CN114965618A - 双模式生物传感器及其在dna甲基转移酶活性检测中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物检测技术领域，涉及双模式生物传感器及其在DNA甲基转移酶活性检测中的应用。双模式生物传感器包括信号探针和捕集探针；信号探针由Cu2O纳米材料、多孔有机聚合物及金纳米颗粒构成，所述多孔有机聚合物包覆Cu2O纳米材料，所述金纳米颗粒附着在多孔有机聚合物的表面，所述多孔有机聚合物以苯环作为连接基团将铁卟啉连接形成；捕集探针由磁珠、双链DNA构成，所述双链DNA由DNA1和DNA2杂交构成，DNA1与磁珠连接，DNA2的设置巯基，所述双链DNA能够被DNA甲基转移酶甲基化。本发明提供的双模式生物传感器，通过综合利用类漆酶样活性和较强的DPV信号，能够实现对Dam高灵敏度及高选择性的检测。
Description
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，涉及双模式生物传感器及其在DNA甲基转移酶活性检测中的应用。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
据发明人研究了解，目前DNA甲基转移酶(Dam)活性的检测方法需要复杂的仪器、样品处理和操作过程，而且输出信号为单模式，抗干扰能力差、灵敏低、选择性差，假阳性和假阴性率较高。
发明内容
为了解决现有技术的不足，本发明的目的是提供双模式生物传感器及其在DNA甲基转移酶活性检测中的应用，本发明提供的双模式生物传感器，通过综合利用类漆酶样活性和较强的DPV信号，能够实现对Dam高灵敏度及高选择性的检测。
为了实现上述目的，首先，需要构建双模式生物传感器的检测平台，研究表明，Cu(I)中心是天然漆酶的催化活性位点，驱动氧化反应。在天然漆酶催化原理的启发下，一些含铜纳米材料，如Cu2O纳米颗粒，Bpy-Cu，BSA-Cu和CuNi/CoMoO4等已经开发并表现出优异的漆酶样活性。其中，Cu2O纳米材料还具有突出的氧化还原对，在电化学中具有强烈的DPV信号，然而，由于Cu2O纳米材料的稳定性较弱，严重限制了Cu2O纳米材料构建双模式生物传感器平台。
因而，一方面，本发明的技术方案为：
一种信号探针，由Cu2O纳米材料、多孔有机聚合物及金纳米颗粒构成，所述多孔有机聚合物包覆Cu2O纳米材料，所述金纳米颗粒附着在多孔有机聚合物的表面，所述多孔有机聚合物以苯环作为连接基团将铁卟啉连接形成。
本发明将以苯环作为连接基团将铁卟啉连接形成多孔有机聚合物包覆在Cu2O纳米材料的表面，不仅具有显著提高和协同的催化活性，来源于Cu2O本身类漆酶样活性和卟啉铁的催化活性，而且由于以苯环作为连接基团将铁卟啉连接形成多孔有机聚合物壳优良的保护作用，有效地克服了纯Cu2O纳米材料稳定性较弱的问题。
为了基于上述信号探针形成的双模式生物传感器的检测平台，实现能够实现对Dam高灵敏度及高选择性的检测，另一方面，本发明的技术方案为：
一种双模式生物传感器，包括捕集探针和上述信号探针；
所述捕集探针，由磁珠(MB)、双链DNA(dsDNA)构成，所述双链DNA由DNA1和DNA2杂交构成，DNA1与磁珠连接，DNA2的设置巯基，所述双链DNA能够被DNA甲基转移酶甲基化。
当Dam存在时，dsDNA被Dam特异性识别，进而被甲基化，随后，甲基化部位被裂解，使得设置巯基的DNA2离开磁珠，此时，加入信号探针后，未被甲基化的捕集探针通过Au-S键，使得部分信号探针被固定在未被甲基化的捕集探针上，通过磁分离，将固定在捕集探针上的部分信号探针去除，对剩余游离的信号探针进行电化学检测和比色检测，从而实现了双模式检测。当Dam活性越高时，剩余捕集探针越少，使得能够固定在捕集探针上的信号探针越少，即Dam活性越高，游离的信号探针越多，从而实现了“信号增加”检测。
第三方面，一种上述双模式生物传感器在其在DNA甲基转移酶活性检测中的应用。
第四方面，一种DNA甲基转移酶活性的检测试剂盒，包括上述双模式生物传感器、S-腺苷-L-蛋氨酸(SAM)、缓冲液和Dpn I酶。
第五方面，一种上述双模式生物传感器在筛选Dam抑制剂中的应用。
本发明的有益效果为：
1.本发明提供的信号探针，在电化学方面具有出色的DPV信号，无需氧化还原介质，在以苯环作为连接基团将铁卟啉连接形成多孔有机聚合物组我诶外壳的保护作用下具有良好的稳定性。
2.本发明提供的信号探针，具有优越的协同增效漆酶样催化作用，这源于Cu2O的漆酶样活性和卟啉氧化铁的催化活性，随着O2的还原，能催化产生明显增强的比色信号。
3.本发明基于信号探针构建的双模式生物传感器构建的响应信号和传输机制独立的双模生物传感器保证了结果的准确性和可靠性。
经过实验表明，本发明提供的双模式生物传感器在Dam活性检测中表现出突出的性能，检测限分别为0.0009U/mL(ECL)和0.0014U/mL(CL)，范围从0.005到100U/mL。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为本发明实施例中Cu2O@FePPOPBADE的合成方法示意图；
图2为本发明实施例中基于Cu2O@FePPOPBADE建立的双模式策略用于Dam检测的示意图；
图3为本发明实施例中Cu2O和Cu2O@FePPOPBADE的表征图，A为Cu2O纳米立方体的TEM，B为Cu2O纳米立方体的SEM，C为PXRD图像，D为Cu2O@FePPOPBADE的TEM，E为Cu2O@FePPOPBADE的SEM，F为Cu2O@FePPOPBADE的SEM-EDS元素谱；
图4为本发明实施例中Cu2O@FePPOPBADE和AuNPs@Cu2O@FePPOPBADE的表征图，A为红外谱图，B为XPS全谱，C为Cu 2p XPS谱，D为Cu俄歇谱图，E为AuNPs的TEM，F为AuNPs@Cu2O@FePPOPBADE的TEM；
图5为本发明实施例中比色检测图，A为2,4-DP和4-AP被Cu2O或者Cu2O@FePPOPBADE催化反应的示意图，B为2,4-DP(1mg/mL)、4-AP(1mg/mL)的图片和它们的产物被1mg/mL的Cu2O或者Cu2O@FePPOPBADE催化一小时后的图片，C为不同体系孵育一小时后的紫外光谱，(a)4-AP+2,4-DP,(b)4-AP+2,4-DP+Cu2O,(c)4-AP+2,4-DP+Cu2O@FePPOPBADE,(d)4-AP+2,4-DP+Cu2O+O2,(e)4-AP+2,4-DP+Cu2O@FePPOPBADE+O2，以上所用底物和酶的浓度均为1mg/mL；
图6为本发明实施例中对Cu2O@FePPOPBADE催化的O2还原产物的研究结果，A为照片，B为414nm处的吸光度，a)Cu2O@FePPOPBADE氧化2,4-DP 1小时后的上清液，b)HRP和ABTS混合30分钟后的上清液，c)上清液中加入H2O2；
图7为本发明实施例中Cu2O(A)和Cu2O@FePPOPBADE(B)的Lineweaver-Burk双倒数图像；
图8为本发明实施例中循环使用Cu2O@FePPOPBADE和Cu2O纳米立方体催化2,4-DP氧化的结果图，A为循环利用Cu2O@FePPOPBADE(1,黑色)和Cu2O(2,红色)催化氧化2,4-DP，B为Cu2O@FePPOPBADE(1,黑色)及在空气中贮存20天后(2,红色)的催化活性，Cu2O的催化活性(3,蓝色)和在空气中保存20天后(4,绿色)的催化活性；
图9为本发明实施例中可行性验证的结果图，A为DPV响应，Cu2O(a)、Cu2O@FePPOPBADE(b)、Cu2O s饱和O2(c)Cu2O@FePPOPBADE饱和O2(d)，B为Dam在不同情况下的凝胶电泳图像，DNA marker(M)，单链DNA1(条带1)，单链DNA2(条带2)，DNA1/DNA2 dsDNA(l条带3)，DNA1/DNA2 dsDNA+Dam(条带4)，DNA1/DNA2 dsDNA+Dpn I(条带5)，DNA1/DNA2 dsDNA+Dam+Dpn I(条带6)，C为不同情况下的电化学的信号，(a)杂交探针，(b)杂交探针+Dam，(c)杂交探针+Dpn I，(d)杂交探针+Dam+Dpn I，D为不同情况下的比色的信号，(a)杂交探针，(b)杂交探针+Dam，(c)杂交探针+Dpn I，(d)杂交探针+Dam+Dpn I；
图10为本发明实施例中实验参数优化结果图，A为PBS电解质溶液pH，B为MES缓冲溶液pH，C为比色反应体系温度，D为比色反应体系反应时间；
图11为本发明实施例中灵敏度检测结果图，A为不同浓度的Dam的电化学响应，B为电化学响应线性关系，C为不同浓度的Dam的紫外信号响应，D为紫外信号响应线性关系；
图12为本发明实施例中选择性检测结果图，A为电化学传感平台的选择性，(a)0U/mL Dam,(b)50U/mL BSA,(c)50U/mL M.SssI,(d)50U/mL Dam，B为比色传感平台的选择性，(a)0U/mL Dam,(b)50U/mL BSA,(c)50U/mL M.SssI,(d)50U/mL Dam，C为5-氟尿嘧啶对Dam在电化学平台中性能的抑制作用，D为5-氟尿嘧啶对Dam在比色平台中性能的抑制作用；
图13为本发明实施例中稳定性的检测结果图。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
鉴于现有Dam活性的检测方法存在抗干扰能力差、灵敏低、选择性差，假阳性和假阴性率较高等缺陷，本发明提出了双模式生物传感器及其在DNA甲基转移酶活性检测中的应用。
本发明的一种典型实施方式，提供了一种信号探针，由Cu2O纳米材料、多孔有机聚合物及金纳米颗粒构成，所述多孔有机聚合物包覆Cu2O纳米材料，所述金纳米颗粒附着在多孔有机聚合物的表面，所述多孔有机聚合物以苯环作为连接基团将铁卟啉连接形成。
本发明将以苯环作为连接基团将铁卟啉连接形成多孔有机聚合物包覆在Cu2O纳米材料的表面，不仅具有显著提高和协同的催化活性，来源于Cu2O本身类漆酶样活性和卟啉铁的催化活性，而且由于以苯环作为连接基团将铁卟啉连接形成多孔有机聚合物壳优良的保护作用，有效地克服了纯Cu2O纳米材料稳定性较弱的问题。
该实施方式的一些实施例中，所述Cu2O纳米材料为Cu2O纳米立方体。研究表明，该Cu2O纳米材料与多孔有机聚合物复合后具有更高的催化活性。
在一种或多种实施例中，Cu2O纳米立方体的制备过程为：将铜盐加入至柠檬酸三钠的水溶液中混合均匀，然后加入碱金属的氢氧化物溶液，再加入还原剂还原后获得。
该实施方式的一些实施例中，多孔有机聚合物包覆Cu2O纳米材料的过程为：将Cu2O纳米材料分散至溶剂中，加入Fe(III)Cl-5,10,15,20-四(4-碘苯基)卟啉(FeTIPP)和1,4-苯二硼酸频那醇酯(BADE)进行铃木反应(Suzuki偶联反应)，即得。
该实施方式的一些实施例中，信号探针的制备过程为：将多孔有机聚合物包覆Cu2O纳米材料获得Cu2O@FePPOPBADE，将Cu2O@FePPOPBADE分散后加入带正电荷的金纳米颗粒分散液，混合均匀后即得。混合均匀后进行离心分离、洗涤、真空冷冻干燥。
本发明的另一种实施方式，提供了一种双模式生物传感器，包括捕集探针和上述信号探针；
所述捕集探针，由磁珠(MB)、双链DNA(dsDNA)构成，所述双链DNA由DNA1和DNA2杂交构成，DNA1与磁珠连接，DNA2的设置巯基，所述双链DNA能够被DNA甲基转移酶甲基化。
该实施方式的一些实施例中，DNA1与磁珠通过生物素和链霉亲和素连接。
该实施方式的一些实施例中，所述双链DNA中能够能够被DNA甲基转移酶特异性识别的序列为5′-G-A-T-C-3′。
本发明的第三种实施方式，提供了一种上述双模式生物传感器在其在DNA甲基转移酶活性检测中的应用。
本发明所述的应用可以是以疾病的诊断与治疗为目的，也可以是以非疾病的诊断与治疗为目的。
具体地，检测DNA甲基转移酶活性的步骤如下：
(1)将待测含有Dam的样品与捕集探针、SAM、Dpn I酶和缓冲液进行混合，孵育；
(2)将步骤(1)孵育后的溶液进行磁分离，获得上清液；
(3)向步骤(2)获得的上清液中添加信号探针，进行混合；
(4)将步骤(3)的混合混合液进行磁分离，获得上清液；
(5)将步骤(2)获得的上清液进行电化学检测和比色检测。
电化学检测中采用PBS电解质，当电解液的pH为6.4～6.6时，峰值电流更高。
比色检测体系中，含有2,4-二氯苯酚(2,4-DP)和4-氨基安替比林(4-AP)。比色检测采用MES缓冲溶液，当缓冲溶液的pH为5.9～6.1时，催化性能更好。
比色检测中，当温度为54～56℃时，信号探针的活性更高。
本发明的第四种实施方式，提供了一种DNA甲基转移酶活性的检测试剂盒，包括上述双模式生物传感器、S-腺苷-L-蛋氨酸(SAM)、缓冲液和Dpn I酶。
该实施方式的一些实施例中，所述缓冲液包括Dam缓冲液、PBS缓冲液(PBS电解液)、MES缓冲溶液中的一种或多种。
该实施方式的一些实施例中，包括2,4-二氯苯酚和4-氨基安替比林。
本发明的第五种实施方式，提供了一种上述双模式生物传感器在筛选Dam抑制剂中的应用。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。
1.制备Cu2O立方：
方法如下。首先，柠檬酸三钠(0.9M,2.0mL)加到400mL水中，搅拌20分钟后，将CuSO4水溶液(1.2M,2.0mL)加入再搅5分钟。接着加NaOH水溶液(4.8M,2.0mL)，5分钟后形成Cu(OH)2沉淀物。之后，加入抗坏血酸水溶液(1.2M，2.0mL)搅拌30分钟。颜色由蓝变为黄时，停止反应，然后通过离心分离，用超纯水洗并在真空下干燥。
2.合成Cu2O@FePPOPBADE：
如图1所示。将100mg Cu2O和11.2mg PdCl2(PPh3)2溶在40mL甲苯，加1mL三乙胺，超声1h。同时，将Fe(III)Cl-5,10,15,20-四(4-碘苯基)卟啉(FeTIPP)(0.016mmol,19.2mg)和1,4-苯二硼酸频那醇酯(BADE)(0.032mmol,11.6mg)溶于5mL甲苯，然后加入到上述体系。室温搅15小时。最后，离心获得产物,用水洗并干燥。
3.制备Cu2O@FePPOPBADE@AuNPs探针：
HAuCl4溶液(40mL,1.4mM)与400μL半胱氨酸溶液(210mM)混合，再加10μL NaBH4(10mM)。当体系变红时，AuNPs被成功合成，储存在4℃下。然后，将10mg Cu2O@FePPOPBADE分散在10mL超纯水中。紧接着，将4mL带正电荷的AuNPs加入上述混合物中，使整个体系在室温下连续搅拌8小时。最后，用5000转速离心5分钟，去离子水洗涤和真空冷冻干燥获得产物。
4.制备SA-MB/dsDNA：
首先，将带巯基的单链DNA2(20μL,10μM)(DNA2:5’-TCTCCTTGATCTCGTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-SH-3’,见SEQ ID NO.1)与0.5μL TCEP(50mM)一起孵育1.5小时以除去二硫键，然后与生物素的修饰的单链DNA1(20μL,10μM)(DNA1:5’-ACGAGATCAAGGAGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-biotin-3’,见SEQ ID NO.2)一起孵育1小时以获得DNA1/DNA2杂交双链(dsDNA)。然后，1μL链霉亲和素修饰的MB(30mg/mL)，经过30μL洗涤缓冲液(1mM EDTA,0.5M NaCl,20mM tris-HCl)洗涤后与dsDNA溶液一起孵育1小时。用水洗涤后，通过生物素-链霉亲和素相互作用获得了SA-MB/dsDNA。
5.构建电化学传感器：
将玻璃碳电极(GCE)用0.5μm和50nm的Al2O3粉末打磨，然后按照水，乙醇和水的顺序冲洗，以获得干净的电极表面。用N2干燥后，将空白GCE置于5mL质量分数1.0％的HAuCl4溶液中。然后，在-0.2V下进行电沉积金，持续30s，以获得表面覆盖有金的电极(Au-GCE)。
6.检测Dam甲基转移酶的活性：
将MB/dsDNA加入到含有160μM SAM、10U Dpn I、5μL 10×Dam缓冲液(50mM Tris-HCl、10mM EDTA、5mM 2-巯基乙烷)和不同浓度的Dam的反应混合物中，在37℃下放置2h，使dsDNA甲基化并且被切断。接下来，通过磁分离除去上清液。用洗涤缓冲液洗涤后，将30μLCu2O@FePPOPBADE@AuNPs探针水溶液(1mg/mL)与剩余的MB/dsDNA混合1小时，通过Au-S键使Cu2O@FePPOPBADE@AuNPs与MB/dsDNA连接。磁分离后，将10μL上清液转移液到Au-GCE上。干燥后，将电极置于0.1M PBS电解质(5mL,pH 6.5)中在-0.6至0.6V的电压范围内使用差分脉冲伏安法(DPV)扫描。同时，将另外20μL上清液转移到含有100μL 2,4-DP(1mg/mL)、100μL 4-AP(1mg/mL)和1800μL MES缓冲溶液(50mM,pH 6)的比色检测系统中，在55℃下放置一小时后，通过紫外吸收光谱测定510nm处的吸光度，如图2所示。
结果：
Cu2O@FePPOPBADE纳米复合材料的合成过程如图1所示，一方面，通过在Cu2O纳米立方体表面生成卟啉基多孔有机聚合物(FePPOPBADE)，制备了具有核壳结构的Cu2O@FePPOPBAD纳米复合材料。与单纯的Cu2O相比，Cu2O@FePPOPBAD不仅具有更强的DPV响应，而且表现出稳定和协同增强的类漆酶活性，可催化2,4-DP与4-AP的显色反应。利用这些优异的性质，选择Cu2O@FePPOPBADE作为探针，以实现双模式超灵敏对Dam的检测。
另一方面，设计了生物素修饰的单链DNA1和巯基修饰的单链DNA2，两者都具有特异性识别碱基序列5′-G-A-T-C-3′。DNA1和DNA2杂交形成的dsDNA可以通过生物素-链霉亲和素之间的相互作用在链霉亲和素修饰的MB上组装。当Dam存在时，dsDNA的特定序列5′-G-A-T-C-3′可以被Dam特异性识别，进而被甲基化。随后，dsDNA甲基化的部位被Dpn I裂解，导致一些硫醇修饰的DNA2离开磁珠。通过磁分离洗涤除去游离状的DNA2后，将定量的Cu2O@FePPOPBADE@AuNPs探针加入到体系中，通过Au-S键与MB/dsDNA连接。再次磁分离，将上清液中残留的未连接的Cu2O@FePPOPBADE@AuNPs转移到双模分析平台进行检测。随着Dam的增加，更多的dsDNA被甲基化和裂解，从而更多的Cu2O@FePPOPBADE@AuNPs探针被保留在上清液中。因此，构建了“信号增加”的双模式检测，如图2所示。
Cu2O、Cu2O@FePPOPBADE和AuNPs@Cu2O@FePPOPBADE的表征：
从TEM和SEM图(图3A和图3B)可以看出，制备的Cu2O纳米立方体高度均匀、单分散。表面光滑，平均大小约为70nm。粉末x射线衍射(PXRD)研究(图3C)发现，Cu2O纳米立方体分别在73.6°、61.4°、42.3°、36.4°和29.5°处出现衍射峰，与典型立方Cu2O(JCPDS 05-0667)的(311)、(220)、(200)、(111)和(110)晶面匹配良好。以PdCl2(PPh3)2为催化剂，FeTIPP和BADE为构建模块，通过Suzuki偶联反应将卟啉基多孔有机聚合物(FePPOPBADE)包覆在Cu2O纳米立方体的外侧，得到了以Cu2O为芯、聚合物为壳的核壳纳米复合材料(Cu2O@FePPOPBADE)。如图3D所示，Cu2O@FePPOPBADE很好地保持了立方形态，与Cu2O纳米立方体相似。FePPOPBADE镀层厚度约为10nm。与Cu2O纳米立方体相比，纳米材料的表面更加粗糙(图3E)。Cu2O@FePPOPBADE的EDS元素映射图(图3F)显示Cu、C和Fe元素分布在材料上。傅立叶变换红外光谱分析表明，成功制备了核壳纳米结构。如图3A所示，Cu2O@FePPOPBADE的主要振动峰与FePPOPBADE相似。特别是在3260cm-1、1388cm-1和1003cm-1处的峰分别属于N-H、卟啉C＝N和Fe-N。与Cu2O纳米立方体的PXRD相比，Cu2O@FePPOPBADE保留了相同的衍射峰。同时，未观察到额外的衍射峰，这不仅表明Cu2O纳米立方体与FePPOPBADE聚合物成功复合，也表明FePPOPBADE并未破坏Cu2O的晶体结构。
用XPS测定Cu2O@FePPOPBADE样品中Cu的组成和状态。首先进行全谱扫描光谱。如图4B所示，Cu2O@FePPOPBADE中有C1s,O1s,Fe2p和Cu2p，由FePPOPBADE聚合物元素和铜离子组成。在Cu 2p光谱中，在952.5eV和932.6eV处出现两个特征峰，分别归属于Cu+或Cu0的Cu 2p 1/2电子和Cu 2p 3/2电子(图4C)。而Cu2+的Cu 2p 3/2和Cu 2p 1/2电子均未出现峰，说明在制备Cu2O纳米立方体过程中，Cu2+被完全还原。为了进一步了解Cu元素的状态，实现了Cu LMM的俄歇谱(图4D)。在570.2eV处的峰证实了Cu元素的价态为Cu+。先前的研究表明，Cu+中心驱动天然漆蛋白酶的氧化活性。Cu2O@FePPOPBADE的高Cu+含量可以有效模拟天然漆酶中的Cu+活性位点，从而提高漆酶的催化活性。
为了使Cu2O@FePPOPBADE具有与DNA结合的位点,制备了带正电的AuNPs平均大小为15nm(图4E)，通过强大的Au-N键均匀附着在Cu2O@FePPOPBADE的表面(图4F)。同时，AuNPs@Cu2O@FePPOPBADE也保持了Cu2O纳米立方体的立方形态和结晶性质。
Cu2O@FePPOPBADE的类漆酶活性：
如图5B和图5C所示，含有2,4-DP和4-AP的混合溶液无色，并且在510nm处未观察到明显的吸光度值。在2,4-DP和4-AP体系中加入等量的Cu2O@FePPOPBADE或Cu2O纳米立方体后，体系颜色由无色变为紫色，在510nm处观察到明显的吸光度峰值，表明Cu2O@FePPOPBADE和Cu2O纳米立方体均具有类似漆酶的活性。此外，Cu2O@FePPOPBADE的吸光强度明显高于Cu2O纳米立方体，表明Cu2O@FePPOPBADE的催化性能优于Cu2O纳米立方体。
如图5C所示，2,4-DP+4-AP+Cu2O@FePPOPBADE和2,4-DP+4-AP+Cu2O体系在溶液中O2饱和后，吸光度峰均显著增加，说明其氧化反应中O2是电子受体。随后，对Cu2O@FePPOPBADE催化的O2还原产物进行了研究。
Cu2O@FePPOPBADE和2,4-DP的混合物放置1小时。离心分离，上清液与辣根过氧化物酶(HRP)和2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)(ABTS)混合。5分钟后无颜色变化和吸光度变化(图6b)。而加入H2O2后，溶液立即变绿，同时出现414nm处的吸收峰(图6c)。这些实验结果表明Cu2O@FePPOPBADE在催化过程中缺乏活性氧，这意味着Cu2O@FePPOPBADE是一类具有类漆酶活性的纳米酶。
为了进一步评价催化性能，通过调整底物2,4-DP的初始用量，保持其他物质浓度不变，记录510nm处吸光度随时间的变化来测定动力学参数。如图7所示，Cu2O和Cu2O@FePPOPBADE的催化行为符合Michaelis-Menten模型。动力学参数Vmax和Km由双倒数Lineweaver-Burk图得到。已知Km值代表酶与底物的亲和力。Km越小，对底物的亲和力越高。其中Cu2O@FePPOPBADE的Km值为0.39mM，低于Cu2O(0.8mM)和天然漆酶(0.41mM)，说明Cu2O@FePPOPBADE对2,4-DP的亲和性优于Cu2O和天然漆酶。
已知Cu2O因其Cu+离子不稳定而不能在大气中长期暴露。为了测量其稳定性和可持续性，我们重复使用Cu2O@FePPOPBADE和Cu2O纳米立方体催化2,4-DP氧化。如图8A所示，Cu2O@FePPOPBADE重复使用5次，吸光强度无明显变化。然而，2,4-DP+4-AP+Cu2O体系经过两次循环后，其吸收强度下降到70％。此外，当Cu2O@FePPOPBADE和Cu2O纳米立方体在空气中保存20天后，Cu2O@FePPOPBADE的催化活性基本保持不变，而Cu2O纳米立方体仅保持60％左右(图8B)。这些结果清楚地反映出Cu2O@FePPOPBADE具有比Cu2O更高的漆酶活性和可持续性，这不仅是因为Cu2O核与FePPOPBADE壳之间的协同催化作用提高，而且FePPOPBADE壳具有良好的保护作用。有效地避免了Cu2O芯的氧化和聚集。
生物传感器的可行性：
为了研究Cu2O@FePPOPBADE的电化学性能，用DPV测量了Cu2O@FePPOPBADE和Cu2O的电化学信号。在0.1M PBS缓冲液(5mL,pH 6.5)中，扫描电位范围为-0.6～0.6V时，Cu2O和Cu2O@FePPOPBADE对DPV都有明显的响应。如图9A所示，Cu2O@FePPOPBADE的响应明显高于Cu2O。此外，Cu2O@FePPOPBADE和Cu2O的电化学信号在O2饱和后均显著增强，说明O2作为电子受体，促进了电子传递，放大了信号。与Cu2O相比，Cu2O@FePPOPBADE的增加信号更明显。上述结果表明壳层FePPOPBADE对Cu2O信号具有协同增强作用。这可能是因为在Cu2O与FePPOPBDAB复合后，金属卟啉中心的Fe3+可以加速Cu2O中Cu+的氧化，促进Cu2O的电子转移，使其具有更强的氧化还原信号峰。
采用丙烯酰胺凝胶电泳验证DNA杂交和Dam甲基化过程。如图9B所示，条带1和条带2分别对应单链DNA1和单链DNA2。DNA1和DNA2孵育后出现一个新的更高的条带(第3条带)，表明DNA1和DNA2成功杂交形成了dsDNA。当Dpn I或Dam单独存在时，dsDNA条带(第4和第5条带)没有任何变化，这表明没有触发裂解和甲基化事件。相比之下，当Dam和Dpn I同时存在时，dsDNA的条带消失了，在之前条带的下方出现了一个新的条带(第6条带)，说明Dam成功地将dsDNA甲基化，而甲基化后的dsDNA又被Dpn I切割成小片段。
随后记录DPV和吸光度信号强度的变化，以验证所设计的生物传感器策略在不同条件下的可行性。从图9C和图9D可以看出，当Dam和Dpn I存在时，电化学和比色信号强度都显著增加，表明由于甲基化诱导的有效裂解，大量探针滞留在上清液中。然而，在没有Dam或Dpn I的情况下，电化学和比色信号都较弱，表明甲基化诱导的裂解事件没有发生。当Dam和Dpn I都不存在时，也出现了类似的结果，这是由于Dpn I抑制了对探针dsDNA的切割。从以上实验结果可以推断，目前的检测策略是可行的。
优化实验条件：
在检测过程中，PBS电解液或MES缓冲液的pH值是一个重要参数，它不仅影响探针在电解液溶液与电极表面之间的电子传递速率，还影响Cu2O@FePPOPBADE的类漆酶活性。图10A显示PBS电解质溶液在3～7.5范围内，随着pH值的增加，峰值电流的变化。峰值电流从3到6.5略有增加，然后随着pH值的增加有显著降低的趋势。因此，电解液的最适pH为6.5。比色检测方面，随着MES pH值的增加，催化性能从3逐渐上升到6，然后又下降(图10B)。因此，电解液的最佳pH值为6。
为了了解反应温度的影响，催化反应在25～75℃的范围下进行。由图10C可知，随着温度的升高，Cu2O@FePPOPBADE的相对活性由～10％上升到100％，然后逐渐下降到60％。所以，体系的最适温度为55℃，与天然漆酶的最适温度相近。然而，当反应体系温度进一步升高(75℃时为25％)，天然漆酶的活性明显下降。显然，Cu2O@FePPOPBADE作为纳米酶在耐温方面具有更好的优势。
考察了在最佳pH和温度以上条件下体系的反应时间。如图10D显示，吸光度值随着反应时间从5到90分钟显著增强，但当达到60分钟以后上升速度变得缓慢。为了保证足够的反应和节约实验时间，60分钟被选为实际的反应时间。
检测灵敏度：
如图11A所示，Cu2O@FePPOPBADE的峰值电流随着Dam浓度的升高而逐渐升高。这是因为更多的Dam会导致更多的DNA底物被甲基化，然后被Dpn I裂解，从而导致更多的探针在上清液中释放。电化学信号与Dam浓度的对数在0.005～100U/mL之间呈良好的线性关系(图11B)。回归方程为ΔI＝0.37+0.07lg C(R2＝0.9928)，LOD为0.0009U/mL(S/N＝3)。
随着Dam从0.005U/mL上升到100U/mL，特征峰的吸光度增加(图11C)。校正曲线拟合回归方程为ΔA＝0.43+0.09lg C，相关指数为0.9974,LOD为0.0014U/mL(图11D)。由于Cu2O@FePPOPBADE具有良好的电化学活性和漆酶样活性，本实施例的生物传感器的检出限较低，检测范围较宽，灵敏度分别比现有传感器的电化学和比色法高出至少3倍。
生物传感器的检测选择性、可重复性以及稳定性：
以甲基转移酶M.SssI、HhaI、蛋白质BSA、PSA和MUC1为干扰物，进行选择性实验，评价所提出的生物传感器的抗干扰能力。结果表明，有Dam的体系的电化学和比色信号都明显强于有M.SssI等干扰的体系(图12A和图12B)，这清楚地证明了所提出的生物传感器对Dam具有良好的选择性。之所以能有如此出色的抗干扰能力，可能是因为Dam对BSA、M.SssI等干扰物质的展现出了特殊的功能，而M.SssI和BSA在本研究中不具有对底物的特定位点进行识别和甲基化的功能。
此外，还对所设计的生物传感器的重复性和稳定性进行了考察。为了重现性，1UmL-1Dam样品通过5个单独试验进行分析。5组样品的电化学和比色信号相似，相对标准偏差(RSD)分别为2.19％和1.76％，重现性良好。同时，将构建的电极放置在冰箱(4℃)中，考察其稳定性。在14天内，每隔两天记录一次电化学信号。如图13所示，即使存储14天，信号变化可以忽略不计，峰值电流仍然保持在94.9％，表明所提出的生物传感器具有良好的长期稳定性。
Dam活性抑制性实验：
该实验采用5-氟尿嘧啶作为模型判断生物传感器在抑制剂筛选中的可用性。研究表明，5-氟尿嘧啶可阻断甲基的转移，导致dsDNA识别和裂解失败。因此，在5-氟尿嘧啶的抑制下，信号强度将会很弱。测定了不同含量的5-氟尿嘧啶对Dam信号的影响。在图12C和图12D中，随着5-氟尿嘧啶浓度的增加，系统的信号强度明显降低，表现出明显的剂量依赖性抑制。计算出酶活性降至50％时的IC50值为12.07μM(EC)和11.28μM(CL)。这些结果清楚地表明生物传感器在筛选Dam抑制剂方面有很大的潜力。
真实样品中检测：
为了验证该策略对真实生物样本分析的实际适用性，将一定浓度的Dam注入人血清进行恢复实验。结果表明，该生物传感器对EC和CL的回收率分别在98.9％～101.1％和95.4％～101.3％之间，相对标准偏差(RSD)均小于5％(表S3)，表明该生物传感器在复杂真实样品的定量检测中具有巨大的潜力。
综上所述，通过在Cu2O纳米材料表面涂覆FePPOPBADE，成功制备了有机-无机纳米复合材料(Cu2O@FePPOPBADE)，并利用该复合材料构建了用于Dam敏感检测的双模态生物传感器。与以往的方法相比，该策略有以下几个优点:(1)Cu2O@FePPOPBADE在电化学方面具有出色的DPV信号，无需氧化还原介质，在FePPOPBADE外壳的保护作用下具有良好的稳定性。(2)Cu2O@FePPOPBADE具有优越的协同增效漆酶样催化作用，这源于Cu2O的漆酶样活性和卟啉氧化铁的催化活性，随着O2的还原，能催化产生明显增强的比色信号。(3)与传统的电化学或比色传感器相比，构建的响应信号和传输机制独立的双模生物传感器保证了结果的准确性和可靠性。由于这些突出的优点，所提出的生物传感器在Dam检测中表现出突出的性能，检测限分别为0.0009U/mL(ECL)和0.0014U/mL(CL)，范围从0.005到100U/mL。这项工作不仅首次使用了Dam可靠、灵敏的双模平台，而且展示了将多功能有机-无机杂化纳米复合材料应用于临床诊断的创新灵感。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
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<110> 潍坊学院
<120> 双模式生物传感器及其在DNA甲基转移酶活性检测中的应用
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tctccttgat ctcgtaaaaa aaaaaaaaaa aaaaa 35
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acgagatcaa ggagaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaa 35
Claims (10)
1.一种信号探针，其特征是，由Cu2O纳米材料、多孔有机聚合物及金纳米颗粒构成，所述多孔有机聚合物包覆Cu2O纳米材料，所述金纳米颗粒附着在多孔有机聚合物的表面，所述多孔有机聚合物以苯环作为连接基团将铁卟啉连接形成。
2.如权利要求1所述的信号探针，其特征是，所述Cu2O纳米材料为Cu2O纳米立方体；
优选地，Cu2O纳米立方体的制备过程为：将铜盐加入至柠檬酸三钠的水溶液中混合均匀，然后加入碱金属的氢氧化物溶液，再加入还原剂还原后获得。
多孔有机聚合物包覆Cu2O纳米材料的过程为：将Cu2O纳米材料分散至溶剂中，加入Fe(III)Cl-5,10,15,20-四(4-碘苯基)卟啉和1,4-苯二硼酸频那醇酯进行铃木反应，即得。
3.如权利要求1所述的信号探针，其特征是，信号探针的制备过程为：将多孔有机聚合物包覆Cu2O纳米材料获得Cu2O@FePPOPBADE，将Cu2O@FePPOPBADE分散后加入带正电荷的金纳米颗粒分散液，混合均匀后即得；优选地，混合均匀后进行离心分离、洗涤、真空冷冻干燥。
4.一种双模式生物传感器，其特征是，包括捕集探针和权利要求1～3任一所述的信号探针；
所述捕集探针，由磁珠、双链DNA构成，所述双链DNA由DNA1和DNA2杂交构成，DNA1与磁珠连接，DNA2的设置巯基，所述双链DNA能够被DNA甲基转移酶甲基化。
5.如权利要求4所述的双模式生物传感器，其特征是，DNA1与磁珠通过生物素和链霉亲和素连接。
6.如权利要求4所述的双模式生物传感器，其特征是，所述双链DNA中能够能够被DNA甲基转移酶特异性识别的序列为5′-G-A-T-C-3′。
7.一种权利要求4～6任一所述的双模式生物传感器在其在DNA甲基转移酶活性检测中的应用。
8.一种DNA甲基转移酶活性的检测试剂盒，其特征是，包括权利要求4～6任一所述的双模式生物传感器、S-腺苷-L-蛋氨酸、缓冲液和Dpn I酶。
9.如权利要求8所述的DNA甲基转移酶活性的检测试剂盒，其特征是，所述缓冲液包括Dam缓冲液、PBS缓冲液、MES缓冲溶液中的一种或多种；
或，包括2,4-二氯苯酚和4-氨基安替比林。
10.一种权利要求4～6任一所述的双模式生物传感器在筛选Dam抑制剂中的应用。
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| Publication number | Publication date |
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| CN114965618B (zh) | 2023-10-17 |
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