CN114878614A - X射线光片共聚焦三维荧光显微成像系统和方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种X射线光片共聚焦三维荧光显微成像系统和方法，属于X射线荧光标记的显微成像技术领域。包括扇形X射线源、X射线狭缝、电动平移台、三维电动载物台、显微扫描模块、共聚焦模块、透镜和光电探测器；样品放置在三维电动载物台上，扇形X射线源位于三维电动载物台一侧；X射线狭缝位于三维电动载物台与扇形X射线源之间，由电动平移台控制升降；显微扫描模块位于三维电动载物台的上方，共聚焦模块、透镜和光电探测器依次位于显微扫描模块的出射光路上。本发明结合了基于扇形X射线源的断层扫描技术和基于激光的荧光共聚焦显微系统，空间分辨率高，扫描速度快。
Description
技术领域
本发明涉及X射线荧光标记的显微成像技术领域，特别是涉及一种X射线光片共聚焦三维荧光显微成像系统和方法。
技术背景
X射线一种常见的探测手段，当X射线与材料相互作用时，X射线会被材料吸收将原子中的内层电子激发到高能态上，随后，高能态上的电子会通过碰撞、辐射等形式将能量释放回到低能态，对于不同的材料，其对X射线的吸收和辐射出的特征谱线也会有所差异，因此，X射线可以用于物质检测，此外，相比于可见光，X射线的光子能量更高、穿透能力更强，这一特性使得X射线检测能够对样品内部的结构和元素分布进行分析。
为了得到样品内部的三维信息，目前主要有两种方式：一种是X射线计算机断层成像技术(CN02283444.3；CN02155046.8)，该技术基于切片的原理，使用扇形射束的X射线源，对每一个断面用X射线沿着轴面旋转照射样品进行分析，结合三维算法重建出样品的三维影像，但是这种方法的极限分辨率只能达到0.5mm，无法实现显微成像；另一种是利用微焦斑X射线源对样品的每个区域进行逐点扫描(基于单毛细管椭球镜的微束X射线荧光成像[J].陶芬,丰丙刚,邓彪,等.光谱学与光谱分析,2020,40(7):5；用共聚焦X射线方法研究活体植物中元素及化学态三维分布[C].魏向军,姜政,邹杨,等.全国x射线荧光光谱学术报告会.中国地质学会,2010.)，进而重建样品的三维信息，这种方法具有更高的空间分辨率，但是对X射线源及其配套系统的要求很高，此外，扫描过程需要花费很长时间，无法适用于动态过程的检测，例如生物组织中的新陈代谢。
发明内容
本发明结合了基于扇形X射线源的断层扫描技术和基于激光的荧光共聚焦显微系统，通过使用荧光共聚焦系统进行荧光信号探测，可以极大地提高空间分辨率；结合在样品侧面放置微米级的X射线狭缝对X射线整形，使样品中激发出的荧光信号层更薄，可以进一步提高深度方向上的空间分辨率；此外，结合二维扫描振镜系统，可以显著提高扫描速度，极大地缩短扫描过程所需的时间。
本发明提供了一种X射线光片共聚焦三维荧光显微成像系统和方法。通过特殊的系统设计，可以对X射线荧光闪烁体标记的样品进行快速、高分辨的三维荧光显微成像，适合于透明生物组织中新陈代谢等微观动态过程的研究，以及其它透明X射线荧光闪烁体材料内部的微观结构和元素组分研究。
本发明的技术方案如下：
一种X射线光片共聚焦三维荧光显微成像系统，包括扇形X射线源、X射线狭缝、电动平移台、三维电动载物台、显微扫描模块、共聚焦模块、透镜和光电探测器；
待进行显微成像的样品放置在所述的三维电动载物台上，扇形X射线源位于三维电动载物台一侧；X射线狭缝位于三维电动载物台与扇形X射线源之间，由电动平移台控制升降；
所述的显微扫描模块位于三维电动载物台的上方，用于收集样品发出的荧光信号并逐点扫描，所述的共聚焦模块、透镜和光电探测器依次位于显微扫描模块的出射光路上，共聚焦模块将显微扫描模块射出的荧光信号进行过滤，再经透镜聚焦后由光电探测器接收。
作为本发明的优选，所述的X射线狭缝与三维电动载物台的载物面平行。
作为本发明的优选，所述的显微扫描模块包括显微物镜、筒镜、扫描镜、二维扫描振镜、电动推拉分束/反射镜、相机；
所述的显微物镜用于对样品中的荧光信号进行收集并实现显微功能，并由筒镜将信号传递至电动推拉分束/反射镜；
所述的筒镜和扫描镜用于与二维扫描振镜组成二维扫描系统，通过二维扫描振镜偏转实现样品水平方向上的二维扫描；所述的电动推拉分束/反射镜能够实现分束和反射功能的切换，相机位于电动推拉分束/反射镜的分束光路上，用于对样品成像；扫描镜和二维扫描振镜依次位于电动推拉分束/反射镜的反射光路上。
作为本发明的优选，所述的共聚焦模块包含一组同轴放置的共焦透镜和一个小孔光阑，所述的小孔光阑位于共焦透镜组的共焦平面上，与显微扫描模块的焦点形成共轭，用于将显微扫描模块焦点外的荧光过滤掉，提高三维成像的空间分辨率。
上述系统工作过程如下：扇形X射线源发出的X射线经X射线狭缝整形后入射到样品中，在样品内部很薄的一个水平面截面内激发闪烁体发出荧光，随后样品的荧光信号被显微物镜收集，经过显微扫描模块、共聚焦模块、透镜被光电探测器接收，从而得到样品中某一点的荧光信号，结合显微扫描模块中的二维扫描振镜对整个横截面进行扫描，就能得到整个横截面内的荧光显微图像，之后控制三维电动载物台上下移动对样品的每个横截面进行荧光成像，最终就能重建样品的三维荧光显微图像。
与现有技术相比，本发明的优势在于：
(1)与传统的计算机断层成像技术相比，本发明结合了共聚焦显微成像系统，可以极大的提高系统的成像分辨率，获得样品的显微三维信息。
(2)与基于微焦斑X射线源扫描的成像技术相比，本发明使用了振镜扫描系统作为扫描模块，通过控制二维扫描振镜对整个横截面进行扫描，可以极大的提高扫描的速度，缩短检测时间，更适用于动态过程的三维扫描。
附图说明
图1是X射线光片共聚焦三维荧光显微成像系统结构示意图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明进行进一步的说明。
如图1所示，X射线光片共聚焦三维荧光显微成像系统主要由扇形X射线源、X射线狭缝、电动平移台、三维电动载物台、显微扫描模块、共聚焦模块、透镜、光电探测器构成，基本系统结构见附图1：
其中，所述的扇形X射线源用于激发样品中的X射线荧光闪烁体标记物产生荧光信号；
X射线狭缝用于减小扇形X射线的厚度，从而减小样品中被激发的荧光信号层的厚度，提高样品切片的精度；
电动平移台用于控制X射线狭缝的上下位置，使X射线激发出的荧光信号层恰好位于显微扫描模块的焦平面上；
三维电动载物台用于放置被测样品，能够对样品的位置进行调整；
本实施例中，所述的显微扫描模块包含显微物镜、筒镜、扫描镜、二维扫描振镜、电动推拉分束/反射镜、相机，所述的显微物镜用于对样品中的荧光信号进行收集并实现显微功能，筒镜和扫描镜用于与二维扫描振镜形成共轭系统，通过二维扫描振镜偏转实现样品水平方向上的二维扫描，电动推拉分束/反射镜用于配合相机对样品成像，从而便于调整样品和X射线荧光层的位置。
本实施例中，所述的共聚焦模块包含一组同轴放置的共焦透镜和一个小孔光阑，所述的小孔光阑位于共焦透镜组的共焦平面上，与显微扫描模块的焦点形成物象共轭，可以将显微扫描模块焦点外的噪声信号过滤掉，从而提高三维成像的空间分辨率。
所述的透镜用于将荧光信号聚焦，使其能完全被光电探测器接收；
所述的光电探测器用于接收收集到的荧光信号，本发明可以选择普通的光电探测器件，也可以选择光电倍增管、雪崩二极管等适用于弱信号的探测器件，甚至还可以使用光谱仪实现对荧光信号的光谱检测。
下面将结合附图1对整套系统的工作过程进行说明：
打开所有设备的电源，打开X射线防护门，将X射线荧光闪烁体标记过的样品放置在三维电动载物台上，调整三维电动载物台使样品处于合适的位置，之后关闭X射线防护门；
打开扇形X射线源，将推拉分束/反射镜切换到分束镜，此时相机上可以对样品进行成像，一边观察相机上的像，一边通过电动平移台控制X射线狭缝的高度，使X射线经过狭缝后在样品中激发出的荧光信号层恰好位于显微扫描系统的焦平面上，之后将推拉分束/反射镜切换到反射镜，通过控制二维扫描振镜和三维电动载物台对样品进行三维扫描。
在所述的三维扫描过程中，上述样品的荧光信号层发出的荧光信号被显微扫描模块中的显微物镜收集，依次经过筒镜、反射镜、扫描镜、二维扫描振镜后射出，出射的荧光信号随后入射到共聚焦模块中，经小孔光阑滤光后，从共聚焦模块出射，最终被光电探测器接收，从而得到样品中某一点的荧光信号。也就是，样品上每次只有焦点处的荧光信号进入探测器，随着二维振镜偏转，样品上的焦点会在焦平面上移动，对整个焦平面进行扫描。由于前述中已经将焦平面和荧光面重合，所以通过控制二维扫描振镜能够实现对整个荧光信号层所在的样品横截面进行扫描，从而得到样品在荧光信号层的荧光信息。
之后通过三维电动载物台调整样品的高度，对样品的每个横截面进行荧光成像，得到整个样品的荧光信息。通过对整个样品的荧光数据进行分析处理，就能重建样品的三维荧光显微图像。
在本发明的一项具体实施中，光路中还可以加入滤光片、衰减片等其它光学元件对荧光信号进行滤波处理，降低背景噪声、防止探测器饱和；此外，光电探测器可以用光谱仪代替，结合多种荧光峰不同X射线荧光闪烁体标记物，实现对多种待测物的三维显微荧光成像。
以上列举的仅是本发明的具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
Claims (6)
1.一种X射线光片共聚焦三维荧光显微成像系统，其特征在于，包括扇形X射线源、X射线狭缝、电动平移台、三维电动载物台、显微扫描模块、共聚焦模块、透镜和光电探测器；
待进行显微成像的样品放置在所述的三维电动载物台上，扇形X射线源位于三维电动载物台一侧；X射线狭缝位于三维电动载物台与扇形X射线源之间，由电动平移台控制升降；
所述的显微扫描模块位于三维电动载物台的上方，用于收集样品发出的荧光信号并逐点扫描，所述的共聚焦模块、透镜和光电探测器依次位于显微扫描模块的出射光路上，共聚焦模块将显微扫描模块射出的荧光信号进行过滤，再经透镜聚焦后由光电探测器接收。
2.根据权利要求1所述的一种X射线光片共聚焦三维荧光显微成像系统，其特征在于，所述的X射线狭缝与三维电动载物台的载物面平行。
3.根据权利要求1或2所述的一种X射线光片共聚焦三维荧光显微成像系统，其特征在于，所述的显微扫描模块包括显微物镜、筒镜、扫描镜、二维扫描振镜、电动推拉分束/反射镜、相机；
所述的显微物镜用于对样品中的荧光信号进行收集并实现显微功能，并由筒镜将信号传递至电动推拉分束/反射镜；
所述的筒镜和扫描镜用于与二维扫描振镜组成二维扫描系统，通过二维扫描振镜偏转实现样品水平方向上的二维扫描；所述的电动推拉分束/反射镜能够实现分束和反射功能的切换，相机位于电动推拉分束/反射镜的分束光路上，用于对样品成像；扫描镜和二维扫描振镜依次位于电动推拉分束/反射镜的反射光路上。
4.根据权利要求1或2所述的一种X射线光片共聚焦三维荧光显微成像系统，其特征在于，所述的共聚焦模块包含一组同轴放置的共焦透镜和一个小孔光阑，所述的小孔光阑位于共焦透镜组的共焦平面上，与显微扫描模块的焦点形成共轭，用于将显微扫描模块焦点外的荧光过滤掉，提高三维成像的空间分辨率。
5.一种基于权利要求3所述的X射线光片共聚焦三维荧光显微成像系统的成像方法，其特征在于，包括：
将X射线荧光闪烁体标记过的样品放置在三维电动载物台上，调整三维电动载物台的位置，使样品位于工作区间内；
启动扇形X射线源，将推拉分束/反射镜切换到分束镜功能，由扇形X射线源发出的光经过X射线狭缝后在样品内部激发出荧光信号层，通过相机观察样品，通过电动平移台调整X射线狭缝的高度，使荧光信号层位于显微物镜的焦平面上；
将推拉分束/反射镜切换到反射镜功能，样品发射的荧光信号由显微物镜成像，成像信号依次经筒镜、反射镜、扫描镜和二维扫描振镜后输出，由共聚焦模块对焦点外的荧光进行过滤；通过控制二维扫描振镜偏转，实现样品在荧光信号层水平方向上的二维扫描，最终由光电探测器接收显微物镜焦平面上的荧光信号；
控制三维电动载物台上下移动样品，对样品的每个横截面进行荧光成像，由光电探测器得到整个样品的荧光信息，最后重建样品的三维荧光显微图像。
6.根据权利要求5所述的X射线光片共聚焦三维荧光显微成像系统的成像方法，其特征在于，通过三维电动载物台调整样品的高度，使样品内部激发出从低到高或者从高到低的荧光信号层，对样品沿高度方向进行顺序切片。
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