CN114983997A - 一种治疗石斑鱼虹彩病毒病的药物 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种治疗石斑鱼虹彩病毒病的药物，按照质量份数计算，该药物包括儿茶素类化合物单体；其中，儿茶素类化合物单体包括表没食子酸儿茶素没食子酸酯、表儿茶素没食子酸酯、表没食子儿茶素和表儿茶素。本发明所提供的治疗石斑鱼虹彩病毒病的药物利用多种儿茶素类化合物单体复配，能够对石斑鱼虹彩病毒感染产生有效的抑制效果。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种治疗石斑鱼虹彩病毒病的药物。
背景技术
近年来，我国海洋经济迅猛发展，《2021年中国海洋经济统计公报》数据显示2021年全国海洋生产总值达到9.03万亿元，其中海洋渔业经济在海洋经济中占比超过15.6％。石斑鱼是我国华南地区及东南亚各国最名贵的海水养殖鱼类之一，因其肉质鲜美，营养丰富受广大消费者青睐。据《2021中国渔业统计年鉴》2020年我国石斑鱼养殖年产量已达到19.2万吨，产业直接产值超过一百亿元，具有极高的经济价值。近年来，在石斑鱼高密度、集约化养殖条件下，各种养殖疫病频频爆发造成巨大经济损失。目前虽然已有石斑鱼虹彩病毒相关疫苗报道，但是因其操作繁琐而没有广泛使用。因此开发绿色、无污染、易操作的高效抗病毒药物，用于石斑鱼养殖中虹彩病毒病的防控治疗迫在眉睫。
近年来，从传统中草药筛选具有显著抗病毒作用的活性化合物成分，进而研制新型渔用药物制剂，已成为水产领域的研究热点，具有重要的经济价值和社会意义。我国中草药资源丰富，且使用历史悠久，中草药含有大量结构各异、生物活性多样的天然化合物成分，主要包括有机酸类、生物碱、多糖类、皂苷类、黄酮类等。中草药源化合物不仅具有杀菌抑虫、抗病毒、促生长、提高免疫力等功能，还具有易降解、天然无污染、不易产生病菌耐药性等优点，因此基于中草药开发高效、低毒、环境友好的抗病渔药对于水产高质化健康养殖意义重大。
发明内容
本发明的目的在于提供一种治疗石斑鱼虹彩病毒病的药物，以针对石斑鱼虹彩病毒发挥有效的抑制作用。
根据本发明的一个方面，提供一种治疗石斑鱼虹彩病毒病的药物：包括儿茶素类化合物单体，其中，上述儿茶素类化合物单体包括表没食子酸儿茶素没食子酸酯、表儿茶素没食子酸酯、表没食子儿茶素和表儿茶素。
优选地，按照质量份数计算，在儿茶素类化合物单体中，表没食子酸儿茶素没食子酸酯：表儿茶素没食子酸酯：表没食子儿茶素：表儿茶素＝2.5～10：2.～10：1.25～5：5～20。
优选地，按照质量份数计算，在儿茶素类化合物单体中，表没食子酸儿茶素没食子酸酯：表儿茶素没食子酸酯：表没食子儿茶素：表儿茶素＝2：2：1：4。
优选地，儿茶素类化合物单体的植物来源包括绿茶、金荞麦中的至少一种。
优选地，药物由表没食子酸儿茶素没食子酸酯、表儿茶素没食子酸酯、表没食子儿茶素和表儿茶素混合而成。
本发明所提供的治疗石斑鱼虹彩病毒病的药物利用多种儿茶素类化合物单体复配，能够对石斑鱼虹彩病毒感染产生有效的抑制效果。进一步地，将该药物中的儿茶素类化合物单体限定为表没食子酸儿茶素没食子酸酯(EGCG)、表儿茶素没食子酸酯(ECG)、表没食子儿茶素(EGC)、表儿茶素(EC)，由此所形成的复合配方制剂能够通过破坏石斑鱼虹彩病毒的结构、影响病毒复制感染的过程，而对石斑鱼虹彩病毒感染产生显著的抑制效果。
附图说明
图1为在实施例1中对石斑鱼脾脏细胞形态的光镜观察结果；
图2为在实施例2的细胞活性检测结果统计情况；
图3为在实施例4的细胞活力测定结果统计情况；
图4为实施例5的RT-qPCR技术检测MCP基因表达结果统计图；
图5为实施例6的RT-qPCR技术检测MCP基因表达结果统计图；
图6为实施例7的RT-qPCR技术检测MCP基因表达结果统计图。
具体实施方式
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
以下实施例中的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的实验材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获取。
下述实施例中涉及的定量实验数据以均数±标准差(±s)表示，采用SPSS 17.0统计软件运用单因素水平方差分析的方法对组间比较数据进行统计处理。
石斑鱼脾脏细胞(Grouper Spleen cell,GS)保存于本实验室，公众可从申请人课题组处获得，仅用于重复本发明实验使用。
石斑鱼虹彩病毒(广西株，Grouper iridovirus Guangxi strain,SGIV)分离自广西北海患病的珍珠龙胆石斑鱼(Epinephelus fuscoguttatus♀×E.lanceolatus♂)，保存于本实验室，公众可从申请人课题组处获得，仅用于重复本发明实验使用。
表没食子酸儿茶素没食子酸酯：上海麦克林生化科技有限公司(分析纯度≥98％)，产品编号为E808890，CAS#989-51-5。表儿茶素没食子酸酯：上海麦克林生化科技有限公司(分析纯度≥98％)，产品编号为E837314，CAS#1257-08-5。表没食子儿茶素：上海麦克林生化科技有限公司(分析纯度≥98％)，产品编号为E808621，CAS#970-74-1。表儿茶素：上海麦克林生化科技有限公司(分析纯度≥95％)，产品编号为E835578，CAS#490-46-0。
石斑鱼虹彩病毒主要衣壳蛋白(Major capsid protein，MCP)基因引物：
正向引物(qMCP-F)5’-GCACGCTTCTCTCACCTTCA-3’，
反向引物(qMCP-R)5’-AACGGCAACGGGAGCACTA-3’。
内参基因β-actin引物：
正向引物(β-actin-F)5’-TACGAGCTGCCTGACGGACA-3’，
反向引物(β-actin-R)5’-GGCTGTGATCTCCTTCTGCA-3’。引物由上海生工合成。
实施例1
本实施例利用光学显微镜分别观察表没食子酸儿茶素没食子酸酯(EGCG)、表儿茶素没食子酸酯(ECG)、表没食子儿茶素(EGC)、表儿茶素(EC)对细胞毒性影响。
实验方法：将GS细胞按照1×105个/孔的数量传入96孔板，28℃培养18小时，然后将四种植物源化合物单体用对应的细胞培养基稀释成不同的浓度(100,50,20,10,5,2.5μg/mL)；实验组是将含有不同浓度的植物化合物单体分别与96孔板中的GS细胞在28℃孵育培养48h，对细胞形态进行光镜观察。本实验的对照组是培养基中没有加入植物源化合物单体的GS细胞。
实验结果：图1展示了分别采用不同浓度的表没食子酸儿茶素没食子酸酯(EGCG)、表儿茶素没食子酸酯(ECG)、表没食子儿茶素(EGC)、表儿茶素(EC)对石斑鱼脾脏细胞的细胞毒作用的光镜观察结果。如图1所示，对照组GS细胞无明显变化，实验组中EGCG、ECG浓度高于20μg/mL、EGC浓度高于10μg/mL，实验组GS细胞出现明显的形态变化和细胞病变，包括细胞变圆、皱缩、从细胞培养面上脱落等。实验组中EGCG、ECG浓度低于10μg/mL、EGC浓度低于5μg/mL、EC浓度低于50μg/mL，GS细胞形态无明显变化，并且与对照组细胞相近。
实施例2
在本实施例中，分别测试细胞活力检测表没食子酸儿茶素没食子酸酯(EGCG)、表儿茶素没食子酸酯(ECG)、表没食子儿茶素(EGC)、表儿茶素(EC)各植物化合物单体对细胞毒性影响。
实验方法：将GS细胞按照1×105个/孔的数量传入96孔板，28℃培养18小时，然后将四种植物源化合物单体在细胞培养基中设置成不同的浓度(100,50,20,10,5,2.5μg/mL)；将不同浓度的植物源化合物单体分别与96孔板中的GS细胞在28℃孵育培养48h。为了检测细胞活性，各孔中的细胞加入100μL的CCK-8溶液(CCK-8:PBS＝1:9)继续在28℃培养4小时，然后用酶标仪检测450nm处的吸光度。细胞存活率(％)＝实验组OD450/对照组OD450×100％，每组四个重复，每个实验分别重复三次。根据细胞存活率测定结果确定各植物源化合物单体对GS细胞无损伤组，即为安全使用浓度。本实验的对照组是培养基中没有加入植物源化合物单体的GS细胞。
实验结果：图2展示了分别采用不同浓度的EGCG、ECG、EGC、EC对石斑鱼脾脏细胞活力影响的细胞活性检测结果。如图2所示，实验组中EGCG、ECG浓度高于20μg/mL、EGC浓度高于10μg/mL时，各实验组细胞存活率均显著低于对照组，实验组中EGCG、ECG浓度低于10μg/mL、EGC浓度低于5μg/mL、EC浓度低于50μg/mL时，各实验组细胞存活率与对照组无显著性差异，且存活率均超过98％。结合实施例1光镜观察结果，确定各植物源化合物单体EGCG、ECG、EGC、EC的最高安全工作浓度分别为10μg/mL、10μg/mL、5μg/mL、50μg/mL。
实施例3
在本实施例中，按照如下方法制备表没食子酸儿茶素没食子酸酯(EGCG)、表儿茶素没食子酸酯(ECG)、表没食子儿茶素(EGC)、表儿茶素(EC)复方配合制剂：
将表没食子酸儿茶素没食子酸酯(EGCG)、表儿茶素没食子酸酯(ECG)、表没食子儿茶素(EGC)、表儿茶素(EC)按照质量配比为2：2：1：4的比例混合均匀，得到药用植物源化合物单体复合配方制剂，使用细胞培养基溶解复合配方制剂，母液浓度为100μg/mL(EGCG、ECG、EGC、EC在溶液中的总浓度)，使用0.22μm滤柱过滤除菌后，-20℃保存备用。
实施例4
在本实施例中，利用实施例3所制得的表没食子酸儿茶素没食子酸酯(EGCG)、表儿茶素没食子酸酯(ECG)、表没食子儿茶素(EGC)、表儿茶素(EC)复合配方制剂进行细胞毒性试验。
实验方法：将GS细胞按照1×105个/孔的数量传入96孔板，28℃培养24小时备用。将实施例3的复合配方制剂在细胞培养基中倍比梯度稀释，设置成不同的浓度100，50，25，12.5，6.25μg/mL；将含有不同浓度的复合配方制剂分别加入96孔板中的GS细胞，在28℃孵育培养48h。为了检测细胞活性，各孔中的细胞加入20μL的WST-8溶液继续在28℃培养4小时，然后用酶标仪检测450nm处的吸光度。细胞存活率＝实验组OD450/对照组OD450×100％，每组四个重复，实验分别重复三次。根据细胞存活率测定结果确定复合配方制剂的最大无毒浓度，即安全使用浓度。本实验的对照组是培养基中没有加入复合配方制剂的GS细胞。
实验结果：图3展示了实施例3所制得的复合配方制剂(EGCG、ECG、EGC、EC质量配比为2：2：1：4)在不同浓度下对石斑鱼脾脏细胞活力影响的细胞活性检测结果。如图3所示，复合配方制剂浓度低于12.5μg/mL的实验组细胞存活率超过92％，即实施例3中表没食子酸儿茶素没食子酸酯(EGCG)、表儿茶素没食子酸酯(ECG)、表没食子儿茶素(EGC)、表儿茶素(EC)复合配方制剂的最高安全工作浓度为12.5μg/mL。见图3。
实施例5
本实施例为病毒感染抑制试验。
实验方法：本实施例利用RT-qPCR技术检测了实施例3制备的表没食子酸儿茶素没食子酸酯(EGCG)、表儿茶素没食子酸酯(ECG)、表没食子儿茶素(EGC)、表儿茶素(EC)复合配方制剂，在安全浓度条件下抑制石斑鱼虹彩病毒感染的效果。具体操作如下：将GS细胞按照8×105个/孔的数量传入12孔板，28℃培养18小时。将实施例3中复合配方制剂在细胞培养基中稀释成安全使用浓度12.5,6.25,3.125μg/mL。然后将800μL含有安全浓度的复合配方制剂和SGIV病毒(MOI＝1)一起加入12孔板的细胞中，28℃培养。在48小时将细胞和培养基收集提取RNA，并将其反转录成cDNA，以cDNA为模板，β-actin基因作为内参基因，用RT-qPCR检测石斑鱼虹彩病毒主要衣壳蛋白MCP基因的表达情况，来判断抗石斑鱼虹彩病毒复合配方制剂对石斑鱼虹彩病毒的抑制作用。本实验的阳性对照组为只加入了SGIV病毒的GS细胞，阴性对照组为只加入了SGIV病毒的GS细胞。
实验结果：向石斑鱼脾脏细胞中加入石斑鱼虹彩病毒和安全使用浓度(12.5μg/mL)的复合配方抑制剂(EGCG、ECG、EGC、EC质量配比为2：2：1：4)，利用实时荧光定量PCR技术(qRT-PCR)检测复合配方抑制剂对石斑鱼虹彩病毒的抑制作用，RT-qPCR技术检测MCP基因表达结果显示(图4)，与只加入了SGIV病毒的阳性对照组GS细胞中MCP基因表达量相比，同时加入SGIV和安全浓度的复合配方制剂的实验组细胞中MCP基因的表达量明显降低，其抑制率可达到98％以上，说明实施例3制备的表没食子酸儿茶素没食子酸酯(EGCG)、表儿茶素没食子酸酯(ECG)、表没食子儿茶素(EGC)、表儿茶素(EC)复合配方制剂对石斑鱼虹彩病毒感染具有显著的抑制效果。
实施例6
本实施例为针对不同抑制剂对石斑鱼虹彩病毒结构的破坏作用检测。
实验方法：本实施例中，利用RT-qPCR技术检测了实施例3制备的表没食子酸儿茶素没食子酸酯(EGCG)、表儿茶素没食子酸酯(ECG)、表没食子儿茶素(EGC)、表儿茶素(EC)复合配方抑制剂对石斑鱼虹彩病毒结构的破坏作用。具体操作如下：将GS细胞按照8×105个/孔的数量传入12孔板，28℃培养18小时。然后将实施例3制备的复合配方制剂在细胞培养基中稀释成安全使用浓度12.5μg/mL，将800μL含有安全浓度的复合配方制剂和SGIV病毒(MOI＝1)一起加入12孔板的细胞中，4℃孵育30分钟，然后使用冷冻高速离心机25,000g在4℃条件下离心30分钟，移除上清中抑制剂，将离心沉淀的病毒用PBS漂洗后，重悬于800μL细胞培养基并加入12孔板的GS细胞，细胞在28℃继续培养12小时。其中对照组为只加入了SGIV病毒的GS细胞。12小时后将实验组和对照组中细胞和培养基收集提取RNA，并将其反转录成cDNA；然后，以cDNA为模板，β-actin基因作为内参基因，用RT-qPCR检测石斑鱼虹彩病毒主要衣壳蛋白MCP基因的表达情况，来判断复合配方抑制剂对石斑鱼虹彩病毒结构的破坏作用。
实验结果：图5展示了在安全使用浓度(12.5μg/mL)下，复合配方抑制剂(EGCG、ECG、EGC、EC质量配比为2：2：1：4)对石斑鱼虹彩病毒结构的破坏作用，图5的RT-qPCR技术检测MCP基因表达结果显示，与对照组细胞中MCP基因表达量相比，实验组细胞中MCP基因的表达量明显降低，且抑制率可达到70％，说明实施例3制备的表没食子酸儿茶素没食子酸酯(EGCG)、表儿茶素没食子酸酯(ECG)、表没食子儿茶素(EGC)、表儿茶素(EC)复合配方制剂可以通过破坏石斑鱼虹彩病毒的结构来发挥抗石斑鱼虹彩病毒感染的效果。
实施例7
本实施例为针对不同抑制剂对石斑鱼虹彩病毒在宿主细胞内的复制合成过程中的抑制作用检测。
实验方法：将GS细胞按照8×105个/孔的数量传入12孔板，28℃培养18小时。将800μL含有安全浓度的复合配方制剂和SGIV病毒(MOI＝1)一起加入12孔板的细胞中，4℃静置30分钟，然后将细胞移至28℃培养2小时。移除12孔板细胞中的培养基，用新鲜培养基将细胞清洗两次，然后将实施例3制备的复合配方制剂在细胞培养基中稀释成安全使用浓度12.5μg/mL，将800μL含有安全浓度的复合配方制剂和SGIV病毒(MOI＝1)混匀后加入12孔板的细胞中，在28℃继续培养12小时。然后将细胞和培养基收集提取总RNA，并将其反转录成cDNA，以cDNA为模板，β-actin基因作为内参基因，利用RT-qPCR技术检测石斑鱼虹彩病毒主要衣壳蛋白MCP基因的表达情况，来判断抑制剂对石斑鱼虹彩病毒在宿主细胞内的复制合成过程中的抑制作用。
实验结果：图6展示了在安全使用浓度(12.5μg/mL)下，复合配方抑制剂(EGCG、ECG、EGC、EC质量配比为2：2：1：4)对石斑鱼虹彩病毒在宿主细胞内的复制合成过程中的抑制作用，图6的RT-qPCR技术检测MCP基因表达结果显示，与对照组细胞中MCP基因表达量相比，实验组细胞中MCP基因的表达量明显降低，其抑制率可达到99％。说明实施例3制备的表没食子酸儿茶素没食子酸酯(EGCG)、表儿茶素没食子酸酯(ECG)、表没食子儿茶素(EGC)、表儿茶素(EC)复合配方抑制剂具有抑制石斑鱼虹彩病毒在宿主细胞内的复制合成的作用。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细的说明，所属领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，但这些修改或替换均在本发明的保护范围之内。
Claims (5)
1.一种治疗石斑鱼虹彩病毒病的药物，其特征在于：包括儿茶素类化合物单体，所述儿茶素类化合物单体包括表没食子酸儿茶素没食子酸酯、表儿茶素没食子酸酯、表没食子儿茶素和表儿茶素。
2.如权利要求1所述治疗石斑鱼虹彩病毒病的药物，其特征在于：按照质量份数计算，在所述儿茶素类化合物单体中，
所述表没食子酸儿茶素没食子酸酯：所述表儿茶素没食子酸酯：所述表没食子儿茶素：所述表儿茶素＝2.5～10：2.5～10：1.25～5：5～20。
3.如权利要求2所述治疗石斑鱼虹彩病毒病的药物，其特征在于，按照质量份数计算，在所述儿茶素类化合物单体中，
所述表没食子酸儿茶素没食子酸酯：所述表儿茶素没食子酸酯：所述表没食子儿茶素：所述表儿茶素＝2：2：1：4。
4.如权利要求1所述治疗石斑鱼虹彩病毒病的药物，其特征在于：所述儿茶素类化合物单体的植物来源包括绿茶、金荞麦中的至少一种。
5.如权利要求1所述治疗石斑鱼虹彩病毒病的药物，其特征在于：所述药物由所述表没食子酸儿茶素没食子酸酯、所述表儿茶素没食子酸酯、所述表没食子儿茶素和所述表儿茶素混合而成。
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