CN114874973A - 获得成熟肝细胞的培养基及培养方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及获得成熟肝细胞的培养基及培养方法，属于细胞工程技术领域。获得成熟肝细胞的培养基，用于进一步诱导肝细胞获得成熟肝细胞，其包括肝细胞培养基和如下小分子化合物：Forskolin，SB431542，以及γ‑secretase抑制剂和/或Wnt抑制剂。本发明的培养方法包括多能干细胞诱导获得DE细胞；诱导获得肝祖细胞；诱导获得肝细胞，以及使用包括Forskolin，SB431542，以及γ‑secretase抑制剂和/或Wnt抑制剂的肝细胞培养基进一步诱导肝细胞获得成熟肝细胞。本发明可使得肝细胞快速成熟。

Description

获得成熟肝细胞的培养基及培养方法
技术领域
本发明涉及细胞工程技术领域，具体涉及多能干细胞定向诱导分化获得成熟肝细胞的培养基及培养方法。
背景技术
多能干细胞具有无限扩增及多潜能性，可分化为成人体内所有的细胞类型，可为再生医学提供丰富而无限的细胞来源。
以往的肝细胞分化一般为3段法，所获得的肝细胞尚不成熟。表现为：1)多能干细胞分化而来的肝细胞与原代肝细胞相比仍不够成熟，表现为ALB表达水平低，肝细胞表面的转运体表达水平较低，肝药酶表达较低；2)长时间培养多能干细胞分化而来的肝细胞仍比较困难。3)2D培养获得的肝细胞成熟度较低，消化较困难，大量扩增受限。
现有技术中(CN107723271A)曾提及通过增加第四个肝细胞成熟的培养基处理，可以提升分化而来的肝细胞成熟度。但其诱导过程中需要额外的静电刺激，且其获得肝细胞数据较少，仍需要进一步鉴定。本发明通过引入3D培养方式、操控特定信号通路，提供了一种便捷的、可促进了肝细胞进一步成熟的方法。我们进一步在急性肝衰竭小鼠模型上验证了该方法获得的肝细胞可拯救急性肝衰竭。
发明内容
有鉴于此，本发明主要建立了一种经过优化的多能干细胞分化为成熟肝细胞的方法和该过程中用到的培养基。在此之前，发明人利用肝细胞培养基添加HGF(肝细胞生长因子)，OSM(Oncostatin M)，TGFβ抑制剂和腺苷酸环化酶激活剂提升了多能干细胞来源的肝细胞(iHeps)的培养时间以及成熟度(见于专利申请202210113503.4)，在本发明中，发明人在前述基础上使用Wnt抑制剂，γ-secretase抑制剂，或其组合，更进一步地提升了iHep的体外培养时间以及成熟度。并进一步精选出Wnt抑制剂和γ-secretase抑制剂分别具有促进iHeps成熟的作用。
因此，本发明的多能干细胞定向诱导分化获得成熟肝细胞的培养基，用于多能干细胞定向诱导分化为肝细胞的过程中，进一步诱导非成熟的肝细胞获得成熟肝细胞，其包括肝细胞培养基和如下小分子化合物：腺苷酸环化酶激活剂，ALK5抑制剂，以及γ-secretase抑制剂和/或Wnt抑制剂。
其中，腺苷酸环化酶激活剂，优选为Forskolin，浓度为5-100μM；
ALK5抑制剂，优选为SB431542，浓度为0.1-50μM；
γ-secretase抑制剂，浓度为1-20μM；
Wnt抑制剂，浓度为0.5-20μM。
所述肝细胞培养基包括Hepatocyte Culture Medium，HepatoZYME-SFM以及以William's E为基础培养基的自制培养基中的一种。
所述γ-secretase抑制剂选自YO-01027、LY41575、L-685,458、Nirogacestat、NGP555、DAPT中的至少一种，优选为DAPT。
所述Wnt抑制剂选自IWP-2、Adavivint、XAV-939ICG-001、IWR-1-endo、CCT251545、NCB-0846、Wnt-C59、LGK-974、PRI-724、Pyrvinium pamoate、Salinomycin、IWP-4、KY02111、NCB-0846、Triptonide、FH535、LF3、DK419、iCRT3、KYA1797K、IQ 1、CWP232228、IWP-3、JW74，JW55、MSAB中的至少一种，优选为IWP2。
本发明的多能干细胞包括胚胎干细胞和诱导多能干细胞。
本发明的获得成熟肝细胞的培养方法，包括如下步骤：
1)经第一培养基诱导获得内胚层细胞(DE细胞)：iPSC汇合至85％以上，消化为单细胞后，铺至细胞培养基质包被的培养板上，GFR(Growth Factor Reduced Matrigel)浓度为产品分析证书推荐浓度的1/4。
2)DE细胞经第二培养基诱导获得肝祖细胞，并经3D培养形成第一球体，其中所述第一球体直径达到约40-200μm，或约200-300μm的平均大小，所述球体由AggreWellTM系列产品产生，优选AggreWellTM800；或轨道摇床震荡培养产生；或经磁力搅拌器培养产生；或经含有磁力搅拌子的培养体系培养产生；或经生物反应器培养产生。
3)经第三培养基诱导获得多个第二球体，其中包含非成熟的肝细胞；
4)在合适的时间用上述的获得成熟肝细胞的培养基继续培养获得第三球体，包含高比例的相对成熟的肝细胞。
具体地，第一阶段，诱导获得DE(Definitive endoderm：定型内胚层)细胞：
我们测试了在多能干细胞分化成DE细胞的过程中的若干条件，通过进一步将这些DE细胞分化为肝细胞，并观察其荧光强度以及肝细胞形态以获得最佳的DE细胞诱导条件。我们通过测试确定了培养板包被材料的浓度，细胞铺板浓度，以及DE阶段诱导培养基配方。
待iPSC汇合至85％以上，用Accutase消化，细胞培养基质包被的培养板上，铺板密度为2-6×104cells/cm2。
Day 0，更换第一培养基(含100ng/mL Activin A和1-20μM GSK3抑制剂的RPMI1640培养基)；
Day 1和day 2，分别更换不含Wnt3A或GSK3抑制剂的第一培养基。
上述细胞培养基质可为Matrigel，人纤连蛋白或重组人纤连蛋白，层粘连蛋白或重组层粘连蛋白或其片段。上述GSK3抑制剂可为CHIR99021，SB216763，AT7519，CDK9/CyclinT，CDK5/p35，CDK2/CyclinA，CHIR-98014，TWS119，Tideglusib，SB415286，BIO，KY19382，2-D08，AR-A014418，IM-12，Indirubin，TDZD-8，MAZ51，CP21R7，Resibufogenin，LY2090314，Alsterpaullone，BIO-acetoxime，1-Azakenpaullone，AZD1080，BRD0705，优选为CHIR99021。
第二阶段，诱导获得肝祖细胞：
Day 3开始，更换含第二培养基(Knockout DMEM培养基中加入20％KSR、1×NEAA、1×GlutaMax、1％DMSO和0.1mMβ-ME)，之后隔天(Day3开始，之后day5、day7、day9)更换培养基直到Day10。在Day 5-Day 9时，肝祖细胞会形成均一、致密的多边形结构。
第三阶段，诱导获得肝细胞：
Day10，更换第三培养基(S3+FS)，即肝细胞培养基中加1×GlutaMAX，10μM HCC(氢化可的松琥珀酸钠)，10ng/mL HGF(肝细胞生长因子)，20ng/mL OSM(Oncostain M，肿瘤抑制素M)以及ALK5抑制剂和腺苷酸环化酶激活剂。隔天换液，在Day 16即可看到核凝聚的肝细胞形态，但还未出现典型的肝板样多边形结构。上述肝细胞培养基可为自己配制或购买的商品化培养基，包括但不限于HCM(Lonza)，HepatoZYME(Thermofisher)以及以William’sE为基础的自配培养基。
第四阶段，进一步诱导获得成熟肝细胞：
在第三阶段培养基培养6-10天之后，使用第四培养基培养(第三培养基基础上单独添加Wnt抑制剂或单独添加Notch抑制剂继续培养；或添加以上2种抑制剂组合，或添加以上两种抑制剂以及BMP抑制剂的3种抑制剂组合)，促使iHeps进一步成熟。
与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：
本发明在以往常用技术方案的基础上增加了第四阶段，用于iHeps的进一步成熟。本发明主要在第一阶段优化了培养基配方，即在现有第一阶段培养基中使用小分子化合物GSK3抑制剂替换了Wnt3A蛋白，解决了诱导成本较高、工艺控制复杂的问题，可大大降低成本，并且对原料更容易质量控制。自第二阶段开始建立iHep分化的3D培养体系，可获得更为成熟的肝细胞，缩短培养时间，并便于建立放大培养的体系；更重要的是，通过3D培养方式，细胞可以简单地通过离心收获，获得高收获率高活率的细胞，完全不用担心2D培养的iHeps在消化收获过程中所造成的细胞损失和低活率。引入第四阶段，并在此基础上优化了该阶段的培养基配方。在第四培养基中添加Wnt抑制剂，γ-secretase抑制剂，或其组合，主要优势包括：1)获得的肝细胞更加成熟；2)支持肝细胞长时间培养(到100天)；3)肝细胞特异性基因(ALB，肝药酶相关基因，肝细胞表面转运体基因)表达显著提升；4)ALB分泌水平显著提升。为了便于观察，本发明使用经过基因修饰获得的表达ALB融合蛋白mCherry的iPSC(诱导多能干细胞，ALB-18iPSC)，并在其他另外多个iPSC细胞系中获得验证。ALB-18iPSC的优势在于，在分化过程中，内源ALB表达后，mCherry可以同步表达。因此，通过在荧光显微镜下观察mCherry的表达水平，可以推断细胞内源ALB的表达水平。
附图说明
图1.肝细胞诱导条件测试。A.不同浓度GFR诱导肝细胞的效率及mCherry荧光表达情况；B.不同细胞铺板密度下肝细胞的诱导效率及mCherry荧光表达情况；C.国产GSK3抑制剂和Wnt激动剂CHIR99021替代进口Wnt3A后的肝细胞诱导效率及mCherry荧光表达情况；D.诱导第2天添加B27-VA后，day 7肝细胞的产量增多。
图2.诱导获得的DE细胞标志基因表达情况。A.分别用Wnt3A和CHIR99021诱导的肝祖细胞中内胚层标记物FOXA2和CXCR4表达情况比较；B.肝分化第一阶段(day 1)3D诱导,不同培养基条件下细胞形态。
图3.第二阶段诱导条件测试。A.KOSR诱导天数测试的mCherry荧光表达；B.KOSR诱导时间测试中，day 35肝细胞胞外分泌的ALB浓度比较；C.第二阶段进行传代后继续诱导，day 35肝细胞中mCherry荧光表达情况；D.第二阶段进行传代后继续诱导，day 35肝细胞胞外分泌的ALB浓度比较。
图4.第一阶段使用CHIR99021和Wnt3A诱导的iHeps在day 2、day 10、day 14时的细胞形态及mCherry表达。左侧四栏为3D培养，最右侧为2D培养。
图5.3D诱导的肝细胞球与2D诱导的肝细胞鉴定。A.免疫荧光检测CK19、ZO-1、CYP2C9、CD8(和mCherry同时导入标记ALB的基因)表达；B.肝细胞功能测试：ICG摄取与释放。
图6.2D和3D诱导分化条件下肝细胞特异性标志物表达。A.qPCR检测iPSC阶段3D诱导分化的肝细胞和2D诱导分化的肝细胞ALB、CYP3A4、NTCP、ABCC2、ASGR1、AFP的表达量；B.肝祖细胞阶段3D诱导培养的肝细胞球与2D诱导培养的肝细胞ALB、AAT、NTCP、ABCC2、BSEP、ASGR1、AFP、NNMT、PXR、CK7、CYP3A4、CYP2D6的表达。
图7.第三、四阶段诱导条件测试。A.使用不同条件诱导的肝细胞(day 35)中mCherry荧光的表达情况；B.ELISA检测不同条件诱导的肝细胞胞外分泌ALB的量。
图8.第四培养基可长时间维持iPSC来源的肝细胞体外培养。A.第四培养基诱导到100天的过程中肝细胞形态及mCherry荧光表达情况；B.免疫荧光检测诱导到90天的肝细胞CYP3A4表达；C.不同诱导条件下肝细胞标志物的表达,原代肝细胞(PHH)为对照；C.iPSC来源的肝细胞诱导至100天的过程中胞外ALB分泌量曲线。
图9.不同时间更换第四培养基的iHeps mCherry荧光表达情况及胞外分泌ALB的情况。
图10.第四培养基配方优化实验。A.qPCR检测第四培养基中不同小分子化合物组合诱导的肝细胞标志物ALB、CYP3A4、NTCP、ABCC2、AFP的表达情况，FSDIL化合物组合为对照；B.第四培养基中不同小分子化合物组合诱导而来的肝细胞CYP3A4P450肝药酶活性，PHH为对照。
图11.qPCR检测小分子化合物组合FSD、FSI以及FSDI对iPSC诱导而来的肝细胞相关基因的表达的影响。A-L.qPCR检测含有小分子化合物组合FSD、FSI以及FSDI的培养基诱导的肝细胞中ALB、AAT、NTCP、ABCC2、BSEP、ASGR1、CAR、PXR、CYP3A4、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6的表达情况，FS和FSDIL为对照。
图12.移植iPSC诱导的肝细胞可拯救由CCl4诱导的肝衰竭小鼠。A.用于移植的iPSC诱导的ALB-18iHeps形态及mCherry荧光表达情况；B.移植iHeps或空白对照的小鼠存活曲线，注射橄榄油组(Sham group)的小鼠为对照；C.不同处理条件下肝衰竭的小鼠肝脏病理形态。
图13.移植iPSC诱导的肝细胞拯救由CCl4诱导的肝衰竭小鼠的血清指标检测及体重变化。A-C.造模后不同时间点，模型组(注射ALB-18iHeps或PBS对照)及对照组(Shamgroup)小鼠血清谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、白蛋白(ALB)的水平；D.小鼠体重变化；E.注射iHeps的模型小鼠及对照组小鼠血清中人白蛋白(hALB)的水平。
图14.H&E染色显示CCl4诱导的肝衰竭小鼠移植iPSC来源的肝细胞后肝脏切片形态。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
定义：
人多能干细胞：具有多种分化潜能的干细胞，包括胚胎干细胞和诱导多能干细胞(iPSC)。后者为通过人工方式，使体细胞具有多能性，并具备分化为多种人体细胞的潜能。
分化：通过提供特定的诱导环境，在体内或体外将多能干细胞转变为内胚层，中胚层或外胚层终末分化细胞或中间阶段细胞的过程。在本发明中，特指将多能干细胞诱导分化为内胚层细胞，肝祖细胞和肝细胞的过程。
抑制剂：对某个靶点或信号通路有抑制作用的小分子化合物，抗体，siRNA或其他材料，抑制的效果为30％以上。
2D分化：指分化过程中，细胞在培养皿或特定材料上贴壁生长。
3D分化：指分化过程中，细胞以成球的方式或单个细胞的方式在培养基中悬浮培养。
培养基：液体和无机物及有机物的组合，一般包括基础培养基和特定的细胞因子、蛋白或小分子化合物的组合。
肝细胞培养基：可支持原代肝细胞生长的培养基，包括但不限于商品化培养基Hepatocyte Culture Medium(HCM；Lonza)，HepatoZYME-SFM(Thermo FisherScientific)；以及以William’s E为基础培养基的自制培养基。
成熟培养基：多能干细胞分化为肝细胞后，用于促进肝细胞进一步成熟的培养基。
GSK3抑制剂：可抑制GSK3α或GSK3β活性的小分子化合物，蛋白，核酸等。其中小分子化合物包括但不限于：CHIR99021，SB216763，AT7519，CDK9/CyclinT,CDK5/p35,CDK2/CyclinA，CHIR-98014，TWS119，Tideglusib，SB415286，BIO，KY19382，2-D08，AR-A014418，IM-12，Indirubin，TDZD-8，MAZ51，CP21R7，Resibufogenin，LY2090314，Alsterpaullone，BIO-acetoxime，1-Azakenpaullone，AZD1080，BRD0705，优选为CHIR99021。
Wnt抑制剂：可抑制Wnt信号通路活性的小分子化合物，蛋白，核酸等。其中小分子化合物包括但不限于：IWP2、Adavivint(SM04690)、XAV-939ICG-001、IWR-1-endo、CCT251545、NCB-0846、Wnt-C59(C59)、LGK-974(I期临床)、PRI-724、Pyrvinium pamoate(FDA批准的抗寄生虫药物)、Salinomycin(抗球虫药)、IWP-4、KY02111、NCB-0846、Triptonide、FH535、LF3、DK419、iCRT3、KYA1797K、IQ 1、CWP232228、IWP-3、JW74，JW55、MSAB。优选为IWP2。
iHep或iHeps：由多能干细胞分化而来的肝样细胞。
1.多能干细胞分化到内胚层细胞(definitive endoderm，DE细胞)
本发明使用的多能干细胞细胞为通过基因修饰获得的表达ALB融合蛋白mCherry的诱导多能干细胞(ALB-mCherry iPSC)，其在专利申请号202210134008.1的专利申请中有详细描述。
2D分化：待iPSC汇合满后，用Accutase细胞消化液消化，铺板于使用不同浓度基质胶(1/4GFR,1/16GFR,1/32GFR)包被的培养板上，铺板密度使用为3×104cells/cm2，4×104cells/cm2，5×104cells/cm2。待铺板细胞长到第三天时，更换含第一培养基(含有100ng/mL Activin A和3μM GSK3抑制剂CHIR99021或25nm Wnt3A的RPMI1640培养基)，记为day 0。在随后的24小时和48小时(day 1-day 2)分别更换不含GSK3抑制剂或Wnt3A抑制剂的第一培养基。通过比较day 20-day 35细胞形态及mCherry荧光强度及分布。我们获得了最佳GFR基质胶浓度以包被培养板，以及最佳的细胞铺板浓度(图1)。我们证实，GSK3抑制剂/Wnt激活剂CHIR99021可替代Wnt3A(图1C)。获得的DE细胞进行qPCR检测DE阶段markerCXCR4(C-X-C Motif Chemokine Receptor 4)、FOXA2(Forkhead box protein A2)的表达量。其中CHIR99021诱导的肝细胞中CXCR4表达量显著高于Wnt3A诱导的DE细胞，而FOXA2的表达量无差异(图2A)。FOXA2在诱导到day 5时表达量最高，而CXCR4的表达量在诱导到day3之后开始下降(图2A)。
3D分化：待iPSC汇合满后，用Accutase消化，选取70万-80万细胞每毫升的密度，使用上述2D分化用培养基在轨道摇床悬浮培养成球并进行诱导测试，摇床转速为50rpm-120rpm。在本实施例中，直接进行诱导的iPSC无法成球(图2A)。
2.分化至肝祖细胞(Hepatoblasts)
诱导72小时(day 3)，更换含第二培养基(Konckout DMEM培养基中加入20％KSR、1×NEAA、1×GlutaMax、1％DMSO和0.1mMβ-ME)，之后隔天更换培养基。在这一阶段，通过测试KOSR培养基分别诱导4天、6天和7天，发现KOSR培养7天的细胞胞外ALB分泌量最高(图3A-3B)。在Day5-Day9时，肝祖细胞会形成形态均一的肝脏前体细胞，此时可将细胞进行传代或者冻存。
在传代诱导测试中，我们首先测试了肝祖细胞消化方法，并对比了Accutase和TrypLE传代效果。在传代后继续诱导中，我们也测试了一系列条件，最终确定传代后使用KOSR继续诱导3-4天，然后继续诱导，可获得高比例mCherry荧光表达和分泌ALB的肝细胞(图3C-3D)。
3.分化至肝样细胞(iHeps)
Day 10的肝祖细胞更换为第三培养基(S3+FS)培养，即肝细胞培养基中加1×GlutaMAX，10μM HCC(氢化可的松琥珀酸钠)，10ng/mL HGF(肝细胞生长因子)，20ng/mL OSM(Oncostain M，肿瘤抑制素M)以及ALK5抑制剂SB431542(10μM)和腺苷酸环化酶激活剂Forskolin(50μM)。隔天换液直至day 17或day 20，在Day 16即可看到核凝聚的肝细胞形态，但还未出现典型的肝板样多边形结构。该方案可以参考我们上一个专利申请(202210113503.4)。
为了进一步优化培养方案，我们比较了2D培养和3D培养对分化而来肝细胞的影响。在2D培养中，day 10更换第三阶段培养基S3+FS。在3D方案中，我们将iPSC或day5-day10分化而来的肝祖细胞消化后使用磁力搅拌、低吸附板、轨道摇床、AgreewellTM800、U型底96孔板进行成球测试，除去U型底96孔板成球效果不理想，其余几种方法均能获得不同大小的肝细胞球，其中AgrewellTM800成球大小最为均匀(见表一)。从mCherry荧光表达来看，在第三阶段培养基加到4天时无荧光表达，而在3D培养系统中，第三阶段培养基培养到第4天时已经有明显的荧光表达(图4)，说明3D形态诱导的肝脏细胞的效率更高。而免疫荧光染色显示3D培养的肝细胞球表达CK19、ZO-1、CYP2C9、CD8，且表达量高于2D(图5A)。肝细胞转运功能测试ICG摄取和释放实验中也显示3D形态下的肝脏细胞摄取和释放ICG效果更好(图5B)。对2D和3D的肝细胞收取RNA测试肝细胞特异性maker表达情况，发现在iPSC低吸附板成球后3D诱导的肝细胞中，CYP3A4、NTCP、ABCC2表达明显高于2D培养的肝细胞，并且与PHH(原代肝细胞)的表达量无明显差异(图6A)。而在肝祖细胞成球诱导的肝细胞中，CYP3A4、CYP2D6、ALB、ASGR1、BSEP、NNMT、PXR的表达量相对于2D诱导的肝脏细胞均显著提高，而AFP均表达较低(图6B)，说明3D培养的肝脏细胞相对于2D诱导的肝细胞更为成熟。
表一 肝细胞球3D培养方式比较
Figure BDA0003612140990000111
4.肝样细胞的进一步成熟
为了更进一步优化我们的分化方案，我们在肝细胞三个阶段分化的基础上，增加了第四阶段—肝细胞成熟阶段。在该阶段我们发明了第四培养基，一种含有多种小分子化合物的促成熟培养基(肝细胞培养基中添加5-100μM Forskolin(F)、0.1-50μM SB431542(S)、1-20μM DAPT(D)、0.5-20μM IWP2(I)、0.1μM LDN193189(L))。通过比较传统肝细胞培养基S3(肝细胞培养基添加HGF，OSM)，经过优化的培养基S3+FS(肝细胞培养基添加10ng/mLHGF，20ng/mL OSM，50μM Forskolin,10μM SB431542)，以及本发明中使用的第四培养基FSDIL(肝细胞培养基添加20μM Forskolin、10μM SB431542、5μM DAPT、0.5μM IWP2、0.1μMLDN193189)，我们发现S3诱导的肝细胞分泌到培养基上清中的ALB的表达量在day 19即达到顶峰。S3+FS诱导的肝细胞胞外ALB的表达量在day 25达到顶峰，而FSDIL诱导的肝细胞胞外ALB的表达量在更换培养基初期相对于S3+FS低，但在day 25之后持续增加，到day 35时是S3的2.6倍，是S3+FS的1.63倍(图7B)。并且S3诱导的肝细胞在day20时开始逐渐死亡脱壁，到day 35时只剩下不到30％，而此时FSDIL诱导的肝细胞仍然生长旺盛，且正常表达mCherry荧光(图7A)。在此基础上，我们进一步测试了FSDIL长时间培养肝细胞到100天，和ALB共表达的mCherry的表达量在day 35-day 40达到峰值，从day 40开始，随着培养时间的延长，ALB-mCherry的亮度随着培养时间的增加逐渐减弱，但可以一直培养到100天仍有存活细胞(图8A)。qPCR结果和胞外分泌的ALB均显示day 100的ALB表达量低于day 35，且整个培养过程中ALB的表达量在day 35达到峰值后，维持了10天左右，到day 45开始逐渐下降(图8C-8D)。免疫荧光显示诱导到day 90的肝细胞近乎100％为CYP3A4阳性(图8B)，qPCR结果显示day 100的CYP3A4的表达量显著提升(day 35的169倍)，且与PHH类似(图8C)。同时，ABCC2的表达量也显著升高，是PHH的1.15倍，AFP则均表达较低，NTCP、ASGR1的表达量与PHH比较则分别只差6.1倍和2.4倍(图8C)。以上说明FSDIL培养基可显著促进iPSC来源的肝细胞成熟。
我们同时测试了该阶段开始的最佳时间，通过在day11，day12，day16之后添加第四培养基，我们发现在第三阶段早期更换第四培养基时，细胞衰老得比较快，而在day 16之后更换第四培养基时诱导的肝脏细胞能长久维持肝细胞形态以及ALB-mCherry的表达(图9A)，胞外分泌的ALB(白蛋白)水平也显示在Day 16+更换第四培养基时胞外分泌的ALB的表达量最高(图9B)。
5.第四培养基的进一步优化
通过在FS的基础上分别单独添加优选的γ-secretase抑制剂DAPT、Wnt抑制剂IWP2和BMP抑制剂LDN193189，或两两组合，或三种组合，qPCR结果和P450肝药酶CYP3A4表达显示，DAPT和IWP2的加入能明显增加诱导的iHeps中CYP3A4的表达，且表达量分别是FSDIL培养基诱导的iHeps的5.5倍和6.8倍；而ALB的表达量则分别是FSDIL培养基诱导的iHeps的1.1倍和1.2倍(图10)。我们的数据显示，BMP抑制剂LDN193189对于iHep成熟没有明显作用。
为了进一步验证我们的培养基配方，我们进一步测试了γ-secretase抑制剂DAPT和Wnt抑制剂IWP2对iHep成熟的效用。我们测试了FSD，FSI，FSDI组合，使用FS和FSDIL为对照，qPCR结果显示FSI和FSD条件下诱导的iHeps的表达肝脏功能基因，如：ALB(白蛋白)、AAT(α1-抗胰蛋白酶)、NTCP(Na依赖牛磺胆酸共转运多肽)、BSEP(胆盐输出泵)、CAR(核受体家族：参与调控P45药物代谢)、PXR(核受体：CYP3A4转录调控因子)、CYP3A4(P450肝药酶)、CYP2C9(P450肝药酶)、CYP2C19(P450肝药酶)，均显著高于FS或FSDIL诱导的iHeps。ABCC2(多耐药相关蛋白)、ASGR1(去唾液酸糖蛋白受体)、CYP2D6(P450肝药酶)则无明显差异。而相对于FS，主要增加了ALB、BSEP、CYP2C9、CYP2C19的表达量(图10-图11)。不过FSDI并没有表现出明显的优势，预示着DAPT和IWP2并没有叠加效应。
6.移植iPSC来源的肝细胞可拯救肝衰竭小鼠
为了验证iHeps的功能，采用10％的CCl4腹腔注射制造肝损伤模型，并在造模24小时给治疗组通过脾脏注射day 30-day 36的iHeps(图12A)，每只小鼠注射75万-100万细胞。造模后第1、4、8天眼眶取血分离血清，实验期间死亡小鼠进行解剖拍照记录病理形态并取肝脏固定，造模后8天将存活小鼠处死解剖、拍照记录肝脏病理形态并取肝脏固定(图12C)。结果显示，假手术组小鼠(腹腔注射橄榄油，脾脏注射DPBS)无死亡，造模组小鼠(腹腔注射10％CCl4，脾脏注射DPBS)到day 3尚有20％存活，到day 6全部死亡，而细胞组小鼠(腹腔注射10％CCl4，脾脏注射iHeps)到day 8仍有58％的小鼠存活(图12B)，证明iPSC诱导的iHeps可拯救肝衰竭小鼠。血清检测ALT(谷丙转氨酶)、AST(谷草转氨酶)、ALB(白蛋白)，证明注射iHeps能显著降低肝损伤造成的ALT、AST，逆转由肝损伤造成的体重下降(图13)。小鼠肝脏通过制作石蜡切片并进行H&E染色后发现造模组小鼠肝脏存在明显的，均匀的损伤痕迹，而注射iHeps组小鼠肝脏基本恢复(图14)。小鼠肝脏解剖也证实注射iHeps能恢复肝脏损伤，拯救肝衰竭小鼠(图12C)。
1.第一阶段，使用小分子化合物(GSK3抑制剂)替代细胞因子(Wnt3A)，效果相当，但成本低，制备培养基时易做质量控制。
2.第二阶段开发的3D培养方式，使肝细胞更加成熟，且成熟更早，且易于后续大规模培养。
3.通过本方案获得肝细胞可以长时间培养，最长可到100天；
4.通过增加一个肝细胞成熟的阶段(第四阶段)，本方案获得的肝细胞更加成熟，表现为ALB分泌量更高，ALB mRNA表达量更高，肝药酶表达量更高，肝细胞特有的转运体表达量更高。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (11)

1.获得成熟肝细胞的培养基，其特征在于，用于进一步诱导肝细胞获得成熟肝细胞，其包括肝细胞培养基和如下小分子化合物：
腺苷酸环化酶激活剂，ALK5抑制剂，以及γ-secretase抑制剂和/或Wnt抑制剂。
2.根据权利要求1所述的获得成熟肝细胞的培养基，其特征在于，所述小分子化合物在肝细胞培养基中的含量如下：
腺苷酸环化酶激活剂，优选为Forskolin，浓度为5-100μM；
ALK5抑制剂，优选为SB431542，浓度为0.1-50μM；
γ-secretase抑制剂，浓度为1-20μM；
Wnt抑制剂，浓度为0.5-20μM。
3.根据权利要求1所述的获得成熟肝细胞的培养基，其特征在于，
所述肝细胞培养基包括Hepatocyte Culture Medium，HepatoZYME-SFM以及以William's E为基础培养基的自制培养基中的一种。
4.根据权利要求1所述的获得成熟肝细胞的培养基，其特征在于，所述γ-secretase抑制剂选自YO-01027、LY41575、L-685,458、Nirogacestat、NGP555、DAPT中的至少一种，优选为DAPT；
所述Wnt抑制剂选自IWP-2、Adavivint、XAV-939ICG-001、IWR-1-endo、CCT251545、NCB-0846、Wnt-C59、LGK-974、PRI-724、Pyrvinium pamoate、Salinomycin、IWP-4、KY02111、NCB-0846、Triptonide、FH535、LF3、DK419、iCRT3、KYA1797K、IQ 1、CWP232228、IWP-3、JW74，JW55、MSAB中的至少一种，优选为IWP2。
5.根据权利要求1所述的获得成熟肝细胞的培养基，其特征在于，所述多能干细胞包括胚胎干细胞和诱导多能干细胞。
6.获得成熟肝细胞的方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)经第一培养基诱导获得内胚层细胞iPSC汇合至85％以上，消化为单细胞后，铺至细胞培养基质包被的培养板上，细胞基质GFR浓度为推荐浓度的1/4，细胞铺板浓度3×104cells/cm2；
2)内胚层细胞经第二培养基诱导获得肝祖细胞，并经3D培养形成第一球体，其中所述第一球体直径达到约40-200μm，或约200-300μm的平均大小，所述球体由AggreWellTM系列产品产生，优选AggreWellTM800；或轨道摇床震荡培养产生；或经磁力搅拌器培养产生；或经含有磁力搅拌子的培养体系培养产生；或经生物反应器培养产生。
3)经第三培养基诱导获得多个第二球体，其中包含非成熟的肝细胞；
4)在合适的时间用权利要求1～5任一项所述的培养基继续培养获得第三球体，包含高比例的相对成熟的肝细胞。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，
所述第一培养基为含100ng/mL Activin A和1-20μM GSK3抑制剂的RPMI1640培养基；
所述第二培养基为Knockout DMEM培养基中加入20％KSR、1×NEAA、1×GlutaMax、1％DMSO和0.1mMβ-ME；
所述第三培养基为肝细胞培养基中加1×GlutaMAX，10μM HCC，10ng/mL HGF，20ng/mLOSM，10μM ALK5抑制剂SB431542和50μM腺苷酸环化酶激活剂Forskolin。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，
细胞培养基质选自Matrigel，人纤连蛋白或重组人纤连蛋白，层粘连蛋白或重组层粘连蛋白或其片段。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述GSK3抑制剂选自CHIR99021，SB216763，AT7519，CDK9/CyclinT，CDK5/p35，CDK2/CyclinA，CHIR-98014，TWS119，Tideglusib，SB415286，BIO，KY19382，2-D08，AR-A014418，IM-12，Indirubin，TDZD-8，MAZ51，CP21R7，Resibufogenin，LY2090314，Alsterpaullone，BIO-acetoxime，1-Azakenpaullone，AZD1080，BRD0705。
10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，
所述肝细胞培养基包括Hepatocyte Culture Medium，HepatoZYME-SFM以及以William’s E为基础培养基的自制培养基中的一种。
11.根据权利要求6所述的方法所获得的成熟肝细胞在制备治疗肝衰竭的注射药物中的应用。
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