CN114940698B

CN114940698B - 一种脾氨肽原液中酸性多肽的提取方法

Info

Publication number: CN114940698B
Application number: CN202210860035.7A
Authority: CN
Inventors: 张博文; 罗坚; 郑新越; 冯雪; 王烈; 曹媛; 杨志云
Original assignee: Beijing First Biochemical Pharmaceutical Co ltd
Current assignee: Beijing First Biochemical Pharmaceutical Co ltd
Priority date: 2022-07-22
Filing date: 2022-07-22
Publication date: 2022-10-21
Anticipated expiration: 2042-07-22
Also published as: CN114940698A

Abstract

本发明涉及一种脾氨肽原液中酸性多肽的提取方法。所述提取方法包括以下步骤：（1）样品预处理：取脾氨肽原液冷冻样品，融化后离心弃沉淀，得到脾氨肽预处理液；（2）层析柱层析分离：用缓冲液A平衡层析柱，步骤（1）中所述脾氨肽预处理液，继续用缓冲液A进行淋洗，收集得到流穿液；然后联用缓冲液A和缓冲液B进行梯度洗脱，收集得到洗脱液。本发明采用阴离子交换层析高效分离脾氨肽酸性多肽，分离过程简单，分离耗时短，从而获得高生物活性的脾氨肽酸性多肽，采用全柱成像毛细管电泳检测酸性多肽的等电点为3.38。经过生物活性评估，利用本发明提供的提取方法得到的洗脱液比脾氨肽原液的比活性高，表明其具备较高的生物活性。

Description

一种脾氨肽原液中酸性多肽的提取方法

技术领域

本发明涉及生物制品领域，特别涉及一种脾氨肽原液中酸性多肽的提取方法。

背景技术

脾氨肽（Spleen Aminopeptide）是从健康的动物脾脏中提取的复合物，其中的主要活性物质为多肽，常见制剂有脾氨肽口服液/口服溶液和脾氨肽口服冻干粉。

脾氨肽口服液/口服溶液可用于过敏性鼻炎及慢性乙型肝炎的治疗；脾氨肽口服冻干粉用于治疗细胞免疫功能低下、免疫缺陷和自身免疫功能紊乱性疾病，提高恶性肿瘤病人放、化疗及术后生活质量，降低各种原因引起的感冒、发烧或其它感染发生率。

脾氨肽能够有效地干预免疫调节，但是其成分较为复杂，脾氨肽中各种活性成分未鉴定或尚不明确，限制了脾氨肽单一活性成分的制备和高效利用。目前，关于脾氨肽的物质基础研究主要是其组成分析和游离氨基酸及多肽含量研究，但是脾氨肽中多肽种类尚未鉴定。因此对脾氨肽中的活性多肽进行分离和鉴定是提高脾氨肽产品质量和应用的关键。

有研究从脾氨肽口服冻干粉中提取得到一种分子量约为4.963 kDa，等电点为5.1的多肽，其与胸腺素β4的序列有75%的同源性，具有促进伤口愈合和抗炎的功能活性^[1]。杨宇琴等从牛脾脏中提取得到了β-防御素BNBD-4和BNBD-5，其分子量约为7 kDa，等电点在9~11范围内，具有抗菌、抗病毒及免疫调节的作用^[2]。一泰医药从牛脾中提取得到一种多肽KZ-36，其具有治疗Masugi肾炎的作用^[3]。王凤山等从猪脾脏中提取得到了多肽SISE-p1，其分子量小于5kDa，具有免疫调节的活性，另外，还从脾脏中提取得到了多肽SISE-p2，分子量为5~10kDa，其具有免疫调节的活性^[4]。

Jürgen Borghardt等发现从猪脾脏中提取得到的多肽对头颈癌的辅助治疗有显著效果^[5]。Dongxu Jia等和Wenqian Lu等发现小牛脾提取物注射液（Calf spleenextractive injection，CSEI）可以通过ROS/MAPKs通路诱导癌细胞凋亡和通过JAK2/STAT3信号通路促进造血功能来发挥免疫作用^{[6, 7]}。此外，张冰清等从荷斯坦牛的脾脏中分离纯化出一种抗菌肽（Antimicrobial peptides，AMPs）BSN27，其由27个氨基酸组成，其分子量为3.214 kDa，对革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌和真菌都具有高效的抗菌作用^[8]。已报道的脾氨肽活性成分的分离方法仅涉及凝胶色谱法^[1]和液相色谱法^[9,10,11]，所述方法存在以下缺陷：凝胶色谱处理样品量少、时间长，分离效果不佳，分子尺寸相同的化合物不易分开，不具实际应用价值；液相色谱价格昂贵，容量小，且流动相毒性大，不适合用于生产放大。

【参考文献】：

[1]黄静芳等，“脾氨肽口服冻干粉中活性多肽的分离及鉴定”[J]，《中南药学》，2019，17(05)： 681-686；

[2]杨宇琴等，“β防御素在牛健康组织和病变组织中的分布”[J]，《畜牧与兽医》，2015，47(12)：25-30；

[3]张磊等，“牛脾提取肽类对大鼠Masugi肾炎的治疗作用”[J]，《中药材》，2004，27(6)：423-425；

[4] 王凤山等，“猪脾来源的免疫抑制组分制备及其性质的初步研究”[J]；《华东理工大学学报》，2000(6)：24-27；

[5] Jürgen Borghardt. et al.,“Effects of a spleen peptide preparationas supportive therapy in inoperable head and neck cancer patients”[J]，《Arzneimittel-Forschung》，2000，50(02)：178-184；

[6] Lu, W., et al., “Calf Spleen Extractive Injection protects miceagainst cyclophosphamide-induced hematopoietic injury through G-CSF-mediatedJAK2/STAT3 signaling”[J]，《Scientific Reports》，2017，7(1)：8402；

[7] Jia, D., et al.,“Calf Spleen Extractive Injection (CSEI), a smallpeptides enriched extraction, induces human hepatocellular carcinoma cellapoptosis via ROS/MAPKs dependent mitochondrial pathway”[J]，《Journal ofPharmacological Sciences》，2016，132(2)：122-130；

[8]张冰清，“牛脾脏抗菌肽BSN27的分离、纯化及活性分析”[D]，2017；

[9]CN108107141B，一种脾氨肽内多肽的提取方法；

[10]CN108129549B，一种脾氨肽内多肽的提取方法；

[11]CN108148111B，一种脾氨肽内多肽的提取方法。

发明内容

发明要解决的问题

针对现有技术中对于脾氨肽中活性成分（例如游离氨基酸和多肽）无法有效分离和鉴定的缺陷以及现有技术中公开的脾氨肽活性成分分离方法存在的缺陷，本发明提供了一种脾氨肽原液中酸性多肽的提取方法。

用于解决问题的方案

本发明人鉴于上述现有技术中存在的问题，进行了深入的研究、反复试验，通过层析方法将脾氨肽原液进行分离纯化制备酸性多肽，并采用T细胞脱E受体恢复实验对从脾氨肽原液中提取出来的酸性多肽进行测定，确定脾氨肽原液中的酸性多肽的比活，从而完成了本发明。即本发明如下所述：

本发明在第一方面提供了一种脾氨肽原液中酸性多肽的提取方法，其特征在于，所述提取方法包括以下步骤：

（1）样品预处理：取脾氨肽原液冷冻样品，融化后离心弃沉淀，得到脾氨肽预处理液；

（2）层析柱层析分离：用缓冲液A平衡层析柱，上样步骤（1）中所述脾氨肽预处理液，继续用缓冲液A进行淋洗，收集得到流穿液；然后联用缓冲液A和缓冲液B进行洗脱，收集得到洗脱液。

在一些具体的实施方式中，所述提取方法的步骤（2）中所述缓冲液A为25~75mM的磷酸盐缓冲液、其pH为5.0~7.0；所述缓冲液B由25~75mM的磷酸盐缓冲液和0.5~1.5M的氯化钠组成、其pH为5.0~7.0；

优选的，所述缓冲液A为50mM的磷酸盐缓冲液、其pH为6.0，所述缓冲液B由50mM的磷酸盐缓冲液和1.0M的氯化钠组成、其pH为6.0。

在一些具体的实施方式中，所述提取方法的步骤（2）中所述层析柱为阴离子交换层析柱；优选的，所述层析柱为阴离子交换琼脂糖凝胶层析柱；最优选的，所述层析柱为DEAE-Sepharose Fast Flow层析柱、Q-Sepharose Fast Flow或Capto DEAE层析柱。

在一些具体的实施方式中，所述提取方法的步骤（2）中的色谱条件为：柱温20~30℃，流速1~10ml/min，进样量5~170ml，色谱柱内径为10~26mm，柱长为50mm~250mm，填料颗粒直径为30~100μm，检测波长为280nm/260nm，梯度洗脱过程中缓冲液B的初始比例为0%，缓冲液B的最终比例为30%~100%，梯度洗脱时间为15~90min；优选的，所述步骤（2）中的色谱条件中的柱温为25℃，流速为8ml/min，填料颗粒直径为90μm。

在一些具体的实施方式中，所述提取方法的步骤（1）中的离心条件为2~8℃，4000~10000 r/min，8~30min；优选的，所述步骤（1）中的离心条件为4℃，6000 r/min，10 min。

在一些具体的实施方式中，所述提取方法的步骤（2）中所述洗脱液中酸性多肽的含量为0.3~1.0mg/mL。

在另外一些具体的实施方式中，所述提取方法还进一步包括步骤（3）冷冻干燥，对步骤（2）得到的洗脱液进行冷冻干燥，得到冻干粉。

本发明在第二方面提供了利用本发明第一方面中所述的提取方法制备得到的脾氨肽酸性多肽。

在一些具体的实施方式中，所述酸性多肽的等电点为3.38。

发明的效果

由本发明的技术方案可见，本发明的技术方案与现有技术相比，具有以下有益效果：

（1）现有文献报道了脾氨肽的免疫活性可能是其中的活性多肽发挥了生物学作用。因此，研究脾氨肽中多肽的成分是实现脾氨肽质量控制的关键。本发明通过分离、纯化和鉴定脾氨肽中的活性组分，可为脾氨肽的生化药学研究提供理论基础，从而实现脾氨肽中酸性多肽组分的高效利用，提高脾氨肽产品的安全性和有效性。

（2）本发明基于脾氨肽原液中不同组分种类之间荷电性质的差异，采用离子交换层析纯化技术将脾氨肽原液中的酸性多肽组分实现高效分离。同时还通过细胞活性实验验证不同种类组分对活性的影响，进而确定脾氨肽原液中的活性组分。

（3）本发明采用阴离子交换层析高效分离脾氨肽酸性多肽，分离过程简单，分离耗时短，获得了高生物活性的脾氨肽酸性多肽。经过生物活性评估，洗脱液比脾氨肽原液活性高，表明其具备较高的生物活性。

具体来说，利用本发明提供的方法，经过离子交换层析得到的洗脱组分的比活为181%，较脾氨肽原液的比活25%，提高至7倍，表明经过离子层析纯化的产物具有高比活性。另外，本发明将脾氨肽层析工艺进行了放大：层析柱的柱体积（CV）从5毫升放大到120毫升，进料量从5毫升增加到170毫升，经过7次重复性试验验证了，该层析条件分离效果稳定，并经过该分离方法制备得到了克级酸性多肽。

为了让本发明的上述和其他目的、特征和优点能更明显易懂，下面特举较佳实施例，并配合说明书附图，作详细说明如下。

附图说明

图1示出了脾氨肽原液中酸性多肽的层析分离、纯化技术路线图。

图2示出了利用实施例1中所述方法分离得到的洗脱液（EL）和流穿液（FT）的DEAE层析图谱(开始进样时为横坐标0点)。

图3示出了利用实施例1中所述方法分离得到的洗脱液（EL）检测其成分纯度的HPLC-SEC图谱。

图4示出了利用实施例1中所述方法分离得到的洗脱液（EL）全柱成像毛细管等电聚焦电泳图谱。

图5示出了利用实施例1中所述方法分离得到的洗脱液（EL）中多肽含量试验中BCA蛋白试剂盒的标准曲线。

图6示出了利用实施例1中所述方法分离得到的洗脱液（EL）、流穿液（FT）、脾氨肽原液（即PAT）以及脾氨肽原液冻干粉（即PAT冻干粉）对T细胞恢复活性的对比图。

图7示出了利用实施例2中所述分离方法B得到的洗脱液（EL）和流穿液（FT）的DEAE层析图谱(开始进样为横坐标0点)。

图8示出了利用实施例2中所述分离方法B得到的洗脱液（EL）检测其成分纯度的HPLC-SEC图谱。

图9示出了实施例2中采用Capto DEAE柱层析重复性试验的DEAE层析图谱(开始进样时为横坐标0点)。

具体实施方式

本发明所列举的具体实施例只作为本发明的范例，本发明并不限制于下文所描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对下文所述的实施例进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

本发明实施例中所使用的试验材料、试验试剂和仪器均可市购获得。

实施例1：脾氨肽原液中酸性多肽的离子层析分离方法及其鉴定和生物活性评估

（1）脾氨肽原液中酸性多肽的分离方法A

参照图1所示的技术线路图，对脾氨肽原液中的酸性多肽进行分离，具体操作步骤如下：

1)、样品预处理：取脾氨肽原液（北京第一生物化学药业有限公司，批号200305）冷冻样品，融化后离心（具体条件为4℃，6000 r/min，10min），取上清液，用1.0M的盐酸溶液调节pH值为6.0，作为分析样品；

2)、阴离子交换琼脂糖凝胶柱层析分离：

缓冲液A：50 mM 磷酸盐液缓冲液，pH 6.0

缓冲液B：50 mM磷酸盐液缓冲液+1.0 M氯化钠，pH 6.0

层析柱：DEAE Sepharose Fast Flow（10×100 mm，CV=5ml，填料颗粒平均粒径为90μm）

检测波长：280nm，260nm双波长

柱温：25℃

流速：1.0ml/min

上样前，用缓冲液A 3CV（15ml）平衡DEAE Sepharose Fast Flow层析柱。平衡后上样5ml脾氨肽预处理液，继续用缓冲液A 2CV（10ml）进行淋洗，收集到的样品为流穿液（FT），淋洗后采用缓冲液A和缓冲液B 10CV（50ml）进行梯度洗脱（缓冲液B为0％-100%），收集的样品为洗脱液（EL）。其具体操作参数如表1：

表1 实施例1具体操作参数

（2）脾氨肽原液中酸性多肽的鉴定

①纯度分析：将分离所得洗脱液样品收集，经HPLC-SEC分析柱（Superdex Peptide10/300GL，CV=24mL）测定洗脱组分中酸性多肽的纯度。具体测定条件为，流动相为：50 mMPBS + 0.15 M NaCl，pH 7.0，上样量100μL，流速0.6mL/min，操作时间40min。

②等电点分析：利用全柱成像毛细管等电聚焦电泳分析EL样品的等电点。

实验仪器：全柱成像毛细管等电聚焦电泳仪（型号：Maurice C；厂家：ProteinSimple），毛细管：免组装毛细管卡盒，毛细管内径 100μm，长度5 cm；

检测方法和条件：进样（压力进样），聚焦（1500V，1min），迁移（3000V，6~10min），仪器温度（10℃），检测器（紫外280nm）。

③ 多肽含量分析：BCA法测定洗脱液中多肽含量。

实验仪器：紫外分光光度计（型号：UV1800；厂家：TOSOH），检测试剂：BCA快速检测试剂盒（货号：A53225；厂家：Thermo）。

检测方法：1）梯度稀释牛血清白蛋白（BSA）标准品（试剂盒提供）至0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mg/mL；2）配置BCA工作液（试剂盒中工作液A 100mL+工作液B 2mL混匀）；3）将稀释后的标准品及稀释后的待测样品（EL、FT样品稀释5倍，PAT、PAT冻干粉样品稀释10倍）分别加入至酶标板中（20μL每孔），加入BCA工作液200μL，37℃孵育30min；4）562nm读取各孔吸光度，绘制标准曲线，计算待测样品浓度。

（3）分离得到的脾氨肽酸性多肽的生物活性评估

【试验分组】：本试验中分为四组，分别为：（a）利用实施例1中所述方法A分离得到的洗脱液简称EL；（b）利用实施例1中所述方法分离A得到的流穿液简称FT：（c）脾氨肽原液，简称PAT（北京第一生物化学药业有限公司，批号200305）；（d）脾氨肽原液冻干粉，简称PAT冻干粉（由（c）组所述脾氨肽原液经冷冻干燥制得）。

具体使用的试剂和评估的操作方法为：

一、试剂

（1）Hank’s液：取氯化钠8.0g，氯化钾0.4g，碳酸氢钠0.35g，磷酸二氢钾0.06g，磷酸氢二钠0.06g，葡萄糖1.0g，加水，溶解，稀释至1000ml，用4％碳酸氢钠溶液调节pH值至7.3～7.4(临用前配制)。

（2）分离液：为TBD猪外周血淋巴细胞分离液。

（3）抗体：为CD2单克隆抗体（种属反应性为抗猪）。

（4）PBS缓冲液：磷酸二氢钾0.24g，磷酸氢二钠1.44g，氯化钠8g，氯化钾0.2g；加水约800ml，充分搅拌溶解，然后加入浓盐酸调pH至7.4，定容至1L。

二、操作方法

（1）胸腺T细胞悬液的制备：取新鲜猪胸腺（运输全程应保证4℃冷链，运输时间控制在4小时以内）4-5g，去除脂肪并剪碎，加适量Hank’s液使成细胞悬液，经100目筛滤过，取滤液，每分钟1500转离心5分钟，弃去上清液，沉淀同法离心、弃去上清液重复处理3次。取沉淀加入15ml Hank’s液，振荡均匀，将此混悬液转入已加5ml分离液的50ml离心管中，每分钟2000转离心20分钟。弃去上层，小心吸取中间层的胸腺T细胞，转入另一50ml离心管中，加适量Hank’s液洗涤，摇匀，以每分钟1500转离心5分钟。弃去上清液，加适量Hank’s液洗涤，摇匀，再以每分钟1500转离心5分钟。弃去上清液，在沉淀中加入适量Hank’s液混匀并稀释，使用显微计数法计数，使最终浓度为每1ml中含1×10⁶个细胞。

（2）脱E受体胸腺T细胞悬液的制备：取上述新鲜猪胸腺4-5g，参照上述步骤（1）胸腺T细胞悬液的制备中自“去除脂肪并剪碎，……再以每分钟1500转离心5分钟”部分相同的方法操作得到胸腺T细胞沉淀。在沉淀中加入适量Hank’s液，混匀，45℃水浴保温30分钟(每隔5分钟振摇30秒)取出，每分钟1500转离心5分钟，弃去上清液，加入适量Hank’s液，混匀，置45℃水浴保温30分钟后取出，每分钟1500转离心5分钟，弃去上清液。用Hank’s液混匀并稀释，使用显微计数法计数，使最终浓度为每1ml中5×10⁶个细胞。

（3）样品溶液的制备：分别取4组待测样品，用Hank’s液稀释制成0.5mg/mL浓度的溶液10mL，配液操作见表2。

表2 样品溶液的配制

（4）测定方法：取1.5ml离心管4支，各加Hank’s液500µl，其中3支分别加入脱E受体胸腺T细胞悬液50µl，作为空白管。另1支加入胸腺T细胞悬液50µl，作为阳性管。再取1.5ml离心管1支，加样品溶液500µl（如：EL稀释液），加脱E受体胸腺T细胞悬液50µl，作为供试品管。取上述5支离心管于37℃保温1小时。

取上述空白管2支和阳性管1支，分别以每分钟1500转离心5分钟，弃去上清液，分别加200µl PBS缓冲液，混匀。从中取出空白管和阳性管各1支，分别加入CD2单克隆抗体5µl做染色处理，阳性管和空白管同时避光冰浴30分钟后取出。分别以每分钟1500转的速率离心5分钟，弃去上清液，加入PBS缓冲液1ml，振荡均匀，重复操作1次，空白管和阳性管分别加入PBS缓冲液200µl，混匀，用100目尼龙筛网过滤后，取滤液，分别用流式细胞仪检测。用未染色的空白管结果确定胸腺T细胞分选区域，染色的空白管胸腺T细胞占比应小于细胞总数的60%，阳性管中胸腺T细胞占比应大于细胞总数的70%。

另取上述剩余的空白管和供试品管各1支，37℃保温12小时后，分别以每分钟1500转的速率离心5分钟，弃去上清液，加200µl的PBS缓冲液，混匀。分别加入CD2单克隆抗体5µl做染色处理，避光冰浴30分钟。取出，分别以每分钟1500转的速率离心5分钟，弃去上清液，加入PBS缓冲液1ml，振荡均匀，再以每分钟1500转的速率离心5分钟，弃去上清液，加入PBS缓冲液200µl，混匀，用100目尼龙筛网过滤后，取滤液，用流式细胞仪分别检测供试品管与空白管的恢复E受体功能的胸腺T细胞数量占比，按下式计算样品活力。

【计算公式】：

样品比活（%）=供试品管恢复E受体功能的胸腺T细胞数量占细胞总数之比（%）-空白管恢复E受体功能的胸腺T细胞数量占细胞总数之比（%）/样品多肽浓度

样品比活即单位质量多肽的样品活力。

【试验结果】

(I)关于脾氨肽原液中酸性多肽的分离结果和纯度，如图2所示，DEAE层析将脾氨肽原液分为两个组，即流穿液（FT）峰，洗脱液（EL）峰。如图3所示，HPLC-SEC液相色谱分析EL的纯度大于90%。

(II)关于脾氨肽原液中酸性多肽的等电点，如图4所示，EL洗脱液样品等电点pI=3.38。

(III)关于脾氨肽原液中酸性多肽的含量，如图5示出了BCA蛋白试剂盒标准曲线，BCA法测定洗脱液（EL）多肽含量为0.85mg/mL。

相同方法测得脾氨肽原液（PAT）、脾氨肽原液冻干粉（PAT冻干粉）、洗脱液（EL）和流穿液（FT）中多肽含量结果如表3：

表3 各样品多肽含量结果

(IV)关于从脾氨肽原液中分离得到的酸性多肽的生物活性，如图6所示，各组样品的比活性结果为：洗脱液（EL）>流穿液（FT）>脾氨肽原液冻干粉（PAT冻干粉）>脾氨肽原液（PAT）。具体来说，根据T细胞脱E受体实验恢复活性的结果可以看出，利用实施例1中所述方法分离得到的洗脱液中的洗脱组分即脾氨肽原液中的酸性多肽的比活最高，其比活高约181%。采用相同活性检测方法，得到的EL、FT、PAT和PAT冻干粉的多肽浓度和样品比活数据如表4所示：

表4 各样品比活数据

实施例2：脾氨肽原液中酸性多肽的离子层析分离方法及其鉴定和生物活性评估

（1）脾氨肽原液中酸性多肽的分离方法B

1)、样品预处理：取脾氨肽原液冷冻样品，融化后离心（具体条件为4℃，6000 r/min，10 min），取上清液，用1.0M的盐酸溶液调节pH值为6.0，作为分析样品；

2)、阴离子交换琼脂糖凝胶柱层析分离：

缓冲液A：50 mM 磷酸盐液缓冲液，pH 6.0

缓冲液B：50 mM磷酸盐液缓冲液+1M氯化钠，pH 6.0

层析柱：DEAE Sepharose Fast Flow层析柱（26mm×250mm, CV=120ml，填料颗粒平均粒径为90μm）

检测波长：280nm，260nm双波长

柱温：25℃

流速：8.0ml/min

上样前，用缓冲液A 3CV（360mL）平衡DEAE Sepharose Fast Flow层析柱。平衡后上样170ml脾氨肽预处理液，用缓冲液A 2CV（240mL）进行淋洗，收集样品为流穿液（FT）；再用缓冲液A和缓冲液B 3CV（360mL）进行梯度（0%~30%的缓冲液B）洗脱，收集到的为洗脱液（EL），后继续用100%缓冲液B洗脱2.5CV（300mL）。具体操作如表5：

表5 实施例2具体操作参数

（2）重复性验证试验：

用Capto DEAE对170mL的脾氨肽原液进行多次层析纯化，通过观察图谱的峰型、确认重复性是否良好。

具体方法为：

缓冲液A：50 mM 磷酸盐液缓冲液，pH 6.0

缓冲液B：50 mM磷酸盐液缓冲液+1M氯化钠，pH 6.0

层析柱：Capto DEAE层析柱（26mm×250 mm, CV=120 ml，填料颗粒平均粒径为90μm）

检测波长：280nm，260nm双波长

柱温：25℃

流速：8.0ml/min

上样前，用缓冲液A 3CV（360mL）平衡Capto DEAE层析柱。平衡后上样170ml脾氨肽预处理液，用缓冲液A 2CV（240mL）进行淋洗，收集样品为流穿液（FT）；再用缓冲液A和缓冲液B 3CV（360mL）进行梯度（0%~30%的缓冲液B）洗脱，收集到的为洗脱液（EL），后继续用100%缓冲液B洗脱2.5CV（300mL）。

（3）脾氨肽原液中酸性多肽的鉴定

纯度分析：将分离所得洗脱液样品收集，经HPLC-SEC分析柱（Superdex Peptide10/300GL，CV=24mL）测定洗脱组分中酸性多肽的纯度。

具体测定条件为，流动相为：50 mM PBS + 0.15 M NaCl，pH 7.0，上样量100μL，流速0.6mL/min，操作时间40min。

【试验结果】

(I)关于脾氨肽原液中酸性多肽的分离结果，如图7所示，按实施例2采用DEAE层析的B方法将脾氨肽原液分为两个组，即流穿液（FT）峰，洗脱液（EL）峰。

如图8所示，通过高效液相色谱-空间排阻色谱（HPLC-SEC）法测定了洗脱组分的纯度大于95%。

（II）如图9所示，用Capto DEAE对脾氨肽原液（上样量170mL）进行了7次层析纯化重复性试验，结果显示层析图谱的峰型基本一致，重复性好。

Claims

1.一种脾氨肽原液中酸性多肽的提取方法，其特征在于，所述提取方法包括以下步骤：

(1)样品预处理：取脾氨肽原液冷冻样品，融化后离心弃沉淀，得到脾氨肽预处理液；

(2)层析柱层析分离：用缓冲液A平衡层析柱，上样步骤(1)中所述脾氨肽预处理液，继续用缓冲液A进行淋洗，收集得到流穿液；然后联用缓冲液A和缓冲液B进行梯度洗脱，收集得到洗脱液；

其中步骤(2)中所述缓冲液A为25～75mM的磷酸盐缓冲液、其pH为5.0～7.0；所述缓冲液B由25～75mM的磷酸盐缓冲液和0.5～1.5M的氯化钠组成、其pH为5.0～7.0；所述层析柱为阴离子交换琼脂糖凝胶层析柱；

所述步骤(2)中的色谱条件为：层析柱内径为10～26mm，柱长为50mm～250mm，填料颗粒直径为30～100μm，梯度洗脱过程中缓冲液B的初始比例为0％，梯度洗脱过程中缓冲液B的最终比例为30％～100％，梯度洗脱时间为15～90min。

2.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述缓冲液A为50mM的磷酸盐缓冲液、其pH为6.0，所述缓冲液B由50mM的磷酸盐缓冲液和1.0M的氯化钠组成、其pH为6.0。

3.根据权利要求1或2所述的提取方法，其特征在于，所述层析柱为DEAE-SepharoseFast Flow层析柱、Q-Sepharose Fast Flow层析柱或Capto DEAE层析柱。

4.根据权利要求1或2所述的提取方法，其特征在于，所述步骤(2)中的色谱条件还包括：柱温20～30℃，流速1～10ml/min，进样量5～170ml，检测波长为280nm/260nm。

5.根据权利要求4所述的提取方法，其特征在于，所述步骤(2)中的色谱条件中的柱温为25℃，流速为8ml/min，填料颗粒直径为90μm。

6.根据权利要求1或2所述的提取方法，其特征在于，步骤(1)中的离心条件为2～8℃，4000～10000r/min，8～30min。

7.根据权利要求6所述的提取方法，其特征在于，所述步骤(1)中的离心条件为4℃，6000r/min，10min。

8.根据权利要求1或2所述的提取方法，其特征在于，步骤(2)中所述洗脱液中酸性多肽的含量为0.3～1.0mg/mL。

9.根据权利要求1或2所述的提取方法，其特征在于，还包括步骤(3)冷冻干燥，对步骤(2)得到的洗脱液进行冷冻干燥，得到冻干粉。

10.利用权利要求1～9中任一项所述的提取方法制备得到的脾氨肽酸性多肽。

11.根据权利要求10所述的酸性多肽，其特征在于，所述酸性多肽的等电点为3.38。