CN114940990B - 与颅内动脉瘤相关的基因突变位点及其应用 - Google Patents

与颅内动脉瘤相关的基因突变位点及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN114940990B
CN114940990B CN202210699800.1A CN202210699800A CN114940990B CN 114940990 B CN114940990 B CN 114940990B CN 202210699800 A CN202210699800 A CN 202210699800A CN 114940990 B CN114940990 B CN 114940990B
Authority
CN
China
Prior art keywords
mutation
gene
dna
intracranial aneurysm
detection reagent
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202210699800.1A
Other languages
English (en)
Other versions
CN114940990A (zh
Inventor
王坤
杨新健
张明琦
赵森
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Beijing Neurosurgical Institute
Original Assignee
Beijing Neurosurgical Institute
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Beijing Neurosurgical Institute filed Critical Beijing Neurosurgical Institute
Priority to CN202210699800.1A priority Critical patent/CN114940990B/zh
Publication of CN114940990A publication Critical patent/CN114940990A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN114940990B publication Critical patent/CN114940990B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/28—Neurological disorders
    • G01N2800/2871—Cerebrovascular disorders, e.g. stroke, cerebral infarct, cerebral haemorrhage, transient ischemic event

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了与颅内动脉瘤相关的基因突变位点及其应用，具体的，所述的基因突变为ESR1基因上的突变，所述的突变为NM_000125.3(ESR1):c.420_422delGGTinsTGGAGAACGAGCCCA(p.Val141delinsGlyGluArgAlaGln)。经体外实验验证，该突变位点是颅内动脉瘤的致病因素。本发明为颅内动脉瘤诊断或治疗提供了一种新方法。

Description

与颅内动脉瘤相关的基因突变位点及其应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体的，本发明涉及与颅内动脉瘤相关的基因突变位点及其应用。
背景技术
颅内动脉瘤(IA)是一种以颅内动脉异常扩张为特征的脑血管疾病。虽然多年来对IAs的发病机制进行了多项研究，但其形成、生长和最终破裂的机制仍不清楚。已证明IAs的起始与高血压、年龄增长、吸烟、过度饮酒和环境因素有关，但也与遗传因素有关。一些孟德尔疾病，如常染色体显性多囊肾病、神经纤维瘤病型、IV型埃勒斯-丹洛斯综合征、马凡综合征和Loeys-Dietz综合征，与IA形成风险增加有关。一项大型协同全基因组关联研究已经确定了17个独立和重复的位点，这些位点对IAs风险有影响此外，基于二代测序的家族研究扩大了被证实引起家族性IAs的基因和突变。然而，目前还没有可靠的生物标志物或诊断工具来预测IA的形成或演化。
大多数IA患者的年龄在35-75岁之间，发生在25岁以下年轻人身上的动脉瘤极为罕见。大多数环境危险因素不存在，因此，发病机制被认为是遗传因素。此外，越来越多的证据表明，女性绝经后发生脑血管事件的风险迅速增加，包括动脉瘤雌激素水平的降低可能是导致女性动脉瘤发生率较高的原因，一些研究表明，雌激素的缺乏与大鼠动脉瘤的形成有关。甚至激素替代疗法也被证明对动物IAs有效，这证实了雌激素水平的重要性此外，雌激素也与男性血管系统有关。动物研究表明，雄性小鼠体内的雌激素对维持血管系统内环境的稳定具有重要作用，然而，关于哪些IAs可能由雌激素相关基因引起的信息目前还缺乏。
内皮细胞(ECs)被认为是颅内动脉瘤发生的关键细胞类型，有研究表明，雌激素受体在整个人体的ECs中高度表达。因此，IAs可能是由于雌激素受体缺陷和雌激素在脑血管中的保护作用丧失而引起的。
发明内容
本发明的目的是提供一种与颅内动脉瘤相关的基因突变位点及其应用，为实现该目的，本发明采用了如下技术方案：
本发明第一方面提供了一种可用于预测或诊断颅内动脉瘤的基因突变，所述的基因突变为ESR1基因上的突变，所述的突变为NM_000125.3(ESR1):c.420_422delGGTinsTGGAGAACGAGCCCA(p.Val141delinsGlyGluArgAlaGln)。
在本发明中，所述的ESR1的Gene ID为2099。
本发明第二方面提供了一种核酸，与野生型ESR1基因相比，所述的核酸具有c.420_422delGGTinsTGGAGAACGAGCCCA突变。
对于本发明说明书和权利要求书中，提及核酸，本领域技术人员应当理解，实际包括互补双链的任意一条，或者两条。为了方便，在本说明书和权利要求书中，虽然多数情况下只给出了一条链，但实际上也公开了与之互补的另一条链。例如，提及ESR1基因的序列，实际包括其互补序列。本领域技术人员还可以理解，利用一条链可以检测另一条链，反之亦然。
本发明第三方面提供了一种多肽，与野生型ESR1基因编码的多肽的氨基酸序列相比，所述的多肽的氨基酸序列具有p.Val141delinsGlyGluArgAlaGln的突变。
本发明第四方面提供了一种检测试剂，所述的检测试剂为检测本发明第一方面所述的基因突变或本发明第二方面所述的核酸或本发明第三方面所述的多肽的试剂。
检测基因突变或蛋白突变的方法包括(但不限于)：PCR-SSCP法、异源双链分析法、变性梯度凝胶电泳法、化学切割错配法、等位基因特异性寡核苷酸分析法、DNA芯片技术、连接酶链反应、等位基因特异性扩增法、直接测序法。
PCR-SSCP法是在非变性聚丙烯酰胺凝胶上，短的单链DNA和RNA分子依其碱基序列不同而形成不同构象，一个碱基的改变将影响其构象而导致其在凝胶上的移动速度改变。其基本原理为单链DNA在中性条件下会形成二级结构，这种二级结构依赖于其碱基组成，即使一个碱基的不同，也会形成不同的二级结构而出不同的迁移率。
异源双链分析法(HA)是直接在变性凝胶上分离杂交的突变型-野生型DNA双链的一种方法。其基本原理为突变和野生型DNA形成的异源杂合双链DNA在其错配处会形成一突起，在非变性凝胶中电泳时，会产生与相应的同源双DNA不同的迁移率。
变性梯度凝胶电泳法(DGGE)用于分析PCR产物，如果突变发生在最先解链的DNA区域，检出率可达100％，检测片段可达1kb。基本原理是基于当双链DNA在变性梯度凝胶中进行到与DNA变性湿度一致的凝胶位置时，DNA发生部分解链，电泳适移率下降，当解链的DNA链中有一个碱基改变时，会在不同的时间发生解链，因影响电泳速度变化的程而被分离。
化学切割错配法(CCM)是在Maxam-Gilbert测序法的基础上发展的一项检测突变的技术，其检测突变的准确性可与DNA测序相仿。其基本原理为将待测含DNA片段与相应的野生型DNA片段或DNA和RNA片段混和变性杂交，在异源杂合的双链核酸分子中，错配的C、T能被切割，经变性凝胶电泳即可确定是否存在突变，该法检出率很高。
等位基因特异性寡核苷酸分析法(ASO)是一种以杂交为基础对已知突变进行检测的技术。以PCR和ASO相结合，设计一段20bp左右的寡核苷酸片段，其中包含了发生突变的部位，以此为探针，与固定在膜上的经PCR拉增的样品DNA杂交。可以用各种突变类型的寡核苷酸探针，同时以野生型探针为对照，如出现阳性杂交带，则表明样品中存在与该ASO探针相应的点突变。
DNA芯片技术，其基本原理为将许多已知序列的寡核苷酸DNA排列在1块集成电路板上，彼此之间重叠1个碱基，并覆盖全部所需检测的基因，将荧光标记的正常DNA和突变DNA发别与2块DNA芯片杂交，由于至少存在1个碱基的差异，正常和突变的DNA将会得到不同的杂交图谱，经过共聚集显微镜分别检测两种DNA分子产生的荧光信号，即可确定是否存在突变，该方法快速简单、片动化程度高。
等位基因特异性扩增法(ASA)，通过设计两个5’端引物，一个与正常DNA互补，一个与突变DNA互补，对于纯合性突变，分别加入这两种引物及3’端引物进行两个平行PCR，吸有与突变DNA完互补的引物才可延伸并得到PCR扩增产物。如果错配位于引物的3’端则导致PCR不能延伸。
进一步，所述的试剂包括特异性针对所述基因突变的探针、引物、抗体。
本发明中使用的术语“探针”，是指能与另一分子的特定序列或亚序列或其它部分结合的分子。除非另有指出，在本发明中，术语“探针”通常指能通过互补碱基配对与另一多核苷酸(往往称为“靶多核苷酸”)结合的多核苷酸探针。根据杂交条件的严格性，探针能和与该探针缺乏完全序列互补性的靶多核苷酸结合。探针可作直接或间接的标记，其范围包括引物。杂交方式包括(但不限于)：溶液相、固相、混合相或原位杂交测定法。在本发明中的示例性探针包括PCR引物以及基因特异性DNA寡核苷酸探针，例如固定于微阵列基底上的微阵列探针、定量核酸酶保护检验探针、与分子条形码连接的探针、以及固定于珠上的探针。这些探针具有与靶点基因的特定的碱基序列互补的碱基序列。这里，所谓“互补”，只要是杂交即可，可以不是完全互补。这些多核苷酸通常相对于该特定的碱基序列具有80％以上、优选90％以上、更优选95％以上、特别优选100％的同源性。这些探针可以是DNA，也可以是RNA，另外，可以为在其一部分或全部中核苷酸通过PNA、LNA、ENA、GNA、TNA等人工核酸置换得到的多核苷酸。
本发明中使用的术语“引物”，是指能与模板互补配对，在DNA聚合酶的作用下，合成与模板互补的DNA链的寡聚核苷酸的总称。引物可以是天然的RNA、DNA，也可以是任何形式的天然核苷酸，引物甚至可以是非天然的核苷酸如LNA或ZNA等。引物“大致上”或“基本上”与模板上一条链上的一个特殊的序列互补。引物必须与模板上的一条链充分互补才能开始延伸，但引物的序列不必与模板的序列完全互补。例如，在一个3’端与模板互补的引物的5’端加上一段与模板不互补的序列，这样的引物仍大致上与模板互补。只要有足够长的引物能与模板充分的结合，非完全互补的引物也可以与模板形成引物-模板复合物，从而进行扩增。
在本发明中，所述引物或探针的设计和合成可以使用磷酰亚胺固相支持法或其他熟知化学方法。也可以使用本领域已知的许多手段修饰所述核酸序列。这些修饰的非限制性实例是甲基化、加帽、用天然核苷酸的一种或多种类似物进行的置换和在核苷酸之间的修饰，例如：修饰不带电荷的连接体(例如：磷酸甲酯、磷酸三酯、磷酰亚胺、氨基甲酸酯等)，或修饰带电荷的连接体(例如：硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)。
如本文所用，术语“抗体”是指免疫球蛋白分子，其通过至少一个抗原结合位点识别并特异性结合靶标，诸如蛋白质、多肽、肽、碳水化合物、多核苷酸、脂质或前述的组合。如本文所用，该术语涵盖完整的多克隆抗体、完整的单克隆抗体、单链抗体、抗体片段(诸如Fab、Fab′、F(ab')2和Fv片段)、单链Fv(scFv)抗体、多特异性抗体(诸如双特异性抗体)、单特异性抗体、单价抗体、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、包含抗体的抗原结合位点的融合蛋白，以及包含抗原结合位点的任何其他修饰的免疫球蛋白分子，只要该抗体表现出所需的生物结合活性。抗体可以是五种主要类别的免疫球蛋白中的任一种：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，或其亚类(同种型)(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)。不同类别的免疫球蛋白具有不同的和熟知的亚单位结构和三维构型。抗体可以是裸露的或与其他分子缀合，包括但不限于毒素和放射性同位素。
术语“抗体片段”是指完整抗体的一部分并且是指完整抗体的抗原决定可变区。抗体片段的示例包括，但不限于，Fab、Fab′、F(ab')2和Fv片段、线性抗体、单链抗体和由抗体片段形成的多特异性抗体。如本文所用，“抗体片段”包含至少一个抗原结合位点或表位结合位点。术语抗体的“可变区”是指单独或组合的抗体轻链的可变区或抗体重链的可变区。重链或轻链的可变区通常由四个框架区(FR)组成，其由三个互补决定区(CDR)连接，也称为“高变区”。每条链中的CDR通过框架区紧密邻近地结合在一起，并且有助于抗体的抗原结合位点的形成。
进一步，所述的检测试剂包括Taqman法、质谱法、DNA微阵列法、测序法、微测序、杂交、限制性片段分析、寡核苷酸连接检测、或等位基因特异性PCRHRM方法检测所述基因突变所需的试剂。
本发明第五方面提供了一种预测或诊断颅内动脉瘤的产品，所述的产品包括本发明第四方面所述的检测试剂。
进一步，所述的产品包括试剂盒、芯片、试纸。
本发明中提供了用于预测或诊断颅内动脉瘤的试剂盒，该试剂盒用于确定ESR1基因上的突变。试剂盒可以包括适于选择性检测来源于受试者的样品中用于诊断颅内动脉瘤的基因突变的材料和试剂。在进一步的实施方案中，试剂盒可以含有标记或产品插页形式的合适操作参数的说明书。例如，说明书可以包括关于如何收集样品，如何将样品中的基因突变与受试者的颅内动脉瘤相关联的信息或指导。在另一个实施方案中，试剂盒可以含有一个或多个容器，其具有生物标志物样品，以用作参比标准，合适的对照，或用于测定的校准以检测测试样品中的基因突变。
在本发明中，“芯片”也称为“阵列”，指包含连接的核酸或肽探针的固体支持物。阵列通常包含按照不同的已知位置连接至基底表面的多种不同的核酸或肽探针。这些阵列，也称为“微阵列”，通常可以利用机械合成方法或光引导合成方法来产生这些阵列，所述光引导合成方法合并了光刻方法和固相合成方法的组合。阵列可以包含平坦的表面，或者可以是珠子、凝胶、聚合物表面、诸如光纤的纤维、玻璃或任何其它合适的基底上的核酸或肽。可以以一定的方式来包装阵列，从而允许进行全功能装置的诊断或其它方式的操纵。
“微阵列”是杂交阵列原件有序排列在基质上，所述杂交阵列原件诸如聚核苷酸探针(例如寡核苷酸)或结合剂(例如抗体)。所述基质可以是固体基质，例如，玻璃或二氧化硅玻片、珠、纤维光学粘结剂或半固态基质，例如硝酸纤维素膜。核苷酸序列可以是DNA、RNA或其中的任何排列。
本发明中所述芯片的制备可采用本领域已知的生物芯片的常用制造方法。若固相载体采用的是修饰玻片或硅片，探针的5’端含有氨基修饰的聚dT串，可将寡核苷酸探针配制成溶液，然后采用点样仪将其点在修饰玻片或硅片上，排列成预定的序列或阵列，然后通过放置过夜来固定，就可得到本发明中所述的芯片。
本发明第六方面提供了本发明第四方面所述的检测试剂在制备预测或诊断颅内动脉瘤的产品中的应用。
本发明第七方面提供了能特异性改变本发明第一方面所述的基因突变或本发明第二方面所述的核酸的物质在制备治疗颅内动脉瘤的药物中的用途。
需要说明的是，这里的“特异性改变”是指能使得突变的核酸或者基因突变的位点恢复到原来的野生状态或者其他不具有致病性的状态，而对于个体基因组的其他序列不产生实质影响。
进一步，所述的物质包括shRNA、反义核酸、核酶、显性负突变、CRISPR-Cas9、CRISPR-Cpf1或锌指核酸酶。
CRISPRs技术是一种由RNA指导Cas蛋白对靶向基因进行修饰的技术，CRISPR-Cas9主要通过基因敲除、特种变异的引入和定点转基因三种途径来实现基因组改造，基于CRISPR-Cas9的方法，发明人可以设计出sgRNA并合成该序列的gRNA，然后将gRNA与d Cas9在细胞中共表达，通过gRNA介导d Cas9蛋白与目标DNA区域结合，进而实现特定位点的修复或改变。
本发明的优点和有益效果：
本发明首次发现在两个年轻的IAs患者中发现一种ESR1基因突变，所述的基因突变为NM_000125.3(ESR1):c.420_422delGGTinsTGGAGAACGAGCCCA(p.Val141delinsGlyGluArgAlaGln)。
本发明进一步通过体外实验证明，该基因突变为颅内动脉瘤的致病突变，将该基因突变用于预测、诊断或治疗颅内动脉瘤具有很好的应用价值。
附图说明
图1为ESRα突变携带者的头部及脑血管影像，其中，图A为患者一的脑血管造影图，图B为患者一脑出血后即刻CT平扫图，图C为患者二的脑血管造影图，图D为患者二术前的磁共振平扫T2像；
图2为ESRα突变及野生型sanger测序结果图；
图3为ESRα野生型与突变型在转染的HUVEC免疫荧光示意图；
图4为ESRα野生型与突变型在转染的HUVEC划痕实验图，其中，图A表示对照、野生型和突变型的0h和24h的划痕示意图，图B为划痕面积统计结果；图5为载体pcDNA3.1(+)的图谱。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1与颅内动脉瘤相关的基因突变的筛选
本发明在135例散发性IAs患者的全外显子组测序中，发现两个非常年轻的患者存在雌激素受体α(ESRα)突变：NM_000125.3(ESR1):c.420_422delGGTinsTGGAGAACGAGCCCA(p.Val141delinsGlyGluArgAlaGln)
如图1A-B所示，19岁的女性患者为前交通动脉瘤，首次发病为蛛网膜下腔出血。图1A为患者的脑血管造影图，图中黑色箭头显示在前交通动脉有一个动脉瘤，形态不规则，瘤顶有一尖样突起可疑为破裂处。图1B为患者脑出血后即刻CT平扫图，白色箭头所示可见大脑前中央沟散在弥漫的高密度影，提示患者蛛网膜下腔出血，与造影所见动脉瘤的位置可对应。
如图1C-D所示，8岁男性患者为基地动脉夹层动脉瘤。图1C为患者的脑血管造影图，通过左侧椎动脉造影可见在左侧椎动脉V4段见一个不规则的瘤样膨大，夹层动脉瘤的形态。图1D患者术前的磁共振平扫T2像，在脑干左侧可见一低信号的不规则的血管占位，脑干受压明显。
这两个患者从发病年龄及发病形式均为罕见。
图2为患者sanger测序结果，WT为正常序列，MT为突变性序列，可见突变型的sanger测序图显示紊乱的双峰，二代测序所测的是一个真性突变。
sanger测序的正向引物为CCTCCACACCAAAGCATCTG(SEQ ID NO.1)，反向引物为GACGGTAAGTGGGTGGAGAG(SEQ ID NO.2)。
实施例2体外实验验证
本发明进行体外实验，在人脐静脉内皮细胞(HUVECs)系中观察本发明所述基因突变的功能。两个细胞实验，分别是免疫荧光实验和划痕实验。
一、实验方法
1、构建质粒
野生型ESR1序列如SEQ ID NO.3所示，突变型ESR1序列如SEQ ID NO.4所示。将以上序列构建到载体pcDNA3.1(+)上，图谱如图5所示，获得野生型和突变型ESR1质粒。
2、细胞培养和质粒转染
将HUVEC细胞置于Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM，Invitrogen)中进行培养，并在6孔板中，添加胎牛血清(Gibco)、青霉素(50U/mL)和链霉素(50μg/mL)。分别将野生型和突变型ESR1质粒(pEGFP-C1质粒1μg)转染到上述细胞中，48小时后收集细胞。荧光显微镜来观察细胞转染的效率。
3、免疫荧光实验
实验试剂：4％中性多聚甲醛、1x PBS、Triton X-100、BSA、DAPI染色剂(Vectorlabs，H-1500)、正常山羊血清等
实验仪器设备及耗材：晾片板、镊子、注射器针头，盖玻片，载玻片等。
实验步骤：
1.取出转染后1d的培养板，吸弃培养基，用1x PBS清洗1次，0.8mL/孔，加入4％多聚甲醛固定液，每孔500μL，室温固定20min。
2.用1x PBS清洗4遍(轻轻的晃动)，0.8mL/孔。
3.加入封闭液(20％山羊血清、1％TritonTM X-100、PBS，pH7.0)，500μL/孔，室温孵育1h。
4.吸去封闭液加双一抗，共250μL/孔，4℃过夜孵育。
表1一抗稀释倍数/使用浓度
Figure BDA0003703574640000101
5.从冰箱拿出恢复至室温
6.PBS清洗4遍，每孔0.8mL，每清洗一个孔都要换一个新的枪头(避免交叉污染)；
7.加二抗，共250μL/孔，二抗稀释液与一抗稀释液相同，室温、避光孵育1h。Anti-VE使用Invitrogen,A10520；Anti-ZO1使用Abcam，150077。
表2二抗稀释倍数/使用浓度
Figure BDA0003703574640000102
8.PBST清洗4次，每孔0.8mL。
9.在载玻片上滴加14μL抗荧光衰减封片剂,用注射器针头和镊子轻轻从24孔板中扣出细胞爬片，反向放在载玻片上。
10.拍照
实验结果：
图3为ESRα野生型与突变型在转染的HUVEC免疫荧光示意图，其中第一行为对照组，第二行为野生型质粒转染，第三行为突变型质粒转染，DAPI染色为细胞核，ZO-1抗体染色为细胞之间了连接部分，图中所示在对照组和野生型组的细胞之间可清楚的看到有条状荧光显示(白色箭头)而突变型组的细胞之间无荧光染色。
根据拍照结果来看对照组的细胞之间的荧光较清晰，野生型序列的细胞之间也能够观察到荧光，而突变型的细胞之间的荧光几乎不存在，证明当这个突变发生后，细胞之间的紧密连接遭到破坏，可能与动脉瘤内皮驱动的发病因素有关。
4、划痕实验
实验试剂：细胞样品，无血清培养基PBS，6孔板，marker笔，直尺，枪头
实验步骤：
1.器械灭菌，直尺和marker笔在操作前紫外照射30min，先用marker笔在6孔板背后，用直尺比着，均匀得划横线，大约每隔0.5～1cm一道，横穿过孔。每孔至少穿过5条线。
2.在孔中加入约5*105个细胞，过夜铺满单层，达到密度约90％左右。
3.第二天用枪头比着直尺，尽量垂至于背后的横线划痕，枪头要垂直，不能倾斜。
4.用PBS洗细胞3次，去处划下的细胞，加入无血清培养基。
5.放入37度5％CO2培养箱，培养。按0，24小时取样，拍照。
统计分析：实验重复四次，每个重复样品测量三次，以尽量减少分析的变化。采用单因素方差分析(ANOVA)和Dunnett多重比较检验进行统计分析。所有统计过程均采用GraphPad Prism8。统计学显著性定义为P≤0.05。
实验结果
图4ESR为α野生型与突变型在转染的HUVEC划痕实验图，其中图A表示对照、野生型和突变型的0h和24h的划痕示意图，可见突变组的细胞迁移速度明显较另两组慢。图B为划痕面积统计结果，可见突变型细胞的迁移速度与对照组和野生型组均有明显的统计学差异，P值分别为0.0062和0.0095。P≤0.05即有统计学意义。
根据既往文献中报道1,2，在各种内皮细胞系中，雌激素可以激活细胞的MAPK通路，并可能在内皮细胞的迁移中发挥作用，根据本发明的实验证明，经过突变序列转染的细胞具有明显的细胞迁移能力的下降，从而导致当内皮受损后细胞的自愈能力减弱可能与动脉瘤的发病有关。
参考文献：
1.Klinge,C.M.,K.A.Blankenship,K.E.Risinger,S.Bhatnagar,E.L.Noisin,W.K.Sumanasekera,L.Zhao,D.M.Brey,and R.S.Keynton,Resveratrol and estradiolrapidly activate MAPK signaling through estrogen receptors alpha and beta inendothelial cells.J Biol Chem,2005.280(9):p.7460-8.
2.Sengupta,K.,S.Banerjee,N.K.Saxena,and S.K.Banerjee,Thombospondin-1disrupts estrogen-induced endothelial cell proliferation and migration andits expression is suppressed by estradiol.Mol Cancer Res,2004.2(3):p.150-8.
以上结合附图详细描述了本申请的优选实施方式，但是，本申请并不限于上述实施方式中的具体细节，在本申请的技术构思范围内，可以对本申请的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本申请的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本申请对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本申请的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本申请的思想，其同样应当视为本申请所公开的内容。
序列表
<110> 北京市神经外科研究所
<120> 与颅内动脉瘤相关的基因突变位点及其应用
<141> 2022-06-20
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cctccacacc aaagcatctg 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gacggtaagt gggtggagag 20
<210> 3
<211> 1788
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atgaccatga ccctccacac caaagcatct gggatggccc tactgcatca gatccaaggg 60
aacgagctgg agcccctgaa ccgtccgcag ctcaagatcc ccctggagcg gcccctgggc 120
gaggtgtacc tggacagcag caagcccgcc gtgtacaact accccgaggg cgccgcctac 180
gagttcaacg ccgcggccgc cgccaacgcg caggtctacg gtcagaccgg cctcccctac 240
ggccccgggt ctgaggctgc ggcgttcggc tccaacggcc tggggggttt ccccccactc 300
aacagcgtgt ctccgagccc gctgatgcta ctgcacccgc cgccgcagct gtcgcctttc 360
ctgcagcccc acggccagca ggtgccctac tacctggaga acgagcccag cggctacacg 420
gtgcgcgagg ccggcccgcc ggcattctac aggccaaatt cagataatcg acgccagggt 480
ggcagagaaa gattggccag taccaatgac aagggaagta tggctatgga atctgccaag 540
gagactcgct actgtgcagt gtgcaatgac tatgcttcag gctaccatta tggagtctgg 600
tcctgtgagg gctgcaaggc cttcttcaag agaagtattc aaggacataa cgactatatg 660
tgtccagcca ccaaccagtg caccattgat aaaaacagga ggaagagctg ccaggcctgc 720
cggctccgca aatgctacga agtgggaatg atgaaaggtg ggatacgaaa agaccgaaga 780
ggagggagaa tgttgaaaca caagcgccag agagatgatg gggagggcag gggtgaagtg 840
gggtctgctg gagacatgag agctgccaac ctttggccaa gcccgctcat gatcaaacgc 900
tctaagaaga acagcctggc cttgtccctg acggccgacc agatggtcag tgccttgttg 960
gatgctgagc cccccatact ctattccgag tatgatccta ccagaccctt cagtgaagct 1020
tcgatgatgg gcttactgac caacctggca gacagggagc tggttcacat gatcaactgg 1080
gcgaagaggg tgccaggctt tgtggatttg accctccatg atcaggtcca ccttctagaa 1140
tgtgcctggc tagagatcct gatgattggt ctcgtctggc gctccatgga gcacccaggg 1200
aagctactgt ttgctcctaa cttgctcttg gacaggaacc agggaaaatg tgtagagggc 1260
atggtggaga tcttcgacat gctgctggct acatcatctc ggttccgcat gatgaatctg 1320
cagggagagg agtttgtgtg cctcaaatct attattttgc ttaattctgg agtgtacaca 1380
tttctgtcca gcaccctgaa gtctctggaa gagaaggacc atatccaccg agtcctggac 1440
aagatcacag acactttgat ccacctgatg gccaaggcag gcctgaccct gcagcagcag 1500
caccagcggc tggcccagct cctcctcatc ctctcccaca tcaggcacat gagtaacaaa 1560
ggcatggagc atctgtacag catgaagtgc aagaacgtgg tgcccctcta tgacctgctg 1620
ctggagatgc tggacgccca ccgcctacat gcgcccacta gccgtggagg ggcatccgtg 1680
gaggagacgg accaaagcca cttggccact gcgggctcta cttcatcgca ttccttgcaa 1740
aagtattaca tcacggggga ggcagagggt ttccctgcca cggtctga 1788
<210> 4
<211> 1800
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
atgaccatga ccctccacac caaagcatct gggatggccc tactgcatca gatccaaggg 60
aacgagctgg agcccctgaa ccgtccgcag ctcaagatcc ccctggagcg gcccctgggc 120
gaggtgtacc tggacagcag caagcccgcc gtgtacaact accccgaggg cgccgcctac 180
gagttcaacg ccgcggccgc cgccaacgcg caggtctacg gtcagaccgg cctcccctac 240
ggccccgggt ctgaggctgc ggcgttcggc tccaacggcc tggggggttt ccccccactc 300
aacagcgtgt ctccgagccc gctgatgcta ctgcacccgc cgccgcagct gtcgcctttc 360
ctgcagcccc acggccagca ggtgccctac tacctggaga acgagcccag cggctacact 420
ggagaacgag cccagcgcga ggccggcccg ccggcattct acaggccaaa ttcagataat 480
cgacgccagg gtggcagaga aagattggcc agtaccaatg acaagggaag tatggctatg 540
gaatctgcca aggagactcg ctactgtgca gtgtgcaatg actatgcttc aggctaccat 600
tatggagtct ggtcctgtga gggctgcaag gccttcttca agagaagtat tcaaggacat 660
aacgactata tgtgtccagc caccaaccag tgcaccattg ataaaaacag gaggaagagc 720
tgccaggcct gccggctccg caaatgctac gaagtgggaa tgatgaaagg tgggatacga 780
aaagaccgaa gaggagggag aatgttgaaa cacaagcgcc agagagatga tggggagggc 840
aggggtgaag tggggtctgc tggagacatg agagctgcca acctttggcc aagcccgctc 900
atgatcaaac gctctaagaa gaacagcctg gccttgtccc tgacggccga ccagatggtc 960
agtgccttgt tggatgctga gccccccata ctctattccg agtatgatcc taccagaccc 1020
ttcagtgaag cttcgatgat gggcttactg accaacctgg cagacaggga gctggttcac 1080
atgatcaact gggcgaagag ggtgccaggc tttgtggatt tgaccctcca tgatcaggtc 1140
caccttctag aatgtgcctg gctagagatc ctgatgattg gtctcgtctg gcgctccatg 1200
gagcacccag ggaagctact gtttgctcct aacttgctct tggacaggaa ccagggaaaa 1260
tgtgtagagg gcatggtgga gatcttcgac atgctgctgg ctacatcatc tcggttccgc 1320
atgatgaatc tgcagggaga ggagtttgtg tgcctcaaat ctattatttt gcttaattct 1380
ggagtgtaca catttctgtc cagcaccctg aagtctctgg aagagaagga ccatatccac 1440
cgagtcctgg acaagatcac agacactttg atccacctga tggccaaggc aggcctgacc 1500
ctgcagcagc agcaccagcg gctggcccag ctcctcctca tcctctccca catcaggcac 1560
atgagtaaca aaggcatgga gcatctgtac agcatgaagt gcaagaacgt ggtgcccctc 1620
tatgacctgc tgctggagat gctggacgcc caccgcctac atgcgcccac tagccgtgga 1680
ggggcatccg tggaggagac ggaccaaagc cacttggcca ctgcgggctc tacttcatcg 1740
cattccttgc aaaagtatta catcacgggg gaggcagagg gtttccctgc cacggtctga 1800

Claims (6)

1.一种可用于预测或诊断颅内动脉瘤的突变基因，其特征在于，所述的基因突变为ESR1基因上的突变，所述的突变为NM_000125.3: c.420_422delGGTinsTGGAGAACGAGCCCA，即p.Val141delinsGlyGluArgAlaGln。
2.一种检测试剂，其特征在于，所述的检测试剂为检测权利要求1所述的突变基因的试剂。
3.根据权利要求2所述的检测试剂，其特征在于，所述的试剂包括特异性针对所述基因突变的探针、引物或抗体。
4.根据权利要求2所述的检测试剂，其特征在于，所述的检测试剂包括Taqman法、质谱法、DNA微阵列法、测序法、杂交、限制性片段分析、寡核苷酸连接检测或等位基因特异性PCRHRM方法检测所述基因突变所需的试剂。
5.一种预测或诊断颅内动脉瘤的产品，其特征在于，所述的产品包括权利要求2-4任一项所述的检测试剂，所述的产品为试剂盒、芯片或试纸。
6.权利要求2-4任一项所述的检测试剂在制备预测或诊断颅内动脉瘤的产品中的应用。
CN202210699800.1A 2022-06-20 2022-06-20 与颅内动脉瘤相关的基因突变位点及其应用 Active CN114940990B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210699800.1A CN114940990B (zh) 2022-06-20 2022-06-20 与颅内动脉瘤相关的基因突变位点及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210699800.1A CN114940990B (zh) 2022-06-20 2022-06-20 与颅内动脉瘤相关的基因突变位点及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN114940990A CN114940990A (zh) 2022-08-26
CN114940990B true CN114940990B (zh) 2023-03-14

Family

ID=82910929

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210699800.1A Active CN114940990B (zh) 2022-06-20 2022-06-20 与颅内动脉瘤相关的基因突变位点及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN114940990B (zh)

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009033744A1 (en) * 2007-09-11 2009-03-19 Mondo Biotech Laboratories Ag Use of urodilatin as a therapeutic agent
WO2009046878A1 (en) * 2007-09-11 2009-04-16 Mondobiotech Laboratories Ag Tnf inhibitory peptide and cgrp as therapeutic agents
CN105400888A (zh) * 2015-12-18 2016-03-16 四川省人民医院 一种诊治颅内动脉瘤的分子标志物

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2263894A1 (en) * 1996-08-23 1998-02-26 Human Genome Sciences, Inc. Novel human growth factors
ES2365852T3 (es) * 2003-11-07 2011-10-11 Novartis Ag Utilización de fragmentos del factor de crecimiento de fibroblastos.

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009033744A1 (en) * 2007-09-11 2009-03-19 Mondo Biotech Laboratories Ag Use of urodilatin as a therapeutic agent
WO2009046878A1 (en) * 2007-09-11 2009-04-16 Mondobiotech Laboratories Ag Tnf inhibitory peptide and cgrp as therapeutic agents
CN105400888A (zh) * 2015-12-18 2016-03-16 四川省人民医院 一种诊治颅内动脉瘤的分子标志物

Non-Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Differentially Expressed Genes Associated with the Estrogen Receptor Pathway in Cerebral Aneurysms;Lai PMR等;《World Neurosurg》;20190302;第126卷;e557-e563 *
Estrogen protects against intracranial aneurysm rupture in ovariectomized mice;Tada Y等;《Hypertension》;20140414;第63卷(第6期);1339-1344 *
Roles of estrogen in the formation of intracranial aneurysms in ovariectomized female mice;Tada Y等;《Neurosurgery》;20141231;第75卷(第6期);690-695 *
全外显子组测序技术探寻家族性颅内动脉瘤致病基因的研究进展;丁兴欢等;《中国微侵袭神经外科杂志》;20181231;第23卷(第10期);470-474 *
雌激素受体α基因RFLP与脑动脉瘤的相关性;伍刚等;《现代医学》;20140831;第42卷(第8期);884-887 *
雌激素在颅内动脉瘤内皮细胞生物学行为中的意义;闫研等;《中国临床神经外科杂志》;20220219;第27卷(第12期);125-128 *
颅内动脉瘤患者瘤壁雌激素和雄激素受体的表达及其作用;叶锋等;《中国脑血管病杂志》;20170630;第14卷(第6期);308-312 *
颅内动脉瘤雌激素受体与血管平滑肌细胞表型蛋白的表达;邓志刚等;《江西中医学院学报》;20080815(第04期);88-90 *
颅内囊状动脉瘤女性患者血浆性激素水平变化的研究;孙季冬等;《山西医科大学学报》;20160226(第02期);65-68 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN114940990A (zh) 2022-08-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101679869B1 (ko) 생물학적 활성제의 생산을 위한 단일 세포의 스크리닝 방법
EP3822362B1 (en) On-slide staining by primer extension
US8071324B2 (en) Methods for diagnosing and treating kidney cancer
US20150218652A1 (en) Methods for diagnosis and treatment of cancer
US9562259B2 (en) Method of analyzing chromosomal inversions
JP2006525026A (ja) 形質細胞疾患の診断におけるｊａｇ２の発現の使用
US20020197656A1 (en) Cell arrays and the uses thereof
AU2012228424A1 (en) A method of analyzing chromosomal translocations and a system therefore
Kunkel et al. Diagnosis and cell-based therapy for Duchenne muscular dystrophy in humans, mice, and zebrafish
US10723790B2 (en) Method for diagnosis of polycystic ovary syndrome (PCOS) by measuring levels of DENN/MADD domain containing 1A variant 2 (DENND1A variant 2)
US7833733B2 (en) Methods for detecting and treating cancer
CN114940990B (zh) 与颅内动脉瘤相关的基因突变位点及其应用
JP2800850B2 (ja) 新生物形成の検出方法
JP2019007759A (ja) 老化度を評価する方法及び老化度の評価用キット
CN105695617A (zh) 乳头状癌的肿瘤标志物及其应用
EP2186827A1 (en) Surrogate marker directed cDNA cloning of selectively induced mRNAs
AU2022416566A1 (en) Single extracellular vesicle protein and rna assay via in-situ fluorescence microscopy in a uv micropattern array
WO2023086824A1 (en) Methods for identification of antigen-binding molecules
Chen et al. The value of ASPL-TFE3 dual-color single-fusion FISH assay in diagnosing alveolar soft part sarcoma

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant