；以及
-包括通过疏水性接头连接的一种或多种亲水性组分的拴系复合物。
在一些实施例中，拴系复合物包括通过疏水性接头与第二亲水性组分连接的第一亲水性组分。
在一些实施例中，所述系统进一步包括用于控制分析物相对于纳米孔移动的分析物处理蛋白。在一些实施例中，分析物是多核苷酸并且分析物处理蛋白是多核苷酸处理蛋白。
在一些实施例中，两亲性层如本文所描述的。在一些实施例中，拴系复合物如本文所描述的组装。在一些实施例中，纳米孔如本文所描述的。在一些实施例中，分析物处理蛋白如本文所描述的。
还提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括：
-包括通过疏水性接头连接的一种或多种亲水性组分的拴系复合物；或其组分；
-纳米孔；以及
-分析物处理蛋白。
在一些实施例中，拴系复合物包括通过疏水性接头与第二亲水性组分连接的第一亲水性组分。
在一些实施例中，拴系复合物的组分如本文所描述的。在一些实施例中，所述试剂盒包括(i)疏水性接头；(ii)第一亲水性组分；以及(iii)第二亲水性组分。在一些实施例中，第一亲水性组分和第二亲水性组分被配置成与疏水性接头上的反应性基团反应以形成拴系复合物。在其它实施例中，所述试剂盒包括第一部分，所述第一部分包括与包括第一反应性基团的第一疏水性部分连接的第一亲水性组分；并且第二部分包括与包括第二反应性基团的第二疏水性部分连接的第二亲水性组分。
在一些实施例中，所述试剂盒进一步包括用于形成两亲性层的两亲性分子。
在一些实施例中，拴系复合物或其组分、纳米孔和分析物处理蛋白以及两亲性分子(如果存在)如本文所描述的。
所述试剂盒可以被配置成与本文所提供的算法一起使用，所述算法被适配成在计算机系统上运行。所述算法可以适用于检测与拴系复合物连接的分析物的信息特征(例如，当分析物是多肽或多核苷酸时，分析物序列的特征)，并选择性地处理在分析物相对于纳米孔移动时获得的信号。还提供了一种包括计算构件的系统，所述计算构件被配置成检测与拴系复合物连接的分析物的信息特征(例如，当分析物是多肽或多核苷酸时，分析物序列的特征)，并选择性地处理在分析物相对于纳米孔移动时获得的信号。在一些实施例中，所述系统包括用于从分析物的检测接收数据的接收构件、用于处理当分析物相对于纳米孔移动时获得的信号的处理构件以及用于输出由此获得的表征信息的输出构件。
应当理解，虽然本文已经针对根据本发明的方法讨论了特定实施例、特定构造以及材料和/或分子，但是可以在不脱离本发明的范围和精神的情况下在形式和细节上进行各种改变或修改。提供以下实例仅用于说明，并且不应被认为限制本申请。本申请仅由权利要求书限制。
实例
以下非限制性实例证明了所公开方法的功效。
实例1
实例1描述了三嵌段两亲性层中拴系复合物的非共价形成。
材料和方法
以下寡核苷酸购自IDTDNA。序列和修饰如下所示。
SEQ ID NO:11 5'-/A1a/TACTTCGTTATTCTTGTCTCTAT/Cy5/-3'
SEQ ID NO:12 5'-/Cy5/ATAGAGACAAGAATAACGAAGTA/Cy5/-3'
A1a是选择性地与A1b反应以形成稳定的共价键的连接基团。
产生了以下缓冲溶液：
Figure BDA0003765571150000461
此实例使用链霉亲和素作为A2a以及生物素作为A2b。
三嵌段和疏水性接头(A2b-pDMSx-pMOXAn-[系链-寡聚体]，其中A2b是选择性地与A2a形成高亲和力非共价相互作用的连接基团，其中n＝1-20并且x＝5-80)的合成
WO 2001/032146中描述了pDMS/pMOXA嵌段共聚物分子的合成。使用WO 2001/032146中所描述的合成方法和标准合成方法合成A2b-pDMSx-pMOXAn-[系链-寡聚体](其中A2b是选择性地与A2a形成高-亲和力非共价相互作用的连接基团，n＝1-20并且x＝5-80)。SEQ ID NO:11用于连接[系链-寡聚体]。含有疏水性接头的前体含有A2b和A1b。A1b基团用于将疏水性接头与SEQ ID NO:11上的A1a基团缀合，以得到最终产物：A2b-pDMSx-pMOXAn-[系链-寡聚体]。
生成膜溶液“M”
WO 2014/064444中描述了膜溶液的制备。使用WO 2014/064444中所描述的方法制备具有疏水性接头的油。
溶液“M”是通过将0.2-20mg/mL pMOXAn-pDMSx-pMOXAn三嵌段(其中n＝1到20并且x＝5到80)与A2b-pDMSx-pMOXAn-[系链-寡聚体](其中A2b是选择性地与A2a形成高-亲和力非共价相互作用的连接基团，其中n＝1-20并且x＝5-80)以99:1的比率溶解在pDMS硅油中制备的。
组装反式锚定的系链-寡聚体
组装MinION流通池(牛津纳米孔技术公司(Oxford Nanopore Technologies))以在反式孔中形成具有缓冲液“A”或“B”的产物，所述产物接触由膜溶液“M”形成的膜，所述膜溶液“M”接触缓冲液“A”作为顺式溶液。
共聚焦显微镜测量
为了增加来自顺式可接近的系链-寡聚体(SEQ ID NO:11)的荧光，将顺式缓冲液替换为含有SEQ ID NO:12的缓冲液“C”。SEQ ID NO:12可以与SEQ ID NO:11杂交，并且由此增加其荧光。
在存在缓冲液“C”的情况下对流通池进行成像。
使用10x M平面透镜(0.28NA)通过共聚焦显微镜对所组装的流通池进行Z-堆叠成像；使用640nm激光进行激发，使用C2检测器和Cy5滤波器组收集发射。使用NIS元素软件将Z-堆叠重建为3D图像。使用红色查找表显示图像。
在MinION芯片上形成有或没有反式锚的膜。在膜形成后，使用共焦显微镜生成膜荧光的重建3D图像，如在图1A和1B中所示，其中
反式缓冲液
图1A：缓冲液A(无反式锚)。
图1B：0.5mg/mL A2a(其中A2a是选择性地与A2b形成高-亲和力非共价相互作用的大的亲水性连接基团)
膜溶液：
M(1％A2b-pDMSx-pMOXAn-[系链-寡聚体])，
(其中A2b是选择性地与A2a形成高亲和力非共价相互作用的连接基团，n＝1-20并且x＝5-80)
顺式缓冲液
C(荧光SEQ ID NO:12)
结果
A2a是能够选择性地与疏水性接头上的A2b形成高亲和力非共价相互作用的大的亲水性反式锚。
在图1A中，在不存在A2a反式锚的情况下组装对照流通池，并将荧光寡核苷酸添加到顺式缓冲液中，以荧光标记任何顺式可接近的系链-寡聚体。在此处，我们看到荧光标记均匀地分散在整个顺式溶液中。这表明膜上不存在可检测量的顺式可接近的系链-寡聚体。
在图1B中，流通池组装0.5mg/mL A2a反式锚。在此处，我们看到来自膜的荧光。这表明A2a的包含已经增加了膜上系链-寡聚体的可用性，并且SEQ ID NO:11能够与SEQ IDNO:12结合。这与反式锚定的系链-寡聚体的成功组装以及随后系链在膜上的累积是一致的。
实例2
实例2描述了三嵌段两亲性层中拴系复合物的非共价形成。
材料和方法
以下寡核苷酸购自IDTDNA或ADTBio。序列和修饰如下所示。
SEQ ID NO:12 5'-/Cy5/ATAGAGACAAGAATAACGAAGTA/Cy5/-3'
SEQ ID NO:13 5'-/A3a//HEG//HEG//HEG/TACTTCGTTATTCTTGTCTCTAT-3
SEQ ID NO:14 5'-/A3a/TACTTCGTTATTCTTGTCTCTAT/Cy5/-3'
A3a是选择性地与A3b反应以形成稳定的共价键的反应性连接基团。HEG＝六乙二醇。
产生了以下缓冲溶液：
Figure BDA0003765571150000481
疏水性接头(A1b-pDMSx-A3b，其中A1b是选择性地与A1a反应以形成稳定的共价键的连接基团，A3b是选择性地与A3a反应以形成稳定的共价键的连接基团，并且x＝5-80)的合成
WO 2001/032146中描述了pDMS/pMOXA嵌段共聚物分子的合成。膜溶液“Q”中的A1b-pDMSx-A3b中的pDMS单元的数量是膜溶液“P”中的pDMS单元生物数量的4倍。使用WO2001/032146中所描述的方法和标准合成方法合成产物。由于所使用的合成路线，A1b-pDMSx-A3b产物将含有一些不期望的对称副产品(即，A1b-pDMSx-A1b和A3b-pDMSx-A3b)。
生成膜溶液“P”和“Q”
WO 2014/064444中描述了膜溶液的制备。使用WO 2014/064444中所描述的方法制备具有疏水性接头的油。
溶液“P”是通过将0.2-20mg/mL pMOXAn-pDMSx二嵌段(其中n＝1-20并且x＝5-80)和A1b-pDMSx-A3b(其中x＝5-80)以999:1的比率溶解在pDMS硅油中制备的。
溶液“Q”是通过将0.2-20mg/mL pMOXAn-pDMSx二嵌段(其中n＝1-20并且x＝5-80)和A1b-pDMSx-A3b(其中x＝5-80)以999:1的比率溶解在pDMS硅油中制备的。
组装反式锚定的系链-寡聚体
组装MinION流通池(牛津纳米孔技术公司)以形成具有以下的产物：反式孔中的缓冲液“A”或“D”接触由膜溶液“P”或“Q”形成的膜，所述膜溶液“P”或“Q”接触缓冲液“E”或“F”作为顺式溶液。在系链-寡聚体与疏水性接头连接后，用缓冲液“A”替换顺式缓冲液以去除多余的未经反应的系链-寡聚体。
共聚焦显微镜测量
为了荧光标记顺式可接近的系链-寡聚体，将顺式缓冲液替换为缓冲液“C”。缓冲液“C”中的荧光-寡聚体可以与系链-寡聚体杂交，并且由此增加其荧光。成像之前，用缓冲液“A”替换顺式缓冲液以去除非杂交的荧光-寡聚体。
使用10x M平面透镜(0.28NA)通过共聚焦显微镜对所组装的流通池进行Z-堆叠成像；使用640nm激光进行激发，使用C2检测器和Cy5滤波器组收集发射。使用NIS元素软件将Z-堆叠重建为3D图像。使用红色查找表显示图像。
使用二嵌段共聚物膜在MinION芯片上形成膜。
反式锚定的系链-寡聚体由三个单独的组分在三个单独的区室(反式缓冲液、膜和顺式缓冲液)中组装。最终的反式系链复合物的组装驱动系链-寡聚体在膜上的累积。
A1a-H1用作反式锚，并添加到反式缓冲液中。H1被抑制跨膜“翻转”，并且A1a基团用于连接到疏水性接头的A1b基团上。
将系链-寡聚体添加到顺式缓冲液中。系链-寡聚体含有用于与疏水性接头的A3b基团连接的A3a基团。系链寡聚体是使用DNA或吗啉基化学反应制备的。
将疏水性接头添加到膜溶液中。疏水性接头有两个末端，每个末端含有不同的正交反应性基团(A1b和A3b)。这确保了接头的A3b末端只能与顺式缓冲液中的A3a-寡聚体(系链)反应，而A1b末端只能与反式缓冲液中的A1a-H1(锚)反应。
在膜形成后，使用溶液“C”标记系链，并使用共聚焦显微镜生成膜荧光的重建3D图像，如在图2A-C中所示，其中
图2A、2B
膜溶液：
Q(A1b-pDMSx-A3b，其中A1b是选择性地与A1a反应以形成稳定的共价键的连接基团，A3b是选择性地与A3a反应以形成稳定的共价键的连接基团，并且x＝5-80)
顺式缓冲液
F(具有A3a反应性基团的DNA系链-寡聚体)
反式缓冲液
图2A：反式缓冲液“A”(无反式锚)
图2B：反式缓冲液“D”(A1a-H1反式锚，其中A1a是选择性地与A1b反应以形成稳定的共价键的连接基团，并且H1是亲水性部分)
图2C
膜溶液：
P(A1b-pDMSx-A3b，其中A1b是选择性地与A1a反应以形成稳定的共价键的连接基团，A3b是选择性地与A3a反应以形成稳定的共价键的连接基团，并且x＝5-80)
顺式缓冲液
E(具有A3a反应性基团的吗啉基系链-寡聚体)
反式缓冲液
D(A1a-H1反式锚，其中A1a是选择性地与A1b反应以形成稳定的共价键的连接基团，并且H1是亲水性部分)
结果
在图2A中，未添加反式锚，并且在图2B中，添加了A1a-H1反式锚。反式锚的包含导致更多的系链在膜上累积，从而证明了反式锚的连接导致系链在膜上的累积。
在图2B中，使用了较长的疏水性接头和吗啉基系链。在图2C中，使用了较短的疏水性接头和DNA系链。pDMS长度的差异是4倍。在这两种情况下，在膜上均观察到了荧光，从而表明通过产生反式锚定的系链-寡聚体复合物已经成功地累积了系链-寡聚体。这表明大范围的接头长度和系链化学反应可以用于通过反式锚定来累积系链-寡聚体。
实例3
实例3描述了三嵌段两亲性层中拴系复合物的共价形成。
材料和方法
以下寡核苷酸购自IDTDNA或ADTBio。序列和修饰如下所示。
SEQ ID NO:12 5'-/Cy5/ATAGAGACAAGAATAACGAAGTA/Cy5/-3'
SEQ ID NO:14 5'-/A3a/TACTTCGTTATTCTTGTCTCTAT/Cy5/-3'
A3a是选择性地与A3b反应以形成稳定的共价键的反应性连接基团。
产生了以下缓冲溶液：
Figure BDA0003765571150000501
疏水性接头(A1b-pDMSx-pMOXAn-A3b，其中A1b是选择性地与A1a反应以形成稳定的共价键的连接基团，A3b是选择性地与A3a反应以形成稳定的共价键的连接基团，n＝1-20并且x＝5-80)的合成
WO 2001/032146中描述了pDMS/pMOXA嵌段共聚物分子的合成。A1b-pDMSx-pMOXAn-A3b是使用WO 2001/032146A3中所描述的方法和标准合成方法合成的。由于所使用的合成路线，A1b-pDMSx-pMOXAn-A3b产物将含有一些不期望的对称副产品(即，A1b-pDMSx-A1b和A3b-pMOXAn-pDMSx-pMOXAn-A3b)。
生成膜溶液“R”
WO 2014/064444中描述了膜溶液的制备。使用WO 2014/064444中所描述的方法制备具有疏水性接头的油。溶液“R”是通过将0.2-20mg/mL pDMSx-pMOXAn-pDMSx三嵌段(其中n＝1-20并且x＝5-80)和A1b-pDMSx-pMOXAn-A3b(其中A1b是选择性地与A1a反应以形成稳定的共价键的连接基团，A3b是选择性地与A3a反应以形成稳定的共价键的连接基团，并且x＝5-80)以99:1的比率溶解在pDMS硅油中制备的。
组装反式锚定的系链-寡聚体
组装MinION流通池(牛津纳米孔技术公司)以形成具有以下的产物：反式孔中的缓冲液“A”或“G”接触由膜溶液“R”形成的膜，所述膜溶液“R”接触缓冲液“F”作为顺式溶液。在系链-寡聚体与疏水性接头连接后，用缓冲液“A”替换顺式缓冲液以去除多余的未经反应的系链-寡聚体。
共聚焦显微镜测量
为了荧光标记顺式可接近的系链-寡聚体，将顺式缓冲液替换为缓冲液“C”。缓冲液“C”中的荧光-寡聚体可以与系链-寡聚体杂交，并且由此增加其荧光。成像之前，用缓冲液“A”替换顺式缓冲液以去除非杂交的荧光-寡聚体。
使用10x M平面透镜(0.28NA)通过共聚焦显微镜对所组装的流通池进行Z-堆叠成像；使用640nm激光进行激发，使用C2检测器和Cy5滤波器组收集发射。使用NIS元素软件将Z-堆叠重建为3D图像。使用“火(fire)”查找表显示图像。
使用三嵌段共聚物膜在MinION芯片上形成膜。反式锚定的系链-寡聚体由三个单独的组分在三个单独的区室(反式缓冲液、膜和顺式缓冲液)中组装。最终的反式系链复合物的组装驱动系链-寡聚体在膜上的累积。
A1a-H2用作反式锚，并添加到反式缓冲液中。H2被抑制跨膜“翻转”，并且A1a基团用于连接到疏水性接头的A1b基团上。
将系链-寡聚体添加到顺式缓冲液中。系链-寡聚体含有用于与疏水性接头的A3b基团连接的A3a基团。
将疏水性接头添加到膜溶液中。疏水性接头有两个末端，每个末端含有不同的正交反应性基团(A1b和A3b)。这确保了接头的A3b末端只能与顺式缓冲液中的A3a-寡聚体(系链)反应，而A1b末端只能与反式缓冲液中的A1a-H2(锚)反应。
在膜形成后，使用溶液“C”标记系链，并使用共聚焦显微镜生成膜荧光的重建3D图像，如在图3A-B中所示，其中
膜溶液：
R(A1b-pDMSx-pMOXAn-A3b，其中A1b是选择性地与A1a反应以形成稳定的共价键的连接基团，A3b是选择性地与A3a反应以形成稳定的共价键的连接基团，n＝1-20并且x＝5-80)
顺式缓冲液
F(具有A3a反应性基团的DNA系链-寡聚体)
反式缓冲液
图3A：A(无反式锚)
图3B：G(A1a-H2反式锚，其中A1a是选择性地与A1b反应以形成稳定的共价键的连接基团，并且H2是亲水性部分)
结果
在图3A中，未添加反式锚，并且在图3B中，添加了A1a-H2反式锚。反式锚的包含导致更多的系链在膜上累积，从而证明了反式锚的连接导致系链在膜上的累积。
在此实例中，膜溶液“R”中的大多数两亲物是三嵌段分子，而在实例2中，膜溶液“P”和“Q”中的大多数两亲物是二嵌段分子。在这两种情况下，在添加反式锚时均观察到系链的累积。这表明无论膜的组合物如何，均可以实现系链的累积。
序列表说明
SEQ ID NO:1示出了来自大肠杆菌的(六组氨酸标记的)外切核酸酶I(EcoExo I)的氨基酸序列。
SEQ ID NO:2示出了来自大肠杆菌的外切核酸酶III酶的氨基酸序列。
SEQ ID NO:3示出了来自嗜热栖热菌的RecJ酶(TthRecJ-cd)的氨基酸序列。
SEQ ID NO:4示出了噬菌体λ外切核酸酶的氨基酸序列。所述序列是组装成三聚体的三个完全相同亚基中的之一。(http://www.neb.com/nebecomm/products/productM0262.asp)。
SEQ ID NO:5示出了来自枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的
Figure BDA0003765571150000521
DNA聚合酶的氨基酸序列。
SEQ ID NO:6示出了Trwc Cba(深洋柠檬色微菌(Citromicrobiumbathyomarinum))解旋酶的氨基酸序列。
SEQ ID NO:7示出了Hel308 Mbu(布氏拟甲烷球菌(Methanococcoidesburtonii))解旋酶的氨基酸序列。
SEQ ID NO:8示出了来自肠杆菌噬菌体T4的Dda解旋酶1993的氨基酸序列。
SEQ ID NO:11示出了实例中使用的寡核苷酸的核苷酸序列。
SEQ ID NO:12示出了实例中使用的寡核苷酸的核苷酸序列。
SEQ ID NO:13示出了实例中使用的寡核苷酸的核苷酸序列。
SEQ ID NO:14示出了实例中使用的寡核苷酸的核苷酸序列。
序列表
SEQ ID NO:1-来自大肠杆菌的外切核酸酶I
MMNDGKQQSTFLFHDYETFGTHPALDRPAQFAAIRTDSEFNVIGEPEVFYCKPADDYLPQPGAVLITGITPQEARAKGENEAAFAARIHSLFTVPKTCILGYNNVRFDDEVTRNIFYRNFYDPYAWSWQHDNSRWDLLDVMRACYALRPEGINWPENDDGLPSFRLEHLTKANGIEHSNAHDAMADVYATIAMAKLVKTRQPRLFDYLFTHRNKHKLMALIDVPQMKPLVHVSGMFGAWRGNTSWVAPLAWHPENRNAVIMVDLAGDISPLLELDSDTLRERLYTAKTDLGDNAAVPVKLVHINKCPVLAQANTLRPEDADRLGINRQHCLDNLKILRENPQVREKVVAIFAEAEPFTPSDNVDAQLYNGFFSDADRAAMKIVLETEPRNLPALDITFVDKRIEKLLFNYRARNFPGTLDYAEQQRWLEHRRQVFTPEFLQGYADELQMLVQQYADDKEKVALLKALWQYAEEIVSGSGHHHHHH
SEQ ID NO:2-来自大肠杆菌的外切核酸酶III酶
MKFVSFNINGLRARPHQLEAIVEKHQPDVIGLQETKVHDDMFPLEEVAKLGYNVFYHGQKGHYGVALLTKETPIAVRRGFPGDDEEAQRRIIMAEIPSLLGNVTVINGYFPQGESRDHPIKFPAKAQFYQNLQNYLETELKRDNPVLIMGDMNISPTDLDIGIGEENRKRWLRTGKCSFLPEEREWMDRLMSWGLVDTFRHANPQTADRFSWFDYRSKGFDDNRGLRIDLLLASQPLAECCVETGIDYEIRSMEKPSDHAPVWATFRR
SEQ ID NO:3-来自嗜热栖热菌的RecJ酶
MFRRKEDLDPPLALLPLKGLREAAALLEEALRQGKRIRVHGDYDADGLTGTAILVRGLAALGADVHPFIPHRLEEGYGVLMERVPEHLEASDLFLTVDCGITNHAELRELLENGVEVIVTDHHTPGKTPPPGLVVHPALTPDLKEKPTGAGVAFLLLWALHERLGLPPPLEYADLAAVGTIADVAPLWGWNRALVKEGLARIPASSWVGLRLLAEAVGYTGKAVEVAFRIAPRINAASRLGEAEKALRLLLTDDAAEAQALVGELHRLNARRQTLEEAMLRKLLPQADPEAKAIVLLDPEGHPGVMGIVASRILEATLRPVFLVAQGKGTVRSLAPISAVEALRSAEDLLLRYGGHKEAAGFAMDEALFPAFKARVEAYAARFPDPVREVALLDLLPEPGLLPQVFRELALLEPYGEGNPEPLFL
SEQ ID NO:4-噬菌体λ外切核酸酶
MTPDIILQRTGIDVRAVEQGDDAWHKLRLGVITASEVHNVIAKPRSGKKWPDMKMSYFHTLLAEVCTGVAPEVNAKALAWGKQYENDARTLFEFTSGVNVTESPIIYRDESMRTACSPDGLCSDGNGLELKCPFTSRDFMKFRLGGFEAIKSAYMAQVQYSMWVTRKNAWYFANYDPRMKREGLHYVVIERDEKYMASFDEIVPEFIEKMDEALAEIGFVFGEQWR
SEQ ID NO:
Figure BDA0003765571150000531
DNA聚合酶
MKHMPRKMYSCAFETTTKVEDCRVWAYGYMNIEDHSEYKIGNSLDEFMAWVLKVQADLYFHNLKFDGAFIINWLERNGFKWSADGLPNTYNTIISRMGQWYMIDICLGYKGKRKIHTVIYDSLKKLPFPVKKIAKDFKLTVLKGDIDYHKERPVGYKITPEEYAYIKNDIQIIAEALLIQFKQGLDRMTAGSDSLKGFKDIITTKKFKKVFPTLSLGLDKEVRYAYRGGFTWLNDRFKEKEIGEGMVFDVNSLYPAQMYSRLLPYGEPIVFEGKYVWDEDYPLHIQHIRCEFELKEGYIPTIQIKRSRFYKGNEYLKSSGGEIADLWLSNVDLELMKEHYDLYNVEYISGLKFKATTGLFKDFIDKWTYIKTTSEGAIKQLAKLMLNSLYGKFASNPDVTGKVPYLKENGALGFRLGEEETKDPVYTPMGVFITAWARYTTITAAQACYDRIIYCDTDSIHLTGTEIPDVIKDIVDPKKLGYWAHESTFKRAKYLRQKTYIQDIYMKEVDGKLVEGSPDDYTDIKFSVKCAGMTDKIKKEVTFENFKVGFSRKMKPKPVQVPGGVVLVDDTFTIKSGGSAWSHPQFEKGGGSGGGSGGSAWSHPQFEK
SEQ ID NO:6-Trwc Cba解旋酶
MLSVANVRSPSAAASYFASDNYYASADADRSGQWIGDGAKRLGLEGKVEARAFDALLRGELPDGSSVGNPGQAHRPGTDLTFSVPKSWSLLALVGKDERIIAAYREAVVEALHWAEKNAAETRVVEKGMVVTQATGNLAIGLFQHDTNRNQEPNLHFHAVIANVTQGKDGKWRTLKNDRLWQLNTTLNSIAMARFRVAVEKLGYEPGPVLKHGNFEARGISREQVMAFSTRRKEVLEARRGPGLDAGRIAALDTRASKEGIEDRATLSKQWSEAAQSIGLDLKPLVDRARTKALGQGMEATRIGSLVERGRAWLSRFAAHVRGDPADPLVPPSVLKQDRQTIAAAQAVASAVRHLSQREAAFERTALYKAALDFGLPTTIADVEKRTRALVRSGDLIAGKGEHKGWLASRDAVVTEQRILSEVAAGKGDSSPAITPQKAAASVQAAALTGQGFRLNEGQLAAARLILISKDRTIAVQGIAGAGKSSVLKPVAEVLRDEGHPVIGLAIQNTLVQMLERDTGIGSQTLARFLGGWNKLLDDPGNVALRAEAQASLKDHVLVLDEASMVSNEDKEKLVRLANLAGVHRLVLIGDRKQLGAVDAGKPFALLQRAGIARAEMATNLRARDPVVREAQAAAQAGDVRKALRHLKSHTVEARGDGAQVAAETWLALDKETRARTSIYASGRAIRSAVNAAVQQGLLASREIGPAKMKLEVLDRVNTTREELRHLPAYRAGRVLEVSRKQQALGLFIGEYRVIGQDRKGKLVEVEDKRGKRFRFDPARIRAGKGDDNLTLLEPRKLEIHEGDRIRWTRNDHRRGLFNADQARVVEIANGKVTFETSKGDLVELKKDDPMLKRIDLAYALNVHMAQGLTSDRGIAVMDSRERNLSNQKTFLVTVTRLRDHLTLVVDSADKLGAAVARNKGEKASAIEVTGSVKPTATKGSGVDQPKSVEANKAEKELTRSKSKTLDFGI
SEQ ID NO:7-Hel308 Mbu解旋酶
MMIRELDIPRDIIGFYEDSGIKELYPPQAEAIEMGLLEKKNLLAAIPTASGKTLLAELAMIKAIREGGKALYIVPLRALASEKFERFKELAPFGIKVGISTGDLDSRADWLGVNDIIVATSEKTDSLLRNGTSWMDEITTVVVDEIHLLDSKNRGPTLEVTITKLMRLNPDVQVVALSATVGNAREMADWLGAALVLSEWRPTDLHEGVLFGDAINFPGSQKKIDRLEKDDAVNLVLDTIKAEGQCLVFESSRRNCAGFAKTASSKVAKILDNDIMIKLAGIAEEVESTGETDTAIVLANCIRKGVAFHHAGLNSNHRKLVENGFRQNLIKVISSTPTLAAGLNLPARRVIIRSYRRFDSNFGMQPIPVLEYKQMAGRAGRPHLDPYGESVLLAKTYDEFAQLMENYVEADAEDIWSKLGTENALRTHVLSTIVNGFASTRQELFDFFGATFFAYQQDKWMLEEVINDCLEFLIDKAMVSETEDIEDASKLFLRGTRLGSLVSMLYIDPLSGSKIVDGFKDIGKSTGGNMGSLEDDKGDDITVTDMTLLHLVCSTPDMRQLYLRNTDYTIVNEYIVAHSDEFHEIPDKLKETDYEWFMGEVKTAMLLEEWVTEVSAEDITRHFNVGEGDIHALADTSEWLMHAAAKLAELLGVEYSSHAYSLEKRIRYGSGLDLMELVGIRGVGRVRARKLYNAGFVSVAKLKGADISVLSKLVGPKVAYNILSGIGVRVNDKHFNSAPISSNTLDTLLDKNQKTFNDFQ
SEQ ID NO:8-Dda解旋酶
MTFDDLTEGQKNAFNIVMKAIKEKKHHVTINGPAGTGKTTLTKFIIEALISTGETGIILAAPTHAAKKILSKLSGKEASTIHSILKINPVTYEENVLFEQKEVPDLAKCRVLICDEVSMYDRKLFKILLSTIPPWCTIIGIGDNKQIRPVDPGENTAYISPFFTHKDFYQCELTEVKRSNAPIIDVATDVRNGKWIYDKVVDGHGVRGFTGDTALRDFMVNYFSIVKSLDDLFENRVMAFTNKSVDKLNSIIRKKIFETDKDFIVGEIIVMQEPLFKTYKIDGKPVSEIIFNNGQLVRIIEAEYTSTFVKARGVPGEYLIRHWDLTVETYGDDEYYREKIKIISSDEELYKFNLFLGKTAETYKNWNKGGKAPWSDFWDAKSQFSKVKALPASTFHKAQGMSVDRAFIYTPCIHYADVELAQQLLYVGVTRGRYDVFYV
SEQ ID NO:11
5'-/A1a/TACTTCGTTATTCTTGTCTCTAT/Cy5/-3'
SEQ ID NO:12
5'-/Cy5/ATAGAGACAAGAATAACGAAGTA/Cy5/-3'
SEQ ID NO:13
5'-/A3a//HEG//HEG//HEG/TACTTCGTTATTCTTGTCTCTAT-3
SEQ ID NO:14
5'-/A3a/TACTTCGTTATTCTTGTCTCTAT/Cy5/-3'
序列表
<110> 牛津纳米孔技术有限公司（OXFORD NANOPORE TECHNOLOGIES LIMITED）
<120> 方法
<130> N418168WO
<150> GB 1917060.4
<151> 2019-11-22
<160> 14
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 485
<212> PRT
<213> 大肠杆菌（Escherichia coli）
<400> 1
Met Met Asn Asp Gly Lys Gln Gln Ser Thr Phe Leu Phe His Asp Tyr
1 5 10 15
Glu Thr Phe Gly Thr His Pro Ala Leu Asp Arg Pro Ala Gln Phe Ala
20 25 30
Ala Ile Arg Thr Asp Ser Glu Phe Asn Val Ile Gly Glu Pro Glu Val
35 40 45
Phe Tyr Cys Lys Pro Ala Asp Asp Tyr Leu Pro Gln Pro Gly Ala Val
50 55 60
Leu Ile Thr Gly Ile Thr Pro Gln Glu Ala Arg Ala Lys Gly Glu Asn
65 70 75 80
Glu Ala Ala Phe Ala Ala Arg Ile His Ser Leu Phe Thr Val Pro Lys
85 90 95
Thr Cys Ile Leu Gly Tyr Asn Asn Val Arg Phe Asp Asp Glu Val Thr
100 105 110
Arg Asn Ile Phe Tyr Arg Asn Phe Tyr Asp Pro Tyr Ala Trp Ser Trp
115 120 125
Gln His Asp Asn Ser Arg Trp Asp Leu Leu Asp Val Met Arg Ala Cys
130 135 140
Tyr Ala Leu Arg Pro Glu Gly Ile Asn Trp Pro Glu Asn Asp Asp Gly
145 150 155 160
Leu Pro Ser Phe Arg Leu Glu His Leu Thr Lys Ala Asn Gly Ile Glu
165 170 175
His Ser Asn Ala His Asp Ala Met Ala Asp Val Tyr Ala Thr Ile Ala
180 185 190
Met Ala Lys Leu Val Lys Thr Arg Gln Pro Arg Leu Phe Asp Tyr Leu
195 200 205
Phe Thr His Arg Asn Lys His Lys Leu Met Ala Leu Ile Asp Val Pro
210 215 220
Gln Met Lys Pro Leu Val His Val Ser Gly Met Phe Gly Ala Trp Arg
225 230 235 240
Gly Asn Thr Ser Trp Val Ala Pro Leu Ala Trp His Pro Glu Asn Arg
245 250 255
Asn Ala Val Ile Met Val Asp Leu Ala Gly Asp Ile Ser Pro Leu Leu
260 265 270
Glu Leu Asp Ser Asp Thr Leu Arg Glu Arg Leu Tyr Thr Ala Lys Thr
275 280 285
Asp Leu Gly Asp Asn Ala Ala Val Pro Val Lys Leu Val His Ile Asn
290 295 300
Lys Cys Pro Val Leu Ala Gln Ala Asn Thr Leu Arg Pro Glu Asp Ala
305 310 315 320
Asp Arg Leu Gly Ile Asn Arg Gln His Cys Leu Asp Asn Leu Lys Ile
325 330 335
Leu Arg Glu Asn Pro Gln Val Arg Glu Lys Val Val Ala Ile Phe Ala
340 345 350
Glu Ala Glu Pro Phe Thr Pro Ser Asp Asn Val Asp Ala Gln Leu Tyr
355 360 365
Asn Gly Phe Phe Ser Asp Ala Asp Arg Ala Ala Met Lys Ile Val Leu
370 375 380
Glu Thr Glu Pro Arg Asn Leu Pro Ala Leu Asp Ile Thr Phe Val Asp
385 390 395 400
Lys Arg Ile Glu Lys Leu Leu Phe Asn Tyr Arg Ala Arg Asn Phe Pro
405 410 415
Gly Thr Leu Asp Tyr Ala Glu Gln Gln Arg Trp Leu Glu His Arg Arg
420 425 430
Gln Val Phe Thr Pro Glu Phe Leu Gln Gly Tyr Ala Asp Glu Leu Gln
435 440 445
Met Leu Val Gln Gln Tyr Ala Asp Asp Lys Glu Lys Val Ala Leu Leu
450 455 460
Lys Ala Leu Trp Gln Tyr Ala Glu Glu Ile Val Ser Gly Ser Gly His
465 470 475 480
His His His His His
485
<210> 2
<211> 268
<212> PRT
<213> 大肠杆菌（Escherichia coli）
<400> 2
Met Lys Phe Val Ser Phe Asn Ile Asn Gly Leu Arg Ala Arg Pro His
1 5 10 15
Gln Leu Glu Ala Ile Val Glu Lys His Gln Pro Asp Val Ile Gly Leu
20 25 30
Gln Glu Thr Lys Val His Asp Asp Met Phe Pro Leu Glu Glu Val Ala
35 40 45
Lys Leu Gly Tyr Asn Val Phe Tyr His Gly Gln Lys Gly His Tyr Gly
50 55 60
Val Ala Leu Leu Thr Lys Glu Thr Pro Ile Ala Val Arg Arg Gly Phe
65 70 75 80
Pro Gly Asp Asp Glu Glu Ala Gln Arg Arg Ile Ile Met Ala Glu Ile
85 90 95
Pro Ser Leu Leu Gly Asn Val Thr Val Ile Asn Gly Tyr Phe Pro Gln
100 105 110
Gly Glu Ser Arg Asp His Pro Ile Lys Phe Pro Ala Lys Ala Gln Phe
115 120 125
Tyr Gln Asn Leu Gln Asn Tyr Leu Glu Thr Glu Leu Lys Arg Asp Asn
130 135 140
Pro Val Leu Ile Met Gly Asp Met Asn Ile Ser Pro Thr Asp Leu Asp
145 150 155 160
Ile Gly Ile Gly Glu Glu Asn Arg Lys Arg Trp Leu Arg Thr Gly Lys
165 170 175
Cys Ser Phe Leu Pro Glu Glu Arg Glu Trp Met Asp Arg Leu Met Ser
180 185 190
Trp Gly Leu Val Asp Thr Phe Arg His Ala Asn Pro Gln Thr Ala Asp
195 200 205
Arg Phe Ser Trp Phe Asp Tyr Arg Ser Lys Gly Phe Asp Asp Asn Arg
210 215 220
Gly Leu Arg Ile Asp Leu Leu Leu Ala Ser Gln Pro Leu Ala Glu Cys
225 230 235 240
Cys Val Glu Thr Gly Ile Asp Tyr Glu Ile Arg Ser Met Glu Lys Pro
245 250 255
Ser Asp His Ala Pro Val Trp Ala Thr Phe Arg Arg
260 265
<210> 3
<211> 425
<212> PRT
<213> 嗜热栖热菌（Thermus thermophilus）
<400> 3
Met Phe Arg Arg Lys Glu Asp Leu Asp Pro Pro Leu Ala Leu Leu Pro
1 5 10 15
Leu Lys Gly Leu Arg Glu Ala Ala Ala Leu Leu Glu Glu Ala Leu Arg
20 25 30
Gln Gly Lys Arg Ile Arg Val His Gly Asp Tyr Asp Ala Asp Gly Leu
35 40 45
Thr Gly Thr Ala Ile Leu Val Arg Gly Leu Ala Ala Leu Gly Ala Asp
50 55 60
Val His Pro Phe Ile Pro His Arg Leu Glu Glu Gly Tyr Gly Val Leu
65 70 75 80
Met Glu Arg Val Pro Glu His Leu Glu Ala Ser Asp Leu Phe Leu Thr
85 90 95
Val Asp Cys Gly Ile Thr Asn His Ala Glu Leu Arg Glu Leu Leu Glu
100 105 110
Asn Gly Val Glu Val Ile Val Thr Asp His His Thr Pro Gly Lys Thr
115 120 125
Pro Pro Pro Gly Leu Val Val His Pro Ala Leu Thr Pro Asp Leu Lys
130 135 140
Glu Lys Pro Thr Gly Ala Gly Val Ala Phe Leu Leu Leu Trp Ala Leu
145 150 155 160
His Glu Arg Leu Gly Leu Pro Pro Pro Leu Glu Tyr Ala Asp Leu Ala
165 170 175
Ala Val Gly Thr Ile Ala Asp Val Ala Pro Leu Trp Gly Trp Asn Arg
180 185 190
Ala Leu Val Lys Glu Gly Leu Ala Arg Ile Pro Ala Ser Ser Trp Val
195 200 205
Gly Leu Arg Leu Leu Ala Glu Ala Val Gly Tyr Thr Gly Lys Ala Val
210 215 220
Glu Val Ala Phe Arg Ile Ala Pro Arg Ile Asn Ala Ala Ser Arg Leu
225 230 235 240
Gly Glu Ala Glu Lys Ala Leu Arg Leu Leu Leu Thr Asp Asp Ala Ala
245 250 255
Glu Ala Gln Ala Leu Val Gly Glu Leu His Arg Leu Asn Ala Arg Arg
260 265 270
Gln Thr Leu Glu Glu Ala Met Leu Arg Lys Leu Leu Pro Gln Ala Asp
275 280 285
Pro Glu Ala Lys Ala Ile Val Leu Leu Asp Pro Glu Gly His Pro Gly
290 295 300
Val Met Gly Ile Val Ala Ser Arg Ile Leu Glu Ala Thr Leu Arg Pro
305 310 315 320
Val Phe Leu Val Ala Gln Gly Lys Gly Thr Val Arg Ser Leu Ala Pro
325 330 335
Ile Ser Ala Val Glu Ala Leu Arg Ser Ala Glu Asp Leu Leu Leu Arg
340 345 350
Tyr Gly Gly His Lys Glu Ala Ala Gly Phe Ala Met Asp Glu Ala Leu
355 360 365
Phe Pro Ala Phe Lys Ala Arg Val Glu Ala Tyr Ala Ala Arg Phe Pro
370 375 380
Asp Pro Val Arg Glu Val Ala Leu Leu Asp Leu Leu Pro Glu Pro Gly
385 390 395 400
Leu Leu Pro Gln Val Phe Arg Glu Leu Ala Leu Leu Glu Pro Tyr Gly
405 410 415
Glu Gly Asn Pro Glu Pro Leu Phe Leu
420 425
<210> 4
<211> 226
<212> PRT
<213> 噬菌体λ（Bacteriophage lambda）
<400> 4
Met Thr Pro Asp Ile Ile Leu Gln Arg Thr Gly Ile Asp Val Arg Ala
1 5 10 15
Val Glu Gln Gly Asp Asp Ala Trp His Lys Leu Arg Leu Gly Val Ile
20 25 30
Thr Ala Ser Glu Val His Asn Val Ile Ala Lys Pro Arg Ser Gly Lys
35 40 45
Lys Trp Pro Asp Met Lys Met Ser Tyr Phe His Thr Leu Leu Ala Glu
50 55 60
Val Cys Thr Gly Val Ala Pro Glu Val Asn Ala Lys Ala Leu Ala Trp
65 70 75 80
Gly Lys Gln Tyr Glu Asn Asp Ala Arg Thr Leu Phe Glu Phe Thr Ser
85 90 95
Gly Val Asn Val Thr Glu Ser Pro Ile Ile Tyr Arg Asp Glu Ser Met
100 105 110
Arg Thr Ala Cys Ser Pro Asp Gly Leu Cys Ser Asp Gly Asn Gly Leu
115 120 125
Glu Leu Lys Cys Pro Phe Thr Ser Arg Asp Phe Met Lys Phe Arg Leu
130 135 140
Gly Gly Phe Glu Ala Ile Lys Ser Ala Tyr Met Ala Gln Val Gln Tyr
145 150 155 160
Ser Met Trp Val Thr Arg Lys Asn Ala Trp Tyr Phe Ala Asn Tyr Asp
165 170 175
Pro Arg Met Lys Arg Glu Gly Leu His Tyr Val Val Ile Glu Arg Asp
180 185 190
Glu Lys Tyr Met Ala Ser Phe Asp Glu Ile Val Pro Glu Phe Ile Glu
195 200 205
Lys Met Asp Glu Ala Leu Ala Glu Ile Gly Phe Val Phe Gly Glu Gln
210 215 220
Trp Arg
225
<210> 5
<211> 608
<212> PRT
<213> 枯草芽孢杆菌噬菌体φ29（Bacillus subtilis phage Phi 29）
<400> 5
Met Lys His Met Pro Arg Lys Met Tyr Ser Cys Ala Phe Glu Thr Thr
1 5 10 15
Thr Lys Val Glu Asp Cys Arg Val Trp Ala Tyr Gly Tyr Met Asn Ile
20 25 30
Glu Asp His Ser Glu Tyr Lys Ile Gly Asn Ser Leu Asp Glu Phe Met
35 40 45
Ala Trp Val Leu Lys Val Gln Ala Asp Leu Tyr Phe His Asn Leu Lys
50 55 60
Phe Asp Gly Ala Phe Ile Ile Asn Trp Leu Glu Arg Asn Gly Phe Lys
65 70 75 80
Trp Ser Ala Asp Gly Leu Pro Asn Thr Tyr Asn Thr Ile Ile Ser Arg
85 90 95
Met Gly Gln Trp Tyr Met Ile Asp Ile Cys Leu Gly Tyr Lys Gly Lys
100 105 110
Arg Lys Ile His Thr Val Ile Tyr Asp Ser Leu Lys Lys Leu Pro Phe
115 120 125
Pro Val Lys Lys Ile Ala Lys Asp Phe Lys Leu Thr Val Leu Lys Gly
130 135 140
Asp Ile Asp Tyr His Lys Glu Arg Pro Val Gly Tyr Lys Ile Thr Pro
145 150 155 160
Glu Glu Tyr Ala Tyr Ile Lys Asn Asp Ile Gln Ile Ile Ala Glu Ala
165 170 175
Leu Leu Ile Gln Phe Lys Gln Gly Leu Asp Arg Met Thr Ala Gly Ser
180 185 190
Asp Ser Leu Lys Gly Phe Lys Asp Ile Ile Thr Thr Lys Lys Phe Lys
195 200 205
Lys Val Phe Pro Thr Leu Ser Leu Gly Leu Asp Lys Glu Val Arg Tyr
210 215 220
Ala Tyr Arg Gly Gly Phe Thr Trp Leu Asn Asp Arg Phe Lys Glu Lys
225 230 235 240
Glu Ile Gly Glu Gly Met Val Phe Asp Val Asn Ser Leu Tyr Pro Ala
245 250 255
Gln Met Tyr Ser Arg Leu Leu Pro Tyr Gly Glu Pro Ile Val Phe Glu
260 265 270
Gly Lys Tyr Val Trp Asp Glu Asp Tyr Pro Leu His Ile Gln His Ile
275 280 285
Arg Cys Glu Phe Glu Leu Lys Glu Gly Tyr Ile Pro Thr Ile Gln Ile
290 295 300
Lys Arg Ser Arg Phe Tyr Lys Gly Asn Glu Tyr Leu Lys Ser Ser Gly
305 310 315 320
Gly Glu Ile Ala Asp Leu Trp Leu Ser Asn Val Asp Leu Glu Leu Met
325 330 335
Lys Glu His Tyr Asp Leu Tyr Asn Val Glu Tyr Ile Ser Gly Leu Lys
340 345 350
Phe Lys Ala Thr Thr Gly Leu Phe Lys Asp Phe Ile Asp Lys Trp Thr
355 360 365
Tyr Ile Lys Thr Thr Ser Glu Gly Ala Ile Lys Gln Leu Ala Lys Leu
370 375 380
Met Leu Asn Ser Leu Tyr Gly Lys Phe Ala Ser Asn Pro Asp Val Thr
385 390 395 400
Gly Lys Val Pro Tyr Leu Lys Glu Asn Gly Ala Leu Gly Phe Arg Leu
405 410 415
Gly Glu Glu Glu Thr Lys Asp Pro Val Tyr Thr Pro Met Gly Val Phe
420 425 430
Ile Thr Ala Trp Ala Arg Tyr Thr Thr Ile Thr Ala Ala Gln Ala Cys
435 440 445
Tyr Asp Arg Ile Ile Tyr Cys Asp Thr Asp Ser Ile His Leu Thr Gly
450 455 460
Thr Glu Ile Pro Asp Val Ile Lys Asp Ile Val Asp Pro Lys Lys Leu
465 470 475 480
Gly Tyr Trp Ala His Glu Ser Thr Phe Lys Arg Ala Lys Tyr Leu Arg
485 490 495
Gln Lys Thr Tyr Ile Gln Asp Ile Tyr Met Lys Glu Val Asp Gly Lys
500 505 510
Leu Val Glu Gly Ser Pro Asp Asp Tyr Thr Asp Ile Lys Phe Ser Val
515 520 525
Lys Cys Ala Gly Met Thr Asp Lys Ile Lys Lys Glu Val Thr Phe Glu
530 535 540
Asn Phe Lys Val Gly Phe Ser Arg Lys Met Lys Pro Lys Pro Val Gln
545 550 555 560
Val Pro Gly Gly Val Val Leu Val Asp Asp Thr Phe Thr Ile Lys Ser
565 570 575
Gly Gly Ser Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys Gly Gly Gly Ser
580 585 590
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ser Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys
595 600 605
<210> 6
<211> 970
<212> PRT
<213> 深洋柠檬色微菌（Citromicrobium bathyomarinum）
<400> 6
Met Leu Ser Val Ala Asn Val Arg Ser Pro Ser Ala Ala Ala Ser Tyr
1 5 10 15
Phe Ala Ser Asp Asn Tyr Tyr Ala Ser Ala Asp Ala Asp Arg Ser Gly
20 25 30
Gln Trp Ile Gly Asp Gly Ala Lys Arg Leu Gly Leu Glu Gly Lys Val
35 40 45
Glu Ala Arg Ala Phe Asp Ala Leu Leu Arg Gly Glu Leu Pro Asp Gly
50 55 60
Ser Ser Val Gly Asn Pro Gly Gln Ala His Arg Pro Gly Thr Asp Leu
65 70 75 80
Thr Phe Ser Val Pro Lys Ser Trp Ser Leu Leu Ala Leu Val Gly Lys
85 90 95
Asp Glu Arg Ile Ile Ala Ala Tyr Arg Glu Ala Val Val Glu Ala Leu
100 105 110
His Trp Ala Glu Lys Asn Ala Ala Glu Thr Arg Val Val Glu Lys Gly
115 120 125
Met Val Val Thr Gln Ala Thr Gly Asn Leu Ala Ile Gly Leu Phe Gln
130 135 140
His Asp Thr Asn Arg Asn Gln Glu Pro Asn Leu His Phe His Ala Val
145 150 155 160
Ile Ala Asn Val Thr Gln Gly Lys Asp Gly Lys Trp Arg Thr Leu Lys
165 170 175
Asn Asp Arg Leu Trp Gln Leu Asn Thr Thr Leu Asn Ser Ile Ala Met
180 185 190
Ala Arg Phe Arg Val Ala Val Glu Lys Leu Gly Tyr Glu Pro Gly Pro
195 200 205
Val Leu Lys His Gly Asn Phe Glu Ala Arg Gly Ile Ser Arg Glu Gln
210 215 220
Val Met Ala Phe Ser Thr Arg Arg Lys Glu Val Leu Glu Ala Arg Arg
225 230 235 240
Gly Pro Gly Leu Asp Ala Gly Arg Ile Ala Ala Leu Asp Thr Arg Ala
245 250 255
Ser Lys Glu Gly Ile Glu Asp Arg Ala Thr Leu Ser Lys Gln Trp Ser
260 265 270
Glu Ala Ala Gln Ser Ile Gly Leu Asp Leu Lys Pro Leu Val Asp Arg
275 280 285
Ala Arg Thr Lys Ala Leu Gly Gln Gly Met Glu Ala Thr Arg Ile Gly
290 295 300
Ser Leu Val Glu Arg Gly Arg Ala Trp Leu Ser Arg Phe Ala Ala His
305 310 315 320
Val Arg Gly Asp Pro Ala Asp Pro Leu Val Pro Pro Ser Val Leu Lys
325 330 335
Gln Asp Arg Gln Thr Ile Ala Ala Ala Gln Ala Val Ala Ser Ala Val
340 345 350
Arg His Leu Ser Gln Arg Glu Ala Ala Phe Glu Arg Thr Ala Leu Tyr
355 360 365
Lys Ala Ala Leu Asp Phe Gly Leu Pro Thr Thr Ile Ala Asp Val Glu
370 375 380
Lys Arg Thr Arg Ala Leu Val Arg Ser Gly Asp Leu Ile Ala Gly Lys
385 390 395 400
Gly Glu His Lys Gly Trp Leu Ala Ser Arg Asp Ala Val Val Thr Glu
405 410 415
Gln Arg Ile Leu Ser Glu Val Ala Ala Gly Lys Gly Asp Ser Ser Pro
420 425 430
Ala Ile Thr Pro Gln Lys Ala Ala Ala Ser Val Gln Ala Ala Ala Leu
435 440 445
Thr Gly Gln Gly Phe Arg Leu Asn Glu Gly Gln Leu Ala Ala Ala Arg
450 455 460
Leu Ile Leu Ile Ser Lys Asp Arg Thr Ile Ala Val Gln Gly Ile Ala
465 470 475 480
Gly Ala Gly Lys Ser Ser Val Leu Lys Pro Val Ala Glu Val Leu Arg
485 490 495
Asp Glu Gly His Pro Val Ile Gly Leu Ala Ile Gln Asn Thr Leu Val
500 505 510
Gln Met Leu Glu Arg Asp Thr Gly Ile Gly Ser Gln Thr Leu Ala Arg
515 520 525
Phe Leu Gly Gly Trp Asn Lys Leu Leu Asp Asp Pro Gly Asn Val Ala
530 535 540
Leu Arg Ala Glu Ala Gln Ala Ser Leu Lys Asp His Val Leu Val Leu
545 550 555 560
Asp Glu Ala Ser Met Val Ser Asn Glu Asp Lys Glu Lys Leu Val Arg
565 570 575
Leu Ala Asn Leu Ala Gly Val His Arg Leu Val Leu Ile Gly Asp Arg
580 585 590
Lys Gln Leu Gly Ala Val Asp Ala Gly Lys Pro Phe Ala Leu Leu Gln
595 600 605
Arg Ala Gly Ile Ala Arg Ala Glu Met Ala Thr Asn Leu Arg Ala Arg
610 615 620
Asp Pro Val Val Arg Glu Ala Gln Ala Ala Ala Gln Ala Gly Asp Val
625 630 635 640
Arg Lys Ala Leu Arg His Leu Lys Ser His Thr Val Glu Ala Arg Gly
645 650 655
Asp Gly Ala Gln Val Ala Ala Glu Thr Trp Leu Ala Leu Asp Lys Glu
660 665 670
Thr Arg Ala Arg Thr Ser Ile Tyr Ala Ser Gly Arg Ala Ile Arg Ser
675 680 685
Ala Val Asn Ala Ala Val Gln Gln Gly Leu Leu Ala Ser Arg Glu Ile
690 695 700
Gly Pro Ala Lys Met Lys Leu Glu Val Leu Asp Arg Val Asn Thr Thr
705 710 715 720
Arg Glu Glu Leu Arg His Leu Pro Ala Tyr Arg Ala Gly Arg Val Leu
725 730 735
Glu Val Ser Arg Lys Gln Gln Ala Leu Gly Leu Phe Ile Gly Glu Tyr
740 745 750
Arg Val Ile Gly Gln Asp Arg Lys Gly Lys Leu Val Glu Val Glu Asp
755 760 765
Lys Arg Gly Lys Arg Phe Arg Phe Asp Pro Ala Arg Ile Arg Ala Gly
770 775 780
Lys Gly Asp Asp Asn Leu Thr Leu Leu Glu Pro Arg Lys Leu Glu Ile
785 790 795 800
His Glu Gly Asp Arg Ile Arg Trp Thr Arg Asn Asp His Arg Arg Gly
805 810 815
Leu Phe Asn Ala Asp Gln Ala Arg Val Val Glu Ile Ala Asn Gly Lys
820 825 830
Val Thr Phe Glu Thr Ser Lys Gly Asp Leu Val Glu Leu Lys Lys Asp
835 840 845
Asp Pro Met Leu Lys Arg Ile Asp Leu Ala Tyr Ala Leu Asn Val His
850 855 860
Met Ala Gln Gly Leu Thr Ser Asp Arg Gly Ile Ala Val Met Asp Ser
865 870 875 880
Arg Glu Arg Asn Leu Ser Asn Gln Lys Thr Phe Leu Val Thr Val Thr
885 890 895
Arg Leu Arg Asp His Leu Thr Leu Val Val Asp Ser Ala Asp Lys Leu
900 905 910
Gly Ala Ala Val Ala Arg Asn Lys Gly Glu Lys Ala Ser Ala Ile Glu
915 920 925
Val Thr Gly Ser Val Lys Pro Thr Ala Thr Lys Gly Ser Gly Val Asp
930 935 940
Gln Pro Lys Ser Val Glu Ala Asn Lys Ala Glu Lys Glu Leu Thr Arg
945 950 955 960
Ser Lys Ser Lys Thr Leu Asp Phe Gly Ile
965 970
<210> 7
<211> 760
<212> PRT
<213> 布氏拟甲烷球菌（Methanococcoides burtonii）
<400> 7
Met Met Ile Arg Glu Leu Asp Ile Pro Arg Asp Ile Ile Gly Phe Tyr
1 5 10 15
Glu Asp Ser Gly Ile Lys Glu Leu Tyr Pro Pro Gln Ala Glu Ala Ile
20 25 30
Glu Met Gly Leu Leu Glu Lys Lys Asn Leu Leu Ala Ala Ile Pro Thr
35 40 45
Ala Ser Gly Lys Thr Leu Leu Ala Glu Leu Ala Met Ile Lys Ala Ile
50 55 60
Arg Glu Gly Gly Lys Ala Leu Tyr Ile Val Pro Leu Arg Ala Leu Ala
65 70 75 80
Ser Glu Lys Phe Glu Arg Phe Lys Glu Leu Ala Pro Phe Gly Ile Lys
85 90 95
Val Gly Ile Ser Thr Gly Asp Leu Asp Ser Arg Ala Asp Trp Leu Gly
100 105 110
Val Asn Asp Ile Ile Val Ala Thr Ser Glu Lys Thr Asp Ser Leu Leu
115 120 125
Arg Asn Gly Thr Ser Trp Met Asp Glu Ile Thr Thr Val Val Val Asp
130 135 140
Glu Ile His Leu Leu Asp Ser Lys Asn Arg Gly Pro Thr Leu Glu Val
145 150 155 160
Thr Ile Thr Lys Leu Met Arg Leu Asn Pro Asp Val Gln Val Val Ala
165 170 175
Leu Ser Ala Thr Val Gly Asn Ala Arg Glu Met Ala Asp Trp Leu Gly
180 185 190
Ala Ala Leu Val Leu Ser Glu Trp Arg Pro Thr Asp Leu His Glu Gly
195 200 205
Val Leu Phe Gly Asp Ala Ile Asn Phe Pro Gly Ser Gln Lys Lys Ile
210 215 220
Asp Arg Leu Glu Lys Asp Asp Ala Val Asn Leu Val Leu Asp Thr Ile
225 230 235 240
Lys Ala Glu Gly Gln Cys Leu Val Phe Glu Ser Ser Arg Arg Asn Cys
245 250 255
Ala Gly Phe Ala Lys Thr Ala Ser Ser Lys Val Ala Lys Ile Leu Asp
260 265 270
Asn Asp Ile Met Ile Lys Leu Ala Gly Ile Ala Glu Glu Val Glu Ser
275 280 285
Thr Gly Glu Thr Asp Thr Ala Ile Val Leu Ala Asn Cys Ile Arg Lys
290 295 300
Gly Val Ala Phe His His Ala Gly Leu Asn Ser Asn His Arg Lys Leu
305 310 315 320
Val Glu Asn Gly Phe Arg Gln Asn Leu Ile Lys Val Ile Ser Ser Thr
325 330 335
Pro Thr Leu Ala Ala Gly Leu Asn Leu Pro Ala Arg Arg Val Ile Ile
340 345 350
Arg Ser Tyr Arg Arg Phe Asp Ser Asn Phe Gly Met Gln Pro Ile Pro
355 360 365
Val Leu Glu Tyr Lys Gln Met Ala Gly Arg Ala Gly Arg Pro His Leu
370 375 380
Asp Pro Tyr Gly Glu Ser Val Leu Leu Ala Lys Thr Tyr Asp Glu Phe
385 390 395 400
Ala Gln Leu Met Glu Asn Tyr Val Glu Ala Asp Ala Glu Asp Ile Trp
405 410 415
Ser Lys Leu Gly Thr Glu Asn Ala Leu Arg Thr His Val Leu Ser Thr
420 425 430
Ile Val Asn Gly Phe Ala Ser Thr Arg Gln Glu Leu Phe Asp Phe Phe
435 440 445
Gly Ala Thr Phe Phe Ala Tyr Gln Gln Asp Lys Trp Met Leu Glu Glu
450 455 460
Val Ile Asn Asp Cys Leu Glu Phe Leu Ile Asp Lys Ala Met Val Ser
465 470 475 480
Glu Thr Glu Asp Ile Glu Asp Ala Ser Lys Leu Phe Leu Arg Gly Thr
485 490 495
Arg Leu Gly Ser Leu Val Ser Met Leu Tyr Ile Asp Pro Leu Ser Gly
500 505 510
Ser Lys Ile Val Asp Gly Phe Lys Asp Ile Gly Lys Ser Thr Gly Gly
515 520 525
Asn Met Gly Ser Leu Glu Asp Asp Lys Gly Asp Asp Ile Thr Val Thr
530 535 540
Asp Met Thr Leu Leu His Leu Val Cys Ser Thr Pro Asp Met Arg Gln
545 550 555 560
Leu Tyr Leu Arg Asn Thr Asp Tyr Thr Ile Val Asn Glu Tyr Ile Val
565 570 575
Ala His Ser Asp Glu Phe His Glu Ile Pro Asp Lys Leu Lys Glu Thr
580 585 590
Asp Tyr Glu Trp Phe Met Gly Glu Val Lys Thr Ala Met Leu Leu Glu
595 600 605
Glu Trp Val Thr Glu Val Ser Ala Glu Asp Ile Thr Arg His Phe Asn
610 615 620
Val Gly Glu Gly Asp Ile His Ala Leu Ala Asp Thr Ser Glu Trp Leu
625 630 635 640
Met His Ala Ala Ala Lys Leu Ala Glu Leu Leu Gly Val Glu Tyr Ser
645 650 655
Ser His Ala Tyr Ser Leu Glu Lys Arg Ile Arg Tyr Gly Ser Gly Leu
660 665 670
Asp Leu Met Glu Leu Val Gly Ile Arg Gly Val Gly Arg Val Arg Ala
675 680 685
Arg Lys Leu Tyr Asn Ala Gly Phe Val Ser Val Ala Lys Leu Lys Gly
690 695 700
Ala Asp Ile Ser Val Leu Ser Lys Leu Val Gly Pro Lys Val Ala Tyr
705 710 715 720
Asn Ile Leu Ser Gly Ile Gly Val Arg Val Asn Asp Lys His Phe Asn
725 730 735
Ser Ala Pro Ile Ser Ser Asn Thr Leu Asp Thr Leu Leu Asp Lys Asn
740 745 750
Gln Lys Thr Phe Asn Asp Phe Gln
755 760
<210> 8
<211> 439
<212> PRT
<213> 肠杆菌噬菌体T4（Enterobacteria phage T4）
<400> 8
Met Thr Phe Asp Asp Leu Thr Glu Gly Gln Lys Asn Ala Phe Asn Ile
1 5 10 15
Val Met Lys Ala Ile Lys Glu Lys Lys His His Val Thr Ile Asn Gly
20 25 30
Pro Ala Gly Thr Gly Lys Thr Thr Leu Thr Lys Phe Ile Ile Glu Ala
35 40 45
Leu Ile Ser Thr Gly Glu Thr Gly Ile Ile Leu Ala Ala Pro Thr His
50 55 60
Ala Ala Lys Lys Ile Leu Ser Lys Leu Ser Gly Lys Glu Ala Ser Thr
65 70 75 80
Ile His Ser Ile Leu Lys Ile Asn Pro Val Thr Tyr Glu Glu Asn Val
85 90 95
Leu Phe Glu Gln Lys Glu Val Pro Asp Leu Ala Lys Cys Arg Val Leu
100 105 110
Ile Cys Asp Glu Val Ser Met Tyr Asp Arg Lys Leu Phe Lys Ile Leu
115 120 125
Leu Ser Thr Ile Pro Pro Trp Cys Thr Ile Ile Gly Ile Gly Asp Asn
130 135 140
Lys Gln Ile Arg Pro Val Asp Pro Gly Glu Asn Thr Ala Tyr Ile Ser
145 150 155 160
Pro Phe Phe Thr His Lys Asp Phe Tyr Gln Cys Glu Leu Thr Glu Val
165 170 175
Lys Arg Ser Asn Ala Pro Ile Ile Asp Val Ala Thr Asp Val Arg Asn
180 185 190
Gly Lys Trp Ile Tyr Asp Lys Val Val Asp Gly His Gly Val Arg Gly
195 200 205
Phe Thr Gly Asp Thr Ala Leu Arg Asp Phe Met Val Asn Tyr Phe Ser
210 215 220
Ile Val Lys Ser Leu Asp Asp Leu Phe Glu Asn Arg Val Met Ala Phe
225 230 235 240
Thr Asn Lys Ser Val Asp Lys Leu Asn Ser Ile Ile Arg Lys Lys Ile
245 250 255
Phe Glu Thr Asp Lys Asp Phe Ile Val Gly Glu Ile Ile Val Met Gln
260 265 270
Glu Pro Leu Phe Lys Thr Tyr Lys Ile Asp Gly Lys Pro Val Ser Glu
275 280 285
Ile Ile Phe Asn Asn Gly Gln Leu Val Arg Ile Ile Glu Ala Glu Tyr
290 295 300
Thr Ser Thr Phe Val Lys Ala Arg Gly Val Pro Gly Glu Tyr Leu Ile
305 310 315 320
Arg His Trp Asp Leu Thr Val Glu Thr Tyr Gly Asp Asp Glu Tyr Tyr
325 330 335
Arg Glu Lys Ile Lys Ile Ile Ser Ser Asp Glu Glu Leu Tyr Lys Phe
340 345 350
Asn Leu Phe Leu Gly Lys Thr Ala Glu Thr Tyr Lys Asn Trp Asn Lys
355 360 365
Gly Gly Lys Ala Pro Trp Ser Asp Phe Trp Asp Ala Lys Ser Gln Phe
370 375 380
Ser Lys Val Lys Ala Leu Pro Ala Ser Thr Phe His Lys Ala Gln Gly
385 390 395 400
Met Ser Val Asp Arg Ala Phe Ile Tyr Thr Pro Cys Ile His Tyr Ala
405 410 415
Asp Val Glu Leu Ala Gln Gln Leu Leu Tyr Val Gly Val Thr Arg Gly
420 425 430
Arg Tyr Asp Val Phe Tyr Val
435
<210> 9
<400> 9
000
<210> 10
<400> 10
000
<210> 11
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> A1a是选择性地与A1b反应以形成稳定的共价键的连接基团。
<220>
<221> misc_feature
<222> (23)..(23)
<223> Cy5荧光团
<400> 11
tacttcgtta ttcttgtctc tat 23
<210> 12
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> Cy5荧光团
<220>
<221> misc_feature
<222> (23)..(23)
<223> Cy5荧光团
<400> 12
atagagacaa gaataacgaa gta 23
<210> 13
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> A3a是选择性地与A3b反应以形成稳定的共价键的反应性连接基团。
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> 3x六乙二醇单元
<400> 13
tacttcgtta ttcttgtctc tat 23
<210> 14
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> A3a是选择性地与A3b反应以形成稳定的共价键的反应性连接基团。
<220>
<221> misc_feature
<222> (23)..(23)
<223> Cy5荧光团
<400> 14
tacttcgtta ttcttgtctc tat 23

Claims (46)

1.一种将拴系复合物集中在两亲性层的区域中的方法，所述两亲性层包括多个两亲性分子和检测器，其中所述拴系复合物包括通过疏水性接头连接的一种或多种亲水性组分；
所述方法包括使所述拴系复合物或其一种或多种组分与所述多个两亲性分子接触；
并且其中所述两亲性层包括第一区域和第二区域，所述第一区域包括所述检测器，其中所述第一区域在化学上和/或物理上不同于所述第二区域，并且其中相对于所述第二区域，所述拴系复合物优先定位到所述第一区域；由此将所述拴系复合物集中在所述两亲性层的所述第一区域中。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述拴系复合物包括通过疏水性接头与第二亲水性组分连接的第一亲水性组分。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述第一区域是所述两亲性层的多层区域。
4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一区域和所述第二区域两者均包括同一类型的两亲性分子。
5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一区域包括由两亲性分子构成的第一组合物并且所述第二区域包括由两亲性分子构成的第二组合物，并且所述第一组合物不同于所述第二组合物。
6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述两亲性层的所述第一区域和所述第二区域分别对应于基材的第一区和第二区，其中所述基材的所述第一区在化学上和/或物理上不同于所述第二区。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述第一区对应于基材中的孔，并且所述第二区对应于所述基材的任选涂覆的部分。
8.根据权利要求1到5中任一项所述的方法，其中所述第一区域对应于第一液滴与第二液滴对之间的界面表面区，其中所述第一液滴和第二液滴各自具有两亲性涂层；并且所述第二区域对应于所述第一液滴的未与第二液滴介接的部分的表面区。
9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一区域和所述第二区域是所述两亲性层的相分离区域。
10.一种用于将拴系复合物组装在两亲性层中的方法，其中所述拴系复合物包括通过疏水性接头连接的一种或多种亲水性组分；所述方法包括使所述拴系复合物或其一种或多种组分与多个两亲性分子接触并且随后形成所述两亲性层。
11.一种用于将拴系复合物组装在两亲性层中的方法，其中所述拴系复合物包括通过疏水性接头连接的一种或多种亲水性组分；所述方法包括(i)由多个两亲性分子形成所述两亲性层；以及(ii)使所述两亲性层与所述拴系复合物或其一种或多种组分接触
12.根据权利要求10或权利要求11所述的方法，其包括(i)使所述疏水性接头与所述两亲性分子或所述两亲性层接触；其中当所述疏水性接头与所述两亲性分子或两亲性层接触时，所述疏水性接头未与所述一种或多种亲水性组分中的至少一种亲水性组分连接；以及(ii)一旦已形成所述两亲性层，就将所述一种或多种亲水性组分中的至少一种亲水性组分与所述疏水性接头连接，由此形成所述拴系复合物。
13.一种用于将拴系复合物组装在两亲性层中的方法，其中所述拴系复合物包括通过疏水性接头与第二亲水性组分连接的第一亲水性组分，所述方法包括使所述拴系复合物或其一种或多种组分与多个两亲性分子接触并且随后形成所述两亲性层。
14.根据权利要求13所述的方法，其包括(i)使所述疏水性接头与所述多个两亲性分子接触；以及(ii)形成所述两亲性层。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述疏水性接头与所述第一亲水性组分和/或所述第二亲水性组分中的至少一者连接。
16.根据权利要求13到15中任一项所述的方法，其中当所述疏水性接头与所述两亲性分子接触时，所述疏水性接头未与所述第一亲水性组分和/或所述第二亲水性组分连接，并且其中所述方法进一步包括一旦已形成所述两亲性层，就将所述第一亲水性组分和/或所述第二亲水性组分与所述疏水性接头连接，由此形成所述拴系复合物。
17.根据权利要求13到16中任一项所述的方法，其包括提供包括两亲性分子和所述疏水性接头的混合物；以及
A：
(a)使孔与所述混合物接触，其中在所述孔的反式侧存在包括所述第二亲水性组分的缓冲液，使得包括所述疏水性接头的两亲性层跨所述孔形成，并且所述第二亲水性组分与所述疏水性接头连接；以及
(b)将包括所述第一亲水性组分的缓冲液添加到所述两亲性层的顺式侧，使得所述第一亲水性组分与所述疏水性接头连接；
或
B：
(a)使孔与所述混合物接触，其中在所述孔的顺式侧存在包括所述第一亲水性组分的缓冲液，使得包括所述疏水性接头的两亲性层跨所述孔形成，并且所述第一亲水性组分与所述疏水性接头连接；以及
(b)将包括所述第二亲水性组分的缓冲液添加到所述两亲性层的反式侧，使得所述第二亲水性组分与所述疏水性接头连接。
18.根据权利要求13到16中任一项所述的方法，其包括：
(a)提供包括两亲性分子和首先与第一亲水性组分结合的所述疏水性接头的混合物；以及
(b)使孔与所述混合物接触，其中在所述孔的反式侧存在包括第二亲水性组分的缓冲液，使得包括所述疏水性接头的两亲性层跨所述孔形成，并且所述第二亲水性组分在膜的反式侧与所述疏水性接头连接。
19.根据权利要求13到16中任一项所述的方法，其包括：
(a)提供包括两亲性分子和首先与第二亲水性组分结合的所述疏水性接头的混合物；以及
(b)使孔与所述混合物接触，其中在所述孔的顺式侧存在包括第一亲水性组分的缓冲液，使得包括所述疏水性接头的两亲性层跨所述孔形成，并且所述第一亲水性组分在膜的顺式侧与所述疏水性接头连接
20.一种用于将拴系复合物组装在两亲性层中的方法，其中所述拴系复合物包括通过疏水性接头与第二亲水性组分连接的第一亲水性组分，所述方法包括：(i)由多个两亲性分子形成所述两亲性层；以及(ii)使所述两亲性层与所述疏水性接头接触；
其中所述疏水性接头任选地与所述第一亲水性组分或所述第二亲水性组分连接。
21.根据权利要求20所述的方法，其进一步包括一旦已经形成所述两亲性层，就将所述第一亲水性组分和/或所述第二亲水性组分与所述疏水性接头连接，由此形成所述拴系复合物。
22.根据权利要求13到21中任一项所述的方法，其包括使所述第一亲水性组分；所述第二亲水性组分；以及所述疏水性接头接触；其中所述第一亲水性组分包括第一反应性基团；所述第二亲水性组分包括第二反应性基团；并且所述疏水性接头包括反应性基团；以及
使所述第一反应性基团与所述疏水性接头上的反应性基团反应并且使所述第二反应性基团与所述疏水性接头上的反应性基团反应，以通过所述疏水性接头将所述第一亲水性组分与所述第二亲水性组分连接，由此形成所述拴系复合物。
23.一种用于将拴系复合物组装在两亲性层中的方法，其中所述拴系复合物包括通过疏水性接头与第二亲水性组分连接的第一亲水性组分，所述方法包括：
(a)使第一部分与第二部分接触，其中所述第一部分包括所述第一亲水性组分，所述第一亲水性组分与包括第一反应性基团的第一疏水性部分连接，并且所述第二部分包括所述第二亲水性组分，所述第二亲水性组分与包括第二反应性基团的第二疏水性部分连接；以及
(b)使所述第一反应性基团与所述第二反应性基团反应，由此形成将所述第一亲水性组分与所述第二亲水性组分连接的疏水性接头，由此形成所述拴系复合物。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述第一亲水性组分由所述两亲性层的第一面提供，并且所述第二亲水性组分由所述两亲性层的第二面提供。
25.根据权利要求10到24中任一项所述的方法，其进一步包括将检测器插入到所述两亲性层中。
26.根据权利要求1到9中任一项所述的方法，其中所述拴系复合物是根据权利要求10到24中任一项组装的。
27.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述疏水性接头与(i)所述一种或多种亲水性组分或(ii)所述第一亲水性组分和/或所述第二亲水性组分共价连接。
28.根据权利要求1到27中任一项所述的方法，其中所述疏水性接头与(i)所述一种或多种亲水性组分或(ii)所述第一亲水性组分和/或所述第二亲水性组分非共价连接。
29.根据权利要求1到27中任一项所述的方法，其中(i)所述疏水性接头与所述第一亲水性组分共价连接并且与所述第二亲水性组分非共价连接；或(ii)所述疏水性接头与所述第一亲水性组分非共价连接并且与所述第二亲水性组分共价连接。
30.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述疏水性接头包括以下或由以下组成：饱和或非饱和烃或有机分子、或饱和或非饱和无机分子；
其中任选地所述疏水性接头包括以下或由以下组成：疏水性多肽、螺缩酮、聚二甲基硅氧烷(PDMS)、烷烃、蛋白质、跨膜孔、碳纳米管、天然脂质或合成脂质样分子。
31.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中(i)所述一种或多种亲水性组分中的至少一种亲水性组分；或(ii)所述第一亲水性组分包括分析物结合部分；
任选地其中(i)所述分析物结合部分包括生物素并且所述第一亲水性组分包括链霉亲和素；(ii)所述分析物结合部分包括胆固醇并且所述第一亲水性组分包括环糊精；或(iii)所述第一亲水性组分包括核苷酸或多核苷酸。
32.根据权利要求2到31中任一项所述的方法，其中所述第二亲水性组分包括锚或锚结合部分；
任选地其中(i)所述锚结合部分包括生物素并且所述锚包括链霉亲和素；或(ii)所述锚结合部分包括胆固醇并且所述锚包括环糊精；或(iii)所述锚包括核苷酸或多核苷酸。
33.一种将分析物集中在检测器的区域中的方法，所述方法包括：
-执行根据权利要求1到9或26到32中任一项所述的方法；以及
-使所述分析物与所述拴系复合物接触，使得所述分析物与所述拴系复合物的所述第一亲水性组分连接；
由此将所述分析物集中在所述检测器的区域中。
34.根据权利要求33所述的方法，其中所述分析物与多个拴系复合物结合，由此将所述分析物集中在所述检测器的区域中。
35.一种将分析物集中在包括检测器的两亲性层的区域中的方法，所述方法包括将多个拴系复合物集中在所述检测器的区域中；以及
i)使所述分析物与所述拴系复合物接触，使得所述分析物与多个所述拴系复合物结合；或
ii)使以下接触：(A)夹板，所述夹板包括(i)用于所述拴系复合物的多个结合位点和(ii)用于所述分析物的一个或多个结合位点；以及(B)具有所述拴系复合物的所述分析物，使得所述夹板与多个所述拴系复合物结合并且所述分析物与所述夹板结合；
由此将所述分析物集中在所述检测器的区域中。
36.根据权利要求35所述的方法，其中所述拴系复合物和/或所述两亲性层如权利要求1到32中任一项所定义。
37.一种表征靶分析物的方法；所述方法包括使用根据权利要求33到36中任一项所述的方法将所述分析物集中在检测器的区域中，并且在所述分析物相对于所述检测器移动时进行一个或多个测量，其中所述一个或多个测量指示所述分析物的一种或多种特性，并且由此在所述分析物相对于所述检测器移动时对所述分析物进行表征。
38.根据权利要求37所述的方法，其中对多种靶分析物进行表征。
39.根据权利要求37或权利要求38所述的方法，其中所述分析物或每种分析物是多核苷酸、蛋白质、肽、碳水化合物或代谢物。
40.根据权利要求1到9、25或33到39中任一项所述的方法，其中所述检测器包括跨膜纳米孔，所述跨膜纳米孔能够在所述分析物相对于所述纳米孔移动时表征所述分析物。
41.一种两亲性层，其能通过根据权利要求1到32中任一项所述的方法获得。
42.一种两亲性层，其包括跨膜纳米孔和拴系复合物，其中所述拴系复合物包括跨越所述两亲性层的疏水性接头、位于所述两亲性层的顺式侧的第一亲水性组分和位于所述两亲性层的反式侧的第二亲水性组分。
43.根据权利要求42所述的两亲性层，其包括第一区域和第二区域；其中所述第一区域在化学上和/或物理上不同于所述第二区域，并且其中所述纳米孔位于所述第一区域中并且所述拴系复合物集中在所述第一区域中。
44.根据权利要求42或权利要求43所述的两亲性层，其中：
-所述两亲性层如权利要求3到9中任一项所定义；和/或
-所述拴系复合物是根据权利要求10到25中任一项组装的或如权利要求27到32中任一项所定义。
45.一种阵列，其包括两个或更多个根据权利要求41到44中任一项所述的两亲性层。
46.一种装置，其包括根据权利要求45所述的阵列、用于跨所述两亲性层施加电压电位的构件和用于检测跨所述两亲性层的电荷的构件；
其中所述装置任选地进一步包括用于将样品供应到所述两亲性层的流体系统。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012164270A1 (en) 2011-05-27 2012-12-06 Oxford Nanopore Technologies Limited Coupling method
EP4341433A1 (en) 2021-05-19 2024-03-27 Oxford Nanopore Technologies PLC Methods for complement strand sequencing

Family Cites Families (31)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5198543A (en) 1989-03-24 1993-03-30 Consejo Superior Investigaciones Cientificas PHI29 DNA polymerase
US6267872B1 (en) 1998-11-06 2001-07-31 The Regents Of The University Of California Miniature support for thin films containing single channels or nanopores and methods for using same
US6916488B1 (en) 1999-11-05 2005-07-12 Biocure, Inc. Amphiphilic polymeric vesicles
AU2001264623A1 (en) 2000-05-16 2001-11-26 Biocure, Inc. Membranes formed from amphiphilic copolymers
GB0505971D0 (en) 2005-03-23 2005-04-27 Isis Innovation Delivery of molecules to a lipid bilayer
US20100196203A1 (en) 2007-02-20 2010-08-05 Gurdial Singh Sanghera Formation of Lipid Bilayers
US9121843B2 (en) 2007-05-08 2015-09-01 Trustees Of Boston University Chemical functionalization of solid-state nanopores and nanopore arrays and applications thereof
EP2195648B1 (en) 2007-09-12 2019-05-08 President and Fellows of Harvard College High-resolution molecular graphene sensor comprising an aperture in the graphene layer
GB0724736D0 (en) 2007-12-19 2008-01-30 Oxford Nanolabs Ltd Formation of layers of amphiphilic molecules
JP2012516145A (ja) 2009-01-30 2012-07-19 オックスフォード ナノポア テクノロジーズ リミテッド ハイブリダイゼーションリンカー
GB0901588D0 (en) 2009-02-02 2009-03-11 Itis Holdings Plc Apparatus and methods for providing journey information
CN102405410B (zh) 2009-04-20 2014-06-25 牛津楠路珀尔科技有限公司 脂质双层传感器阵列
EP2580588B1 (en) 2010-06-08 2014-09-24 President and Fellows of Harvard College Nanopore device with graphene supported artificial lipid membrane
KR101939420B1 (ko) 2011-02-11 2019-01-16 옥스포드 나노포어 테크놀로지즈 리미티드 돌연변이체 세공
WO2012164270A1 (en) * 2011-05-27 2012-12-06 Oxford Nanopore Technologies Limited Coupling method
CA2852812A1 (en) 2011-10-21 2013-04-25 Oxford Nanopore Technologies Limited Enzyme method
GB201120910D0 (en) 2011-12-06 2012-01-18 Cambridge Entpr Ltd Nanopore functionality control
CA2861808C (en) 2011-12-29 2021-02-23 Oxford Nanopore Technologies Limited Enzyme method
US9617591B2 (en) 2011-12-29 2017-04-11 Oxford Nanopore Technologies Ltd. Method for characterising a polynucleotide by using a XPD helicase
CN112646019B (zh) 2012-04-10 2022-08-16 牛津纳米孔科技公开有限公司 突变胞溶素孔
CA2879261C (en) 2012-07-19 2022-12-06 Oxford Nanopore Technologies Limited Modified helicases
GB201313121D0 (en) 2013-07-23 2013-09-04 Oxford Nanopore Tech Ltd Array of volumes of polar medium
CN104936682B (zh) 2012-10-26 2017-12-15 牛津纳米孔技术公司 微滴界面
CA2927726A1 (en) 2013-10-18 2015-04-23 Oxford Nanopore Technologies Limited Modified helicases for use in nucleic acid sequencing
GB201417712D0 (en) 2014-10-07 2014-11-19 Oxford Nanopore Tech Ltd Method
EP4053150A1 (en) 2014-09-01 2022-09-07 Vib Vzw Mutant csgg pores
GB201418469D0 (en) * 2014-10-17 2014-12-03 Oxford Nanopore Tech Ltd Method
JP7166586B2 (ja) 2015-06-25 2022-11-08 ロズウェル バイオテクノロジーズ，インコーポレイテッド 生体分子センサーおよび方法
CN109196116B (zh) * 2016-05-25 2022-09-27 牛津纳米孔科技公开有限公司 一种表征靶多核苷酸的方法
US11441118B2 (en) * 2017-11-02 2022-09-13 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Nucleic acid and other compositions and methods for the modulation of cell membranes
GB201801768D0 (en) * 2018-02-02 2018-03-21 Oxford Nanopore Tech Ltd Synthesis method

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