CN114948923A - 奥替溴铵及其盐在制备治疗周围神经病变以及肺纤维化药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了奥替溴铵或其药学上可接受的盐在制备治疗周围神经病变以及肺纤维化药物中的应用。本发明通过大量实验筛选表明，奥替溴铵及其药学上可接受的盐能够明显改善糖尿病鼠的神经传导速度和感觉缺失症状，从而达到治疗糖尿病周围神经病变的效果。奥替溴铵及其药学上可接受的盐还能够明显改善紫杉醇引起的轴突生长抑制，缓解紫杉醇诱导小鼠痛觉敏感和血流缺失情况，从而具有治疗化疗药物引起的外周神经病变的作用。此外，奥替溴铵及其药学上可接受的盐对博来霉素诱导的小鼠肺部纤维化组织具有一定的保护作用，从而在纤维化疾病治疗上也具有很好的应用前景。

Description

奥替溴铵及其盐在制备治疗周围神经病变以及肺纤维化药物 中的应用

技术领域

本发明涉及药物技术领域，具体涉及奥替溴铵及其药物组合物在制备周围神经病变以及肺纤维化药物中的应用。

背景技术

糖尿病周围神经病变(Diabetic peripheral neuropathy，DPN)是1型和2型糖尿病最常见的并发症，超过一半的糖尿病患者会发生糖尿病外周神经病变，导致身体功能受损，降低糖尿病患者生活质量。它是一种主要的感觉神经病变，常累及自主神经系统，临床呈对称性疼痛和感觉异常，下肢症状较上肢多见。感觉异常有麻木、蚁走、虫爬、发热、触电样感觉，往往从远端脚趾上行可达膝上。

DPN首先累及感觉神经元，主要病理变化是轴突萎缩变性甚至消失、髓鞘节段性或弥散性皱缩或脱髓鞘以及髓鞘再生引起郎飞结结间长度改变。在DPN中以神经纤维的缺失为主并主要发生于缺血部位。目前大量的腓神经活检和尸检发现临床表现为远端对称性多发神经病变的糖尿病患者在原发性施旺细胞异常的基础上还存在节段性脱髓鞘，此病理改变多见于腓肠神经、胫神经、正中神经等有髓大神经，可引起郎飞结间距缩短，神经传导速度减慢，出现感觉减退、乏力等症状。故认为可通过保护和促进感觉神经元突起生长来起到抗糖尿病周围神经病变的治疗效果。

DPN的治疗给卫生系统和社会造成了巨大的财政负担，在美国，每年需要花费12.42亿到36.99亿美元用来治疗DPN。并且，目前在临床上治疗糖尿病周围神经病变的药物只能减缓患者的病症，并不能完全减轻病人神经性疼痛和阻断糖尿病周围神经病变的进程，因此对能够阻断糖尿病周围神经病变病理进程的新型抗糖尿病周围神经病变药物的发现有着迫切的需求。

紫杉醇引起的周围神经病变(Paclitaxel inducedperipheral neuropathy,PIPN)发病率极高，首次使用后疼痛发生率为30％-50％，第二次使用后的发生率增加至50％以上。PIPN病人差异很大，典型的症状包括麻木、无力和步态异常以及感觉异常疼痛。其临床症状通常表现为双侧对称的远端感觉神经异常，如呈“袜子与手套分布”的刺痛、麻木、灼痛及冷痛等。严重的患者还会出现运动神经的损伤，表现为步态不稳及精细动作困难等。PIPN病理症状通常表现为表皮内神经纤维的丢失、神经血管功能异常和髓鞘损伤。

因其发生机制尚未明确，限制了当前抗PIPN药物的研发。目前研究认为紫杉醇引起的轴突损伤、线粒体功能障碍、神经炎症、离子通道改变、药物转运蛋白活性改变及CYP2J酶活改变是其引发周围神经病变的主要因素。目前暂无有效治疗PIPN的药物，临床上主要通过减少化疗药物剂量或更改肿瘤患者治疗方案以减弱PIPN的发生；其次通过辅助药物，如局部镇痛药、血清素去甲肾上腺素再摄取抑制剂度洛西汀，三环类抗抑郁药阿米替林及抗惊厥药加巴喷丁等改善PIPN的神经异常性疼痛。但以上治疗方式副作用大，无法真正改善PIPN。因此，寻找有效治疗PIPN的药物具有重要的实用价值和现实意义。

肺纤维化(Pulmonary fibrosis，PF)是以成纤维细胞增殖及大量细胞外基质聚集并伴炎症损伤、组织结构破坏为特征的一大类肺疾病。患者表现为呼吸困难和肺功能持续下降。其发病机制至今尚不明确。肺纤维化病情进展快，预后较差，中位生存时间为3～5年，其发病率呈上升趋势。已知的临床观察也证明，新冠恢复期患者肺部病灶吸收后会留有不同程度的肺间质纤维化。对于肺纤维化的治疗，目前普遍采用糖皮质激素、抗酸制剂及免疫抑制剂进行治疗，但疗效欠佳。因此，积极探索肺纤维化的发病机制及研发新的干预药物，以期为患者肺纤维化的逆转、肺功能的改善、生活质量的提高及寿命的延长提供帮助就显得十分重要。

奥替溴铵(Otilonium Bromide)，其结构式为：

奥替溴铵是一种铵盐，具有抗毒蕈碱活性，临床上用来解痉。奥替溴铵片主要用于治疗肠道易激综合征，结肠痉挛，胃肠炎、胃、十二指肠及食道疾病，内窥镜检查准备(食道镜、胃镜、十二指肠镜及直肠镜)。目前报道奥替溴铵可以治疗金黄色葡萄球菌感染，以及改善大鼠癫痫行为活动，对于其保护周围神经系统中感觉神经元从而起到抗糖尿病周围神经病变，抗化疗药物紫杉醇引发的外周神经病变以及抗肺纤维化的作用未见报道。

发明内容

本发明的目的是开发奥替溴铵及其药学上可接受的盐新的医药用途。即奥替溴铵或其药学上可接受的盐在制备用于治疗与外周神经元轴突损伤、外周神经病变，及肺纤维化药物中的应用。

作为更加优选，奥替溴铵及其药学上可接受的盐在制备用于治疗糖尿病、化疗、病毒等引起的周围神经病变及肺纤维化药物中的应用。

本发明的另一个目的是提供一种药物组合物在制备用于治疗糖尿病周围神经病变、化疗药物引起的外周神经病变以及肺纤维化药物中的应用，所述药物组合物包含奥替溴铵或其药学上可接受的盐及药学上可接受的辅料。

作为更加优选，所述药学上可接受的盐，包括无机酸盐或有机酸盐，例如苹果酸盐、柠檬酸盐、磺酸盐等。

有益效果：本发明通过大量实验筛选，发现奥替溴铵的新的作用机制和药效，实验结果显示奥替溴铵具有很好的保护外周感觉神经元的作用。如奥替溴铵及其药学上可接受的盐能够明显改善糖尿病鼠的神经传导速度和感觉缺失症状，从而达到治疗糖尿病周围神经病变的效果，奥替溴铵及其药学上可接受的盐还能够明显改善紫杉醇引起的轴突生长抑制，缓解紫杉醇诱导小鼠痛觉敏感和血流缺失情况，从而具有治疗化疗药物引起的外周神经病变的作用，显示出了双向调节作用。并且实验结果显示奥替溴铵对肺纤维化疾病也具有一定的治疗作用。

附图说明

图1为奥替溴铵(Otilonium Bromide)能够明显促进外周感觉神经元突起生长的免疫荧光图。

图2为奥替溴铵(Otilonium Bromide)能够明显促进外周感觉神经元突起生长的定量柱状图。^*p<0.05，^**p<0.01，^***p<0.001代表奥替溴铵给药组与正常组相比。统计采用T-test检验和One-way ANOVO检验。

图3为奥替溴铵(Otilonium Bromide)能够明显改善糖尿病小鼠痛觉阈值和运动神经传导速度。

图4为奥替溴铵能够缓解化疗药物紫杉醇引起的机械痛、热痛、冷痛敏感，改善外周神经病变。

图5为奥替溴铵(Otilonium Bromide)能够明显改善小鼠肺纤维化程度的CT图片。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述，但这些实施例不应解释为限制本发明。

实施例1：奥替溴铵促进外周感觉神经元突起的生长

本发明在糖尿病外周感觉神经元DRG(Dorsal root ganglion)中检测奥替溴铵促进外周感觉神经元突起生长的作用，实验结果表明，奥替溴铵具有明显保护糖尿病造成的外周感觉神经元突起生长抑制的作用。

1.实验原理

本实验基于糖尿病周围神经病变首先累及感觉神经元，且主要的病理变化是轴突萎缩变性，甚至消失，而DRG作为外周感觉神经元，它的突起生长状态和糖尿病周围神经病变的发展过程密切相关。本发明将正常组、糖尿病组、糖尿病给与2.5mg/kg或5mg/kg奥替溴铵组小鼠原代DRG提取出来，培养一段时间后，通过免疫细胞荧光法测定细胞突起的生长，并用Neuro J定量突触长度，以此评价奥替溴铵对外周感觉神经元突触生长的促进作用。

2.实验材料与方法

用于荧光染色的β-tubulin III一抗购于Sigma公司，细胞培养试剂均购于Gibco公司，DRG细胞取自C57BL/6J小鼠。具体实验步骤：DRG细胞以1000个/孔接种于12孔板中待DRG细胞过夜贴壁12h后，移去原有培养基，每孔加入4％多聚甲醛固定15min，0.3％Triton透化5min，PBS洗涤后室温封闭1h，一抗(1:1000)4℃过夜，山羊抗鼠荧光二抗(1:200)室温避光孵育1h。最后在荧光显微镜下观察成像。

3.实验结果

结果如图1所示，奥替溴铵能够促进外周感觉神经元突起的生长(荧光图)。如图2所示，奥替溴铵能够浓度依赖性促进外周感觉神经元突起的生长(定量图)，表明奥替溴铵具有明显的浓度依赖性的促进外周感觉神经元突起生长的作用。

实施例2：奥替溴铵改善糖尿病周围神经病变的运动神经传导速度以及感觉缺失实验

本发明在STZ诱导的1型糖尿病小鼠身上检测奥替溴铵对糖尿病周围神经病变的运动神经传导速度及痛觉响应的影响。实验表明，奥替溴铵具有明显的改善糖尿病周围神经病变的运动神经传导速度以及感觉缺失的作用。

1.实验原理

本实验基于糖尿病周围神经病变患者会出现神经传导速度减慢，感觉减退、乏力等症状，在糖尿病周围神经病变模型小鼠身上检测其运动神经传导速度、机械痛阈值以及热痛觉反应时间等行为学指标，以此来评估奥替溴铵对周围神经病变个体行为学水平上的改善作用。

2.实验材料与方法

1)动物分组给药情况

1型糖尿病小鼠：雄性8周龄C57BL/6J小鼠购自北京维通利华，适应性饲养一周后腹腔注射STZ(150mg/kg)，一周后测定血糖，挑选随机血糖大于16.6mmol/L的小鼠。STZ注射6周后根据体重和血糖进行分组，分别分为对照组(非糖尿病鼠)、模型组(DPN鼠)和给药组(奥替溴铵2.5mg/kg或5mg/kg)，奥替溴铵腹腔注射4周。每周检测机械痛和热痛觉敏感性，运动神经传导速度在适应期，造模四周后及给药前及给药4周后分别检测。

2)机械痛阈值实验

本实验是基于啮齿类动物的爪受到机械刺激时会缩回反射的原理。Von frey触觉测量套件购于Ugo Basile公司，Von frey纤维丝可提供0.008g-300g的刺激力，纤维丝的粗细决定提供刺激力的大小。实验根据实际情况选定粗细得当的纤维丝，垂直地刺激皮肤，可通过调换纤维丝调整刺激力大小，直到纤维丝弯曲，小鼠会发生缩足行为，以此来评估小鼠对痛觉的反应。一只鼠发生疼痛后，再测定四次以确定阈值，根据50％threshold＝(10^(x^f+kδ))/10000计算小鼠50％的机械痛觉阈值。

3)热痛觉潜伏期实验

红外足底测痛仪购于Ugo Basile公司。将可移动的辐射热源直接放置在小鼠后爪足底进行热刺激，当小鼠抬脚或者移动离开热源时仪器会自动停止辐射并记录持续时间，用该热潜伏期的时间来评估小鼠对热痛觉的敏感性。

4)运动神经传导速度检测实验

①电极放置：刺激电极置于神经干，记录电极置于肌腹，参考电极置于肌腱；地线置于刺激电极和记录电极之间。②运动神经传导速度的计算：超强刺激神经干远端和近端，在该神经支配的肌肉上可记录到2次复合肌肉动作电位，测定其不同的潜伏期，用远端和近端之间的距离除以两点间潜伏期差，即为神经的传导速度。计算公式为：神经传导速度(m/s)＝两点间距离(cm)×10/两点间潜伏期差(ms)。

3.实验结果

结果如图3所示，奥替溴铵(Otilonium Bromide)能够明显改善1型糖尿病周围神经病变小鼠的运动神经传导速度以及感觉缺失症状。^*p<0.05，^**p<0.01，^***p<0.001代表模型组vs.对照组；^#p<0.05，^##p<0.01，^###p<0.001代表低剂量给药组vs.模型组；^&p<0.05，^&&p<0.01，^&&&p<0.001代表高剂量给药组vs.模型组；其中神经传导速度图，n＝3机械痛和热痛图n＝12，两组数据间比较采用T-test比较，三组数据间采用One-wayANOVA比较。

实施例3：奥替溴铵改善PIPN模型小鼠周围神经病变的作用。

本发明在紫杉醇诱发的神经病理性疼痛(PIPN)小鼠身上检测奥替溴铵对紫杉醇诱导的周围神经病变痛觉敏感性响应的影响。实验表明，奥替溴铵(Otilonium Bromide，简称OB)具有明显的改善紫杉醇诱导的周围神经病变痛觉异常的作用。

1.实验原理

本实验基于紫杉醇诱导的周围神经病变患者会出现刺痛、麻木、灼痛及冷痛等感觉异常的临床症状，在PIPN模型小鼠身上检测其机械痛阈值、热痛觉反应时间及冷痛觉反映时间等行为学指标，以此来评估奥替溴铵对紫杉醇诱导的周围神经病变个体行为学水平上的改善作用。

2.实验材料与方法

1)动物分组及给药：

健康7-8周龄(20g左右)雄性C57BL/6N小鼠购自维通利华(Vital River)实验动物技术有限公司(中国北京)，所有小鼠均适应一周开始实验，根据体重随机分组，包括空白对照组、模型组(PTX,PIPN小鼠)、模型低剂量给药组(PTX+OB,2.5mg/kg)、模型高剂量给药组(PTX+OB,5mg/kg)。模型组及给药组以4mg/kg腹腔注射PTX，间隔1天注射一次，共四次完成造模。造模结束次日，每天分别腹腔注射奥替溴铵(2.5mg/kg)和奥替溴铵(5mg/kg)持续四周。对照组均腹腔注射相应的溶剂。以机械痛、热痛及冷热痛阈值降低作为造模成功的标准。分别于给药前及给药后每周检测机械痛、热痛及冷痛敏感性。

2)冷痛觉潜伏期实验

将小鼠放置在透明的丙烯酸容器中适应20min左右，该容器由黑色不透明分隔物隔开。然后将小鼠放在提前预冷的4℃冷板(Ugo Basile，意大利)上，此时开始计时，直到小鼠出现缩足反应(抓、挠、舔、抬腿)停止计时。为了避免伤害，控制最长停止时间为30s。总共进行三次试验，每次间隔15min左右，统计每只小鼠平均的缩足时间，以此评估小鼠对冷痛的敏感性。

3.实验结果

结果如图4所示，奥替溴铵(Otilonium Bromide)能够明显改善PIPN小鼠周围神经病变异常性疼痛的症状。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001代表模型组vs.对照组；#p<0.05，##p<0.01，###p<0.001代表给药组vs.模型组；单因素方差分析。

实施例4：奥替溴铵减轻博来霉素诱导的小鼠肺纤维化程度

本发明利用Micro CT在博来霉素诱导的肺纤维化模型小鼠身上检测奥替溴铵对小鼠肺纤维化组织的保护作用。实验结果表明，给予奥替溴铵治疗可以明显减轻小鼠肺部纤维化程度。

1.实验原理

本实验通过对小鼠进行气管滴注博来霉素溶液来造成肺纤维化模型，然后给予奥替溴铵治疗。通过对小鼠肺部CT拍照和三维重构，定量小鼠肺部正常组织的体积大小来评估奥替溴铵对博来霉素诱导的小鼠肺纤维化程度的影响。

2.实验材料与方法

6～8周龄C57BL/6J雄性小鼠购自北京维通利华，适应性饲养一周后用micro-CT检查小鼠肺部状况。根据肺部体积大小将小鼠随机分为空白对照组(正常鼠)、模型组和奥替溴铵组(5mg/kg)。采用吸入式麻醉机异氟烷吸入诱导麻醉，将模型组及给药组小鼠经口腔气管滴注5mg/kg的博莱霉素溶液，构建肺纤维化模型，对照组滴注等体积的博来霉素溶剂。造模第八天后开始给药，连续腹腔注射给药20天。在给药前，给药后第10天、第20天进行micro-CT成像实验，观察小鼠肺部纤维化变化情况。

3.实验结果

如图5所示，奥替溴铵(Otilonium Bromide)能够明显减轻小鼠肺纤维化程度。给药20天后，给药组小鼠的肺部正常组织体积要明显大于模型组。小鼠肺部正常组织体积的定量结果如表1所示，两组数据间采用T test进行显著性分析。^*p<0.05，^**p<0.01，^***p<0.001代表模型组vs.对照组；^#p<0.05，^##p<0.01，^###p<0.001代表给药组vs.模型组。

表1肺部正常组织体积(Mean±SD.，n＝5，mm³)

给药天数	对照组	模型组	奥替溴铵组
				0	504.10±37.83	443.50±48.17	441.42±57.23
10	512.82±47.20	400.63±55.15<sup>*</sup>	416.38±69.31
				20	505.63±56.84	282.79±36.84<sup>***</sup>	397.27±71.22<sup>##</sup>

。

以上实施例仅为本发明的示例性实施例，不用于限制本发明，本发明的保护范围由权利要求书限定。本领域技术人员可以在本发明的实质和保护范围内，对本发明做出各种修改或等同替换，这种修改或等同替换也应视为落在本发明的保护范围内。

Claims (10)

1.奥替溴铵或其药学上可接受的盐在制备用于治疗与外周神经元轴突损伤、外周相关的神经病变药物中的应用。

2.奥替溴铵及其药学上可接受的盐在制备用于治疗与外周神经元轴突损伤、外周相关的神经退行性疾病药物中的应用。

3.根据权利要求1或2所述的应用，奥替溴铵及其药学上可接受的盐在制备治疗糖尿病周围神经病变的药物中的应用。

4.奥替溴铵及其药学上可接受的盐在制备治疗化疗引起周围神经病变的药物中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，奥替溴铵及其药学上可接受的盐在制备治疗紫杉醇引起周围神经病变的药物中的应用。

6.奥替溴铵及其药学上可接受的盐在制备治疗肺纤维化药物中的应用。

7.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，奥替溴铵及其药学上可接受的盐能够促进外周感觉神经元突触的生长。

8.含有奥替溴铵或其药学上可接受的盐的药物组合物在制备治疗与外周神经元轴突损伤、外周相关的神经病变的药物中的应用。

9.一种药物组合物在制备治疗糖尿病周围神经病变、化疗药物紫杉醇引起的外周神经病变以及肺纤维化的药物中的应用，所述药物组合物包含奥替溴铵或其药学上可接受的盐及药学上可接受的辅料。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，奥替溴铵药学上可接受的盐为奥替溴铵无机酸盐或奥替溴铵有机酸盐。

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