CN114965263A - 一种集成式qpcr荧光检测系统及方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种集成式QPCR荧光检测系统及方法，包括固定支撑板和安装设置在固定支撑板上的荧光检测组件以及复合位移驱动结构，通过加入复合位移驱动结构为荧光检测组件提供必要的移动自由度，使荧光检测组件能够根据检测需要直接移动至对应的样品孔位置而无需将样品取出文库制备仪，配合光纤传输结构的光路设计，使荧光检测所需要的各功能模块可以较自由的布局，合理使用文库制备仪有限的内部空间，同时也确保光路传输效果不会受到荧光检测组件位移影响。

Description

一种集成式QPCR荧光检测系统及方法

技术领域

本发明涉及基因测序荧光检测技术领域，尤其涉及一种集成式QPCR荧光检测系统及方法。

背景技术

实时荧光定量PCR(QPCR：Quantitative polymerase chain reaction)仪具有特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、全封闭反应等优点，在生物和医学等相关领域得到广泛应用。定量PCR荧光检测系统技术：荧光染料和荧光探针通过与目标基因特异性结合，释放出荧光信号，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线和特定的数学原理对未知样品进行定量分析的方法。

现有NGS文库制备方法，核酸经过抽提设备、超声打断设备、建库仪和捕获等各操作后，均需通过人工操作将样品从相关设备转移到独立的QPCR仪进行定量和质检。独立设置的QPCR仪能够实现较好的光路稳定性和检测性能，但是在样品从文库制备仪移动到QPCR仪过程中，由于测试人员的频繁介入，容易造成样品发生交叉污染，影响测试结果的准确性，对测试环境要求高，样品检测效率低。同时，出于对实验质量的控制要求，需要在文库制备的各阶段分别对样品进行荧光检测，使用独立设置的QPCR仪不可避免的会打断文库制备过程的连续性，降低了文库制备整体效率。

发明内容

为解决现有技术的不足，本发明提出一种集成式QPCR荧光检测系统及方法，通过加入复合位移驱动结构为荧光检测组件提供必要的移动自由度，使荧光检测组件能够根据检测需要直接移动至对应的样品孔位置而无需将样品取出文库制备仪，配合光纤传输结构的光路设计，使荧光检测所需要的各功能模块可以较自由的布局，合理使用文库制备仪有限的内部空间，同时也确保光路传输效果不会受到荧光检测组件位移影响。

为实现以上目的，本发明所采用的技术方案包括：

一种集成式QPCR荧光检测系统，其特征在于，包括固定支撑板和安装设置在固定支撑板上的荧光检测组件以及复合位移驱动结构；

所述固定支撑板固定设置在文库制备仪内；

所述荧光检测组件包括由光纤光路联通的激发光源装置、参考光强监测装置、样品检测室和荧光检测模块；

所述复合位移驱动结构驱动所述样品检测室进行相对固定支撑板的位移并接近/远离待检测样品孔位置的PCR管。

进一步地，所述复合位移驱动结构包括独立工作的垂直位移驱动模块；

所述垂直位移驱动模块包括第一电机和垂直升降支架；

所述样品检测室固定安装在所述垂直升降支架上并通过所述第一电机旋转驱动与所述垂直升降支架同步进行垂直位移。

进一步地，所述复合位移驱动结构还包括独立工作的选位位移驱动模块；

所述选位位移驱动模块包括第二电机和选位支架；

所述样品检测室固定安装在所述垂直升降支架上并通过所述第一电机旋转驱动与所述垂直升降支架同步进行垂直位移，所述第一电机和垂直升降支架安装在所述选位支架上并通过所述第二电机旋转驱动与所述选位支架同步进行选位位移，或，所述样品检测室固定安装在所述选位支架上并通过所述第二电机旋转驱动与所述选位支架同步进行选位位移，所述第二电机和选位支架以及安装在所述选位支架上的样品检测室均安装在所述垂直升降支架上并通过所述第一电机旋转驱动与所述垂直升降支架同步进行垂直位移。

进一步地，所述选位位移包括具有固定中心轴的旋转位移、水平前后纵深位移、水平左右位移的其中一种。

进一步地，所述第一电机和所述垂直升降支架之间的驱动连接以及所述第二电机和所述选位支架之间的驱动连接相互独立的选自直齿轮传动、斜齿轮传动、锥齿轮传动、螺杆传动、同轴传动、摩擦传动、带传动和链传动所组成的驱动连接组中的任意一种。

进一步地，所述样品检测室的开口腔体形状匹配所述PCR管下部形状，所述复合位移驱动结构驱动所述样品检测室垂直上升使所述PCR管下部插入所述样品检测室的开口腔体并进入光纤光路的有效光线传输位置。

进一步地，所述光纤光路包括相互独立的参考光强检测光路和样品检测光路；所述参考光强检测光路包括由光纤光路依次联通的激发光源装置和参考光强监测装置；所述样品检测光路包括由光纤光路依次联通的激发光源装置、样品检测室和荧光检测模块。

进一步地，所述相互独立的参考光强检测光路和样品检测光路通过Y形光纤分离；所述Y形光纤的公共端连接所述激发光源装置，所述Y形光纤的第一分离端连接参考光强监测装置，所述Y形光纤的第二分离端连接样品检测室。

进一步地，所述激发光源装置包括带有透镜和第一滤光片的LED光源或激光光源；所述参考光强监测装置包括第一光电二极管；所述样品检测室包括激发光入射端和荧光出射端；所述荧光检测模块包括第二滤光片和光电探测器。

进一步地，所述激发光入射端和荧光出射端之间的夹角小于等于90°。

本发明还涉及一种集成式QPCR荧光检测方法，其特征在于，使用如上所述的系统在文库制备仪内部随文库制备过程在文库制备实验所在卡盒上同步进行样品荧光检测。

进一步地，所述方法包括：

将文库制备过程中核酸抽提、打断、建库和捕获步骤所得样品分别转移至卡盒上的待检测样品孔位置的PCR管内；

通过复合位移驱动结构驱动样品检测室进行选位位移至需要进行检测的待检测样品孔位置，再驱动样品检测室进行垂直向上位移至PCR管下部插入样品检测室的开口腔体；

对PCR管内样品进行荧光检测；

检测完成后，通过复合位移驱动结构驱动样品检测室进行垂直向下位移脱离PCR管；

通过复合位移驱动结构驱动样品检测室进行选位位移至另一需要进行检测的待检测样品孔位置，重复荧光检测步骤。

进一步地，所述对PCR管内样品进行荧光检测包括使用独立的参考光强检测光路对激发光强度进行监测。

本发明的有益效果为：

采用本发明所述集成式QPCR荧光检测系统及方法，复合位移驱动结构驱动样品检测室进行需要的位移，自行匹配至待检测的PCR管所在位置，对基因测序前样本文库制备的各阶段样本进行自动化定量检测和质检，无须测试人员参与，有效减少交叉污染产生，提升样本测试效率及测试结果的准确性；使用光纤作为不同模块之间的光传输介质，由于光纤具有柔软、可绕曲等优点，使不同模块之间的空间布局不受限制，便于产品进行模块化设计，能够有效利用文库制备仪有限的内部空间。

附图说明

图1为本发明集成式QPCR荧光检测系统第一实施例结构示意图。

图2为本发明集成式QPCR荧光检测系统第一实施例配合文库制备卡盒示意图。

图3为本发明集成式QPCR荧光检测系统的光纤光路连接示意图。

图4为本发明集成式QPCR荧光检测系统第二实施例配合文库制备卡盒示意图。

图5为本发明集成式QPCR荧光检测系统第三实施例配合文库制备卡盒示意图。

附图编号说明：1-固定支撑板、211-激光光源、212-透镜、213-第一滤光片、22-参考光强监测装置、23-样品检测室、231-激发光入射端、232-荧光出射端、241-第二滤光片、242-光电探测器、251-参考光强检测光路、252-样品检测光路、253-Y形光纤、31-第一电机、32-垂直升降支架、33-第二电机、34-选位支架、4-卡盒、41-样品孔、42-PCR管。

具体实施方式

为了更清楚的理解本发明的内容，将结合附图和实施例详细说明。

现有的QPCR荧光检测属于基因检测过程中的一个完全独立的步骤，一般需要对样本完成扩增后再对最终产物进行检测，很难实现在文库制备的抽提、打断、建库及捕获各阶段分别对中间产物进行荧光检测，特别是多次取样会打断文库制备过程连续性并破坏文库制备仪密封状态，容易造成样本污染降低检测准确性。

造成这种问题的一个主要原因是现有的QPCR荧光检测装置需要配备较复杂的固定光路，为了保证光路稳定性，需要尽可能减少光路组件移动特别是多向移动，因此通常选择将PCR管置于荧光检测装置指定位置进行检测。另一方面，现有的荧光检测装置为单独设置，因此一般具有较大的体积。

本发明为了解决上述问题，提出将QPCR荧光检测系统整体集成在文库制备仪内部的解决方案。为了实现这一目的，本发明具体采用了使用光纤光路联通的荧光检测组件以及用以提供荧光检测所需位置变换能力的复合位移驱动结构，能够在文库制备仪内部有限空间内提供多样本的自动化荧光检测功能。

如图1所示为本发明集成式QPCR荧光检测系统第一实施例示意图，主要包括有固定支撑板1和分别设置安装在固定支撑板1上的荧光检测组件以及复合位移驱动结构。其中，图1主要示出了一种优选的复合位移驱动结构组成，主要包括垂直位移模块和选位位移模块，两个模块之间可以相对独立进行位移移动，但同时作用于样品检测室23并使样品检测室23能够相对固定支撑板1执行包括有垂直方向和选位方向的复合位移。对于较为简单的应用环境，可以将复合位移驱动结构简化为只包括垂直位移模块，只提供样品检测室23在垂直方向上的位移实现系统功能。在第一实施例中，选位位移采用具有固定中心轴的旋转位移方式，样品检测室23固定安装在垂直升降支架32上，同时垂直升降支架32连接于选位支架34，使选位位移(第一实施例中为旋转位移)具有较高的执行级别，当进行选位方向移动时将会带动垂直升降支架32和样品检测室23同步进行位移，但垂直方向位移并不会影响选位支架34。垂直升降支架32和选位支架34分别由第一电机31和第二电机33各自独立的进行驱动，因此容易想到的，垂直方向位移与选位位移之间的执行级别改变并不会对样品检测室23的位移功能造成影响，根据需要也可以选择使用样品检测室23固定安装在选位支架34上，同时将选位支架34连接于垂直升降支架32上的解决方案，使系统进行垂直方向移动时带动选位支架34和样品检测室23同步进行位移。

上述垂直方向位移以及选位方向位移主要作用在于实现样品检测室23依据检测需求接近、远离待检测的PCR管。优选的，样品检测室23为顶部具有开口腔体的造型，该开口腔体形状能够匹配PCR管下部形状，例如圆锥形或根据仪器空间结构自行设计定制的任意适合形状。当样品检测室23通过选位位移移动至正对PCR管正下方时，再通过垂直上升位移即可贴合PCR管，使样品检测室23上连接的激发光入射端231与荧光出射端232可以有效作用于PCR管内样品，联通光路。检测结束后，样品检测室23通过垂直下降位移脱离当前PCR管，并可根据需要通过选位位移移动至另一待检测PCR管正下方，重复检测步骤，从而实现自动化检测。

如图2所示为第一实施例配合文库制备卡盒示意图，在第一实施例中，样品检测室23的选位位移采用固定中心轴旋转运动，可以匹配以固定半径圆弧形式排列的多根PCR管42。优选的，如图2所示，荧光检测所涉及的PCR管42集中设置在卡盒4一侧，使荧光检测尽可能不干扰样品孔41的正常实验操作，也能减小样品检测室23的位移幅度；PCR管42的数量不受限制，对应于文库制备过程，可以优选的设置多个PCR管42分别用于检测核酸抽提、超声打断(cfDNA无需此步骤)、建库和捕获操作步骤所得中间产物以及独立的PCR管42用于标定。

荧光检测组件中的各部分由光纤构建光路联通，使部件可以进行较自由的安排设置，，同时可以采用适合长度的光纤连接为样品检测室23的位移活动预留余量。除样品检测室23需要对应PCR管42设置外，其他部分可以依据文库制备仪内部空间灵活布置，例如可以集中布置在固定支撑板1上，或分别设置在文库制备仪内部。荧光检测组件的光纤光路连接如图3所示，包括由激光光源211(或依据需要采用LED光源)、透镜212、第一滤光片213组成的激发光源装置，参考光强监测装置22(例如光电二极管)，容纳了PCR管42的样品检测室23(图3中为清晰表示省略了样品检测室23，以PCR管42代替展示)，以及由第二滤光片241和光电探测器242(例如光电二极管或光电倍增管)组成的荧光检测模块。其中，激发光源装置和参考光强监测装置22经光纤联通组成了参考光强检测光路251，激发光源装置、样品检测室23和荧光检测模块经光纤联通组成了样品检测光路252，参考光强检测光路251与样品检测光路252通过Y形光纤253区分连接，使两个光路之间互相不影响。

优选的，光路所使用的光纤材质为玻璃光纤或塑料光纤，光纤的纤芯直径范围为1mm至2mm，光纤的数值孔径范围0.54至0.64；样品检测室23的激发光入射端231和荧光出射端232之间的夹角小于等于90°。使用中，激光光源211(或LED光源)发出的光，通过透镜212(或透镜组)，进入第一滤光片213滤光后形成所需的激发光，从Y形光纤253公共端进入后分成两束光，其中一束光从Y形光纤253的第一分离端出射，然后入射经样品检测室23的激发光入射端231至PCR反应管的待测样本，在激发光的照射下荧光基团和待测样本中的核酸结合发光，荧光经样品检测室23的荧光出射端232进入光纤后，入射至第二滤光片241后透过对应波长的发射光，进入光电探测器242；另一束光从Y形光纤253的第二分离端出射，进入参考光强检测装置，起到监测光源变化的作用。

图4和图5分别给出了本发明的第二实施例和第三实施例的简易俯视视图，区别于第一实施例，第二实施例和第三实施例采用了直线选位位移方式，根据所使用卡盒4排列方式的不同，可以采用如螺杆或丝杠等直线位移传动方式将第二电机33旋转驱动转化为选位支架34和样品检测室23的直线位移，且该直线位移沿卡盒4上PCR管42的排列方向进行。由此可知，本发明所提出的选位位移是指在水平面上(俯视投影面上)实现样品检测室23与PCR管42位置对应的位移，并不限制于任一方向的位移本身。

以上所述仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换等都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书的保护范围为准。

Claims (13)

1.一种集成式QPCR荧光检测系统，其特征在于，包括固定支撑板和安装设置在固定支撑板上的荧光检测组件以及复合位移驱动结构；

所述固定支撑板固定设置在文库制备仪内；

所述荧光检测组件包括由光纤光路联通的激发光源装置、参考光强监测装置、样品检测室和荧光检测模块；

所述复合位移驱动结构驱动所述样品检测室进行相对固定支撑板的位移并接近/远离待检测样品孔位置的PCR管。

2.如权利要求1所述的系统，其特征在于，所述复合位移驱动结构包括独立工作的垂直位移驱动模块；

所述垂直位移驱动模块包括第一电机和垂直升降支架；

所述样品检测室固定安装在所述垂直升降支架上并通过所述第一电机旋转驱动与所述垂直升降支架同步进行垂直位移。

3.如权利要求1所述的系统，其特征在于，所述复合位移驱动结构还包括独立工作的选位位移驱动模块；

所述选位位移驱动模块包括第二电机和选位支架；

所述样品检测室固定安装在所述垂直升降支架上并通过所述第一电机旋转驱动与所述垂直升降支架同步进行垂直位移，所述第一电机和垂直升降支架安装在所述选位支架上并通过所述第二电机旋转驱动与所述选位支架同步进行选位位移，或，所述样品检测室固定安装在所述选位支架上并通过所述第二电机旋转驱动与所述选位支架同步进行选位位移，所述第二电机和选位支架以及安装在所述选位支架上的样品检测室均安装在所述垂直升降支架上并通过所述第一电机旋转驱动与所述垂直升降支架同步进行垂直位移。

4.如权利要求3所述的系统，其特征在于，所述选位位移包括具有固定中心轴的旋转位移、水平前后纵深位移、水平左右位移的其中一种。

5.如权利要求3所述的系统，其特征在于，所述第一电机和所述垂直升降支架之间的驱动连接以及所述第二电机和所述选位支架之间的驱动连接相互独立的选自直齿轮传动、斜齿轮传动、锥齿轮传动、螺杆传动、同轴传动、摩擦传动、带传动和链传动所组成的驱动连接组中的任意一种。

6.如权利要求1所述的系统，其特征在于，所述样品检测室的开口腔体形状匹配所述PCR管下部形状，所述复合位移驱动结构驱动所述样品检测室垂直上升使所述PCR管下部插入所述样品检测室的开口腔体并进入光纤光路的有效光线传输位置。

7.如权利要求6所述的系统，其特征在于，所述光纤光路包括相互独立的参考光强检测光路和样品检测光路；所述参考光强检测光路包括由光纤光路依次联通的激发光源装置和参考光强监测装置；所述样品检测光路包括由光纤光路依次联通的激发光源装置、样品检测室和荧光检测模块。

8.如权利要求7所述的系统，其特征在于，所述相互独立的参考光强检测光路和样品检测光路通过Y形光纤分离；所述Y形光纤的公共端连接所述激发光源装置，所述Y形光纤的第一分离端连接参考光强监测装置，所述Y形光纤的第二分离端连接样品检测室。

9.如权利要求1至8任一项所述的系统，其特征在于，所述激发光源装置包括带有透镜和第一滤光片的LED光源或激光光源；所述参考光强监测装置包括第一光电二极管；所述样品检测室包括激发光入射端和荧光出射端；所述荧光检测模块包括第二滤光片和光电探测器。

10.如权利要求9所述的系统，其特征在于，所述激发光入射端和荧光出射端之间的夹角小于等于90°。

11.一种集成式QPCR荧光检测方法，其特征在于，使用如权利要求1至10任一项所述的系统在文库制备仪内部随文库制备过程在文库制备实验所在卡盒上同步进行样品荧光检测。

12.如权利要求11所述的方法，其特征在于，包括：

将文库制备过程中核酸抽提、打断、建库和捕获步骤所得样品分别转移至卡盒上的待检测样品孔位置的PCR管内；

通过复合位移驱动结构驱动样品检测室进行选位位移至需要进行检测的待检测样品孔位置，再驱动样品检测室进行垂直向上位移至PCR管下部插入样品检测室的开口腔体；

对PCR管内样品进行荧光检测；

检测完成后，通过复合位移驱动结构驱动样品检测室进行垂直向下位移脱离PCR管；

通过复合位移驱动结构驱动样品检测室进行选位位移至另一需要进行检测的待检测样品孔位置，重复荧光检测步骤。

13.如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述对PCR管内样品进行荧光检测包括使用独立的参考光强检测光路对激发光强度进行监测。

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