CN114886892B - 氧化吲哚螺双环[2,2,1]庚烷类化合物在制备治疗胃癌药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种氧化吲哚螺双环[2,2,1]庚烷类化合物(化合物14‑5‑18)在制备治疗胃癌药物中的应用。该药物通过抑制GIT1/β‑Pix复合物的形成，而抑制胃癌细胞侵袭转移。

Description

氧化吲哚螺双环[2,2,1]庚烷类化合物在制备治疗胃癌药物 中的应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，特别涉及一种氧化吲哚螺双环[2,2,1]庚烷类化合物(化合物14-5-18)在制备治疗胃癌细胞侵袭转移药物中的应用。

背景技术

胃癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，已成为我国第三大癌症死亡原因。虽然目前已采取手术、放疗、化疗、生物治疗等综合治疗手段，但其5年生存率仍较低，部分原因是胃癌细胞的快速转移。采用奥沙利铂、伊立替康等药物治疗晚期胃癌的方案都具有较好的耐受性，且疗效显著，但是大多伴有严重的毒副作用，尤其是Ⅲ、Ⅳ级的外周神经损伤、呕吐以及腹泻。为此，迫切需要针对其转移的更有效的治疗方法。

G蛋白偶联受体激酶相互作用(G protein-coupled receptor(GPCR)-kinaseinteracting protein,GIT)蛋白，包括GIT1和GIT2，是ADP核糖化因子(ADP-ribosylationfactor,Arf)小分子GTP结合蛋白的GTP酶激活蛋白(GTPase activing protein,GAP)。P21激活的激酶相互作用交换因子(Pak-interactive exchange factor,Pix)蛋白，包括α-Pix和β-Pix，是激活Rho家族小分子GTP结合蛋白家族成员Rac1和Cdc42的鸟嘌呤核苷酸交换因子(Guanine nucleotide exchange factor,GEF)

目前，众多研究证据表明，GIT1/β-Pix复合物与等多种恶性肿瘤的侵袭转移过程高度相关。在仓鼠卵巢细胞中，GIT/PIX复合物被接头蛋白Paxlin招募到焦点黏附中，并通过激活下游的Rho GTP酶GTP-Rac1/Cdc42等参与细胞迁移，促进肌动蛋白聚合和伪足的形成，产生推动细胞前进的动力，导致细胞定向迁移。此外，敲降GIT1能够抑制高转移乳腺癌细胞迁移和侵袭能力，以及裸鼠尾静脉肺转移模型中癌细胞的侵袭转移；在胶质母细胞瘤细胞中，敲低β-Pix或α-Pix会增加螯合泛素连接酶Cbl活性，减少迁移和侵袭，降低致瘤性。此外，有研究表明，GIT1/β-Pix复合物可被肿瘤转移抑制因子N-α-乙酰转移酶10蛋白(N-α-acetyltransferase 10protein，Naa10p)抑制，降低Cdc42/Rac1的激活，从而抑制人肺腺癌细胞的侵袭转移，提示GIT1/β-Pix蛋白复合物可能是肿瘤侵袭转移的促进因子。因此，研究GIT1与β-Pix相互作用的分子机制和在肿瘤侵袭转移中的功能有利于发现癌症治疗的新靶点和开发肿瘤治疗的新型药物。然而，尚未报道针对这种具有挑战性的蛋白-蛋白相互作用的小分子实体。

发明内容

本发明的目的是提供一种氧化吲哚螺双环[2,2,1]庚烷类化合物在制备治疗胃癌药物中的应用，该药物通过抑制GIT1/β-Pix复合物的形成，而抑制胃癌细胞侵袭转移。

本发明的技术方案是：

氧化吲哚螺双环[2,2,1]庚烷类化合物在制备治疗胃癌药物中的应用。

所述药物为抑制剂。

所述抑制剂抑制胃癌细胞的侵袭转移。

所述抑制剂抑制胃癌细胞GIT1与β-Pix的相互作用。

所述化合物14-5-18的结构式为：

所述药物以口服方式给药。

所述药物用药量为每公斤每天10～30mg。

本发明所述应用，申请人采用体外和体内模型，系统地研究了化合物14-5-18对胃癌侵袭转移的潜在抑制作用，通过实验验证，化合物14-5-18通过抑制GIT1与β-Pix的相互作用，而抑制胃癌的侵袭转移。

附图说明

图1为6种氧化吲哚螺双环[2,2,1]庚烷类化合物结构式；

图2为FP实验检测6种氧化吲哚螺双环[2,2,1]庚烷类化合物对GIT1/β-Pix抑制活性；

图3为FP实验检测化合物14-5-18K_i值；

图4为免疫共沉淀分析化合物14-5-18对GIT1/β-Pix相互作用的抑制效果；

图5为检测GIT1在胃上皮细胞(GES-01)和胃癌细胞系(MGC803、MKN45、SGC7901、AGS、BGC823)的表达水平；

图6为Transwell分析化合物14-5-18对胃癌细胞侵袭转移能力的影响；

图7为动物实验分析化合物14-5-18对胃癌细胞侵袭转移能力的影响；

图8为动物实验终点小鼠肺组织的H&E染色；

图9为免疫共沉淀分析GIT1上β-Pix结合位点突变对GIT1/β-Pix相互作用的影响；

图10为Transwell分析GIT1上β-Pix结合位点突变后化合物14-5-18对胃癌细胞侵袭转移抑制作用的变化。

具体实施方式

一.试剂

DMEM培养基、胰酶-EDTA、青霉素和链霉素购自Thermo(美国)；

胎牛血清(FBS)购自Lonsera(乌拉圭)；

细胞裂解液RIPA、蛋白酶抑制剂，磷酸酶抑制剂、4x Laemmli Sample Buffer、BCA试剂盒、Tween-80购自Beyotime(中国)；

HA、FLAG抗体购自Cell Signaling Technology(美国)；

抗HA琼脂糖单抗、抗FLAG琼脂糖单抗、DMSO购自Sigma(美国)；

FITC-β-Pix及β-Pix多肽购自强耀生物(中国)；

0.8μm孔大小的底部过滤小室、Matrigel基质胶购自Corning(美国)；

PVDF膜、脱脂牛奶、辣根过氧化物酶标记的二抗、SDS-PAGE配胶试剂盒、化学发光试剂盒购自Bio-Rad(美国)；

4％多聚甲醛购自Servicebio(中国)；

结晶紫购自MCE(美国)；

Tris购自生工(中国)；

氯化钠购自克隆化学(中国)；

其他试剂均采用生物级或分析纯试剂。

二.试剂配制

Tris-HCl缓冲液配制：50mM Tris，100mM氯化钠，加入盐酸调节pH至7.5，4℃保存，每3个月重新配制。

GIT1蛋白缓冲液母液配制：用dd H₂O将GIT1蛋白配制为100μM蛋白母液，于-80℃分装保存。

FITC-β-Pix母液配制：用dd H₂O将FITC-β-Pix(MW：2799.13)配制成为5mM储备液，再将适量5mM储备液用Tris-HCl缓冲液(pH＝7.5)稀释为2μM储存液，于-80℃避光分装保存。

β-Pix母液配制：用dd H₂O将PIX(MW：2278.58)配制成为5mM储备液，再将适量5mM储备液用dd H₂O稀释为100μM储存液，于-80℃分装保存。二.化合物14-5-18的生物学实验方法

1.极化荧光实验

向黑色96孔板加入终浓度为0.3μM的GIT1和0.04μM FITC-β-Pix，十字摇匀使其充分结合。再加入待测小分子化合物，放入酶标仪震荡30s后，室温避光孵育1h、2h、3h读取体系极化值。根据体系极化值是否下降，确定小分子是否对GIT1/β-Pix的相互作用具有抑制活性。

实验分组设置(表1)：GIT1对照组，FITC-β-Pix对照组，GIT1蛋白+FITC-β-Pix对照组，DMSO对照组，阳性对照组和化合物实验组。通过与对照组的数据对比，确保体系稳定无干扰。

表1极化荧光反应体系

(4)计算蛋白与化合物半抑制浓度IC₅₀及亲和力常数K_i

IC₅₀值：化合物分别配置为0.1μM，0.5μM，1μM，5μM，10μM，25μM，50μM，100μM，250μM和500μM，依次将40μL GIT1、20μL FITC-β-Pix和20μL化合物加入到96孔板中，室温避光孵育1h、2h、3h后读取极化值。利用GraphPad Prism 8.0软件非线性回归方法Dose-response-Inhibition log(inhibitor)vs.response-Variable slope(four parameters)模型计算IC₅₀值。

化合物亲和力常数K_i值：公式1中K_i值是受体(蛋白质)抑制剂的抑制常数，IC₅₀是从受体上竞争性解离50％的配体所需的抑制剂浓度，L是游离配体的浓度，K_d值为受体和配体间的解离常数。但在实际应用中，我们无法直接测量出未结合配体的浓度。因此，我们使用另一种K_i值计算方法(公式2-5)。其中[P]₀：抑制率为0％时蛋白P浓度；[P]_T：蛋白总浓度；[L]_T：荧光标记配体总浓度；[L]₅₀：抑制率为50％时荧光标记配体浓度；[I]₅₀：抑制率为50％时抑制剂浓度；PL：蛋白-荧光配体复合物；[PL]₀和[PL]₅₀：抑制率为0％或50％时PL浓度；

K_i＝IC₅₀/(1+[L]/K_d) (1)

[L]₅₀＝[L]_T-[PL]₀/2 (3)

[L]₅₀＝IC₅₀-[P]_T+K_d×[PL]₅₀/[L]₅₀+[PL]₅₀ (4)

K_i＝[I]₅₀/([L]₅₀/K_d+[P]₀/K_d+1) (5)

2.实验动物与处理

雌性裸鼠(4周龄，体重11-13g)从维通利华购买。

采用尾静脉注射带有荧光素酶基因的胃癌细胞MGC803建立侵袭转移裸鼠模型，通过活体成像观察造模成功后，将所有裸鼠随机分为三组(每组6只)：

1)对照组：对照组裸鼠仅接受溶剂处理；

2)化合物14-5-18 10mg/kg组：裸鼠仅接受化合物14-5-18 10mg/kg治疗；

3)化合物14-5-18 30mg/kg组：裸鼠仅接受化合物14-5-18 30mg/kg治疗；

将化合物14-5-18溶解在DMSO﹕Tween-80﹕超纯水(体积比2﹕5﹕93)的溶剂中，每天向裸鼠灌胃溶剂、10mg/kg化合物14-5-18、30mg/kg化合物14-5-18。在第18天通过活体成像观察各组老鼠胃癌细胞转移情况。

所有实验均按照有关动物护理和使用的相关准则进行。

3.细胞培养

将人胃癌细胞系MKN45、MGC803(美国，ATCC)，带有荧光素酶基因的MGC803在含10％胎牛血清的DMEM中于5％CO₂和37℃细胞培养箱中培养，待细胞数达80％时传代。带有荧光素酶基因的MGC803细胞株需要额外的500μg/mL潮霉素B进行筛选。

4.蛋白免疫印迹分析

将细胞用PBS洗2遍后，用加入蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的裂解液裂解细胞30分钟。在13000rpm下离心15min，取上清，用BCA试剂盒测定上清液中的总蛋白。然后，将含有30μg总蛋白的制备样品经过SDS-PAGE电泳分离蛋白质，并转移到PVDF膜。膜用溶解在5％脱脂牛奶中封闭1h，然后与对应的一抗在4℃下孵育过夜(12h)，用辣根过氧化物酶(HRP)偶联的二抗在室温下孵育2h。最后，使用化学发光试剂盒显示蛋白条带。使用ImageJ软件对条带进行量化。

5.免疫共沉淀

接种293T细胞50万/皿，37℃、5％CO₂条件下培养24h待其贴壁后，转染HA-GIT1、FLAG-PIX培养24h，换对应药物浓度的培养基处理12h后裂解细胞蛋白，在13000转/分下离心15min，除去沉淀的颗粒，用BCA试剂盒测定上清液中总蛋白的含量。随后，将10μl的抗HA-琼脂糖单抗或抗FLAG-琼脂糖单抗加入到200μg的蛋白裂解液中，在4℃旋转孵育过夜。在13000转/分下离心5min，弃上清液，用PBS洗涤，结合蛋白在30μl 4x Laemmli SampleBuffer95℃中孵育10min，离心1min，13000转/分。收集上清液，直接用于SDS凝胶电泳，或保存在-80℃，然后在SDS-PAGE上分离，进行免疫印迹分析。

6.Transwell细胞迁移侵袭实验

(1)细胞铺板：将20万/孔细胞铺于六孔板，放入培养箱培养24h至细胞贴壁；

(2)进行细胞转染处理24h后，将细胞培养液更换为空白基饥饿12h。取Transwell小室放入24孔板，加入空白培养基(不含血清)稀释的基质胶(MKN45细胞：基质胶：空培体积比为1:10，MGC803细胞基质胶：空培体积比比例为1:5)，每个小室上室均匀加入50μL，放入37℃、5％CO₂培养箱静置12h。

(3)铺小室：将步骤(2)中饥饿后的细胞消化离心，使用空白培养基(不含血清)重悬细胞，调整密度(MKN45为5×10⁵个/mL，MGC803为1.5×10⁵个/mL)，小室上室中加入200μL细胞悬液，下室加入500μL完培(含10％血清)，放入培养箱孵育24h。

(4)结果处理：取出小室，4％多聚甲醛固定20min，0.1％结晶紫染色20min。使用PBS轻轻漂洗3次，用棉签擦去上室残留细胞和基质胶，使用倒置显微镜5X、10X倍镜拍照记录，利用ImagJ软件进行细胞计数。

7.细胞转染

细胞铺板：以50万/皿细胞铺于10cm培养皿，培养24h至细胞贴壁。加入过表达的质粒DNA和促转染试剂以1:3的体积比转染到10cm细胞培养皿中，轻轻摇匀后在37℃、5％CO₂条件下培养24小时。

8.GIT1表达载体构建

为了构建GIT1及突变表达载体，将人GIT1互补基因的全长序列克隆到表达载体pcDNA3.1-HA-C和pcDNA3.1-3xFLAG-C(Youbio Inc.)中，并与其C端HA或FLAG标签融合。根据定点突变方法，用PCR方法获得GIT1突变体。对于GIT1^Mut1，序列LSNRLFEEL突变为ASNRLFEEL；对于GIT1^Mut2，LSNRLFEEL突变为LSNRLFEEA；对于GIT1^Muts，LSNRLFEEL突变为ASNRLFEEA。所有构建物均经DNA测序检查。按上述方法转染HEK-293T或胃癌细胞，Westernblotting检测其表达水平。

9.统计分析

数据为平均值±平均值的标准误差，并且P<0.05的差异被认为具有统计学意义。

三.实施例

实施例1氧化吲哚螺双环[2,2,1]庚烷类化合物FP活性测试

GIT1/β-Pix复合物是具有高度亲和性的蛋白复合物，被认为是癌细胞侵袭转移的重要原因之一。申请人通过极化荧光实验初步探究6种氧化吲哚螺双环[2,2,1]庚烷类化合物(500μM)对GIT1/β-Pix相互作用抑制活性，化合物结构参见图1。实验结果如图2显示，6种化合物均具有GIT1/β-Pix抑制作用，其中化合物14-5-18抑制效果最佳，进一步测试化合物14-5-18的化合物亲和力常数Ki值为1.8μM(图3)。

结果表明，6种氧化吲哚螺双环[2,2,1]庚烷类化合物在分子水平上均抑制GIT1与β-Pix相互作用，其中化合物14-5-18抑制能力最强。

实施例2化合物14-5-18抑制GIT1/β-Pix相互作用

申请人进一步评估化合物14-5-18在细胞中对GIT1/β-Pix相互作用的抑制效果。免疫共沉淀结果分析，5μM、20μM、50μM化合物14-5-18作用于胃癌细胞后，GIT1/β-Pix的结合能力明显减弱，并呈现剂量依赖性，参见图4。

结果提示化合物14-5-18在细胞水平上也可明显抑制GIT1与β-Pix蛋白的相互作用。

实施例3化合物14-5-18抑制胃癌细胞系的侵袭转移过程

有研究表明，GIT1/β-Pix表达的上调与多种肿瘤的发生、转移有关，因此申请人进一步探究化合物14-5-18在胃癌细胞侵袭转移过程中发挥的作用。首先，申请人检测了GIT1在胃癌细胞和胃正常上皮细胞中的表达水平差异。结果显示，与非胃癌细胞系GES-01相比，MGC803、MKN45、SGC-7901、AGS、BGC823胃癌细胞系中GIT1的表达水平也显著上调，参见图5。

结果提示在胃癌细胞中，GIT1在胃癌中处于高表达水平，GIT1可能与胃癌的发生发展息息相关，GIT1作为胃癌的调控因子具有临床病理意义。

申请人根据上述实验结果，选择了具有代表性的胃癌细胞系MKN45及MGC803胃癌细胞株，进一步探究化合物14-5-18在胃癌细胞侵袭转移过程中发挥的作用。MKN45、MGC803胃癌细胞用10μM、50μM化合物14-5-18处理24小时后，细胞迁移侵袭实验检测化合物14-5-18对细胞侵袭转移作用的影响，参见图6。结果表明，随着化合物14-5-18剂量的增加，胃癌细胞的侵袭转移能力明显下降，化合物14-5-18以剂量依赖性方式抑制细胞的侵袭转移。

结果表明，化合物14-5-18可以作为新的潜在的胃癌细胞侵袭转移抑制剂。

实施例4化合物14-5-18抑制动物体内胃癌细胞的侵袭转移

申请人评估了用化合物14-5-18治疗对尾静脉注入胃癌细胞诱导的裸鼠转移瘤模型的转移抑制作用。在尾静脉注射带有荧光素酶标签的MGC803细胞10天后，活体成像显示裸鼠基本已都形成转移，将其分组每天给予溶剂、10mg/kg、30mg/kg化合物14-5-18治疗18天后活体成像检测结果显示，对照组肺部胃癌细胞的荧光值显著高于化合物14-5-18治疗组，且化合物14-5-18的治疗效果呈剂量依赖性。同样，肺组织的H&E染色也显示，治疗组的转移灶在大小和数量上明显更小，参见图7、图8。

结果提示，化合物14-5-18可以抑制裸鼠体内胃癌细胞的转移。

实施例5GIT1/β-Pix结合位点突变后，化合物14-5-18对胃癌细胞的侵袭转移抑制作用明显减弱

申请人为了进一步证实化合物14-5-18的抑癌作用依赖于对GIT1和β-Pix相互作用的靶向调控。突变GIT1上的与β-Pix结合位点，发现GIT1与β-Pix的相互作用明显减弱，参见图9。因此将MGC803细胞中的GIT1蛋白敲降，转入野生型及突变的GIT1质粒，通过Transwell结果显示，表达GIT1野生型GIT1^WT后，细胞的侵袭能力恢复。经过50μM化合物14-5-18处理后，侵袭能力受到抑制。然而，表达GIT1突变GIT1^Mut1或GIT1^Mut2的细胞在化合物14-5-18处理后侵袭能力变化不明显，表明当GIT1突变后，化合物14-5-18抑制细胞的侵袭能力明显降低，参见图10。

结果提示化合物14-5-18的作用机制是通过抑制GIT1/β-Pix相互作用，从而抑制胃癌细胞的侵袭转移。

Claims (1)

1.氧化吲哚螺双环[2,2,1]庚烷类化合物在制备治疗胃癌药物中的应用，所述化合物的结构式为：