CN114886880A - 氨基酸组合物在制备缺血性脑卒中防治药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了氨基酸组合物在制备缺血性脑卒中防治药物中的应用，属于生物医药技术领域，所述氨基酸组合物由甘氨酸、β‑丙氨酸、D‑丝氨酸、L‑丙氨酸和L‑半胱氨酸组成。本发明将复方氨基酸应用于制备预防和/或治疗脑缺血后继发性脑损伤的药物方面，所述的复方氨基酸可减少脑梗死体积，改善感觉运动功能，从而改善脑梗死后继发性脑损伤，从而为制备预防和/或治疗脑缺血后继发性脑损伤的药物提供了一种新来源，同时也发掘出了这种复合氨基酸的新的药用价值。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及氨基酸组合物在制备缺血性脑卒中防治药物中的应用。
背景技术
缺血性卒中是指脑血循环障碍病因导致脑血管堵塞或严重狭窄，使脑血流灌注下降，进而缺血、缺氧导致脑血管供血区脑组织死亡。临床上表现为突发局灶性或弥散性的神经功能缺损，头部电子计算机断层扫描(CT)或磁共振成像(MRI)上形成新的局灶性脑梗死病灶， 24h之后往往留有后遗症。
2013年首次完成的我国规模最大的脑血管病流行病学调查显示，全国20岁及以上成年人卒中加权患病率1 114.8/10万，首次卒中加权发病率246.8/10万，死亡率114.8/10万；卒中后1年复发率为8.2％，5年复发率为41％。缺血性卒中占卒中的69.6％～70.8％，预后差，其1年后致死/致残率为33.4％～33.8％。
缺血性卒中具有高发病率、高患病率、高复发率、高致残率及高死亡率的特点，加上导致缺血性卒中发生风险增高的血管疾病危险因素及病因，如高血压、糖尿病、高脂血症、心脏病、动脉粥样硬化等，也是危害公众健康的主要慢性疾病，因此针对缺血性卒中的防治与管理意义重大。
发明内容
本发明的目的是提供氨基酸组合物在制备缺血性脑卒中防治药物中的应用。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
氨基酸组合物在制备缺血性脑卒中防治药物中的应用，所述氨基酸组合物由甘氨酸 (Glycine)、β-丙氨酸(β-alanine)、D-丝氨酸(D-serine)、L-丙氨酸(L-alanine)和L-半胱氨酸(L-Cysteine)组成。
进一步地，所述氨基酸组合物以质量百分比计由以下组分组成，甘氨酸(Glycine)12-22％、β-丙氨酸(β-alanine)14-24％、D-丝氨酸(D-serine)16-26％、L-丙氨酸(L-alanine)14-24％、 L-半胱氨酸(L-Cysteine)10-20％。
一种缺血性脑卒中的防治药物，包括氨基酸组合物以及医药上可接受的载体，所述氨基酸组合物由甘氨酸(Glycine)、β-丙氨酸(β-alanine)、D-丝氨酸(D-serine)、L-丙氨酸 (L-alanine)和L-半胱氨酸(L-Cysteine)组成。
进一步地，所述氨基酸组合物以质量百分比计由以下组分组成，甘氨酸(Glycine)12-22％、β-丙氨酸(β-alanine)14-24％、D-丝氨酸(D-serine)16-26％、L-丙氨酸(L-alanine)14-24％、 L-半胱氨酸(L-Cysteine)占比10-20％。
本发明将复方氨基酸应用于制备预防和/或治疗缺血性脑卒中的药物方面，所述的复方氨基酸可减少脑梗死体积，改善感觉运动功能，从而改善脑梗死后继发性脑损伤，从而为制备预防和/或治疗脑缺血性脑卒中的药物提供了一种新来源，同时也发掘出了这种复合氨基酸的新的药用价值。
附图说明
图1为脑缺血7天后的TTC染色图。
图2为肌力测试的结果。
图3为前肢错步实验的结果。
图4为前肢不对称实验的结果。
具体实施方式
脑缺血后，在缺血缺氧性脑损伤发生发展的级联反应过程中，神经元和胶质细胞大量释放谷氨酸等兴奋性氨基酸，而重摄取减少，细胞外间隙谷氨酸堆积，兴奋性氨基酸/抑制性氨基酸比例大大增加，激活兴奋性氨基酸受体，引起兴奋性神经毒性被认为是极其关键的机制，并且与其它机制如胞内钙超载、自由基及一氧化氮生成增加等相关联，最后引起急性或迟发性神经元死亡，损伤脑组织。拮抗或抑制谷氨酸的兴奋性神经毒性以保护脑组织成为这方面治疗的一个重要切入点。然而，目前兴奋性氨基酸受体阻断剂或释放抑制剂对缺血脑损伤的治疗效果并不理想，一是治疗时间窗窄，二是潜在的神经精神方面的副作用较大。本发明从全新的角度入手，激动脑内抑制性氨基酸-甘氨酸受体，降低神经元的兴奋性，抑制谷氨酸对神经元的兴奋性毒性，从而起到保护大脑、抗缺血缺氧性脑损伤的作用，以治疗缺血性脑卒中等引起缺血缺氧性脑损伤的一些疾病。
本发明通过采用大脑中动脉线栓法脑缺血模型，模拟临床上脑实质脑缺血，研究复方氨基酸对脑缺血后的神经保护作用，试验发现复合氨基酸显著减少脑梗死体积，可有效改善感觉运动，从而改善脑缺血后继发性脑损伤。
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细说明，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法及未说明配方的试剂均为按照本领域常规条件。
实施例1
1.试剂及动物：
氨基酸组合物：以质量百分比计：甘氨酸(Glycine)21％、β-丙氨酸(β-alanine)20％、 D-丝氨酸(D-serine)22％、L-丙氨酸(L-alanine)20％、L-半胱氨酸(L-Cysteine)17％。
实验动物：实验用成年雄性SD大鼠，8周龄，体重220-230g，由南通大学实验动物中心，SPF级别动物饲养于南通大学实验动物中心，实验动物室温度20～26℃(日温差≤4℃)，湿度40％～70％，照明12h：12h明暗交替。
2.实验内容：
动物分组：假手术组、(脑缺血)对照组、复合氨基酸组和牛磺酸组，小鼠脑出血造模后，根据组别随机分配。假手术组除了不放线栓以外，其余操作均和(脑缺血)对照组一致。
分组设计如表1。
表1
3.试验方法：脑缺血模型采用大脑中动脉线栓法(middle cerebral arteryocclusion， MCAO)。
手术操作如下：大鼠用10％水合氯醛(350mg/kg，i.p.)麻醉后，仰卧固定，维持大鼠肛温恒定。取颈部正中切口，剪开阔筋膜，沿胸锁乳突肌与颈前肌群之间向深部分离，便可看见颈部血管。暴露、分离一侧颈总动脉(common carotid artery,CCA)、颈外动脉(external carotid artery,ECA)和颈内动脉(internal carotid artery,ICA)，用10-0尼龙线结扎ECA分支动脉：枕动脉、甲状腺上动脉，并将它们剪断，游离并结扎ECA主干一段。轻轻剥离迷走神经，至鼓泡处可见ICA唯一颅外分支翼腭动脉，7-0尼龙线结扎该动脉，至此ICA成为CCA 颅外唯一保留动脉。用缝合线将CCA及ICA血流暂时阻断，在ECA上作一小切口，将5cm4-0 尼龙线(头端5mm加工成外径约0.25mm)从ECA插入ICA。为防止出血，轻轻结扎备线，插入尼龙线直至有阻力为止(可见栓线弯曲和ICA伸展)，说明线栓穿过MCA起始段并达到 ACA近端。尼龙线插入深度平均为18.5土0.5mm(从ECA分叉处算起)。结扎固定尼龙线，缝合皮肤，线栓外留lcm线头于皮肤外。2h后再灌注，勿需再次麻醉和切开颈部，提拉栓线至有阻力时表明尼龙线头端已达到ICA分叉切口处，血流再通。假手术组线栓只插入1cm，其余步骤同模型组。动物苏醒后出现血管栓塞的同侧Horner征和对侧肢体运动障碍即为模型成功。
4.观察指标
一般状态观察：观察时间和频率：给药前后每天固定时间观察1次；观察结果：给药期受试动物整体状态。
脑梗死灶测量(TTC法)：脑缺血损伤后第7天，大鼠用10％水合氯醛深麻醉后处死，迅速取脑，去除嗅脑、小脑和低位脑干，冰冻10min，从额极到枕极作2mm厚度的连续额状切片，切片置0.5％TTC溶液中，于37C°避光孵育30分钟，间隔5分钟摇动切片。再将切片置于4％多聚甲醛缓冲液中固定。24h后拍照并输入计算机，用Image J&Scion Image图像处理软件计算梗死面积(粉红色区为正常脑组织，白色区为梗死区)，梗死面积＝非缺血侧半球面积－缺血侧半球未梗死区面积，各脑片梗死面积之和乘以厚度(2mm)为总的梗死体积，脑梗死灶体积与全脑体积比为脑梗死体积百分比。
神经功能/损伤评分：参考Zea Longa 6分制评分。评分标淮：0分：无神经损伤症状；1 分：不能完全伸展对侧前爪；2分：向外侧转圈；3分：向对侧倾倒；4分：不能自发行走，意识丧失；5分：死亡(排除出血及手术意外所致)。
肌力测试：本实验主要检查大鼠的运动功能。取直径为0.15cm的铁丝，长100cm，在距地面70cm处水平固定其两端，其下放厚5cm的海绵垫，避免大鼠掉下时摔伤。让大鼠两前爪放在铁丝上后松手，观察大鼠的行为并记录其在绳上的悬吊时间。根据大鼠的肢体放置情况和悬挂时间，分为4个等级记分。实验于手术前以及手术后1、3、5、7天后进行。
前肢不对称实验(圆筒实验)：圆筒试验用于评估在脑卒中后患侧和对侧前肢在抬起和放下时的非对称性。实验于手术前3天以及手术后1、3、5、7天后进行。将每只大鼠放在高 15厘米，直径9厘米的透明圆柱体中，并进行录像。为了对大鼠的前肢运动进行录像，在圆柱体后方以特定角度放置一面镜子，以提供观察的视角。行为的评估根据以下几个标准：1. 用后腿完全站立时，能够独立的使用右或左前肢接触墙壁开始重心移动，或者以垂直姿势侧向移动时保持身体重新的平衡；2.在完全站立时，同时使用两前肢接触圆筒的墙壁，并沿着墙壁进行侧向交替跨步运动。对行为进行量化有以下要求：健全(即病灶同侧)的前肢的动作次数作为观察到的肢体在墙壁上总的使用次数中的一部分(I)，患肢动作次数作为观察到的肢体在墙壁上总的使用次数中的一部分(C)，两同时使用次数(或在侧步侧向移动时几乎同时) 作为观察到的肢体在墙壁上总的使用次数中的一部分(B)。独立的肢体使用不对称评分以下面的公式计算：肢体使用不对称评分＝[(I/(I+C+B)]-[C/(I+C+B)]。
前肢错步实验：
错步实验是用于综合评估大鼠感觉运动功能。选择一个网格大小为2.3×2.3cm的大网格，置于约100cm高的地方。先对大鼠进行训练3天，使得大鼠在网格上行走不会踏错步数，正式测试时记录1分钟内大鼠双侧前肢行走的总步数以及左前肢跌落到网格中的步数。错步率＝左前肢跌落网格的步数(错步数)/双侧前肢在网格上行走步数(总步数)×100％。
5.统计分析
试验数据以Mean±SD表示，两组之间采用student t检验，三组及以上之间采用one-way ANOVA检验(M-W法)对组间差异进行比较。统计学分析结果P<0.05认为有显著性差异，P <0.01以及P<0.001认为有极显著性差异。
6.实验结果：
(1)梗死体积改善：脑缺血7天后，行TTC染色，梗死区内坏死组织呈苍白色，未坏死组织呈红色，观测发现梗死区域与MCA支配的脑区基本一致。与(脑缺血)对照组相比，各药物组脑梗死体积及梗死百分体积均有所缩小(p<0.01或p<0.05)；其中以复合氨基酸组作用最显著，优于牛磺酸组(阳性对照组)(p<0.05；表2、图1)。
表2复合氨基酸对脑梗死体积的影响
| 组别 | 动物数(只) | 梗死体积(mm<sup>3</sup>) | 脑梗死百分体积(％) |
| 对照组 | 10 | 232.26土15.12 | 33.01土4.02 |
| 复合氨基酸组 | 10 | <sup>Δ</sup>114.2土7.62** | <sup>Δ</sup>14.35土3.13** |
| 牛磺酸组 | 10 | 176.46土11.35* | 24.15土3.26* |
| 假手术组 | 10 | 0土0** | 0土0** |
注：与对照组比较，*p<0.05，**p<0.01；组合氨基酸组与牛磺酸组相比，Δp<0.05。
(2)神经行为学评分：结果如表3所示，假手术组(Sham)动物无神经功能缺损，其它各组均有不同程度的神经功能缺损分值。脑缺血7天后，复合氨基酸组，(阳性对照)牛磺酸组与对照组神经行为学评分具有显著性差异(p<0.01或p<0.05)；而复合氨基酸组相比牛磺酸组相比效果更为显著(p<0.05)。
表3组合氨基酸对神经功能评分的影响
| 组别 | 动物数(只) | 神经功能评分 |
| 对照组(脑缺血) | 10 | 4.2土1.9 |
| 复合氨基酸组 | 10 | Δ1.1土0.5** |
| 牛磺酸组 | 10 | 2.6土0.9* |
| 假手术组 | 10 | 0土0** |
注：与对照组比较，*p<0.05，**p<0.01；复合氨基酸组与牛磺酸组相比，Δp<0.05。
(3)神经功能损伤评分(感觉运动)：结果如图1-4所示，脑缺血7天，肌力测试，与同一时间的对照组相比，在显著性差异P<0.05，和P<0.01时，复合氨基酸组改善大鼠肌力效果显著高于牛磺酸组。前肢错步实验，与同一时间的(脑缺血)对照组相比，在显著性差异P<0.05，和P<0.01时，牛磺酸组和复合氨基酸组能显著减少术后大鼠的前肢错步率，且效果优于牛磺酸组。前肢不对称实验，与同一时间的(脑缺血)对照组相比，在显著性差异P<0.05，和P<0.01 时，牛磺酸组和复合氨基酸组能显著减少TBI后大鼠的前肢错步率，且效果优于牛磺酸组。
本发明通过制备复合氨基酸用于预防和/或治疗脑缺血性脑卒中的系列实验研究，结果表明复合氨基酸显著减少脑跟死体积并且对神经功能具有明显的改善作用，为脑缺血的药物研究提供了新的思路。
Claims (4)
1.氨基酸组合物在制备缺血性脑卒中防治药物中的应用，所述氨基酸组合物由甘氨酸、β-丙氨酸、D-丝氨酸、L-丙氨酸和L-半胱氨酸组成。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述氨基酸组合物以质量百分比计由以下组分组成，甘氨酸12-22%、β-丙氨酸14-24%、D-丝氨酸16-26%、L-丙氨酸14-24%、L-半胱氨酸10-20%。
3.一种缺血性脑卒中的防治药物，其特征在于：包括氨基酸组合物以及医药上可接受的载体，所述氨基酸组合物由甘氨酸、β-丙氨酸、D-丝氨酸、L-丙氨酸和L-半胱氨酸组成。
4.根据权利要求3所述的防治药物，其特征在于：所述氨基酸组合物以质量百分比由以下组分组成，甘氨酸12-22%、β-丙氨酸14-24%、D-丝氨酸16-26%、L-丙氨酸14-24%、L-半胱氨酸10-20%。
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Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 李晓宇 等: "甘氨酸在心血管疾病中的保护作用" * |
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