CN114874972B - 一种体外泡沫细胞模型及其构建方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种体外泡沫细胞模型及其构建方法，该体外泡沫细胞模型由来源细胞泡沫化后形成脂质条纹结构，相比来源细胞，泡沫细胞胞质内脂质聚集，脂滴增加，细胞核缩小，细胞体积变小。构建方法包括以下步骤：向培养基中加入胎牛血清，然后加入来源细胞进行三维培养，制得。本发明制得了一种新的泡沫细胞，尤其是通过简单的方式可提高泡沫细胞的产量，不会出现接触抑制生长现象。构建得到的泡沫模型还可以用于有内膜损伤、内膜细胞团和泡沫细胞形成的疾病的药物筛选，如心脑血管疾病、肾小球疾病、肺纤维化等。

Description

一种体外泡沫细胞模型及其构建方法
技术领域
本发明涉及泡沫细胞模型构建技术领域，具体涉及一种体外泡沫细胞模型及其构建方法。
背景技术
我国心脑血管疾病的发病率和死亡率一直居高不下，其治疗遭遇瓶颈，给社会带来了沉重负担。动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)是众多心脑血管疾病的共同病理学基础，是引起冠心病和缺血性脑卒中的主要原因。
在动脉粥样硬化形成早期，血液中的单核细胞粘附在损伤的内皮细胞表面，然后穿透内皮层，在内膜下分化成巨噬细胞，在炎症反应环境下巨噬细胞产生的大量自由基使渗入血管内皮下的低密度脂蛋白胆固醇发生氧化修饰，形成氧化型低密度脂蛋白胆固醇，由巨噬细胞清道夫受体吞噬大量氧化型低密度脂蛋白胆固醇，导致巨噬细胞内脂质累积，形成含有许多脂滴的泡沫细胞。随着大量脂质堆积，泡沫细胞死亡破裂，溢出内容物继而引起周围细胞的免疫反应，破坏血管壁的稳定性和完整性，引起血管平滑肌细胞和内皮细胞迁移，最终使得血管内径变窄影响供血。因此，采用人类源细胞构建泡沫细胞形成模型，对研究动脉粥样硬化早期发生机制和筛选有效治疗药物具有重要的意义。
但现有体外泡沫细胞模型的构建均受限于额外添加的氧化低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein，ox-LDL)或成分不可控的患者血浆作为诱导剂，若能研究一种无需添加诱导剂氧化低密度脂蛋白来构建体外泡沫细胞模型的方法是极其有意义的。
发明内容
为了解决现有技术存在的上述不足，本发明的目的是提供一种体外泡沫细胞模型及其构建方法，该构建过程中无需添加任何诱导剂就能形成体外泡沫细胞，对研究动脉粥样硬化早期发生机制和筛选有效治疗药物具有重要的意义。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：提供一种体外泡沫细胞模型，该体外泡沫细胞模型由来源细胞泡沫化后分泌胶原自发形成脂质条纹结构，相比来源细胞，泡沫细胞胞质内脂质聚集，脂滴增加，细胞核缩小，细胞体积变小。
采用上述技术方案的有益效果为：本发明提供的体外泡沫细胞模型，具有脂质条纹结构，该脂质条纹结构具有丰富的胶原、多糖、脂质、钙等，形成了不同的空间，网络结构，该结构可引起血流动力学变化和血管硬度变化，并且脂质条纹结构以及胞质内脂质成分增多，能够聚集成滴，细胞内TC(总胆固醇)和CE(胆固醇酯)增多，其中CE含量占60％左右。此外，本发明提供的泡沫细胞模型相比来源细胞而言，泡沫细胞的细胞核缩小，细胞体积变小。而现有泡沫细胞的体积相比来源细胞而言是变大的，本发明泡沫细胞变小，细胞核变小，核膜增厚，分泌大量的细胞外胶原，细胞表面糖萼脱落，蛋白聚糖密集，同时还有钙沉积，因此本发明提供了一种新的泡沫细胞。本发明提供的泡沫细胞在结构及组成上都更接近病态的形态，对研究动脉粥样硬化早期发生机制具有更重要的意义，此外该模型还可以用于有内膜损伤、内膜细胞团和泡沫细胞形成的疾病的药物筛选，如心脑血管疾病、肾小球疾病、肺纤维化等。
上述体外泡沫细胞模型的构建方法，包括以下步骤：
向培养基中加入胎牛血清，然后加入来源细胞进行三维培养，制得。
采用上述技术方案的有益效果为：将人源内皮细胞加入到含有胎牛血清的培养基中进行培养，该培养过程并非单层结构细胞贴壁生长，而是三维培养，若单层结构细胞培养，细胞在这样的环境下生长容易发生拥挤现象而导致细胞间发生接触抑制，同时细胞暴露于培养液的表面积减少，并且细胞贴附表面积有限，此外还不利于细胞的分化和原有功能的表达。而三维培养可使培养基中的细胞聚集成为类似于组织的微组织球体，能克服单层细胞培养的缺陷，三维细胞培养能够提供更大的表面积，提高细胞产量的同时减少甚至避免细胞接触抑制，提供了近似于人体内的细胞生长三维空间微环境，便于细胞之间和细胞外基质之间的交互作用以及代谢产物的排出，保障了细胞保持原有的分化和功能表达。
在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进：
进一步，来源细胞为内皮细胞、巨噬细胞、平滑肌细胞；内皮细胞如血管内皮细胞等。
采用上述进一步技术方案的有益效果为：现有的泡沫细胞形成来源于单核源性泡沫细胞如巨噬细胞和血管平滑肌细胞，但现有技术人员并不知晓泡沫细胞可来源于人源内皮细胞如人血管内皮细胞。而本发明人打破了现有技术瓶颈，将人源内皮细胞转化为了泡沫细胞。因为本发明在泡沫细胞模型构建过程中无需添加任何诱导剂，在三维培养条件下就能形成体外泡沫细胞，不仅可将人源内皮细胞转化为了一种新的泡沫细胞，也可以将巨噬细胞和血管平滑肌细胞通过本发明构建方法也能形成该结构的泡沫细胞。
进一步，培养基为DMEM培养基。
采用上述进一步技术方案的有益效果为：培养基采用现有常用的培养基均可进行培养，而培养基为DMEM培养基时，细胞长的更好。
进一步地，胎牛血清的加入量为8-15v/v％，优选胎牛血清的加入量为10v/v％。
采用上述进一步技术方案的有益效果为：向培养基中加入胎牛血清后，才能在整个培养过程中维持细胞生长，尤其是胎牛血清加入量为10v/v％，细胞生长最好，维持时间较长。若没有胎牛血清，细胞无法长期存活。
进一步，三维培养是先加入来源细胞进行贴壁培养1-6h，然后去除未贴壁细胞，继续添加来源细胞和含胎牛血清的培养基进行培养1-6h，再去除未贴壁细胞，重复上述过程至少2次，每次加入的来源细胞密度为2×105-5×105cells/ml。
采用上述进一步技术方案的有益效果为：在三维培养过程中，先加入来源细胞，如在培养器皿中央滴加来源细胞液进行贴壁培养1-6h，培养完成后除去未贴壁细胞，继续向培养器皿贴壁细胞处添加来源细胞液和含胎牛血清的培养基后继续培养1-6h，再除去未贴壁细胞，这种加入来源细胞进行培养，然后除去未贴壁细胞后继续加入来源细胞和含胎牛血清的培养基进行培养的过程重复至少2次，也就是说重复2次，得到的就是2层细胞，重复3次得到的就是3层细胞，每次加入的来源细胞密度为2×105-5×105cells/ml，只有在该浓度范围下，培养1-6h，如此完成三维培养过程，该培养过程可产生新的泡沫细胞，该泡沫细胞在结构及组成上都更接近病态的形态，对研究动脉粥样硬化早期发生机制具有更重要的意义。当每层细胞接种间隔时间过长，超过6h，不能很好的形成泡沫细胞，时间过短也无法正常形成泡沫细胞。当加入的细胞浓度过大也无法形成泡沫细胞，细胞会飘在培养液中，细胞死亡。
进一步地，上述重复过程完成后还包括继续加入含胎牛血清的培养基继续培养8-15天。
采用上述进一步技术方案的有益效果为：向得到的多层细胞中加入培养基，然后加入胎牛血清继续培养，培养过程中无诱导剂，含胎牛血清的培养基能够有效维持最上一层细胞的营养物质，当继续培养8-15天后得到泡沫细胞，该培养过程是逐步形成脂质条纹和体积及组分发生变化的过程，如脂质条纹结构由不清晰到形成清晰的脂质条纹结构。
进一步地，三维培养过程中先加入来源细胞进行贴壁培养1.5h，然后去除未贴壁细胞，继续添加来源细胞和含胎牛血清的培养基进行培养1.5h，然后去除未贴壁细胞，该过程重复3次后，加入含胎牛血清的培养基继续培养11天；其中，每次加入的来源细胞密度为4×105cells/ml。
采用上述进一步技术方案的有益效果为：在上述培养条件下，得到的泡沫细胞最佳。
进一步，三维培养过程中还施加流体剪切力刺激或加入促进脂噬或脂质沉积的物质如患者血清，脂多糖LPS、修饰型LDL、溶血磷脂酰胆碱(LPC)等。
进一步，使用平行平板流动腔或板-板流动腔进行流体剪切力刺激。
进一步，通过层流FSS或振荡FSS的方式进行刺激，层流FSS强度为1-4dyn/cm2，振荡FSS强度为1-5dyn/cm2。
采用上述进一步技术方案的有益效果为：动脉粥样硬化好发于动脉的分支和弯曲处，这些区域血流紊乱、流体剪切力低于血管平直部位。衬贴于血管内腔面的血管内皮细胞与血流直接接触，响应流体剪切力改变而发生结构和功能障碍。在体流体剪切力改变可造成血管内皮细胞损伤，加剧动脉粥样硬化病变。施加流体剪切力如通过平行平板流动腔或板-板流动腔施加血流动力学进行刺激细胞，也可通过微流控芯片和人体器官芯片产生流体剪切力。但是不同流体剪切力可产生不同效果，如近生理流体剪切力可以抑制细胞泡沫化，而病理流体剪切力可以促进泡沫化形成。在本发明中，流体剪切力刺激考虑不同流态和强度，可分为层流FSS和振荡FSS，层流FSS强度为1-4dyn/cm2，振荡FSS强度为1-5dyn/cm2，在继续培养的8-15天过程中持续进行流体剪切力刺激，可有效促进泡沫细胞模型的形成。但是剪切力强度对泡沫细胞的影响比较大，有些剪切力强度能够促进泡沫细胞的形成，而有些强度会抑制泡沫细胞的形成，当剪切力强度在上述范围之内均可有效促进泡沫细胞的形成。
进一步，三维培养是通过加入支架如三维细胞培养支架的方式进行培养。
采用上述进一步技术方案的有益效果为：将三维细胞培养支架直接放置在非封闭型的细胞培养装置内部，然后进行细胞接种培养。非封闭型的细胞培养装置可以为培养皿、培养多孔板等。也可以将三维细胞培养支架置于封闭型的细胞培养装置中进行培养，但需要将三维细胞培养支架放置在某一个面敞开的封闭型的细胞培养装置内部，然后采用超声焊接、热焊接、激光烧结焊接等工艺将细胞培养装置体的缺失面焊接封闭成型，最后进行细胞接种培养。封闭型的细胞培养装置可以为培养瓶、培养转瓶、生物反应器等。
进一步，三维细胞培养支架为天然材料的水凝胶支架或合成的水凝胶支架。天然材料的水凝胶支架如细胞外基质胶原蛋白。
进一步，三维培养是通过磁悬浮实现细胞的三维培养，如向培养基质中加入磁性纳米颗粒来实现细胞培养，该过程无需支架。培养过程中可以通过在外部移动磁铁等磁性工具来使得培养液中的细胞发生移动培养，当拿走磁性工具后细胞就不受磁性物质的控制，自由增殖。
本发明的三维培养方式还可通过以下方式实现：通过自发性细胞聚集的方式实现三维培养，或通过细胞牵张应变加载培养实现三维培养，或通过细胞压应力加载培养实现三维培养。
本发明具有以下有益效果：
现有的泡沫细胞形成来源于单核源性泡沫细胞如巨噬细胞和血管平滑肌细胞，但现有技术人员并不知晓泡沫细胞可来源于人源内皮细胞如人血管内皮细胞。而本发明人打破了现有技术瓶颈，将人源内皮细胞转化为了泡沫细胞，尤其是通过简单的方式可提高泡沫细胞的产量，不会出现接触抑制生长现象。构建得到的泡沫模型还可以用于有内膜损伤、内膜细胞团和泡沫细胞形成的疾病的药物筛选，如心脑血管疾病、肾小球疾病、肺纤维化等。
附图说明
图1为油红O染色结果图。
图2为BODIPY 493/503染色结果图。
图3为扫描电镜结果图。
图4为透射电镜结果图。
图5为免疫荧光染色结果图。
图6为DCFH-DA探针和共聚焦显微镜检测胞内ROS含量结果图。
图7为茜素红染色结果图。
图8为甲苯胺蓝染色结果图。
图9为天狼猩红染色结果图。
图10为糖原PAS染色结果图。
图11为骨架染色结果图。
具体实施方式
以下所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1：
一种体外泡沫细胞模型，其构建方法包括以下步骤：
向直径为35mm的培养器皿中加入DMEM培养基，然后加入10v/v％胎牛血清，滴加浓度为4×105cells/ml的人主动脉内皮细胞(HAEC)液，培养1.5h后移除未粘附细胞，粘附细胞记为第一层细胞，然后继续加入浓度为4×105cells/ml的人主动脉内皮细胞液和含10v/v％胎牛血清的培养基，培养1.5h后移除未粘附细胞，得到第二层粘附细胞，接着继续加入浓度为4×105cells/ml的人主动脉内皮细胞液和含10v/v％胎牛血清的培养基，培养1.5h后移除未粘附细胞，得到第三层粘附细胞，最后向培养器皿中继续加入2ml含10v/v％胎牛血清的DMEM培养基，继续培养11天，构建得到泡沫细胞模型。
实施例2：
一种体外泡沫细胞模型，其构建方法包括以下步骤：
向直径为35mm的培养器皿中加入DMEM培养基，然后加入10v/v％胎牛血清，滴加浓度为5×105cells/ml的人主动脉内皮细胞(HAEC)液，培养1h后移除未粘附细胞，粘附细胞记为第一层细胞，然后继续加入浓度为5×105cells/ml的人主动脉内皮细胞液和含10v/v％胎牛血清的培养基，培养1h后移除未粘附细胞，得到第二层粘附细胞，接着继续加入浓度为5×105cells/ml的人主动脉内皮细胞液和含10v/v％胎牛血清的培养基，培养1h后移除未粘附细胞，得到第三层粘附细胞，最后向培养器皿中继续加入2ml含10v/v％胎牛血清的DMEM培养基，继续培养10天，构建得到泡沫细胞模型。
实施例3：
一种体外泡沫细胞模型，其构建方法包括以下步骤：
向直径为35mm的培养器皿中加入DMEM培养基，然后加入10v/v％胎牛血清，滴加浓度为2×105cells/ml的人主动脉内皮细胞(HAEC)液，培养4h后移除未粘附细胞，粘附细胞记为第一层细胞，然后继续加入浓度为2×105cells/ml的人主动脉内皮细胞液和含10v/v％胎牛血清的培养基，培养4h后移除未粘附细胞，得到第二层粘附细胞，接着继续加入浓度为2×105cells/ml的人主动脉内皮细胞液和含10v/v％胎牛血清的培养基，培养4h后移除未粘附细胞，得到第三层粘附细胞，最后向培养器皿中继续加入2ml含10v/v％胎牛血清的DMEM培养基，继续培养15天，构建得到泡沫细胞模型。
实施例4：
一种体外泡沫细胞模型，其构建方法包括以下步骤：
向直径为35mm的培养器皿中加入DMEM培养基，然后加入10v/v％胎牛血清，滴加浓度为4×105cells/ml的人主动脉内皮细胞(HAEC)液，培养1.5h后移除未粘附细胞，粘附细胞记为第一层细胞，然后继续加入浓度为4×105cells/ml的人主动脉内皮细胞液和含10v/v％胎牛血清的培养基，培养1.5h后移除未粘附细胞，得到第二层粘附细胞，接着继续加入浓度为4×105cells/ml的人主动脉内皮细胞液和含10v/v％胎牛血清的培养基，培养1.5h后移除未粘附细胞，得到第三层粘附细胞，最后向培养器皿中继续加入2ml含10v/v％胎牛血清的DMEM培养基，继续培养，培养过程中使用平行板流动腔对细胞进行流体剪切力刺激，选用层流FSS刺激，强度为4dyn/cm2，培养8天，构建得到泡沫细胞模型。该过程将平行板流动腔更换为板-板流动腔对细胞进行流体剪切力刺激，也在同样时间构建得到了泡沫细胞模型。
实施例5：
实施例5与实施例4不同之处在于：层流FSS刺激强度为1dyn/cm2，培养9天，构建得到泡沫细胞模型；该过程将平行板流动腔更换为板-板流动腔对细胞进行流体剪切力刺激，也在同样时间构建得到了泡沫细胞模型。
实施例6：
实施例6与实施例4不同之处在于：选用振荡FSS刺激，强度为1dyn/cm2，培养9天，构建得到泡沫细胞模型。该过程将平行板流动腔更换为板-板流动腔对细胞进行流体剪切力刺激，也在同样时间构建得到了泡沫细胞模型。
实施例7：
实施例7与实施例4不同之处在于：选用振荡FSS刺激，强度为5dyn/cm2，培养8天，构建得到泡沫细胞模型。该过程将平行板流动腔更换为板-板流动腔对细胞进行流体剪切力刺激，也在同样时间构建得到了泡沫细胞模型。
对比例1：
向直径为35mm的培养器皿中加入DMEM培养基，然后加入10wt％胎牛血清，滴加人主动脉内皮细胞(HAEC)液，进行贴壁培养。
对比例2：
向直径为35mm的培养器皿中加入DMEM培养基，然后加入50ug/ml的ox-LDL，然后滴加巨噬细胞，培养24h，细胞内LD大量聚集，CE/TC比值大于50％，泡沫细胞形成。
对比例3：
对比例3与实施例1相比，每次加入的人主动脉内皮细胞浓度为8×105cells/ml，最后的培养时间由培养11天替换为24h。
实施例1-7能够成功构建体外泡沫细胞模型，构建得到的体外泡沫细胞模型由来源细胞泡沫化后形成脂质条纹结构，相比来源细胞，泡沫细胞胞质内脂质聚集，脂滴增加，细胞核缩小，细胞体积变小。而对比例1中并未采用三维培养方法进行培养，仅仅是细胞的单层培养，不能很好的形成泡沫细胞模型。实施例1-7中都缺少胎牛血清时，细胞也不能很好的生长，不能形成泡沫细胞。对比例2中是按照常规方法培养得到的泡沫细胞，培养过程中需要添加高浓度诱导剂ox-LDL才能构建得到泡沫细胞模型，但是构建得到的泡沫细胞模型相比来源细胞，泡沫细胞体积是增大的。
此外，发明人在实验过程中还发现当每次接种来源细胞的间隔时间不在1-6h范围内如间隔时间过短过过长都无法正常形成泡沫细胞。当每次接种的来源细胞浓度过高时，如加入的来源细胞浓度为8×105cells/ml(对比例3)，堆叠培养后继续培养24h，大部分细胞不能贴壁，培养液呈黄色，细胞都飘在培养液上，呈死亡状态。当将来源细胞降低为6×105cells/ml，同样大部分细胞不能贴壁，甚至最终细胞都飘在培养液上，呈死亡状态。而对比例1中培养6天后贴壁细胞较少，大部分细胞死亡。由此可知，只有在本发明间隔时间和细胞密度范围内进行三维细胞培养，才能很好的形成本发明所述的泡沫细胞模型。
以实施例1和对比例1所得泡沫细胞为例，实施例1作为实验组，对比例1作为对照组，具体给出以下检测结果：
1、油红O染色
P35培养皿培养HAEC细胞11天后，将贴有细胞壁的P35培养皿用PBS缓冲液快速清洗2次。加1ml ORO Fixative固定液固定20min，PBS漂洗3次，加入1ml 60％异丙醇浸洗5min，弃去60％异丙醇后加入500μl ORO Stain(Solarbio，G1262)浸染20min，PBS洗3次，之后加入适量PBS均匀覆盖细胞，共聚焦显微镜(Zeiss，LSM7100)下观察和拍照，结果见图1。由图1可知，相比对照组，本发明构建得到的泡沫细胞内脂质聚集，脂质聚集是泡沫细胞的典型特征。
2、BODIPY 493/503染色
BODIPY染色后采用共聚焦显微镜检测泡沫细胞内脂滴中的脂质含量，具体过程如下：P35培养皿培养HAEC细胞11天后，用1ml 4％多聚甲醛固定液(Beyotime，P0099)将细胞固定10min，固定后用PBS漂洗3次，37℃下加入500μl BODIPY493/503染色工作液(2μM，GLPBIO，GC42959)孵育15min，PBS漂洗3次，加入500μl DAPI染色液(Beyotime，C1005)染色5min，PBS漂洗3次。共聚焦显微镜(Zeiss，LSM7100)观察和拍照，结果见图2，由图2可知，相比对照组，本发明构建得到的泡沫细胞内脂滴显著增加。
3、扫描电镜观察
通过采用扫描电镜观察泡沫细胞的形态和空间分布，具体过程如下：P35培养皿培养HAEC细胞11天后，加入1ml 3％戊二醛，4℃固定过夜，PBS清洗样品2次，1ml 30％、50％、70％、80％、90％、100％×2乙醇梯度脱水，每步脱水时间15min，临界点干燥约1.5h，离子溅射镀膜仪对样品进行导电处理。扫描电子显微镜(牛津仪器，Aztec Live ULTIM)观察和拍照，观察结果见图3，由图3可知，相比对照组，本发明构建得到的泡沫细胞的细胞体积变小，形成了三维空间结构。
4、透射电镜观察
通过透射电镜检测泡沫细胞线粒体超微结构和线粒体自噬活化情况，具体过程如下：P35培养皿培养HAEC细胞11天后，刮取新鲜细胞，收集在离心管中，1500rpm离心5min，弃上清，用吸管沿离心管壁缓慢加入1ml 0.5％戊二醛重悬细胞，4℃静置5min，12000rpm离心5min，弃上清，沿管壁缓慢加入1ml 3％戊二醛，保存于4℃。透射电子显微镜(Hitachi，HT7800)观察和拍照，结果见图4，由图4可知，相比对照组，本发明构建得到的泡沫细胞的体积变小，细胞质中出现脂质聚集和脂质空泡(图4左下)，脂质聚集和脂质空泡是泡沫细胞的典型特征，由此可知，通过三维培养后，人主动脉内皮细胞已成功转化为泡沫细胞。由图4由上可知，正常对照组细胞线粒体完好，而由图4右下可知，泡沫细胞中线粒体自噬紊乱。
5、免疫荧光染色
P35培养皿培养HAEC细胞11天后，用1ml 4％多聚甲醛固定液(Beyotime,P0099)将细胞固定10min，固定后用PBS漂洗3次，加入500μl 0.1％Triton X-100(Beyotime，ST795)透膜5min，1ml 1％BSA/PBS封闭20min后，加入500μl CD31/F8抗体(兔抗IgG，1：200，CUSABIO)室温孵育60min，PBS漂洗3次，加入500μl Alexa 488conjugated goat anti-rabbit IgG(1：400，invitrogen，CA11034s)室温孵育1h，PBS漂洗3次，加入500ul DAPI染色液(Beyotime,C1005)染色5min，PBS漂洗3次。共聚焦显微镜(Zeiss，LSM7100)观察和拍照，检测泡沫细胞内标记物CD31和vWF，结果见图5。由图5可知，相比对照组，本发明构建得到的泡沫细胞的细胞核缩小了，并且泡沫细胞丢失了CD31和vWF。
6、DCFH-DA探针和共聚焦显微镜检测胞内ROS含量
P35培养皿培养HAEC细胞11天后，PBS漂洗细胞3次，37℃下加入500μl DCFH-DA(10μM，Beyotime，C0158M)孵育30min，PBS漂洗2次，加入500μl DAPI染色液(Beyotime，C1005)染色5min，PBS漂洗3次。共聚焦显微镜(Zeiss，LSM7100)观察和拍照，观察细胞内ROS生成情况，结果见图6，由图6可知，相比对照组，本发明构建得到的泡沫细胞中ROS大量生成。
7、茜素红染色
P35培养皿培养HAEC细胞11天后，用PBS缓冲液快速清洗2次，然后用1ml 4％多聚甲醛固定液(Beyotime，P0099)固定10min，PBS缓冲液洗涤3次，用500μl 0.2％茜素红S染色液(Solaribio，G1452)在室温下染色20min，之后用PBS缓冲液冲洗细胞3次。共聚焦显微镜(Zeiss，LSM7100)观察和拍照，结果见图7，由图7可知，相比对照组，本发明构建得到的泡沫细胞中有大量的钙沉积。
8、甲苯胺蓝染色
P35培养皿培养HAEC细胞11天后，用1ml 95％乙醇将细胞固定15s，ddH2O漂洗3次，加入500μl甲苯胺蓝染色液(Solarbio，G3660)染色5min，弃去染料，加入等量ddH2O静置15min，之后ddH2O漂洗3次。使用共聚焦显微镜(Zeiss，LSM7100)观察和拍照，结果见图8，由图8可知，相比对照组，本发明构建得到的泡沫细胞中蛋白聚糖大量生成。
9、天狼猩红染色
P35培养皿培养HAEC细胞11天后，用1ml 4％多聚甲醛固定液(Beyotime，P0099)将细胞固定10min，ddH2O清洗细胞3次，加入500μl0.1％天狼猩红染色液(Solaribio，S8060)室温下放置30min，ddH2O清洗3次。共聚焦显微镜(Zeiss，LSM7100)观察和拍照，结果见图9，由图9可知，相比对照组，本发明构建得到的泡沫细胞中胶原大量生成，形成维持脂纹条的支架。
10、糖原PAS染色
P35培养皿培养HAEC细胞11天后，将细胞用1ml PAS固定液(Solarbio，G1360)在培养皿中固定15min，ddH2O漂洗3次，加入1ml氧化剂，室温下氧化15min，ddH2O漂洗三次，室温避光加入500μl Schiff Reagent(Solarbio，G1286)浸染20min，用1ml亚硫酸钠溶液漂洗2次，ddH2O漂洗2次，加入500μl苏木素染色液(Beyotime，C0107)复染2min，ddH2O漂洗2次。共聚焦显微镜(Zeiss，LSM7100)观察和拍照，结果见图10，由图10可知，相比对照组，本发明构建得到的泡沫细胞中糖原大量生成。
11、骨架染色
P35培养皿培养HAEC细胞11天后，用1ml 4％多聚甲醛固定液(Beyotime，P0099)将细胞固定10min，固定后PBS漂洗3次，加入500μl0.1％Triton X-100(Beyotime，ST795)透膜5min，室温避光加入500μl Actin-Tracker Red-555(1:200，Beyotime，C2203S)孵育60min，PBS漂洗3次，加入500ul DAPI染色液(Beyotime，C1005)染色5min，PBS漂洗3次。共聚焦显微镜(Zeiss，LSM7100)观察和拍照，结果见图11，由图11可知，相比对照组，本发明构建得到的泡沫细胞中细胞骨架被破坏，应力纤维解聚。
综上，人主动脉内皮细胞可以转化为泡沫细胞。血管内皮细胞源性泡沫细胞的细胞体积小，细胞核变小，丧失血管内皮细胞表型，细胞质中有脂质聚集和脂质空泡，细胞内氧化应激和线粒体自噬紊乱。正常细胞靠细胞骨架维持其形态，但泡沫细胞细胞骨架紊乱，主要胶原形成其三维结构的支架。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种体外泡沫细胞模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：向培养基中加入8-15v/v%胎牛血清，然后加入来源细胞进行三维培养，向所得细胞中加入含胎牛血清的培养基继续培养8-15天，制得；
所述来源细胞为内皮细胞；
所述三维培养是先加入来源细胞进行贴壁培养1-6h，然后去除未贴壁细胞，继续添加来源细胞和含胎牛血清的培养基进行培养1-6h，再去除未贴壁细胞，重复上述过程至少2次；每次加入的来源细胞密度为2×105-5×105cells/ml。
2.根据权利要求1所述的体外泡沫细胞模型的构建方法，其特征在于，先加入来源细胞进行贴壁培养1.5h，然后去除未贴壁细胞，继续添加来源细胞和含胎牛血清的培养基进行培养1.5h，然后去除未贴壁细胞，该过程重复3次后，加入含胎牛血清的培养基继续培养11天；其中，每次加入的来源细胞密度为4×105cells/ml。
3.根据权利要求1-2任一项所述的体外泡沫细胞模型的构建方法，其特征在于，三维培养过程中还施加流体剪切力刺激或加入促进脂噬或脂质沉积的物质。
4.根据权利要求3所述的体外泡沫细胞模型的构建方法，其特征在于，流体剪切力刺激是通过层流FSS或振荡FSS的方式进行刺激，层流FSS强度为1-4dyn/cm2，振荡FSS强度为1-5dyn/cm2。
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