CN114913065A - 基于空间共定位掩模过滤的超分辨sim-fret图像重建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于空间共定位掩模过滤的超分辨SIM‑FRET图像重建方法,本发明采用统一的维纳重建参数进行FRET三通道SR‑SIM线性维纳重建,该重建方法可以最大程度保持原始图像荧光强度的线性关系进而满足FRET计算荧光强度的保真度的要求;进一步的本发明实现了一种空间共定位掩模生成方法,其可有针对性地过滤去除SR‑SIM线性维纳重建的随机噪声伪像带来的FRET假阳性信号,同时保留具有超分辨精细结构的FRET信号,进而实现FERT的定量超分辨检测。
Description
技术领域
本发明属于荧光共振能量转移检测的技术领域,具体涉及一种基于空间共定位掩模过滤的超分辨SIM-FRET图像重建方法。
背景技术
荧光共振能量转移(FRET)显微成像技术是目前唯一可以在单个活细胞中长时间实时检测生物大分子间动态相互作用的及空间分布的技术,其理论上可以通过显微成像的方式在活细胞中实时定量分析10nm尺度下蛋白分子相互作用,但是FRET显微成像受限于荧光显微镜衍射极限对分辨能力的约束,使得在观测亚细胞区域内蛋白分子相互作用及空间定位时只能进行推测而不能得到直接观测结果。结构光超分辨(SR-SIM)显微成像技术的发展使得更精细观测100nm尺度内亚细胞空间结构成为可能,其照明光强度低,成像速度快,具有多色成像能力,使得融合SR-SIM和FRET技术实现活细胞动态超分辨定量SIM-FRET成像成为可能。
SR-SIM实现的超分辨成像非常依赖于重建算法并极易产生伪像,而FRET定量分析需要对输入图像在空间结构和荧光强度的保真度提出较高要求。因此SIM伪像的产生和定量FRET显微成像成为阻碍两者融合的矛盾。SR-SIM伪像主要来自于两部分:1、参数估计的误差导致的被测样本空间分布的空间结构伪像;2、由探测器件产生的噪声在重建过程中放大而产生随机噪声伪像。前者通过更鲁棒的参数估计算法可以很大程度的解决,且参数误差修正后空间结构的保真度和荧光灰度的保真度可以得到保留,从而不影响FRET的定量分析。后者虽然可以通过提高探测器收集的光子数来提高信噪比或者在重建过程中引入去噪的正则化参数约束来去除,但经过SR-SIM正则化参数约束迭代重构后的超分辨图像荧光强度是否仍然与原始图像有线性的定量关系存疑,因此不适合将迭代重构的超分辨图像作为FRET计算的输入。SR-SIM的线性重建算法原理上可以保持原始图像荧光强度的线性关系,但其缺点是不可避免产生的随机噪声伪像,这种随机噪声伪像会在FRET计算中产生假阳性的FRET信号显著影响FRET效率E和Rc的定量计算。
发明内容
本发明的主要目的在于克服现有技术的缺点与不足,提供一种基于空间共定位掩模过滤的超分辨SIM-FRET图像重建方法。
为了达到上述目的,本发明采用以下技术方案:
本发明的一个方面,提供了一种基于空间共定位掩模过滤的超分辨SIM-FRET图像重建方法,包括下述步骤:
获取经过结构光调制的FRET三通道原始图像数据组;所述FRET三通道包括供体激发供体发射通道DD、受体激发受体发射通道DA以及供体激发受体发射通道AA;
基于统一维纳重建参数进行FRET三通道结构光超分辨线性维纳重建,得到FRET三通道超分辨图像数据;
对FRET三通道超分辨图像进行数据对齐处理;
对FRET三通道超分辨图像进行扣背景处理;
根据DD、AA通道FRET区域图像的强相关特性生成空间共定位掩模版,并根据空间共定位掩模版去除FRET假阳性信号;
将去除FRET假阳性信号的超分辨图像进行FRET效率和供受体浓度比的测量。
作为优选的技术方案,所述获取经过结构光调制的FRET三通道原始图像数据组具体为:
通过SR-SIM系统获取基于通道敏化强度测量法的三通道原始图像数据组,包括供体通道图像组受体通道图像组以及FRET通道图像组其中r=(x,y)为荧光图像像素的空域坐标,每一组原始图像数据组包含若干个不同的结构光方向角,每个结构光方位角包含若干个不同相位差的余弦结构光照明宽场荧光图像。
作为优选的技术方案,所述基于统一维纳重建参数进行FRET三通道结构光超分辨线性维纳重建具体为:
其中,为FRET通道X相应图像的傅里叶变换;k为荧光图像像素转化到频域的坐标,为FRET通道X相应结构光方向角θ下的初相位,为FRET通道X相应结构光方向角θ下的调制深度,为FRET通道X相应结构光方向角θ下的空间频率,为SR-SIM系统的光学传递函数,表示FRET通道X对应SR-SIM系统的光学传递函数在频域空间按照空间频率矢量kθ和-kθ进行频谱搬移, 分别表示的共轭,通道X包括供体激发供体发射通道DD、受体激发受体发射通道DA以及供体激发受体发射通道AA;w为重建维纳参数,为高斯型切趾函数,iFFT为图像的反傅里叶变换。
作为优选的技术方案,所述对FRET三通道超分辨图像进行数据对齐处理具体为:
作为优选的技术方案,所述对FRET三通道超分辨图像进行扣背景处理具体为:
对FRET每个成像通道重建获得的超分辨图像进行逐像素灰度值统计,然后以灰度值直方图中第一个峰值对应的灰度值视为该视野的背景灰度值对图像进行背景修正并将负的像素灰度值置零后得到每个成像通道的修正图像,具体为:
作为优选的技术方案,所述根据DD、AA通道FRET区域图像的强相关特性生成空间共定位掩模版,具体为:
将rmap与Rmap相乘得到混合共定位权重矩阵,并通过自适应阈值处理算法进行混合共定位权重矩阵的分割生成二值化掩膜板Bcolocalmask,如下式:
其中,th为自适应阈值处理算法的阈值。
作为优选的技术方案,所述进行FRET效率和供受体浓度比的测量具体为:
其中,ESIM为结构光超分辨下的FRET效率,RcSIM为结构光超分辨下的FRET供受体浓度比,FcSIM为受体敏化发射荧光强度,G为敏化淬灭转化因子,K为供受体浓度转化因子,a、b、c、d为系统串扰系数。
本发明与现有技术相比,具有如下优点和有益效果:
(1)本发明采用统一的维纳重建参数进行FRET三通道SR-SIM线性维纳重建,可以最大程度保持原始图像荧光强度的线性关系进而满足定量FRET计算荧光强度的保真度的要求;
(2)本发明通过生成空间共定位掩模,并通过该掩模有针对性地去除SR-SIM线性维纳重建的随机噪声伪像带来的FRET假阳性信号,同时能有效保留大部分具有超分辨精细结构的FRET信号,进而实现FERT的定量超分辨检测。
附图说明
图1是本发明实施例所述基于空间共定位掩模过滤和SR-SIM的FRET图像重建方法的流程图;
图2是本发明实施例所述生成空间共定位掩模版的示意图;
图3本发明的仿真重建结果示意图;其中,图3(a)为仿真模型的真值结果,图3(b)为仿真FRET三通道原始图像数据组经过宽场重建的结果,图3(c)为仿真FRET三通道原始图像数据组经过结构光超分辨线性维纳重建但未进行掩膜滤波的结果,图3(d)为仿真FRET三通道原始图像数据组经过结构光超分辨线性维纳重建并根据现有方法进行掩膜滤波的结果,图3(e)为仿真FRET三通道原始图像数据组经过结构光超分辨线性维纳重建并根据和使用空间共定位进行掩膜滤波的结果;
图4本发明的方法在不同信噪比时的效果示意图;其中,图4(a)为本发明的共定位掩膜过滤方法在不同信噪比时的效果示意图,图4(b)为常规FRET掩膜过滤方法在不同信噪比时的效果示意图。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本申请方案,下面将结合本申请实施例中的附图,对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然,所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例,本领域技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本申请保护的范围。
实施例
如图1所示,本实施例提供了一种利用空间共定位掩模过滤的结构光照明超分辨FRET图像重建方法,包括以下步骤:
S1、获取经过结构光调制的FRET三通道原始图像数据组;所述FRET三通道包括供体激发供体发射通道DD、受体激发受体发射通道DA以及供体激发受体发射通道AA,针对不同的FRET供受体,FRET的相应激发发射通道也有所不同,在本实施例中选用荧光蛋白对GFP-mCherry作为FRET供受体对,其中供体激发通道采用488nm的激光作为供体的激发光,供体发射通道采用525±15nm的通道做为供体的发射荧光探测通道,受体激发通道采用561nm的激光作为受体的激发光,受体发射通道采用600±15nm的通道做为受体的发射荧光探测通道;
通过SR-SIM系统获取基于通道敏化强度测量法(E-FRET方法)的三通道原始图像数据组,包括供体通道图像组(供体激发供体发射通道DD探测到的荧光图像组)、受体通道图像组(受体激发受体发射通道AA探测到的荧光图像组)以及FRET通道图像组(供体激发受体发射通道DA探测到的荧光图像组);其中r=(x,y)为荧光图像像素的空域坐标,每一组原始图像数据组包含若干个不同的结构光方向角,每个结构光方位角包含若干个不同相位差的结构光调制的宽场荧光图像。
特别的,在本实施例中,每一组原始图像数据组包含三个不同的结构光方向角θ1,θ2和θ3,每个结构光方位角包含三个不同相位差n1,n2和n3的结构光调制的宽场荧光图像,采集DD、DA、AA通道共计27张结构光调制的宽场荧光图像,为一种优选的技术方案。
其中,为FRET通道X相应图像的傅里叶变换;k为荧光图像像素转化到频域的坐标,为FRET通道X相应结构光方向角θ下的初相位,为FRET通道X相应结构光方向角θ下的调制深度,为FRET通道X相应结构光方向角θ下的空间频率,为SR-SIM系统的光学传递函数(OTF),表示FRET通道X对应SR-SIM系统的OTF在频域空间按照空间频率矢量kθ和-kθ进行频谱搬移, 分别表示的共轭,通道X包括供体激发供体发射通道DD、受体激发受体发射通道DA以及供体激发受体发射通道AA;w为重建维纳参数,为高斯型切趾函数,iFFT为图像的反傅里叶变换。
特别的,上述进行FRET三通道结构光超分辨线性维纳重建的公式中,每一组原始图像数据组包含三个不同的结构光方向角θ1,θ2和θ3,每个结构光方位角包含三个不同相位差n1,n2和n3,该选择为本实施例的一种优选方式。
进一步地,在超分辨线性维纳重建过程中,维纳参数改变会影响重建后超分辨图像的灰度值,通过保持FRET三通道超分辨重建时维纳重建参数的一致,可以最大程度减少重建图像与原始图像相对荧光强度的失真,进而满足FRET计算时荧光强度的保真度的要求,在本实施例中,维纳参数根据三通道图像信噪比选择0.1-0.5之间的一个常数。
进一步地,FRET通道X相应结构光方向角θ下参数初相位调制深度空间频率矢量可通过现有技术《Gustafsson MGL,et al.Three-dimensional resolutiondoubling in wide-field fluorescence microscopy by structuredillumination.Biophys J,2008》从结构光调制的FRET三通道原始图像数据组中进行参数估计获得。
进一步地,其中FRET通道X相应的光学传递函数(OTF)可通过荧光微球拍摄得到的点扩散函数(PSF)进行傅里叶变换后获得,在本实施例中,FRET DD通道的通过测量488nm激发/525nm发射的80nm荧光微球经过多张平均后进行傅里叶变换获得;FRETDA,AA通道的通过测量561nm激发/600nm发射的80nm荧光微球经过多张平均后进行傅里叶变换获得。
S3、对FRET三通道超分辨图像进行数据对齐处理,具体为:
S4、对FRET三通道超分辨图像进行扣背景处理,具体为:
对FRET每个成像通道重建获得的超分辨图像进行逐像素灰度值统计,然后以灰度值直方图中第一个峰值对应的灰度值视为该视野的背景灰度值对图像进行背景修正并将负的像素灰度值置零后得到每个成像通道的修正图像,计算公式如下。
S5、根据DD、AA通道FRET区域图像的强相关特性生成空间共定位掩模版,并根据空间共定位掩模版去除SR-SIM线性维纳重建的随机伪影带来的FRET假阳性信号;
共定位分析(colocalization)是一种通过分析不同荧光标记在空间中的重叠,来判断这两种荧光标记物否处于同一区域的荧光分析方法。其分辨能力受限于荧光分辨极限约为200nm左右。而在研究FRET物理过程当中,当供体和受体存在FRET效应时供受体对的典型距离尺度为10nm,可以看出发生FRET相互作用的典型距离远小于荧光显微镜的分辨极限。因此可以先验的认为有FRET信号产生的必要条件是供受体有极强的空间共定位。
另一方面,由SR-SIM线性维纳重建产生随机噪声伪像来源于成像系统的噪声,这种噪声通常不具备相关性,因此本发明提出利用荧光通道间共定位相关性来进行FRET假阳性信号的筛选和滤除,如图2所示,具体步骤为:
S5.3、将rmap与Rmap相乘得到混合共定位权重矩阵,并通过自适应阈值处理算法进行混合共定位权重矩阵的分割生成二值化掩膜板Bcolocalmask,如下式:
其中,th为自适应阈值处理算法的阈值,自适应阈值处理算法为现有技术《Wellner PD.Adaptive Thresholding for the DigitalDesk[J].xerox,1993.》在此不做赘述。
S6、进行FRET效率和供受体浓度比的测量,具体为:
其中,ESIM为结构光超分辨下的FRET效率,RcSIM为结构光超分辨下的FRET供受体浓度比,FcSIM为受体敏化发射荧光强度,G为敏化淬灭转化因子,K为供受体浓度转化因子,a、b、c、d为系统串扰系数。
进一步地,敏化淬灭转化因子G,供受体浓度转化因子k,系统串扰系数a、b、c、d可通过制备两种不同固定FRET效率、供受体浓度比为1:1的标准质粒样本以及单独转染供体和受体质粒样本进行测定,针对不同的FRET供受体及FRET测量系统,a、b、c、d、G、K等系统参数也有所不同,在本实施例中通过预先测量获得a=0.010135、b=0.001037、c=0.001641、d=0.111086G=0.621361、k=0.292009。
为了进一步直观展示出超分辨SIM-FRET进行空间共定位掩膜滤波的效果,并和传统宽场FRET,超分辨SIM-FRET不进行掩膜滤波以及进行常规掩膜滤波的结果进行对比,我们以GFP-mCherry作为供受体对结合上述实施例中实际系统参数仿真构建的一个仿真模型,该模型假设固定FRET效率为30%和供受体浓度比为1:1的供受体全部分布在放射状星型图案的白色区域内,其他黑色区域的FRET效率为0,放射状星型图案可以通过中心密集到边缘稀疏的空间分布很好的仿真出供受体在实际生物样本中既有稀疏又有密集的分布特性;为了贴近显微成像真实的成像过程,采用和实际系统一致的参数依次(1)模拟结构光照明调制FRET样本(2)PSF对结构光照明调制的真值结果图像进行卷积(3)加入%5强度的高斯和泊松混合加性噪声(4)根据FRET三通参数重复(1-3)来仿真FRET三通道原始图像数据组。
图3为对上述模型的重建结果示意图;其中图3(a)给出了仿真模型的真值结果,图3(b)给出了仿真FRET三通道原始图像数据组经过宽场重建的结果,图3(c)给出了仿真FRET三通道原始图像数据组经过结构光超分辨线性维纳重建但未进行掩膜滤波的结果,图3(d)给出了仿真FRET三通道原始图像数据组经过结构光超分辨线性维纳重建并根据本课题组此前公布的《用于在线E-FRET定量成像的自动背景识别与数据筛选》方法进行掩膜滤波的结果,图3(e)给出了仿真FRET三通道原始图像数据组经过结构光超分辨线性维纳重建并根据和使用空间共定位进行掩膜滤波的结果,从图3(a)和图3(c)、图3(d)、图3(e)的对比可以看出本发明采用统一的维纳重建参数进行FRET三通道SR-SIM线性维纳重建的结果对比真值有一致性;从图3(a)、图3(b)、图3(e)之间的对比可以看出,本发明的SIM-FRET对比传统宽场下的FRET计算重建出了更多超越衍射极限精细结构的FRET信号且这些精细结构FRET信号对比真值具有一致性,进一步表现出本发明的方法满足FRET计算荧光强度的保真度的要求;由图3(c)、图3(d)、图3(e)可以看出空间共定位掩模过滤可以对比常规的FRET掩膜过滤和不进行掩膜过滤可以有效去除SR-SIM线性维纳重建的随机伪影带来的FRET假阳性信号,进而实现FERT的定量超分辨检测。
图4为本发明的方法在不同信噪比时的效果示意图,图4(a)为本发明的共定位掩膜过滤方法在不同信噪比时的效果示意图,图4(b)为常规FRET掩膜过滤方法在不同信噪比时的效果示意图。可见本发明的共定位掩膜过滤方法对比常规FRET掩膜过滤方法在不同信噪比条件下都具备更好的假阳性信号过滤和精细结构保留能力,进一步表现出本发明的方法的鲁棒性。
上述实施例为本发明较佳的实施方式,但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制,其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化,均应为等效的置换方式,都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.基于空间共定位掩模过滤的超分辨SIM-FRET图像重建方法,其特征在于,包括下述步骤:
获取经过结构光调制的FRET三通道原始图像数据组;所述FRET三通道包括供体激发供体发射通道DD、受体激发受体发射通道DA以及供体激发受体发射通道AA;
基于统一维纳重建参数进行FRET三通道结构光超分辨线性维纳重建,得到FRET三通道超分辨图像数据;
对FRET三通道超分辨图像进行数据对齐处理;
对FRET三通道超分辨图像进行扣背景处理;
根据DD、AA通道FRET区域图像的强相关特性生成空间共定位掩模版,并根据空间共定位掩模版去除FRET假阳性信号;
将去除FRET假阳性信号的超分辨图像进行FRET效率和供受体浓度比的测量。
3.根据权利要求1所述的基于空间共定位掩模过滤和SR-SIM的FRET图像重建方法,其特征在于,所述基于统一维纳重建参数进行FRET三通道结构光超分辨线性维纳重建具体为:
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CN202210332681.6A CN114913065A (zh) | 2022-03-31 | 2022-03-31 | 基于空间共定位掩模过滤的超分辨sim-fret图像重建方法 |
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CN116757926A (zh) * | 2023-05-22 | 2023-09-15 | 华南师范大学 | 基于自监督学习图像去噪的超分辨sim-fret成像方法与系统 |
CN116757926B (zh) * | 2023-05-22 | 2024-04-05 | 华南师范大学 | 基于自监督学习图像去噪的超分辨sim-fret成像方法与系统 |
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